MBV用于治疗自身免疫性疾病的用途

mbv用于治疗自身免疫性疾病的用途
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年10月23日提交的美国申请号62/925,129的权益，其通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明涉及施用基质结合囊泡(mbv)用于治疗自身免疫性病症。


背景技术：

4.治疗自身免疫性病况(例如类风湿性关节炎、银屑病、狼疮、多发性硬化症等)的主要挑战是选择性调节负责自身免疫的免疫应答，同时保留宿主对感染因子的保护性免疫应答。迄今为止，目前使用的免疫抑制疗法最常见副作用是感染和恶性肿瘤的风险增加。因此，仍需要用于治疗这些病况的其他治疗剂。


技术实现要素：

5.公开了用于治疗有需要的受试者的自身免疫性病症的方法，该方法包括向该受试者施用药物制剂，该药物制剂包括治疗有效量的源自细胞外基质的分离的基质结合纳米囊泡(matrix bound nanovesicles，mbv)，从而治疗该自身免疫性病症。在一些非限制性实例中，该施用是全身性的。在其他非限制性实例中，该病症是类风湿性关节炎。在进一步的非限制性实例中，该病症是银屑病、狼疮、天疱疮、类天疱疮或多发性硬化症。该方法可以包括选择这些受试者进行治疗。
6.本发明的前述和其他目的、特征和优点将通过参照附图的以下详细描述变得更加显而易见。
附图说明
7.图1a-1g显示了液相细胞外囊泡(ev)和基质结合纳米囊泡(mbv)的形态学特征。图1a显示了源自膀胱基质(ubm)的ecm支架的扫描电子显微镜图像，其中直径约100nm的离散球体分散在整个基体中。标尺＝1μm。图1b显示了用于从液相(ev)或固相细胞外区室(mbv)选择性收获囊泡的3t3成纤维细胞培养模型的图示。图1c显示了相差显微镜检查、苏木素和伊红(h&e)染色以及4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色，表明脱细胞后不存在细胞并且不存在完整的细胞核。图1d显示了分离自3t3成纤维细胞培养模型的液相ev和mbv的透射电子显微镜图像。标尺＝100nm。图1e显示了来自3t3成纤维细胞培养物的液相ev和mbv分离物的纳米颗粒跟踪分析(nta)的尺寸分布图。图1f显示了比较液相ev和mbv中cd9、cd63、cd81和hsp70表达水平的免疫印迹分析。图1g显示了液相ev和mbv中电泳分离的蛋白的银染分析。
8.图2a-2e绘出了ev和mbv之间mirna运载物(cargo)的差异。图2a显示了从3t3亲代细胞分离的总rna、它们分泌的液相ev和它们的mbv的生物分析仪分析。图2b显示了比较液
相ev(绿色)、mbv(蓝色)和细胞(红色)rna-seq数据集的主成分分析(pca)。图2c显示了火山图，示出了液相ev、mbv和亲代细胞中mirna的差异表达。纳入标准是log2(倍数变化)在任一方向上的2倍差异，p值《0.05。每个点代表特定的mirna转录本；垂直虚线的右侧(并且在水平虚线上方)的绿点对应于表达水平的相对增加，左侧(并且在水平虚线上方)的红点对应于表达水平的相对降低。蓝点(出现在水平虚线下方)表示表达水平没有显著变化的mirna。图2d显示了mirna测序结果的rt-qpcr验证，*p《0.05，n＝4。图2e显示了ingenuity通路分析(ipa功能分析)。考虑到mbv(红色-下柱)和液相ev(蓝色-上柱)中差异表达的mirna，确定通过ipa功能分析鉴定的显著丰富的分子功能。细胞生长和增殖、细胞形态、细胞间信号传导和组织发育没有红色柱；消化系统发育和功能、肝脏系统发育和功能以及器官发育和功能没有蓝色柱。
9.图3a-3h绘出了基于mbv细胞来源的mbv mirna运载物的差异。图3a显示了脱细胞bmsc细胞培养板的相差显微图像，显示不存在细胞。图3b显示了分离自脱细胞bmsc培养板的mbv的透射电子显微镜图像。标尺＝100nm。图3c-图3e显示了从bmsc(图3c)、asc(图3d)和ucsc(图3e)脱细胞培养板分离的mbv的纳米颗粒跟踪分析(nta)的尺寸分布图。图3f显示了从bmsc、asc和ucsc来源的mbv分离的总rna的生物分析仪分析。图3g显示了比较bmsc mbv(绿色；左中)、ucsc mbv(蓝色；右上)和asc mbv(红色；右下)rna-seq数据集的主成分分析(pca)。图3h显示了火山图，示出了bmsc、asc和ucsc来源的mbv中mirna的差异表达。纳入标准是log2(倍数变化)在任一方向上的2倍差异，p值《0.05。每个点代表特定的mirna转录本；垂直虚线的右侧(并且在水平虚线上方)的绿点对应于表达水平的相对增加，左侧(并且在水平虚线上方)的红点对应于表达水平的相对降低。蓝点(水平虚线下方)表示表达水平没有显著变化的mirna。
10.图4a-4e显示了mbv、液相ev和亲代细胞之间磷脂的lc/ms表征。图4a显示了从mbv获得的磷脂的典型总离子色谱图。图4b显示了mbv中主要磷脂类别的质谱。评估包括定量磷脂的饱和(双键数＝0)、单不饱和(双键数＝1)和多不饱和(双键数＝2-10)种类。图4c显示了饼图，显示主要磷脂的总含量。数据表示为总磷脂的％。图4d和图4e显示了不同磷脂分子种类的含量。数据显示为自动定标为z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)。缩写为：ev，外泌体囊泡；mbv，基质结合囊泡；pc，磷脂酰胆碱；pcd，pc二酰基种类；pcp，pc缩醛磷脂；pe，磷脂酰乙醇胺；ped，pe二酰基种类；pep，pe缩醛磷脂；pi，磷脂酰肌醇；ps，磷脂酰丝氨酸；bmp，双-单酰基甘油磷酸酯；pa，磷脂酸；pg，磷脂酰甘油；和sm，鞘磷脂。
11.图5a-5d显示了lc/ms表征和后续分析，检查了mbv、液相ev和亲代细胞之间lpe、lpa和lpg的差异。图5a显示了从mbv获得的主要溶血磷脂的典型质谱。图5b显示了饼图，显示主要溶血磷脂的总含量。数据表示为总溶血磷脂的％。图5c和图5d显示了溶血磷脂分子种类的含量。数据显示为自动定标为z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)，n＝3。缩写为：ev，外泌体囊泡；mbv，基质结合囊泡；lpc，溶血磷脂酰胆碱；lpe，溶血磷脂酰乙醇胺；lpi，溶血磷脂酰肌醇；lps，溶血磷脂酰丝氨酸；lpa，溶血磷脂酸；lpg，溶血磷脂酰甘油；和mcl，单溶血心磷脂。
12.图6a-6c示出了与液相ev中的水平相比，mbv中含pufa的磷脂及其氧化修饰的分子种类的水平更高。评估了亲代细胞、液相ev和mbv中游离pufa(图6a)及其氧化代谢物(图6b)的含量。数据表示为平均值
±
s.d.，*p《0.05，并与细胞或mbv进行比较，其中n＝3。图6c显示
了亲代细胞、液相ev和mbv中单氧化、双氧化和三氧化磷脂物质的含量。数据显示为自动定标为z评分的热图，并将蓝色(低值)编码为红色(高值)。缩写为：ev，外泌体囊泡；mbv，基质结合囊泡；pl，磷脂；pc，磷脂酰胆碱；pe，磷脂酰乙醇胺；pi，磷脂酰肌醇；ps，磷脂酰丝氨酸；bmp，双-单酰基甘油磷酸酯；pa，磷脂酸；pg，磷脂酰甘油；和cl，心磷脂。
13.图7绘出了在大鼠动物模型中，mbv用于治疗类风湿性关节炎的施用途径。
14.图8a-8e显示了对照大鼠模型以及接受仅使用降植烷(pristane)、腹腔注射(ip)甲氨蝶呤(mtx)、关节周围注射(pa)mbv或静脉内注射(iv)mbv处理的关节炎大鼠模型的个体关节炎评分。图8a显示了第7天各处理组的关节炎评分。图8b显示了第10天各处理组的关节炎评分，图8c显示了第13天各处理组的关节炎评分，图8d显示了第17天各处理组的关节炎评分，以及图8e显示了第21天各处理组的关节炎评分
15.图9a显示了从通过降植烷诱导表型临床关节炎并接受仅使用降植烷、ip甲氨蝶呤、pa mbv或iv mbv处理的sprague-dawley大鼠的多个视图获取的照片。图9b显示了疾病对照和关节周围mbv处理的大鼠爪的更接近视图。
16.图10显示了对照组以及接受仅使用降植烷、ip甲氨蝶呤、pa mbv或iv mbv处理的关节炎大鼠模型中处理前21天的平均关节炎评分。
17.图11a显示了对照大鼠模型以及接受ip甲氨蝶呤、pa mbv和iv mbv处理的关节炎大鼠模型的鼠爪的数字图像。图11b显示了接受ip甲氨蝶呤、pa mbv和iv mbv处理的关节炎大鼠模型中处理前77天的平均关节炎评分。
18.图12a-12e显示了局部和全身施用mbv显著降低急性和慢性降植烷诱导的关节炎疾病的严重程度。a)实验设计和处理方案。b)在第0天和第100天，每组的前爪和后爪的代表性图像。降植烷 pbs组中出现明显的前爪和后爪水肿、红斑和变形，而在其余处理组中未观察到表面变化。c)与降植烷 pbs相比，腹腔注射甲氨蝶呤显著降低第10-21天和第84-100天之间的疾病评分(p《.05)。d)与降植烷 pbs相比，关节周围注射mbv显著降低第10-21天和第70-100天之间的疾病评分(p《.05)。e)与降植烷 pbs相比，静脉内注射mbv显著降低第10-21天和第70-100天之间的疾病评分(p《.05)。小图c-e中所示的所有值均是平均值
±
sem，并且第7-28天的n＝8和第28-100天的n＝4。
19.图13a-13e提供了基质结合纳米囊泡减少慢性降植烷诱导的关节炎中的滑膜炎症、软骨降解和蛋白聚糖损失的证据。a)胫距(胫骨＝ti，距骨＝ta)关节的代表性10
×
h&e和10
×
甲苯胺蓝图像和相邻滑膜(syn)的40
×
h&e图像。b)在检查滑膜的40
×
h&e图像时，i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv均显著减少滑膜炎症和浸润免疫细胞的相对比例(p《.05)。c)在检查10
×
甲苯胺蓝图像时，与降植烷 pbs相比，i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv降低软骨损伤的严重程度。d)在检查10
×
h&e图像时，与降植烷 pbs相比，i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv降低蛋白聚糖丢失的严重程度。e)与降植烷 pbs相比，降植烷 i.p.mtx、 p.a.mbv和 i.v.mbv均显著降低累积组织病理学评分(p《.05)。小图13b-13e中的所有值代表平均值
±
sem(n＝3)。
20.图14a-14c记录了基质结合纳米囊泡将关节巨噬细胞表型从在降植烷诱导的关节炎中见到的m1主要表型调节为m2主要表型。a)接近胫距关节的滑膜组织的代表性20
×
ihc图像。描绘了四个通道的合成图像以及每个靶标(细胞核、cd68、tnfα和cd206)的单独颜色通道。b)与对照 pbs相比，降植烷 pbs显著增加m1巨噬细胞(tnfα /cd68 )相比于m2巨噬细
胞(cd206 /cd68 )的比例(p《.05)。所有三个处理组(i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv)均显著降低滑膜组织中m1:m2巨噬细胞的比例(p《.05)。c)与对照 pbs和降植烷 pbs相比，所有三个处理组中m2:m1巨噬细胞的比例均增加(p》.05)。小图b和c中的所有值代表平均值
±
sem(n＝3)。
21.图15a-15b是通过显微ct成像显示基质结合纳米囊泡的全身和局部施用防止慢性降植烷诱导的关节炎中的不利骨重塑的数字图像。a)第100天前爪的代表性显微ct图像。在降植烷 pbs组的整个前爪近端骨骼中可见大量骨重塑和损伤，而所有三个处理组的骨形态变化很小甚至无变化。b)在第100天后爪的代表性显微ct图像。在降植烷 pbs组位于胫距关节中可见大量骨重塑和损伤，而所有三个处理组显示出极小骨形态变化或无变化，尤其是在胫距关节区域。
22.图16是显示用基质结合纳米囊泡处理咪喹莫特诱导的鼠银屑病的数字图像。图像是经剃毛、去毛和用imq(对照1)或凡士林(对照2)处理的背部皮肤的图像。全身施用mbv可以减少咪喹莫特诱导的银屑病的红斑和鳞屑。此外，全身施用mbv可以减少咪喹莫特诱导的银屑病的皮肤厚度。
23.图17是累积银屑病评分的线图。从银屑病面积和严重程度指数(pasi)得出的累积银屑病评分用于对疾病严重程度进行评分。全身施用mbv(通过腹腔施用)显著降低imq诱导的皮肤炎症银屑病模型中的累积银屑病评分。累积评分基于修改的临床银屑病面积和严重程度指数(pasi)(最高评分＝12)。红斑和鳞屑以0-4的等级独立评分：0，无；1，轻度；2，中等；3，显著；和4，非常显著。使用卡尺测量双耳的厚度，并计算较基线的百分比变化作为皮肤厚度的指标。与咪喹莫特诱导的银屑病相比，全身施用mbv降低整体疾病评分。
24.图18是mbv后钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)igm测定结果的柱状图。在用klh免疫之前全身施用mbv未影响宿主动物对klh抗原产生正常igm抗体应答的能力。与溶媒 klh对照相比，在第7、14和21天已知的免疫抑制剂环磷酰胺显著降低抗klh igm水平。在产生的igm水平方面，溶媒 klh对照和mbv处理的动物之间没有显著差异。这些结果表明全身施用mbv未抑制生理性抗体免疫应答。
25.图19是图8的柱状图，mbv后钥孔戚血蓝蛋白igg测定的结果。在用klh免疫之前全身施用mbv未影响宿主动物对klh抗原产生正常igg抗体应答的能力。与溶媒 klh对照相比，在第7、14和21天已知的免疫抑制剂环磷酰胺显著降低抗klh igg水平。在产生的igg水平方面，溶媒 klh对照和mbv处理的动物之间没有显著差异。这些结果表明全身施用mbv未抑制生理性抗体免疫应答。
26.序列表
27.随附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码显示，如37c.f.r.1.822所定义。仅显示每个核酸序列的一条链，但互补链应理解为通过对显示链的任何引用而被包括。序列表以ascii文本文件[sequence_listing，2020年10月22日，1.097字节]的形式提交，其通过引用并入本文。
具体实施方式
[0028]
由细胞外基质(ecm)组成的生物支架已被开发为外科网状材料，并用于临床应用，包括腹疝修复(alicuban等人，hernia.2014；18(5):705-712)、肌肉骨骼重建(mase等人，
orthopedics.2010；33(7):511)、食道重建(badylak等人，tissue eng part a.2011；17(11-12):1643-50)、硬脑膜置换(bejjani等人，j neurosurg.2007；106(6):1028-1033)、肌腱修复(longo等人，stem cells int.2012；2012:517165)、乳房重建(salzber,ann plast surg.2006；57(1):1-5)等(badylak等人，acta biomater.2009；5(1):1-13)。
[0029]
基质结合纳米囊泡(mbv)嵌入ecm的纤维状网络中。这些纳米颗粒在ecm支架生产工艺中防护其运载物免受降解和变性。
[0030]
外泌体是先前几乎仅在体液和细胞培养上清液中发现的囊泡。已经证明mbv和外泌体不同。mbv不同于其他囊泡，例如，因为它们对去污剂和/或酶消化具有抗性，具有独特的脂质谱，含有一组不同的microrna。mbv不具有在其他囊泡(例如外泌体)中发现的相同特征表面蛋白。
[0031]
如本文所公开，mbv调节全身愈合反应(例如通过全身施用)，例如，以保持或恢复生物学功能。例如，mbv施用可用于保持或恢复免疫应答，例如治疗自身免疫性疾病(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、类天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)。
[0032]
术语
[0033]
提供以下对术语和方法的解释以更好地描述本公开并指导本领域普通技术人员实施本公开。单数形式“a”、“an”和“the”是指一个或多于一个，除非上下文另有明确规定。例如，术语“包含细胞”包括单个或多个主题，并且被认为等同于短语“包含至少一个主题”。除非上下文另有明确说明，否则术语“或”是指所述可选元件的单个元件或两个或更多个元件的组合。如本文所用，“包含”意指“包括”。因此，“包含a或b”意指“包括a、b、或a和b”，而不排除另外的元件。本文提及的登录号的日期是至少早在2015年9月16日可获得的序列。本文引用的所有参考文献、专利申请和出版物以及登录号均通过引用并入本文。除非另有说明，否则“约”表示在百分之五以内。为了便于综述本公开的各个实施方案，提供以下对特定术语的解释：
[0034]
施用：通过选择的途径将组合物(例如mbv或包括mbv的药物制剂)引入受试者。该途径可以是局部的或全身的。例如，如果选择的途径是静脉内，则通过将组合物引入受试者的静脉中来施用组合物。如果选择的途径是局部的，则可以通过将组合物直接引入受试者的组织中来施用组合物。
[0035]
动物：活的多细胞脊椎动物生物，包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语“哺乳动物”包括人和非人哺乳动物。类似地，术语“受试者”包括人受试者和兽医受试者。
[0036]
关节炎：关节炎是影响身体中一个或更多个关节滑膜的疾病。它是最常见的关节疾病类型，其特征是关节炎症。该疾病通常是少关节型(影响少数关节)，但也可能是全身性的。通常累及的关节包括髋、膝、下腰椎和颈椎、手指近端和远端指间关节、第一腕掌关节和足部第一跗跖关节。症状包括关节疼痛和僵硬、发红、发热、肿胀以及受影响关节的活动范围减小。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗关节炎。
[0037]
一种类型的关节炎是类风湿性关节炎。类风湿性关节炎是慢性、全身性、自身免疫性疾病，其可影响身体中多个关节的滑膜。由于该疾病是全身性疾病，因此该疾病具有许多关节外特征。例如，神经病、巩膜炎、淋巴结病、心包炎、脾肿大、动脉炎和类风湿结节是该疾病的常见组成部分。在大多数类风湿性关节炎病例中，受试者的症状得到缓解和恶化(也称
d-天冬氨酸受体脑炎(抗nmda受体脑炎，可伴有卵巢畸胎瘤，主要影响18-45岁女性)和拉斯穆森脑炎(rasmussen encephalitis)。其他自身免疫性疾病可引起自身免疫性脑炎，例如系统性红斑狼疮、桥本脑病、自身免疫性边缘脑炎和西登哈姆氏舞蹈病(sydenham’s chorea)。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗自身免疫性脑炎。
[0044]
富集的：与富集过程之前相比，在富集过程之后混合物中的目标组分(例如纳米囊泡)具有该组分的量与该混合物中其他非期望组分的量的比率增加的过程。
[0045]
细胞外基质(ecm)：结构和功能生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，它们在组织内围绕并支持细胞，除非另有说明，否则是无细胞的。ecm制剂可以被认为是“脱细胞化的”或“无细胞的”，表示已经通过本文所述和本领域已知的方法将细胞从源组织中去除。通过“ecm来源的材料”，例如“ecm来源的纳米囊泡”、“基质结合纳米囊泡”，“mbv”或“源自ecm的纳米囊泡”是由天然ecm或体外来源制备的纳米囊泡，其中ecm由培养的细胞产生。ecm来源的纳米囊泡定义如下。
[0046]
突发或发作：疾病或病症(例如自身免疫性病症)的恶化。当既存一段时间的疾病或病症的症状突然恶化时，可发生突发。例如，在突发中，疾病或疾病症状的严重程度暂时恶化，但最终消退或减轻。例如，在自身免疫性病症中，炎症或自身免疫性病症的其他体征或症状在突发期间可能恶化。
[0047]
炎症性肠病(ibd)：以来源不明的慢性、复发性肠道炎症为特征的自身免疫性疾病。在ibd患者中，肠道内壁的溃疡和炎症导致腹痛、腹泻和直肠出血的症状。ibd具有两种主要类型，克罗恩氏病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)；这两种疾病似乎均由针对肠上皮细胞的自身抗体介导的肠道炎症反应的无节制激活引起。
[0048]
cd和uc的主要区别在于炎症变化的位置和性质。cd可以影响胃肠道的任何部分，从口腔到肛门(跳过病变)，尽管大多数病例始于回肠末端。相反地，溃疡性结肠炎仅限于结肠和直肠。ibd最常见的症状包括发热、呕吐、腹泻、血便(便血)、腹痛和体重减轻，但也可能包括许多其他问题。症状的严重程度可能损害ibd患者的生活质量。对于大多数患者，ibd是症状持续数月至数年的慢性病。它在年轻人中最常见，但可以在任何年龄发生。ibd在犹太裔人群中尤为常见，并且发病率也存在人种差异。
[0049]
ibd的诊断可以基于临床症状或使用钡灌肠，但直接可视化(乙状结肠镜检查或结肠镜检查)是最准确的检测。长期ibd是结肠癌的风险因素，并且ibd治疗可能涉及药物和手术。
[0050]
一些uc患者仅患有直肠疾病(直肠炎)。其他uc患者的疾病仅限于直肠和接近的左结肠(直肠乙状结肠炎)。还有一些人患有整个结肠的uc(泛发性ibd)。uc的症状通常更严重，疾病范围更广(疾病累及结肠的更大部分)。疾病局限于直肠(直肠炎)或uc局限于左结肠末端(直肠乙状结肠炎)的患者预后优于全结肠uc。在患有更广泛疾病的患者中，发炎的肠道失血可以导致贫血，并且可能需要补铁治疗，甚至输血。
[0051]
极少数情况下，当炎症变得非常严重时，结肠急剧扩张至大尺寸。这种病况被称为毒性巨结肠。毒性巨结肠患者病情严重，伴有发热、腹痛腹胀、脱水和营养不良。除非患者通过药物治疗迅速好转，否则通常需要进行手术以防止结肠破裂。
[0052]
cd可以发生在胃肠道的所有区域。伴随该疾病，在大量患者中发生由于炎症和纤
维化导致的肠梗阻。肉芽肿和瘘管形成是cd的常见并发症。疾病进展后果包括静脉内进食、手术和结肠造口术。
[0053]
ibd缓解可以通过多种方式测量。临床缓解是指疾病没有症状。组织学和内窥镜缓解是指在内窥镜手术期间切除的活检肠组织没有炎症。
[0054]
分离的：“分离的”生物组分(例如核酸、蛋白细胞或纳米囊泡)已与该组分天然存在的生物体细胞或ecm中的其他生物组分基本上分离或纯化。已“分离的”核酸和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。从ecm的纤维材料中去除已分离的mbv。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸和蛋白以及化学合成的核酸。
[0055]
赖氨酰氧化酶(lox)：催化胶原蛋白和弹性蛋白前体中的赖氨酸残基形成醛的铜依赖性酶。这些醛具有高反应性，并与其他赖氨酰氧化酶来源的醛残基或未修饰的赖氨酸残基发生自发化学反应。在体内，这导致胶原蛋白和弹性蛋白交联，其在稳定胶原蛋白原纤维和成熟弹性蛋白的完整性和弹性方面发挥作用。复杂的交联在结构不同的胶原蛋白(源自三个赖氨酸残基的吡啶啉)和弹性蛋白(源自四个赖氨酸残基的锁链素)中形成。编码lox酶的基因已从多种生物体中克隆(hamalainen等人，genomics 11:508,1991；trackman等人，biochemistry 29:4863,1990；通过引用并入本文)。人赖氨酰氧化酶序列的残基153-417和残基201-417已被证明对催化功能很重要。有四种lox样亚型，称为loxl1、loxl2、loxl3和loxl4。
[0056]
巨噬细胞：一类吞噬和降解细胞碎片、异物、微生物和癌细胞的白细胞。除了它们在吞噬中的作用之外，这些细胞在发育、组织维持和修复以及先天免疫和适应性免疫中均发挥重要作用，因为它们招募和影响其他细胞，包括免疫细胞，例如淋巴细胞。巨噬细胞可以以多种表型存在，包括被称为m1和m2的表型。主要发挥促炎功能的巨噬细胞被称为m1巨噬细胞(cd86

/cd68

)，而减少炎症并促进和调节组织修复的巨噬细胞被称为m2巨噬细胞(cd206

/cd68

)。识别巨噬细胞各种表型的标志物因物种而异。应该注意的是，巨噬细胞表型由介于m1和m2极端之间的光谱表示。f4/80(由粘附g蛋白偶联受体e1(adgre1)基因编码)是巨噬细胞标志物，参见2018年4月6日的登录号np_001243181.1和2018年3月5日的np_001965，两者均通过引用并入本文。人们认为mbv具有调节巨噬细胞表型的能力，从而导致m2样、调节或促重塑巨噬细胞的增加。因此，在受试者中，mbv可用于诱导巨噬细胞中的m2表型并抑制m1巨噬细胞。
[0057]
microrna:长度为约17至约25个核苷酸碱基的非编码小rna，通常通过抑制靶mrna翻译在转录后调节基因表达。mirna可以作为负调节因子起作用，使得更大量的特定mirna将与更低水平的靶基因表达相关。mirna有三种形式，初级mirna(pri-mirna)、早熟mirna(pre-mirna)和成熟mirna。初级mirna(pri-mirna)以约数百个碱基至超过1kb的茎环结构的转录本形式表达。pri-mirna转录本在细胞核中被称为drosha的rnase ii核酸内切酶切割，该酶切割靠近茎环基部的茎的两条链。drosha以交错切割方式切割rna双链体，在3'末端留下5'磷酸酯和2个核苷酸突出端。裂解产物，早熟mirna(pre-mirna)长约60至约110个核苷酸，具有以折叠方式形成的发夹结构。pre-mirna通过ran-gtp和exportin-5从细胞核转运到细胞质。pre-mirna在细胞质中经另一种称为dicer的rnase ii核酸内切酶进一步加工。dicer识别5'磷酸酯和3'突出端，并在茎环连接处将环切掉以形成mirna双链体。mirna双链体与rna诱导的沉默复合体(risc)结合，其中反义链优先降解，正义链成熟的mirna将
risc引导至其靶位点。成熟mirna是mirna的生物活性形式，长度为约17至约25个核苷酸。
[0058]
多发性硬化症(ms)：经典地描述为在时间和空间上传播的中枢神经系统白质疾病的自身免疫性疾病，其在80-85％的患者中表现为复发-缓解型疾病。它是慢性、典型的进行性疾病，涉及对大脑和脊髓中的神经细胞鞘造成损害。诊断可以通过脑和脊髓磁共振成像(mri)、体感诱发电位分析和脑脊液分析来检测免疫球蛋白的量或寡克隆带的增加。mri是特别灵敏的诊断工具。指示ms存在或进展的mri异常包括t2加权和液体衰减反转恢复图像上的高信号白质信号、活动病灶的钆增强、低强度“黑洞”(代表神经胶质增生和轴突病理)和基于t1加权的脑萎缩研究。系列mri研究可用于指示疾病进展。ms患者的状态可以通过对ms患者的大脑中磁共振(mri)活动的纵向每月随访来评估。mri为小队列患者的i/ii期临床试验提供了一组独特的结局测量方法，因此非常适合为新治疗策略的原理证明建立数据(例如，参见harris等人，ann.neurol.29:548-555,1991；macfarland等人，ann.neurol.32:758-766,1992；stone等人，ann.neurol.37:611-619,1995)。
[0059]
复发-缓解型多发性硬化症是ms的临床病程，其特征是明确定义的急性发作，伴有完全或部分恢复，并且发作之间没有疾病进展。在缓解期间，所有症状均可能消失，或者某些症状可能持续并成为永久性症状。然而，在缓解期间疾病没有明显的进展。
[0060]
继发性进行性多发性硬化症是ms的临床病程，其初始为复发-缓解，然后以可变速度进展，伴随偶尔复发和轻微缓解。原发性进行性多发性硬化症初始以进行性形式出现。
[0061]
ms的症状包括麻木、言语和肌肉协调障碍、视力模糊和严重疲乏。
[0062]
ms的治疗包括干扰素β-1a、干扰素β-1b、醋酸格拉替雷、米托蒽醌、那他珠单抗、芬戈莫德、特立氟胺、富马酸二甲酯、阿仑单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、西尼莫德、克拉屈滨、奥瑞珠单抗、利妥昔单抗和替代/补充药物。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗ms。
[0063]
纳米囊泡：细胞外囊泡，其是直径为约10至约1,000nm的纳米颗粒。纳米囊泡是脂质膜结合颗粒，其在其他分子之中携带生物活性信号分子(例如microrna、蛋白)。通常，纳米囊泡由脂质双层限制，并且生物分子被包封和/或可以嵌入双层中。因此，纳米囊泡包括被质膜包围的腔体。可以基于直径、亚细胞来源、密度、形状、沉降速率、脂质组成、蛋白标志物、核酸含量和来源(例如来自细胞外基质或分泌)来区分不同类型的囊泡。纳米囊泡可以通过其来源进行识别，例如来自ecm(见上文)的基质结合纳米囊泡、蛋白含量和/或mir含量。
[0064]“外泌体”或“液相细胞外囊泡(ev)”是由细胞分泌的膜囊泡，直径范围为10至150nm。通常，晚期内体或多泡体含有腔内囊泡，这些腔内囊泡由囊泡从有限的内体膜向内出芽和分裂成这些包封的囊泡而形成。然后，在与质膜融合后的胞吐作用期间，这些腔内囊泡从多泡体腔释放到细胞外环境中，通常释放到体液中，例如血液、脑脊液或唾液中。当一段膜内陷并被内吞时，外泌体在细胞内产生。被分解成更小囊泡并最终从细胞中排出的内化片段含有蛋白和rna分子，例如mrna和mirna。血浆来源的外泌体很大程度上缺乏核糖体rna。细胞外基质来源的外泌体包括特定的mirna和蛋白组分，并且已被证明存在于几乎所有体液中，例如血液、尿液、唾液、精液和脑脊液。外泌体可以表达cd11c、cd63、cd81和/或cd9，因此可以是cd11c

和/或cd63

和/或c81

和/或cd9

。外泌体的表面没有高水平的赖氨酰氧化酶。
[0065]“源自ecm的纳米囊泡”、“基质结合纳米囊泡”、“mbv”或“ecm来源的纳米囊泡”均指细胞外基质中存在的相同膜结合颗粒，尺寸范围为10nm-1000nm，其含有生物活性信号分子，例如影响细胞行为的蛋白、脂质、核酸、生长因子和细胞因子。这些术语可互换使用，并且是指相同囊泡。这些纳米囊泡嵌入并结合至ecm内，而不是简单地附接在表面或在体液中自由循环。这些纳米囊泡能够抵抗苛刻的分离条件，例如冻融和蛋白酶(例如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k和胶原酶)消化，以及经洗涤剂消化。mbv与其他细胞外囊泡(包括外泌体)不同，并且具有与外泌体不同的磷脂成分。在某些情况下，基于缺乏通常归因于外泌体的某些标志物，mbv也可以与外泌体区分。在一些实施方案中，mbv的特征在于蛋白表达或脂质含量的以下一种或更多种特征：
[0066]
(i)mbv可能不表达cd63和/或cd81和/或cd9中的一种或更多种，或与其他囊泡(例如外泌体)相比，mbv具有低水平或几乎无法检出水平的cd63和/或cd81和/或cd9(cd63
lo
和/或cd81
lo
和/或cd9
lo
)(参见，例如，实施例1)。多种方法可用于区分mbv中cd63和/或cd81和/或cd9的低表达、几乎无法检出或不存在表达，例如，基于抗体的方法，例如western印迹或流式细胞术(参见，例如，bashashati和brinkman，adv bioinformatics,2009:584603)。在一些实施方案中，与其他囊泡相比，cd63和/或cd81和/或cd9的mbv表达被认为较低或几乎无法检出，其中mbv中cd63和/或cd81和/或cd9的表达比其他囊泡(例如外泌体)的平均表达低至少一个标准偏差或至少两个标准偏差；
[0067]
(ii)mbv具有的磷脂含量其中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合；
[0068]
(iii)mbv具有的磷脂含量其中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(sm)；
[0069]
(iv)mbv具有的磷脂含量其中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(pe)；
[0070]
(v)mbv具有的磷脂含量其中15％或更多的总磷脂含量包括磷脂酰肌醇(pi)，百分比代表脂质浓度的百分比。
[0071]
在一些实施方案中，mbv的特征在于所有以下特征：
[0072]
(i)不表达cd63和/或cd81和/或cd9中的一种或更多种，或具有低水平或几乎无法检出水平的cd63和/或cd81和/或cd9(cd63
lo
和/或cd81
lo
和/或cd9
lo
)(进一步如上所述)；
[0073]
(ii)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合；
[0074]
(iii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(sm)；
[0075]
(iv)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(pe)；和
[0076]
(v)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(pi)。
[0077]
在一些实施方案中，mbv的特征在于所有以下特征：
[0078]
(i)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合；
[0079]
(ii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(sm)；
[0080]
(iii)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(pe)；和
[0081]
(iv)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(pi)。
[0082]
在一些实施方案中，mbv的特征在于以下特征中的一种或更多种：
[0083]
(i)磷脂含量中至少55％的总磷脂包含磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合；
[0084]
(ii)磷脂含量中10％或更少的总磷脂包含鞘磷脂(sm)的；
[0085]
(iii)磷脂含量中20％或更少的总磷脂包含磷脂酰乙醇胺(pe)；和
[0086]
(iv)磷脂含量中15％或更多的总磷脂含量是磷脂酰肌醇(pi)。
[0087]
从中分离mbv的ecm可以是来自组织的ecm，可以从培养的细胞中产生，或者可以购自商业来源。
[0088]
天疱疮：影响皮肤和粘膜的自身免疫性疾病。针对桥粒芯蛋白形成自身抗体，其通过桥粒形成相邻表皮细胞之间的附接。自身抗体攻击桥粒芯蛋白，其将细胞与表皮分离(“棘层松解症”)，形成水疱，该水疱脱落并变成疮；水疱可以覆盖皮肤的重要区域。包括多种天疱疮类型，例如寻常型天疱疮、落叶型天疱疮、表皮内中性粒细胞iga皮肤病、副肿瘤性天疱疮和地方性落叶型天疱疮。天疱疮的治疗包括外用类固醇(例如氯倍他索)、病灶内注射类固醇(例如地塞米松)、免疫抑制药物(例如或麦考酚)、血清或血浆合并产品(例如静脉内注射丙种球蛋白(ivig)，尤其是用于重度天疱疮，例如副肿瘤性天疱疮)和生物制剂(例如或利妥昔单抗，特别是用于顽固性寻常型天疱疮的重度病例)。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗天疱疮。
[0089]
类天疱疮：表现为皮肤起疱的罕见自身免疫性疾病。类天疱疮表现出类似天疱疮，但不包括棘层松解症。类天疱疮在女性和超过60岁的人群中更为常见。包括各种类型的类天疱疮，例如igg介导的类天疱疮，例如妊娠、大疱和瘢痕性类天疱疮，以及iga介导的类天疱疮，例如iga介导的免疫大疱性疾病。治疗可以包括或利妥昔单抗、皮质类固醇(例如外用皮质类固醇和全身性皮质类固醇)、糖皮质激素节制药物、免疫抑制药物、抗炎药物、生物疗法和静脉内注射免疫球蛋白。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗类天疱疮。
[0090]
药学上可接受的载体：可用于要求保护的药物制剂的药学上可接受的载体是常规的。remington制药科学，e.w.martin,mack出版公司，easton，pa，第15版(1975)描述了适用于本文公开的融合蛋白的药物递送的组合物和制剂。
[0091]
通常，载体的性质将取决于所采用的特定施用方式。例如，肠胃外制剂通常包含可注射流体，其包括药学上和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、葡萄糖水溶液、甘油等作为溶媒。对于固体组合物(例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式)，常规的无毒固体载体可以包括例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物中性载体之外，待施用的药物制剂可以包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。
[0092]
药剂：当适当地施用于受试者或细胞时能够诱导期望的治疗或预防效果的化合物或组合物。
[0093]
磷脂：一类脂质，其结构由两个疏水脂肪酸尾和由磷酸基团组成的亲水头组成。磷脂的主要类别包括磷脂酰胆碱(pc)、磷脂酰乙醇胺(pe)、磷脂酰肌醇(pi)、磷脂酰丝氨酸(ps)、磷脂酰甘油(pg)、鞘磷脂(sm)、心磷脂(cl)、磷脂酸(pa)和双-单酰基甘油磷酸酯(bmp)。可以以多种方式测量磷脂。例如，可以使用基于lc-ms的全局脂质组学和氧化还原脂质组学。在一些实施方案中，特定磷脂含量表示为总磷脂(例如mbv中的总磷脂)的百分比浓度，其中百分比浓度为重量/重量。
[0094]
多核苷酸：任何长度的核酸序列(例如线性序列)。因此，多核苷酸包括寡核苷酸，以及染色体中发现的基因序列。“寡核苷酸”是通过天然磷酸二酯键连接的多个连接核苷酸。寡核苷酸是长度为6至300个核苷酸的多核苷酸。寡核苷酸类似物是指功能类似于寡核
苷酸但具有非天然存在部分的部分。例如，寡核苷酸类似物可以含有非天然存在的部分，例如改变的糖部分或糖间键，例如硫代磷酸酯寡脱氧核苷酸。天然存在的多核苷酸的功能类似物可以与rna或dna结合，并且包括肽核酸(pna)分子。
[0095]
银屑病：特征为皮肤异常斑块，例如发红或发紫、干燥、发痒和鳞状斑块，以及皮肤表皮层异常过度和快速生长的自身免疫性疾病。银屑病症状的范围可以从小的局部斑块至全身覆盖。包括各种类型的银屑病，例如斑块型、点滴型、反向型、脓疱型和红皮型银屑病。潜在机制涉及免疫系统对皮肤细胞的反应，并且治疗可以包括类固醇乳膏、维生素d3乳膏、紫外线和免疫系统抑制药物，例如甲氨蝶呤。银屑病与银屑病关节炎、淋巴瘤、心血管疾病、克罗恩氏病和抑郁的风险增加有关。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗银屑病。银屑病突发可由干燥或寒冷天气、应激或皮肤外伤引发，并导致形成该病症独特的干燥、发痒的斑块。
[0096]
纯化的：术语“纯化的”不需要绝对纯度；相反，它是旨在作为相对术语。因此，例如，纯化的核酸分子制剂是其中所指的核酸比细胞内其天然环境中的核酸更纯的制剂。例如，纯化核酸制剂，使得核酸占制剂总蛋白含量的至少50％。类似地，纯化的mbv制剂是其中外泌体比在包括细胞的环境中更纯的制剂，其中存在微泡和外泌体。纯化的核酸或mbv群的纯度分别大于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或不含其他核酸或细胞组分。
[0097]
预防或治疗疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的发展，例如在已知易患病的人中。已知易患病的人的实例是具有家族病史的人，或已暴露于使受试者易患病况的因素的人。“治疗”是指在疾病或病理状况开始发展后改善其体征或症状的治疗干预。
[0098]
缓解：特征为没有临床上可检出的疾病症状或体征和/或没有疾病进展的疾病状态。构成缓解的原因可能根据所讨论的自身免疫性病症而异。
[0099]
复发：在缓解期后疾病体征或症状或疾病进展的恢复或者在症状改善期后疾病体征或症状的恶化。
[0100]
复发-缓解型疾病：特征为症状改善期和缺乏疾病进展(缓解阶段)，随后是病症的症状恶化和疾病进展的体征(包括受影响组织的炎症增加)的自身免疫性疾病。多发性硬化症、系统性红斑狼疮、炎症性肠病(包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎)、银屑病和类风湿性关节炎是复发-缓解型自身免疫性疾病的实例。
[0101]
硬皮病：可能改变皮肤、血管、肌肉和内脏器官的自身免疫性疾病。该疾病可以是局部的(例如皮肤)或累及其他器官。症状可以包括皮肤增厚、僵硬、疲乏和冷暴露时手指或脚趾的血液流动不畅。包括各种类型的硬皮病，例如局部硬皮病，例如，局部硬斑病、硬斑病-硬化萎缩性苔藓重叠(lsa)、全身硬斑病、pasini和pierini皮萎缩病、全硬化硬斑病、深硬斑病、线状硬皮病和系统性硬皮病，例如，crest综合征和进行性系统性硬化症。潜在机制涉及结缔组织的异常生长，这可能是由于身体的免疫系统攻击健康组织所致。该病况最常开始于中年，女性比男性更容易受影响。
[0102]
治疗可以包括皮质类固醇、甲氨蝶呤、非甾体抗炎药(nsaid)、血管扩张剂(例如钙通道阻滞剂、α阻滞剂、5-羟色胺受体拮抗剂、血管紧张素ii受体抑制剂、他汀类药物、局部硝酸盐或伊洛前列素)、磷酸二酯酶5抑制剂(例如西地那非)、波生坦、四环素、环磷酰胺、硫唑嘌呤、内皮素受体拮抗剂、前列腺素、抗酸剂、促动力剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管
紧张素ii受体拮抗剂、免疫抑制剂(例如硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、环磷酰胺、麦考酚酯、静脉内注射免疫球蛋白、利妥昔单抗、西罗莫司、阿法西普(alefacept)和酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼)、内皮素受体拮抗剂、β-聚糖肽、卤夫酮(halofuginone)、巴利昔单抗、阿仑单抗、阿巴西普和造血干细胞移植。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗硬皮病。
[0103]
受试者：人和非人动物，包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、小鼠、兔、羊、犬、猫、马、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。在所述方法的许多实施方案中，受试者是人。“受试者”与术语“患者”可互换使用。
[0104]
系统性红斑狼疮(sle)：sle也称为狼疮，是其中身体的免疫系统(例如抗核抗体)错误地攻击健康组织的自身免疫性疾病。症状范围从轻度至重度，并且可以在受试者之间变化以及随时间(包括例如疾病期，或突发期，以及几乎没有症状的缓解期)而变化。常见症状包括关节疼痛和肿胀、发热、胸痛、脱发、口腔溃疡、淋巴结肿大、疲倦感和红疹(例如脸上)。还可能发生关节、皮肤、肾脏、脑、心脏或肺的炎症。它最常见于15至45岁之间，但可能影响的年龄范围很广。育龄女性以及非洲、加勒比地区和中国裔女性具有更高的风险。
[0105]
治疗可以包括他克莫司、改善疾病的抗风湿药(dmard，例如皮质类固醇；抗疟药，例如羟氯喹和免疫抑制剂，例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤；羟氯喹；环磷酰胺；和麦考酚酸)、免疫抑制药物、镇痛剂(例如非甾体抗炎药或nsaid，例如吲哚美辛和双氯芬酸)、阿片类药物、静脉内注射免疫球蛋白(ivig)、生活方式改变(例如避免阳光和导致疲乏的活动)、肾移植(例如用于治疗狼疮性肾炎)和抗凝剂(例如抗磷脂综合征)。在一些实施方案中，本文公开的组合物和方法可用于治疗sle。
[0106]
治疗有效量：足以在接受治疗的受试者中获得期望的效果的一定量的特定物质(例如mbv)。当向受试者施用时，通常使用的剂量将达到靶组织浓度(例如，在骨骼或关节中)，该浓度已被证明可实现期望的体外效果。
[0107]“总磷脂”或“总磷脂含量”：对于mbv，是指给定量的分离的mbv(即分离自ecm的mbv)中存在的所有磷脂的总和。mbv可以例如通过脱细胞的ecm的酶消化和差速离心进行分离。总磷脂含量可以通过例如基于lc-ms的全局脂质组学和氧化还原脂质组学等方法确定。总磷脂含量以重量测量。总磷脂含量的百分比是指基于重量/重量的百分比浓度。
[0108]
移植：将生物相容性物质(例如mbv)植入有需要的受试者体内。
[0109]
治疗(treating、treatment和therapy)：减轻或改善损伤、病理或病况的任何成功或成功迹象，包括任何客观或主观参数，例如减轻、缓解、减少症状或使患者更耐受病况、减缓退化或衰退的速度、使退化的终点虚弱程度降低，或改善受试者的身体或精神健康。治疗可以通过客观或主观参数进行评估；包括身体检查、神经系统检查或精神评价的结果。
[0110]
除非另有说明，否则根据常规用法使用技术术语。分子生物学中常用术语的定义可见于benjamin lewin,genes v,由牛津大学出版社出版,1994(isbn 0-19-854287-9)；kendrew等人(编辑)，the encyclopedia of molecular biology,由blackwell科学公司出版,1994(isbn 0-632-02182-9)；和robert a.meyers(编辑)，molecular biology and biotechnology:a comprehensive desk reference,由vch出版公司出版,1995(isbn 1-56081-569-8)。
[0111]
概述
[0112]
本文公开了mbv在施用于患有此类病症的受试者时具有治疗自身免疫性病症的能力。具体地，已发现全身递送的mbv在治疗自身免疫性病症的症状方面具有与将mbv局部施用于受影响的组织所获得的治疗效果相当的治疗效果。因此，这将mbv定位为针对自身免疫性病症的独特全身性疗法。
[0113]
本文还公开了对于一些病况，例如但不限于银屑病，局部施用mbv特别有效。例如，在银屑病的治疗中，外用皮肤施用mbv特别有效。
[0114]
如以下实施例2所述，在大鼠类风湿性关节炎模型中，通过尾静脉静脉内注射全身施用或通过关节周围注射局部施用mbv的大鼠的关节炎评分的改善与接受关节周围注射甲氨蝶呤的大鼠的关节炎评分(治疗类风湿性关节炎的金标准)相当。然而，出乎意料地发现，无论是接受全身注射还是局部注射，大鼠之间的关节炎评分改善相当。理论上，全身注射mbv将导致稀释效应，因此未导致任何显著水平的局部治疗效果，但所见情况相反。因此，全身施用mbv具有治疗许多不局限于身体某一部位或不适合局部治疗的自身免疫性病症的治疗潜力。许多自身免疫性病症引起全身性炎症或者是影响许多组织的全身性疾病。因此，局部治疗不是有效或高效的治疗方法。在影响皮肤的病症(例如天疱疮)中，如果皮肤的重要区域受疾病影响，则局部施用(例如外用施用)可能不实用，并且在许多情况下，如果受影响的受试者无法到达受影响的区域以进行局部治疗，则他们可能无法将其局部应用到皮肤上，因此全身性治疗选择可能更有效且实用。此外，在疾病(如类风湿性关节炎)中，将治疗剂局部注射到受影响的关节中是非常痛苦的，并且身体各个部位的多个关节可能会受到影响。因此，全身性治疗的选择不仅提供了更舒适的治疗选择，而且提供了用于治疗由自身免疫性病症引起的全身性炎症的更有效机制。
[0115]
虽然设想了局部施用来治疗本文公开的自身免疫性病症，但当mbv以全身性疗法施用时，患有这些病症的受试者获得独特的治疗获益，特别是当病症影响局部施用无法接近的敏感组织或由于其他原因不能通过局部施用进行治疗时，或者当病症影响整个身体的部位和组织时(例如，全身性疾病)。在治疗在身体多于一个部位发现症状的自身免疫性病症时，使用mbv的全身性治疗为此类病症提供了高效且有效的治疗。尽管设想了其他全身施用方法，但静脉内全身施用可用于实现上述治疗效果。
[0116]
本文公开了治疗有需要的受试者的自身免疫性病症(例如慢性自身免疫性病症)的方法，该方法包括向该受试者施用药物制剂，该药物制剂包括治疗有效量的源自细胞外基质的分离的基质结合囊泡(mbv)(例如源自膀胱、小肠、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、骨、肌肉、胰腺、胃、脾、结肠、脂肪组织或食道的细胞外基质的mbv，例如，mbv源自膀胱基质(ubm)、小肠粘膜下层(sis)或膀胱粘膜下层(ubs)，例如源自选自人、猴、猪、牛或羊的哺乳类脊椎动物)，从而治疗该自身免疫性病症。在一些实施方案中，该施用是全身施用。
[0117]
在一些实施方案中，该自身免疫性病症是非眼部自身免疫性病症。在一些实施方案中，该自身免疫性病症不是类风湿性关节炎、硬皮病或溃疡性结肠炎。在一些实施方案中，该自身免疫性病症是阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性脑炎、自身免疫性肝炎、乳糜泻、克罗恩氏病、肺出血-肾炎综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、免疫性血小板减少症、iga肾病、炎症性肠病(ibd)、多发性硬化症、重症肌无力、类天疱疮、天疱疮、2型多腺体自身免疫综合征、银屑病、银屑病关节炎、类风湿
性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎或未分化结缔组织病(uctd)。在其他实施方案中，该自身免疫性病症是阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性脑炎、自身免疫性肝炎、乳糜泻、克罗恩氏病、肺出血-肾炎综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、免疫性血小板减少症、iga肾病、多发性硬化症、重症肌无力、类天疱疮、天疱疮、2型多腺体自身免疫综合征、银屑病、银屑病关节炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、1型糖尿病或未分化结缔组织病(uctd)。
[0118]
在一些实施方案中，该自身免疫性病症是类风湿性关节炎。在具体的非限制性实例中，该施用是全身施用。在其他实施方案中，该自身免疫性病症是硬皮病。在更多实施方案中，该自身免疫性病症是溃疡性结肠炎。在进一步的实施方案中，该自身免疫性病症是天疱疮。在一些实施方案中，该自身免疫性病症是类天疱疮。在其他实施方案中，该自身免疫性病症是克罗恩氏病。在进一步的实施方案中，该自身免疫性病症是银屑病。在更多实施方案中，该自身免疫性病症是银屑病关节炎。在又其他实施方案中，该自身免疫性病症是多发性硬化症。在一些实施方案中，该自身免疫性病症是系统性红斑狼疮。在一些实施方案中，该自身免疫性病症是自身免疫性脑炎。
[0119]
在任何这些实施方案中，该方法可以包括选择受试者进行治疗。该施用可以是全身施用或局部施用。
[0120]
在本文公开的治疗自身免疫性病症的方法中，该受试者可以在施用mbv后长时间获得治疗获益。在一些实例中，该受试者从mbv施用获得持续至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月的时间段的治疗获益。在具体的非限制性实例中，从施用获得的治疗获益持续至少一周。在具体的实例中，从施用获得的治疗获益持续至少两周。在具体的非限制性实例中，从施用获得的治疗获益持续至少一个月。在具体的非限制性实例中，从施用获得的治疗获益持续至少两个月。在具体的实例中，从施用获得的治疗获益持续至少三个月或更长时间。在一些非限制性实例中，治疗获益是在施用时存在的疾病或病症的症状减轻。在一些非限制性实例中，治疗获益是受试者中自身免疫性病症引起的炎症水平的降低超过mbv施用前自身免疫性病症引起的炎症水平。在一些非限制性实例中，治疗获益是疾病或病症的缓解。在一些非限制性实例中，治疗获益是在该时间段内疾病或病症的症状突发减少或者疾病或病症的症状突发消除。在一些实施方案中，公开的方法减少疾病(例如但不限于类风湿性关节炎、多发性硬化症或系统性红斑狼疮)突发。
[0121]
在一些实施方案中，施用可以是全身施用。全身施用可以是静脉内施用、口服施用、肠内施用、肠胃外施用、鼻内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用、唇下施用、腹腔施用、皮下施用或肌内施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是静脉内施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是口服施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是肠内施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是肠胃外施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是鼻内施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是直肠施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是舌下施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是口腔施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是唇下施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是腹腔施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是皮下施用。在具体的非限制性实例中，该全身施用是肌内施用。
[0122]
源自细胞外基质(ecm)的纳米囊泡
[0123]
源自ecm的纳米囊泡(也称为基质结合纳米囊泡，mbv)通常描述于pct公开号wo 2017/151862和wo2018/204848中，其通过引用并入本文。公开了纳米囊泡嵌入细胞外基质中。这些mbv可以被分离并具有生物活性。因此，这些mbv可以单独或与另一种ecm一起用于治疗目的。细胞外基质是结构和功能生物分子和/或生物大分子的复杂混合物，包括但不限于结构蛋白、特化蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖和生长因子，其围绕和支持哺乳动物组织内的细胞，除非另有说明，否则它们是无细胞的。通常，公开的mbv嵌入任何类型的细胞外基质(ecm)中，并且可以从该位置分离。因此，mbv不能可拆分地存在于ecm表面，并且不是外泌体。
[0124]
细胞外基质在例如但不限于美国专利号4,902,508；4,956,178；5,281,422；5,352,463；5,372,821；5,554,389；5,573,784；5,645,860；5,771,969；5,753,267；5,762,966；5,866,414；6,099,567；6,485,723；6,576,265；6,579,538；6,696,270；6,783,776；6,793,939；6,849,273；6,852,339；6,861,074；6,887,495；6,890,562；6,890,563；6,890,564；和6,893,666中公开；其各自通过引用以其全文并入。然而，ecm可以由任何组织产生，或由任何体外来源产生，其中ecm由培养的细胞产生并且包含天然ecm的一种或更多种聚合物组分(成分)。ecm制剂可以被认为是“脱细胞的”或“无细胞的”，表示细胞已从源组织或培养物中去除。
[0125]
在一些实施方案中，ecm分离自脊椎动物，例如分离自哺乳类脊椎动物，包括但不限于人、猴、猪、牛、羊等。ecm可以源自任何器官或组织，包括但不限于膀胱、肠(例如小肠或大肠)、心脏、真皮、肝脏、肾脏、子宫、脑、血管、肺、骨、肌肉、胰腺、胃、脾脏、结肠、脂肪组织或食道。在具体的非限制性实例中，细胞外基质分离自食道组织、膀胱(例如膀胱基质或膀胱粘膜下层)、小肠粘膜下层、真皮、脐带、心包、心脏组织或骨骼肌。ecm可以包括从器官获得的任何部分或组织，包括例如但不限于粘膜下层、上皮基底膜、固有膜等。在一个非限制性实施方案中，ecm分离自膀胱。
[0126]
ecm可能包括也可能不包括基底膜。在另一个非限制性实施方案中，ecm包括基底膜的至少一部分。ecm材料可能保留或可能不保留一些构成原始组织的细胞基本组成，例如毛细血管内皮细胞或纤维细胞。在一些实施方案中，ecm含有基底膜表面和非基底膜表面。
[0127]
在一个非限制性实施方案中，ecm从猪膀胱(也称为膀胱基质或ubm)中收获。简言之，ecm通过从哺乳动物(例如猪)中取出膀胱组织并修剪残留的外部结缔组织(包括脂肪组织)进行制备。通过用自来水反复洗涤，去除所有残留的尿液。通过首先将组织浸泡在去上皮溶液中，例如但不限于高渗盐水(例如，1.0n盐水)中，将组织脱层十分钟至四小时的时间段。暴露于高渗盐水溶液可从下面的基底膜去除上皮细胞。任选地，可以将钙螯合剂添加至盐水溶液。初始脱层程序后剩余的组织包括上皮基底膜和远离上皮基底膜的组织层。相对脆弱的上皮基底膜总是因腔体表面上的任何机械磨损而受损和去除。接下来对该组织进行进一步处理以去除大部分腔外组织，但保留上皮基底膜和固有膜。外层浆膜、外膜、粘膜肌层、粘膜下层和大部分粘膜肌层经机械磨损或酶处理(例如，使用胰蛋白酶或胶原酶)的组合从剩余的去上皮组织中去除，然后进行水合和磨损。这些组织的机械去除通过去除肠系膜组织来完成，例如但不限于，adson-brown镊子和metzenbaum剪刀，并使用包裹在湿润纱布中的手术刀手柄或其他刚性物体纵向擦拭移动擦拭肌层和粘膜下层。还设想了涉及切割
刀片、激光和其他组织分离方法的自动化机器人程序。去除这些组织后，产生的ecm主要由上皮基底膜和下层固有膜组成。
[0128]
在另一个实施方案中，通过使用手术刀手柄和湿润纱布进行纵向擦拭移动，通过研磨猪膀胱组织以去除包括浆膜和肌层的外层来制备ecm。在组织段外翻后，使用相同的擦拭动作将粘膜的腔部分从下面的组织脱层。注意防止粘膜下层穿孔。去除这些组织后，所得的ecm主要由粘膜下层组成(参见美国专利号9,277,999的图2，其通过引用并入本文)。
[0129]
ecm还可以制成粉末。这种粉末可以根据gilbert等人，biomaterials 26(2005)1431-1435的方法制备，其通过引用以其全文并入本文。例如，ubm片可以被冻干，然后切成小片浸入液氮中。然后可以粉碎速冻材料，使颗粒足够小，可以放入旋转刀磨机中，将ecm磨成粉末。类似地，通过在ecm组织内沉淀nacl，材料将破碎成大小均匀的颗粒，可以快速冷冻、冻干和粉化。
[0130]
在一个非限制性实施方案中，ecm源自小肠粘膜下层或sis。市售制剂包括但不限于surgisis
tm
、surgisis-es
tm
、stratasis
tm
和stratasis-es
tm
(cook urological inc.；indianapolis,ind.)和graftpatch
tm
(organogenesis inc.；canton mass.)。在另一个非限制性实施方案中，ecm源自真皮。市售制剂包括但不限于pelvicol
tm
(在欧洲以permacol
tm
出售；bard,covington,ga.)、repliform
tm
(microvasive；boston,ma)和alloderm
tm
(lifecell；branchburg,n.j.)。在另一个实施方案中，ecm源自膀胱。可商购获得的制剂包括但不限于ubm(acell corporation；jessup,md.)。
[0131]
mbv可以使用以下公开的方法源自(释放自)细胞外基质。例如，方法在quijano等人，tissue engineering，c部分，doi.org/10.1089/ten.tec.2020.0243，2020年10月3日中公开，其通过引用并入本文。
[0132]
在一些实施方案中，ecm经酶(例如胃蛋白酶、胶原酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、释放酶或蛋白酶k)消化，并且mbv被分离。在其他实施方案中，mbv通过以下从ecm释放和分离：通过使用溶液(例如盐酸甘氨酸、柠檬酸、氢氧化铵)改变ph值，使用螯合剂(例如但不限于edta、egta)，通过离子强度和或使用盐的离液效应，例如，但不限于氯化钾(kcl)、氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠，或通过将ecm暴露于变性条件(如盐酸胍或尿素)。
[0133]
在特定实例中，mbv在经酶(例如胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、蛋白酶k、盐溶液或胶原酶)消化ecm之后制备。ecm可以被冻融，或受机械降解。
[0134]
在一些实施方案中，在mbv上不能检测到cd63、cd81和/或cd9的表达。因此，在一些实施方案中，mbv不表达cd63和/或cd81和/或cd9。在一个具体的实例中，在纳米囊泡上不能检测到cd63、cd81和cd9。在其他实施方案中，mbv具有几乎不可检出的cd63、cd81和cd9水平，例如可通过western印迹检测的水平。这些mbv是cd63
lo
cd81
lo
cd9
lo
。在其他实施方案中，mbv不表达具有可检出水平的cd63、cd81或cd9中的一种或更多种。在其他实施方案中，mbv表达几乎无法检出水平的cd63、cd81或cd9中的一种或更多种。使用例如特异性结合cd63、cd81和cd9的抗体，本领域技术人员可以容易地鉴定为cd63
lo
和/或cd81
lo
和/或cd9
lo
的mbv。可以使用程序(例如荧光激活细胞分选(facs)和荧光标记抗体)来确定这些低水平的标志物，以确定低和高量cd63、cd81和cd9的阈值。公开的mbv不同于纳米囊泡，例如外泌体，由于它们存在于生物体液中，它们可能暂时附接在ecm表面，因为体内的mbv与ecm结合，而在生物体液中没有发现。
[0135]
例如，与外泌体相比，mbv具有独特的磷脂含量。在一些实施方案中，mbv的总磷脂含量中至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、85％或90％，或约50％-90％、50％-65％、50％-60％、50％-70％、60％-70％、60％-90％或70％-90％的磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量为至少55％的磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量为至少60％的磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合。在一些实施方案中，mbv的磷脂含量包括小于8:1(例如小于7:1、小于6:1、小于5:1、小于4:1、小于3:1或小于2:1)的磷脂酰胆碱(pc)与磷脂酰肌醇(pi)比率。在一些实施方案中，mbv的磷脂含量包括范围为0.5-1:1、或范围为1:0.5-1、或范围为0.5-1:2、或范围为2:0.5-1、或范围为0.8-1:1、或范围为1:0.8-1的磷脂酰胆碱(pc)与磷脂酰肌醇(pi)比率。在一个实施方案中，mbv的磷脂含量包括约1:1的磷脂酰胆碱(pc)与磷脂酰肌醇(pi)的比率。在具体实施方案中，mbv的磷脂含量包括约0.9:1的磷脂酰胆碱(pc)与磷脂酰肌醇(pi)的比率。
[0136]
在一些实施方案中，mbv的总磷脂含量中15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％或更少，或约5％-10％、5％-15％、10％-15％或8％-12％的鞘磷脂(sm)。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中10％或更少的鞘磷脂(sm)。在一些实施方案中，总磷脂含量中15％或更少的鞘磷脂(sm)、14％或更少的鞘磷脂、13％或更少的鞘磷脂、12％或更少的鞘磷脂、11％或更少的鞘磷脂、10％或更少的鞘磷脂、9％或更少的鞘磷脂、8％或更少的鞘磷脂、7％或更少的鞘磷脂、6％或更少的鞘磷脂、5％或更少的鞘磷脂、或4％或更少的鞘磷脂。
[0137]
在一些实施方案中，mbv的总磷脂含量中20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％或10％或更少，或约10％-20％、15％-20％、14％-18％或12％-16％的磷脂酰乙醇胺(pe)。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中20％或更少的磷脂酰乙醇胺(pe)。
[0138]
在一些实施方案中，mbv的总磷脂含量中5％、10％、12％、15％、18％、20％、25％或30％或更高，或约5％-30％、10％-20％、10-25％、15％-25％或12％-18％的磷脂酰肌醇(pi)。在具体实施方案中，mbv包括磷脂含量中15％或更高的磷脂酰肌醇(pi)。
[0139]
在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量包括15％或更多的磷脂酰肌醇、20％或更少的磷脂酰乙醇胺以及10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中15％或更多的磷脂酰肌醇以及20％或更少的磷脂酰乙醇胺。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中15％或更多的磷脂酰肌醇以及10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量包括20％或更少的磷脂酰乙醇胺以及10％或更少的鞘磷脂。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中多于15％的磷脂酰肌醇、20％或更少的磷脂酰乙醇胺、10％或更少的鞘磷脂，以及至少55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合。在一个实施方案中，mbv的总磷脂含量中至少55％的磷脂酰胆碱(pc)和磷脂酰肌醇(pi)组合以及10％或更少的鞘磷脂(sm)。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中至少55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合以及多于15％的磷脂酰肌醇。在具体实施方案中，mbv的总磷脂含量中55％的磷脂酰肌醇和磷脂酰胆碱组合以及20％或更少的磷脂酰乙醇胺。
[0140]
mbv还可以包括赖氨酰氧化酶(lox)。通常，源自ecm的纳米囊泡比外泌体具有更高的lox含量。lox在mbv的表面上表达。nano-lc ms/ms蛋白质组学分析可用于检测lox蛋白。可以进行lox定量(参见，例如，hill rc等人，mol cell proteomics.2015；14(4):961-73，其通过引用方式以其全文并入本文)。
[0141]
在某些实施方案中，mbv包含一种或更多种mirna。在具体的非限制性实例中，mbv包含mir-143、mir-145和mir-181中的一种、两种或所有三种。mir-143、mir-145和mir-181是本领域已知的。
[0142]
该mir-145核酸序列在mirbase登录号mi0000461中提供，其通过引用并入本文。
[0143]
该mir-145核酸序列是
[0144]
caccuuguccucacgguccaguuuucccaggaaucccuuagaugcuaagauggggauuccuggaaauacuguucuugaggucaugguu(seq id no:1)。该mir-181核酸序列在mirbase登录号mi0000269中提供，其通过引用并入本文。该mir-181核酸序列是：
[0145]
agaagggcuaucaggccagccuucagaggacuccaaggaacauucaacgcugucggugaguuugggauuugaaaaaaaccacugaccguugacuguaccuugggguccuua(seq id no:2)。该mir-143核酸序列在2018年3月30日的ncbi登录号nr_029684.1中提供，其通过引用并入本文。编码mir-143核酸序列的dna是：gcgcagcgcc ctgtctccca gcctgaggtg cagtgctgca tctctggtca gttgggagtc tgagatgaag cactgtagct caggaagaga gaagttgttc tgcagc(seq id no:3)。
[0146]
施用后，mbv保持f4/80(巨噬细胞标志物)和cd-11b在受试者巨噬细胞上的表达。纳米囊泡处理的巨噬细胞主要是f4/80 fizz1 ，表明m2表型。
[0147]
本文公开的mbv可配制成用于药物递送的组合物，并用于生物支架和装置。mbv在pct公开号wo 2017/151862中公开，其通过引用并入本文。
[0148]
从ecm分离mbv
[0149]
为了产生mbv，ecm可以由任何目标细胞产生，或者可以从商业来源使用，见上文。mbv可以由与待治疗的受试者相同的物种产生，或与其不同的物种产生。在一些实施方案中，这些方法包括经酶消化ecm以产生消化的ecm。在具体实施方案中，ecm经胃蛋白酶、弹性蛋白酶、透明质酸酶、胶原酶、金属蛋白酶和/或蛋白酶k中的一种或更多种消化。在具体的非限制性实例中，ecm仅经弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化。在另一个非限制性实例中，ecm未经胶原酶和/或胰蛋白酶和/或蛋白酶k消化。在其他实施方案中，ecm用去污剂处理。在进一步的实施方案中，该方法不包括使用酶。在具体的非限制性实例中，该方法利用离液剂或离子强度来分离mbv，例如盐，例如氯化钾。在另外的实施方案中，ecm可以被操纵以在mbv分离之前增加mbv含量。例如，在quijano等人，组织工程，c部分，doi.org/10.1089/ten.tec.2020.0243，2020年10月3日中公开了用于分离mbv的方法，其通过引用并入本文。
[0150]
在一些实施方案中，ecm经酶消化。ecm可以经酶消化约12至约48小时，例如约12至约36小时。ecm可以经酶消化约12、约24、约36或约48小时。在一个具体的非限制性实例中，ecm在室温下经酶消化。然而，消化可以在约4℃或约4℃至25℃之间的任何温度下进行。通常，ecm在任何温度下经酶消化任何时间长度，足以去除胶原原纤维。消化过程可以因组织来源而异。任选地，在经酶消化之前或之后，通过冻融处理ecm。ecm可以用去污剂(包括离子和/或非离子去污剂)处理。
[0151]
然后处理消化的ecm，例如通过离心，以分离无原纤维的上清液。在一些实施方案中，消化的ecm，例如，以约300至约1000g离心用于第一步骤。因此，消化的ecm可以以约400g至约750g，例如约400g、约450g、约500g或约600g离心。这种离心可以进行约10至约15分钟，例如约10至约12分钟，例如约10、约11、约12、约14、约14或约15分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0152]
mbv包括lox。在一些实施方案中，分离此类mbv的方法包括用弹性蛋白酶和/或金属蛋白酶消化细胞外基质以产生消化的细胞外基质，将消化的细胞外基质离心以去除胶原原纤维残余物从而产生无原纤维上清液，将无原纤维上清液离心以分离固体材料，并将固体材料悬浮于载体中。
[0153]
在一些实施方案中，消化的ecm还可以以约2000g至约3000g离心用于第二步骤。因此，消化的ecm可以以约2,500g至约3,000g，例如以约2,000g、2,500g、2,750g或3,000g离心。该离心可以进行约20至约30分钟，例如约20至约25分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29或约30分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0154]
在另外的实施方案中，消化的ecm可以以约10,000至约15,000g离心用于第三步骤。因此，消化的ecm可以以约10,000g至约12,500g，例如以约10,000g、11,000g或12,000g离心。该离心可以进行约25至约40分钟，例如约25至约30分钟，例如约25、约26、约27、约28、约29、约30、约31、约32、约约33、约34、约35、约36、约37、约38、约39或约40分钟。收集包括消化的ecm的上清液。
[0155]
这些离心步骤中的一个、两个或所有三个可以独立使用。在一些实施方案中，使用所有三个离心步骤。可以重复离心步骤，例如2、3、4或5次。在一个实施方案中，所有三个离心步骤重复三次。
[0156]
在一些实施方案中，消化的ecm以约500g离心约10分钟，以约2,500g离心约20分钟，和/或以约10,000g离心约30分钟。这些步骤(例如所有三个步骤)重复2、3、4或5次，例如3次。因此，在一个非限制性实例中，消化的ecm以约500g离心约10分钟，以约2,500g离心约20分钟，饿以约10,000g离心约30分钟。这三个步骤重复三次。因此，产生无原纤维的上清液。
[0157]
然后将无原纤维的上清液离心以分离mbv。在一些实施方案中，将无原纤维上清液以约100,000g至约150,000g离心。因此，无原纤维上清液以约100,000g至约125,000g，例如约100,000g、约105,000g、约110,000g、约115,000g或约120,000g离心。该离心可以进行约60至约90分钟，例如约70至约80分钟，例如约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90分钟。在一个非限制性实例中，将无纤维的上清液以约100,000g离心约70分钟。收集固体物质，即mbv。然后可以将这些mbv重悬于任何目标载体中，例如但不限于缓冲液。
[0158]
在进一步的实施方案中，ecm未经酶消化。在这些方法中，ecm悬浮于等渗盐溶液中，例如磷酸盐缓冲盐水。然后将盐添加至悬浮液中，使盐的终浓度大于约0.1m。该浓度可以是，例如，至多约3m，例如，约0.1m盐至约3m，或约0.1m至约2m。盐可以是，例如，约0.1m、0.15m、0.2m、0.3m、0.4m、0.7m、0.6m、0.7m、0.8m.、0.9m、1.0m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。在一些非限制性实例中，盐是氯化钾、氯化钠或氯化镁。在其他实施方案中，盐是氯化钠、氯化镁、碘化钠、硫氰酸钠、钠盐、锂盐、铯盐或钙盐。
[0159]
在一些实施方案中，ecm悬浮于盐溶液中约10分钟至约2小时，例如约15分钟至约1小时、约30分钟至约1小时、或约45分钟至约1小时。ecm可以悬浮于盐溶液中约15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115或120分钟。ecm可以在4℃至约50℃的温度下悬浮于盐溶液中，例如但不限于约4℃至约25℃或约4℃至约37℃。在具体的非限制性实例中，ecm在约4℃下悬浮于盐溶液中。在其他具体的非限制性实例中，ecm在约22℃或约25℃(室温)下悬浮于盐溶液中。在进一步的非限制性实例中，ecm在约37
℃下悬浮于盐溶液中。
[0160]
在一些实施方案中，该方法包括以大于约0.4m的盐浓度孵育细胞外基质；将消化后的细胞外基质离心去除胶原原纤维残余物，并分离上清液；离心上清液以分离固体材料；并且将固体材料悬浮于载体中，从而将mbv从细胞外基质中分离。
[0161]
在盐溶液中孵育后，将ecm离心以去除胶原原纤维。在一些实施方案中，消化的ecm还可以以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ecm可以以约2,500g至约4,500g，例如约2,500g、约3,000g、3,500、约4,000g或约4,500g离心。在一个具体的非限制性实例中，离心以约3,500g进行。该离心可以进行约20至约40分钟，例如约25至约35分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟、约31、约32、约33、约34或约35分钟。然后收集上清液。
[0162]
在另外的实施方案中，然后可以将上清液以约100,000至约150,000g离心用于第三步骤。因此，消化的ecm可以以约100,000g至约125,000g，例如以约100,000g、110,000g或120,000g离心。该离心可以进行约30分钟至约2.5小时，例如约1小时至约3小时，例如约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟或约120分钟(2小时)。收集固体材料并悬浮于溶液中，例如缓冲盐水中，从而分离mbv。
[0163]
在又其他实施方案中，将ecm悬浮于等渗缓冲盐溶液中，例如但不限于磷酸盐缓冲盐水。离心或其他方法可用于去除大颗粒(见下文)。然后使用超滤从ecm中分离mbv，约10nm至约10,000nm，例如约10至约1,000nm，例如约10nm至约300nm的颗粒。
[0164]
在具体的非限制性实例中，等渗缓冲盐溶液的总盐浓度约为0.164mm，并且ph为约7.2至7.4。在一些实施方案中，等渗缓冲盐水溶液包括0.002m kcl至约0.164m kcl，例如约0.0027m kcl(磷酸盐缓冲盐水中kcl的浓度)。然后通过超速离心处理该悬浮液。
[0165]
在等渗缓冲盐溶液中孵育后，将ecm离心以去除胶原原纤维。在一些实施方案中，消化的ecm还可以以约2000g至约5000g离心。因此，消化的ecm可以以约2,500g至约4,500g，例如约2,500g、约3,000g、3,500、约4,000g或约4,500g离心。在一个具体的非限制性实例中，离心在约3,500g下进行。该离心可以进行约20至约40分钟，例如约25至约35分钟，例如约20、约21、约22、约23、约24、约25、约26、约27、约28、约29、约30分钟、约31、约32、约33、约34或约35分钟。
[0166]
可以使用并组合微滤和离心以从悬浮液中去除大分子量的材料。在一个实施方案中，使用微滤去除大尺寸分子材料，例如大于200nm。在另一个实施方案中，通过使用离心去除大尺寸材料。在第三个实施方案中，微滤和超速离心均用于去除大分子量材料。从悬浮的ecm中去除大分子量材料，例如大于约10,000nm、大于约1,000nm、大于约500nm或大于约300nm的材料。
[0167]
然后对用于微滤的流出物或上清液进行超滤。因此，收集和利用包括小于约10,000nm、小于约1,000nm、小于约500nm或小于约300nm的颗粒的流出物。然后用截留分子量(mwco)为3,000至100,000的膜对该流出物进行超滤，在该实施例中使用100,000mwco。
[0168]
用于治疗自身免疫性病症的方法
[0169]
本文还公开了用于治疗有需要的受试者的自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、类天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症和/或系统性红斑狼疮等)的方法。这些方法包括选择需要治疗的受试者(例如患有
自身免疫性病症的受试者，例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、类天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、多发性硬化症和/或系统性红斑狼疮)并向该受试者施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)以降低自身免疫应答，从而治疗自身免疫病症。在一些实例中，mbv可以全身施用。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实施方案中，自身免疫性疾病是类风湿性关节炎。在其他实施方案中，mbv经局部施用。在具体的非限制性实例中，自身免疫性疾病是银屑病。
[0170]
受试者可以是兽医受试者或人。在非限制性实例中，受试者是人。受试者可以是哺乳动物。受试者可以是鸟类或家养宠物，例如猫、犬或兔。受试者可以是非人灵长类动物(例如猿猴)或家畜，包括猪、反刍动物、马和家禽。该方法包括选择需要治疗以降低自身免疫应答的受试者并向该受试者施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)。在一些实施方案中，mbv可以全身施用。在其他实施例中，mbv可以局部施用。mbv可以源自与需要降低自身免疫活性的受试者相同或不同的物种。mbv可以是自体的。
[0171]
本文公开的方法可以导致受试者自身免疫活性降低。在一些实例中，自身免疫性病症的体征或症状被减轻或消除。例如，本文的方法可以导致受试者的自身免疫性病症完全或部分缓解。在一些实例中，本文的方法可用于减少或消除受试者的自身免疫性病症的突发或复发。在一些实例中，本文的方法可用于降低或消除受试者的自身免疫性病症突发的频率或强度。在一些实施方案中，本文的方法可用于预防受试者的自身免疫性病症的进展。
[0172]
mbv(或包含mbv的药物制剂)的施用可以在延长的时间段内减少或消除受试者的自身免疫性病症的体征或症状。在一些实施方案中，受试者从mbv疗程获得持续延长的时间段的治疗效果。优选地，mbv经全身施用。例如，该延长的时间段可以是从疗程开始时开始并在其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月结束的时间段。例如，该延长的时间段可以是从疗程结束开始并在其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月结束的时间段。受试者获得的治疗效果可以是(i)与疗程之前的症状的严重程度相比，该时间段内自身免疫性病症的症状的严重程度降低，(ii)该时间段内缓解自身免疫性病症或其症状，(iii)该时间段内预防自身免疫性病症的突发或复发，(iv)与疗程之前出现的症状严重程度相比，该时间段内突发或复发期间出现的症状严重程度降低，(v)与疗程之前的复发或突发的频率相比，该时间段内复发或突发的频率降低，或(vi)在疗程完成后，该时间段内没有疾病进展体征。对于任何给定的自身免疫性病症，症状严重程度的降低或改善或疾病的缓解可以根据特定疾病的相关临床指标和相关临床客观标准(例如特定疾病或病症的评分系统)来测量。例如，与疗程之前的评分相比，由于mbv疗程的结果，患者可能在指示病症改善的时间段内出现疾病或病症的临床评分降低。与治疗之前的评分相比，患者在该时间段内可能出现自身免疫性病症评分降低，并且在该时间段内该评分保持低于治疗之前的评分。
[0173]
可以向受试者施用构成疗程的mbv的1次或更多次施用。疗程优选全身施用。疗程可以是mbv每周施用1次持续4周，每周施用1次持续3周，每周施用1次持续2周，每周施用1次持续1周，每周施用2次持续4周，每周施用2次持续3周，每周施用2次持续2周，每周施用2次持续1周，每周施用3次持续4周，每周施用3次持续3周，每周施用3次持续2周，每周施用3次持续1周，每周施用4次持续1周，每周施用4次持续2周，每周施用4次持续3周，或每周施用4次持续4周。
[0174]
在一个实施方案中，受试者接受初始疗程每周1次持续4周、每周1次持续3周、每周1次持续2周、每周1次持续1周(即仅施用1次)、每周2次持续4周、每周2次持续3周、每周2次持续2周、每周2次持续1周、每周3次持续4周、每周3次持续3周、每周3次持续2周、每周3次持续1周、每周4次持续1周、每周4次持续2周、每周4次持续3周、或每周4次持续4周，随后是维持疗程，自完成初始疗程1个月后、2个月后、3个月后、4个月后、5个月后、6个月后、7个月后、8个月后、9个月后、10个月后、11个月后或12个月后。在一个实施方案中，患者在疗程后6个月接受维持疗程。维持疗程可以与疗程相同或不同。维持疗程可以是每周1次持续4周、每周1次持续3周、每周1次持续2周、每周1次持续1周(即仅施用1次)、每周2次持续4周、每周2次持续3周、每周2次持续2周、每周2次持续1周、每周3次持续4周、每周3次持续3周、每周3次持续2周、每周3次持续1周、每周4次持续1周、每周4次持续2周、每周4次持续3周、或每周4次持续4周。维护疗程可以每3个月、每6个月、每9个月或每年施用。在一个实施方案中，维持疗程每6个月施用。
[0175]
根据一些实施方案，以每次施用每kg体重1
×
106至1
×
10
12
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
107至1
×
10
11
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
107至1
×
108mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
108至1
×
10
10
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
109至1
×
10
10
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
106至1
×
108mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
107至1
×
109mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
108至1
×
10
11
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
109至1
×
10
11
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
106至1
×
10
14
mbv向受试者施用。在另一个实施方案中，以每次施用每kg体重1
×
10
12
至1
×
10
14
mbv向受试者施用。在一个实施方案中，根据任何上述量施用mbv通过全身施用。
[0176]
根据一个实施方案，当受试者出现与自身免疫性病症相关的症状突发时，向受试者施用mbv疗程。根据一个实施方案，当受试者在缓解后出现自身免疫疾病或病症进展时，向受试者施用疗程。根据一个实施方案，向受试者施用mbv疗程以防止自身免疫疾病或病症突发或复发。例如，为了防止突发或复发，每3个月、每4个月、每5个月、每6个月、每7个月、每8个月、每9个月、每10个月、每11个月或每年向受试者施用疗程一次。
[0177]
包括多种自身免疫性病症(例如慢性自身免疫性病症)。在一些实施方案中，自身免疫性病症影响或主要影响皮肤、呼吸系统、生殖系统、心血管系统或神经系统。在一些实施方案中，受试者可患有阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫性肝炎、乳糜泻、克罗恩氏病、肺出血-肾炎综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、免疫性血小板减少症、iga肾病、炎症性肠病(ibd)、多发性硬化症、重症肌无力、类天疱疮、天疱疮、2型多腺体自身免疫综合征、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、硬皮病、干燥综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、1型糖尿病、溃疡性结肠炎或未分化结缔组织病(uctd)。
[0178]
在一些实例中，自身免疫性病症是非眼部自身免疫性病症。在一些实施方案中，自身免疫性病症影响或主要影响皮肤、呼吸系统、生殖系统、心血管系统或神经系统。在一些实施方案中，受试者可患有阿狄森氏病、斑秃、强直性脊柱炎、抗磷脂抗体综合征、自身免疫
性肝炎、乳糜泻、克罗恩氏病、肺出血-肾炎综合征、格雷夫氏病、格林-巴利综合征、桥本甲状腺炎、免疫性血小板减少症、iga肾病、多发性硬化症、重症肌无力、类天疱疮、天疱疮、2型多腺体自身免疫综合征、银屑病、银屑病关节炎、干燥综合征、系统性红斑狼疮、高安动脉炎、1型糖尿病或未分化结缔组织病(uctd)。在一些实例中，自身免疫性病症不是类风湿性关节炎、硬皮病或溃疡性结肠炎。
[0179]
在一些实施方案中，受试者患有类风湿性关节炎(ra)。在一些实例中，该方法包括向患有ra的受试者施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗ra。优选地，mbv经全身施用，例如，通过静脉内施用。mbv还可以全身施用，例如，通过腹腔、肌内、口服、肠内、肠胃外、鼻内、直肠、舌下、口腔、皮下或唇下施用。该方法可以包括选择患有ra的受试者。可以使用多种技术识别受试者的ra。例如，可以使用成像识别ra(例如识别来自关节的滑液、骨侵蚀、关节附近的骨质减少、软组织肿胀和异常小的关节间隙、半脱位，例如使用x射线、mri或超声波)、血液检测(例如识别类风湿因子(rf)、抗瓜氨酸蛋白抗体(acpa，例如，通过抗ccp抗体测量，例如使用elisa)、红细胞沉降率(esr)、c反应蛋白、全血细胞计数、肾功能、肝酶水平或抗核抗体/ana)以及2010acr/eular类风湿关节炎分类标准(aletaha等人，2010类风湿关节炎分类标准：美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟合作倡议，风湿病年鉴，69(9):1580-8(2010)，其通过引用以其全文并入本文)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗ra。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在其他实施方案中，mbv通过肌内、皮下或腹腔施用进行施用。在一些实施方案中，这些方法可以降低ra突发的严重程度或频率。例如，在一些实施方案中，受试者从mbv疗程获得持续延长的时间段的治疗ra的治疗效果。优选地，mbv经全身施用。例如，该延长的时间段可以是从疗程开始的1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月的时间段。例如，该延长的时间段可以是从疗程结束后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月的时间段。受试者获得的治疗效果可以是(i)与疗程之前的症状严重程度相比，该时间段内ra症状的严重程度降低，(ii)该时间段内缓解ra或其症状，(iii)该时间段内预防ra突发或复发，(iv)与疗程之前出现的症状严重程度相比，该时间段内ra突发或复发期间出现的症状严重程度降低，(v)与疗程之前的复发或突发频率相比，该时间段内ra复发或突发的频率降低，或(vi)在疗程完成后，该时间段内没有ra疾病进展体征。对于ra，症状严重程度的减轻或改善或病症的缓解可以根据相关临床指标和相关临床客观标准，例如评分系统，例如ra的das28进行测量。例如，在一个实施方案中，与疗程之前受试者的关节炎评分相比，受试者在从疗程开始的1个月、两个月或三个月的时间段内出现降低的关节炎评分，其中降低的评分在疗程结束后保持不变。在一些实施方案中，mbv施用导致ra在从疗程开始的时间后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内缓解，其中在疗程结束后维持缓解。在一些实施方案中，mbv施用导致受试者的das28评分在从疗程开始到其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月结束的一段时间内降低至低于5.1。在一些实施方案中，mbv疗程的施用导致受试者的das28评分在从疗程开始到其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月结束的一段时间内降低至低于3.2(低疾病活性)。在一些实施方案中，mbv施用导致受试者的das28评分降低至低于2.6，即，施用在从疗程开始到其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月结束的一段时间内实现缓解。
[0180]
在一个实施方案中，受试者在从疗程开始到其后1个月、2个月、3个月、4个月、5个
月或6个月结束的一段时间内出现das28评分降低。在一些实施方案中，das28评分的降低在疗程结束后维持1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。
[0181]
在一个实施方案中，das28评分的降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗ra的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月或更长时间。
[0182]
在一些实施方案中，受试者患有硬皮病。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗硬皮病。优选地，mbv经全身施用，例如通过静脉内施用。可以使用公开的方法治疗多种硬皮病类型，例如局部硬皮病，例如，局部硬斑病、硬斑病-硬化萎缩性苔藓重叠(lsa)、全身硬斑病、pasini和pierini皮萎缩病、全硬化硬斑病、深硬斑病、线状硬皮病和系统性硬皮病，例如crest综合征和进行性系统性硬化症。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗硬皮病。在具体实例中，mbv通过iv或口服施用进行施用。mbv还可以通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。这些方法可以降低硬皮病突发的严重程度或频率。该方法还可以导致硬皮病缓解。
[0183]
该方法可以包括选择患有硬皮病的受试者。可以使用多种技术来识别患有硬皮病的受试者。例如，硬皮病的检测可以包括临床诊断(例如识别皮肤增厚、僵硬、疲乏和冷暴露时手指或脚趾血流不畅的区域)、血液检查(例如免疫因子水平升高，称为抗核抗体)、肺功能检查(例如测量肺功能，例如，使用x射线或计算机断层扫描(ct扫描)，例如识别肺损伤)、心电图(例如识别充血性心力衰竭或心脏电活动缺陷)、超声心动图(例如识别肺动脉高压或充血性心力衰竭)、胃肠道检查(例如内窥镜检查或测压)或肾脏检查(例如使用血液检查来识别高水平蛋白)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗硬皮病。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在其他实施方案中，mbv经局部施用，例如施用于皮肤。使用方法可以降低硬皮病突发的严重程度的频率。该方法还可以导致硬皮病缓解。例如，原始或修改的rodnan评分可用于测量硬皮病的严重程度。rodnan评分通过对身体17个解剖表面区域的皮肤增厚严重程度进行评分(从0至3)并将所有表面评分相加来确定。表面评分为3表示皮肤非常厚且皮肤无法捏成褶皱。表面评分为0对于成年人来说是健康的，而儿童的健康评分可以是0或1。在一个实施方案中，由于mbv施用，受试者出现表面评分降低至0或1并出现缓解。在另一个实施方案中，由于mbv施用，受试者的表面评分降低至2或更少(3表示重度疾病)。在一个实施方案中，受试者从mbv施用时出现rodnan评分降低，在施用后1个月、两个月或三个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过mbv的全身施用实现。在一个实施方案中，治疗硬皮病的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0184]
在一些实施方案中，受试者患有溃疡性结肠炎。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗溃疡性结肠炎。优选地，mbv经全身施用，例如通过静脉内施用。该方法可以包括选择患有溃疡性结肠炎的受试者。可以使用多种技术来识别患有溃疡性结肠炎的受试者。例如，溃疡性结肠炎的检测可以包括全血细胞计数(例如识别贫血或血小板增多症)、电解质或肾功能检测(例如识别低钾血症、低镁血症或肾前功能衰竭)、肝功能检测(例如识别原发性硬化性胆管炎)、x射线、尿液分析、粪便培养(例如识别寄生虫或感染原)、红细胞沉降率或c反应蛋白测量(例如识别炎症)或乙状结肠镜检查(例如识别大肠溃疡)。在一些实例中，临床结肠炎活动指数可
用于评估溃疡性结肠炎的严重程度。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗溃疡性结肠炎。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。mbv可以局部施用，例如肠道施用。这些方法可以降低溃疡性结肠炎突发的严重程度或频率。该方法还可以导致溃疡性结肠炎疾病的临床缓解和内窥镜缓解。例如，在一些实施方案中，与治疗之前的评分相比，mbv施用导致溃疡性结肠炎的mayo评分或溃疡性结肠炎疾病活动指数(ucdai)降低。在一个实施例中，患者出现mayo评分降低至2或更低并出现缓解。在另一个实施方案中，患者的mayo评分降低至5或更低。在另一个实施方案中，患者出现mayo评分降低至小于10。在一个实施方案中，受试者出现从开始mbv治疗疗程开始时测量的mayo评分或ucdai评分降低，在其后的1个月、2个月或3个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗溃疡性结肠炎的治疗效果超出疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0185]
在一些实施例中，受试者患有克罗恩氏病。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗克罗恩氏病。优选地，mbv经全身施用，例如通过静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行使用。可以使用公开的方法治疗多种类型的克罗恩氏病，包括回结肠克罗恩氏病、crohn结肠炎、胃十二指肠克罗恩氏病和空肠回肠炎。可以治疗由某种因素引起的克罗恩氏病，例如由免疫系统功能障碍(例如自身免疫或先天免疫受损)、遗传因素、肠道细菌变化和环境因素引起的克罗恩氏病。该方法可以包括选择患有克罗恩氏病的受试者。可以使用多种技术来识别患有克罗恩氏病的受试者。例如，克罗恩氏病的检测可以包括内窥镜检查(例如结肠镜检查)、成像(例如使用钡跟踪x射线、ct扫描和mri扫描)和血液检查(例如识别铁、维生素d或维生素b12缺乏症；红细胞沉降率(esr)和c反应蛋白水平)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗克罗恩氏病。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。mbv可以局部施用，例如施用于肠道。这些方法可以降低克罗恩氏病突发的严重程度或频率。这些方法还可以导致克罗恩氏病的临床缓解和内镜缓解。例如，在一些实施方案中，与治疗之前的评分相比，mbv施用导致克罗恩氏病活动指数(cdai)降低。在一个实施方案中，患者出现cdai评分降低至低于150并出现缓解。在另一个实施方案中，患者出现cdai评分降低至低于450或更低(450或更高指示重度疾病)。在另一个实施方案中，由于mbv治疗，患者出现下降至少70cdai分(指示治疗反应)。例如，在另一个实施方案中，由于mbv治疗，患者出现下降至少70cdai分(指示治疗反应)，从施用mbv的时间开始在1个月、2个月或3个月或更长时间内保持降低。在一个实施方案中，受试者从施用mbv时出现cdai评分降低，在施用后1个月、2个月或3个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗克罗恩氏病的治疗效果超出疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0186]
在一些实施方案中，受试者患有天疱疮。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗天疱疮。优选地，mbv经全身施用，例如通过静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。在一些实例中，mbv通过外用皮肤施用进行局部施用。可以使用公开的方法治疗多种类型的天疱疮，例如寻常天疱疮、叶状天疱疮、iga天疱疮或副肿瘤性天疱疮。该方法可以包括
选择患有天疱疮的受试者。可以使用多种技术来识别患有天疱疮的受试者。例如，天疱疮的检测可以包括临床诊断(例如通过眼睛和口腔粘膜的病变)、皮肤或粘膜活检(例如识别由棘层松解引起的表皮内囊泡)，以及对血液样本的elisa或皮肤活检的直接免疫荧光(例如识别抗桥粒芯蛋白自身抗体)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗天疱疮。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在其他实施方案中，mbv局部施用于皮肤。这些方法可以降低天疱疮突发的严重程度或频率。这些方法还可以导致天疱疮缓解。症状严重程度的降低可以基于从mbv施用时pdai(天疱疮疾病指数)的降低或自身免疫性大疱性皮肤病强度评分(absis)的降低。中度疾病是pdai《15或absis《17，显著疾病是pdai为15至44或absis为17至53，并且广泛疾病是pdai大于45或absis大于53。在一个实施方案中，受试者出现pdai评分降低至低于15或abssis评分降低至低于17并出现缓解。在另一个实施方案中，受试者出现pdai评分降低至低于45或absis评分降低至低于53或更低(pdai评分45或更高或者absis评分53或更高指示重度疾病)。在一个实施方案中，受试者从mbv施用时出现pdai评分降低，在施用后1个月、2个月或3个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗天疱疮的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0187]
在其他实施方案中，受试者患有类天疱疮。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗类天疱疮。优选地，mbv经全身施用，例如通过静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。在一些实例中，mbv通过外用皮肤施用进行局部施用。可以使用公开的方法治疗多种类天疱疮，例如igg介导的类天疱疮，例如妊娠性类天疱疮、大疱性类天疱疮和瘢痕性类天疱疮，以及iga介导的类天疱疮，例如iga介导的免疫大疱病。该方法可以包括选择患有类天疱疮的受试者。可以使用多种技术来选择患有类天疱疮的受试者。例如，类天疱疮的检测可以包括临床诊断(例如在没有其他可识别原因的情况下识别皮肤上的张力水疱和糜烂；脱屑性牙龈炎或粘膜炎，累及口腔、眼部、鼻部、生殖器、肛门、咽部、喉部和/或食道粘膜；或不明原因的瘙痒、瘙痒性湿疹或荨麻疹)、组织病理学(例如识别病变组织，例如，使用结合苏木素和伊红(h&e)染色的穿孔活检)、直接免疫荧光法(dif；例如识别活检标本中的组织结合抗体)、间接免疫荧光(例如识别针对基底膜区抗原的循环抗体，例如，使用唾液样本)和抗原特异性血清学检测(例如识别针对nc16a、bp180、bp230、层粘连蛋白332或vii型胶原蛋白，例如使用elisa)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗类天疱疮。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在其他实施方案中，mbv局部施用于皮肤。这些方法可以降低类天疱疮突发的严重程度或频率。这些方法还可以导致类天疱疮缓解。症状严重程度的降低可以基于从mbv施用时pdai(天疱疮疾病指数)的降低或自身免疫性大疱性皮肤病强度评分(absis)的降低。中度疾病是pdai《15或absis《17，显著疾病是pdai为15至44或absis为17至53，并且广泛疾病是pdai大于45或absis大于53。在一个实施方案中，受试者出现pdai评分降低至低于15或abssis评分降低至低于17并出现缓解。在另一个实施方案中，受试者出现pdai评分降低至低于45或absis评分降低至低于53或更低(pdai评分45或更高或者absis评分53或更高指示重度疾病)。在一个实施方案中，受试者从mbv施用时出现pdai或absis评分降低，在施用后1个月、2个月或3个月内保持降低。
在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗类天疱疮疾病的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0188]
在进一步的实施方案中，受试者患有银屑病。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗银屑病。在一些实施方案中，公开了用于治疗有需要的受试者的银屑病的方法，包括向受试者施用包含治疗有效量的源自细胞外基质的分离的mbv的药物制剂，从而治疗受试者的银屑病。该药物制剂可以全身施用。该药物组合物可以局部施用，例如外用施用于受试者的皮肤。在一些实施方案中，将药物组合物施用于受试者皮肤上的一个或更多个斑块。包括各种类型的银屑病，例如斑块型、点滴型、反向型、脓疱型和红皮型银屑病。该方法可以包括选择患有银屑病的受试者。可以使用多种技术来识别受试者的银屑病。例如，银屑病检测可以包括临床诊断(例如通过识别鳞屑、红斑、丘疹或可能疼痛和发痒的皮肤斑块)或皮肤活检或刮擦(例如识别与真皮、表皮增厚、来自最表层皮肤层的异常皮肤细胞或炎症浸润)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗银屑病。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过口服施用进行施用。在其他实施方案中，将mbv局部施用于皮肤或损伤处。这些方法可以降低银屑病突发的频率或严重程度。这些方法可以导致银屑病缓解。症状严重程度的降低或缓解可以基于pasi评分(银屑病面积和严重程度指数)的降低，其中多个标准的评分为0至4，并将这些标准相加。轻度银屑病的pasi评分为0至5，中度银屑病的pasi评分为5至12，重度银屑病的pasi评分为12至20，并且极重度银屑病的pasi评分大于20。在一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现pasi75，pasi评分较基线改善75％或更高，指示发生治疗反应。在一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现pasi评分降低至约0并出现缓解。在另一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现pasi评分降低至低于20或更低(20或更高指示重度疾病)。在一个实施方案中，受试者从开始mbv疗程的时间出现pasi评分降低，在施用后1个月、2个月或3个月或更长时间内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗银屑病的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0189]
在更多实施方案中，受试者患有银屑病关节炎。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗银屑病关节炎。优选地，mbv的施用是通过可以使用公开的方法治疗各种类型的银屑病关节炎，例如少关节、多关节、变形性关节炎、变形性关节炎、脊椎关节炎和以远端指间关节为主。该方法可以包括选择患有银屑病关节炎的受试者。可以使用多种技术来识别患有银屑病关节炎的受试者。例如，银屑病关节炎的检测可以包括临床诊断(例如识别银屑病或银屑病关节炎、甲剥离、手的远端指间关节、附接点炎或指炎的家族史)、血液检查(例如识别类风湿因子的阴性结果)和x射线(例如识别退行性关节变化)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗银屑病关节炎。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实例中，mbv通过或口服施用进行施用。在其他实施方案中，mbv经局部施用，例如关节内施用。这些方法可以降低银屑病关节炎突发的频率或严重程度。这些方法可以导致银屑病关节炎缓解。银屑病关节炎疾病活动指数(dapsa)评分的降低可用于确定反应。在一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现dapsa评分降低至低于4并出现缓解。在一些实施方案中，受试者出现dapsa评分降低50％、
75％或85％，这表明mbv疗程导致治疗反应。在另一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现dapsa评分降低至低于28(28或更高指示高疾病活性)。在一个实施方案中，由于mbv施用，受试者出现dapsa评分降低，在mbv疗程开始后1个月、2个月或3个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗银屑病关节炎的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0190]
在一些实施方案中，受试者患有多发性硬化症。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗多发性硬化症。优选地，mbv通过全身施用递送，例如静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。可以使用公开的方法治疗多种多发性硬化症类型，例如复发-缓解型、继发性进行性、原发性进行性和临床孤立综合征多发性硬化症。该方法可以包括选择患有多发性硬化症的受试者。可以使用多种技术来识别患有多发性硬化症的受试者。例如，多发性硬化症的检测可以包括临床诊断(例如通过身体、精神和精神症状，例如复视、单眼失明、肌肉无力、感觉障碍或协调能力)、成像(例如识别脱髓鞘区域，例如通过病变或斑块)、腰椎穿刺(例如识别脑脊液中igg的寡克隆带，例如通过电泳)、视觉和感觉诱发的电位和活检。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗多发性硬化症。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实施方案中，mbv通过口服施用进行施用。这些方法可以降低多发性硬化症突发的频率或严重程度。这些方法可以导致多发性硬化症缓解。这些方法还可以防止疾病进展。扩展残疾状态评分(edss)的降低可用于确定反应。在一个实施方案中，由于mbv疗程，患者出现edss评分降低至1.5或低于1.5，指示残疾缓解。在另一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者步行25英尺的能力得到改善。在另一个实施方案中，患者的edss评分降低至低于8.5或更低(8.5或更高指示极重度残疾)。在一个实施方案中，由于mbv施用，受试者出现edss评分降低，在mbv疗程开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗ms的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0191]
在更多实施方案中，受试者患有系统性红斑狼疮(sle)。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗sle。优选地，mbv通过全身施用进行施用，例如通过静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。可以使用公开的方法治疗由于多种原因导致的系统性红斑狼疮，例如由于遗传因素、药物反应或其他狼疮(例如盘状狼疮、皮肤狼疮)导致的sle。该方法可以包括选择患有sle的受试者。可以使用多种技术来选择患有sle的受试者。例如，sle检测可以包括血清学检测(例如抗核抗体(ana)、抗可提取核抗原(抗ena)、抗dsdna、抗u1 rnp(也出现在全身硬化症和混合结缔组织病中)、ss-a(或抗ro)和ss-b(或抗la)、补体系统水平、电解质水平和肾功能、肝酶水平、全血细胞计数和红斑狼疮(le)细胞检测。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗sle。在具体实例中，mbv通过iv施用进行施用。在其他实施方案中，mbv通过口服施用进行施用。这些方法可以降低sle突发的严重程度或频率。这些方法可以导致sle缓解。疾病严重程度可以通过sle疾病活动指数(sledai)或bilag评分来衡量。在一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者的sledai评分降低至3或低于3或者bilag评分降低至d或e，指示缓解。在一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现sledai评分降低4或更多
或者bilag评分降低至c或更低，指示治疗反应。在另一个实施方案中，由于mbv疗程，受试者出现sledai评分降低至低于7.5或更低或者bilag评分从a降低至b(7.5或更高的sledai评分或a的bilag评分指示重度疾病)。在一个实施方案中，由于mbv施用，受试者出现sledai或bilag评分降低，在mbv疗程开始后1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内保持降低。在一个实施方案中，这种降低通过全身施用mbv来实现。在一个实施方案中，治疗ms的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0192]
该方法可以包括选择患有自身免疫性脑炎的受试者。在一些实例中，该方法包括施用治疗有效量的mbv(例如通过施用包括治疗有效量的mbv的药物制剂)，从而治疗自身免疫性脑炎。可以使用多种技术来选择患有自身免疫性脑炎的受试者。例如，选择患有脑炎的受试者可以包括脑部扫描(例如使用mri)以确定炎症；eeg(例如监测大脑活动，其中脑炎将产生异常信号)、腰椎穿刺(脊髓穿刺)、验血、尿液分析、脑脊液聚合酶链反应(pcr)检测以检测存在病毒dna(例如识别病毒性脑炎)。在一些实施方案中，全身施用mbv以治疗自身免疫性脑炎。在具体实例中，mbv通过iv或口服施用进行施用。在一些实施方案中，mbv通过全身施用进行施用，例如通过静脉内施用。在一些实例中，mbv通过腹腔、皮下或肌内施用进行施用。在其他实施方案中，将mbv局部施用至大脑，例如通过脑内注射。在一些实施方案中，施用方法可以降低自身免疫性脑炎突发的频率或严重程度，或可以降低与自身免疫性脑炎相关的炎症，从而患者不再患有自身免疫性脑炎或自身免疫性脑炎处于缓解状态。在一个实施方案中，治疗自身免疫性脑炎的治疗效果延伸超过疗程的持续时间，例如，一个月、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更长时间。
[0193]
施用可以是全身施用。全身施用的示例性途径包括但不限于静脉内施用、口服施用、肠内施用、肠胃外施用、鼻内施用、直肠施用、舌下施用、口腔施用、唇下施用、腹腔施用、经皮、经粘膜、皮下或肌内施用。在具体的非限制性实例中，全身施用是静脉内施用。
[0194]
施用可以是局部施用。局部施用的示例性途径包括关节内注射、外用皮肤施用、鞘内施用和皮内施用，或通过直接注射或应用至目标组织或器官上或内。
[0195]
剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案，以最终每次施用每千克体重递送1
×
106至1
×
10
12
个mbv(即囊泡的绝对数量)。施用可以以单次施用、定期推注或以连续输注提供，例如通过从缓释药物或药物递送装置连续释放特定时期。可以适当地向受试者施用尽可能多的剂量。如果施用多剂，施用可以是间歇性的。在示例性实施方案中，治疗有效量的mbv的施用(例如全身施用，例如静脉内施用，或任何其他施用途径)可以进行一次，或可以重复进行，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。在示例性实施方案中，施用可以每两周、每周、每隔一周、每月或每2、3、4、5或6个月进行。在其他实施方案中，仅需要单次施用即可获得治疗获益。在其他实施方案中，仅需要一个疗程即可获得治疗获益，从疗程开始持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月内。在其他实施方案中，仅需要一个疗程即可获得治疗获益，从疗程结束持续1个月、2个月、3个月、4个月、5个月或6个月。
[0196]
单个剂量通常不小于对受试者产生可测量效果所需的量，并且可以基于受试者组合物或其副产物的吸收、分布、代谢和排泄(“adme”)的药代动力学和药理学，因此基于受试者体内组合物的处置来确定。这包括考虑施用途径以及剂量，可以针对局部和全身(例如，静脉内)应用进行调整。剂量的有效量和/或剂量方案可以很容易地从临床前测定、安全性
以及增量和剂量探索试验、个体临床医生-患者关系以及体外和体内试验中凭经验确定。通常，这些测定将评价自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)。
[0197]
治疗有效量的mbv可以悬浮于药学上可接受的载体中(例如在药物制剂中)，例如，在等渗缓冲溶液中，ph为约3.0至约8.0，优选ph为约3.5至约7.4、3.5至6.0、或3.5至约5.0。有用的缓冲剂包括柠檬酸钠-柠檬酸和磷酸钠-磷酸，以及醋酸钠/醋酸缓冲剂。可以添加其他试剂(例如防腐剂和抗菌剂)至组合物中。这些组合物可以局部或全身施用，例如静脉内施用。
[0198]
包括治疗有效量的mbv的药物制剂可以被配制成单位剂型，适用于精确剂量的个体施用。施用的活性化合物的量将取决于所治疗的受试者、疾病的严重程度和施用方式，并且最好留给开处方的临床医生来判断。在这些范围内，待施用的制剂将含有一定量的活性成分，其量可有效地在所治疗的受试者中实现期望效果。在示例性实施方案中，mbv治疗导致在施用时存在的自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)的体征或症状减少或减轻。
[0199]
mbv施用使受试者获得治疗获益。治疗获益可以例如作为时间和/或强度的函数而变化。在示例性实施方案中，受试者在施用mbv后在延长的时间段内获得治疗获益。例如，受试者可以在持续至少3天、至少1周、至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月或更长时间的时间段内获得治疗获益。
[0200]
在一些实施方案中，受试者从mbv施用获得治疗获益持续至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月或至少3个月的时间段。在更多实施方案中，从施用获得的治疗获益在疗程完成后持续至少一周。在其他实施方案中，从施用获得的治疗获益在疗程完成后持续至少两周。在进一步的实施方案中，从施用获得的治疗获益在疗程完成后持续至少一个月。在一些实施方案中，从施用获得的治疗获益在疗程完成后持续至少两个月。在进一步的实施方案中，从施用获得的治疗获益在完成疗程之后持续至少三个月或更长时间。在进一步的实施方案中，从施用获得的治疗获益在完成疗程之后持续至少六个月或更长时间。在又其他实施方案中，治疗获益是在施用时存在的病症的症状的减轻。
[0201]
在一些实例中，与mbv施用之前的自身免疫活性水平相比，mbv治疗可以导致受试者自身免疫活性降低或减少。在一些实例中，mbv治疗可以导致自身免疫性病症缓解。在一些实例中，mbv治疗可以导致减少或消除自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)的体征或症状发作。例如，mbv治疗可以在超过疗程完成后的延长时间段内(例如至少3天、至少1周、至少1至少2周、至少3周、至少4周、至少1个月、至少2个月、至少3个月或至少6个月)导致自身免疫性病症的发作或体征或症状的减少或消失。
[0202]
可以以相同或不同的组合物或药物制剂向受试者施用另外的治疗剂。在示例性实施方案中，受试者患有自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)，并且向受试者施用另外的治疗剂，例如可以施用抗炎药和/或免疫抑制药物。
[0203]
在一些实施方案中，该方法包括检测已经实现治疗获益的步骤。疗效的测量将适用于被改善的特定疾病，并且本领域技术人员将认识到用于测量疗效的适当检测方法。可
以使用本领域已知的任何方法评价受试者的反应。在示例性实施方案中，受试者患有自身免疫性病症(例如类风湿性关节炎、硬皮病、溃疡性结肠炎、天疱疮、克罗恩氏病、银屑病、银屑病关节炎、硬化症或系统性红斑狼疮)，并且受试者的治疗反应可以通过以下方式测量抗核抗体检测(ana)或在某些自身免疫类型中产生的特定自身抗体、体内炎症检查等。
[0204]
以下公开了示例性方法。
[0205]
实施例
[0206]
通过参考以下实施例将更容易理解现在一般性地描述的公开内容，仅出于说明本公开的某些方面和实施方案的目的而将其包括在内，并不旨在以任何方式限制本公开的范围。
[0207]
实施例1：通过脂质组学和rna测序区分基质结合囊泡(mbv)和细胞外囊泡(ev)
[0208]
基质结合纳米囊泡(mbv)已被报道作为ecm生物支架的组成部分。尽管液相细胞外囊泡(ev)一直是深入研究的主题，但它们与mbv的相似性仅限于尺寸和形状。本实施例利用基于lc-ms的脂质组学和氧化还原脂质组学对液相ev和mbv磷脂进行详细比较。结合对囊内货物的全面rna测序和生物信息学分析，本实施例表明mbv是ev的不同且独特的亚群，并且是基于ecm的生物材料的区别特征。
[0209]
本实施例识别了ev的液相(即外泌体)和基质结合形式(即mbv)之间的相似性和差异。然而，鉴于存在于生物体液中的ev和存在于天然组织ecm和基于ecm的生物材料中的mbv代表了从多个细胞来源分泌的异源群体，因此在这些假定的ev群之间进行直接比较的体内分析是有问题的。作为使用体液或组织来源的囊泡的可选方案，可以分离由培养细胞在体外产生的ecm和条件培养基(fitzpatrick等人，biomater sci.,3,12-24(2015))。这种方法提供了几个优点，例如使用单细胞类型来源，从而消除了对囊泡来源的任何质疑；从液相或固相区室选择性收获囊泡的能力；以及控制细胞培养环境的能力，从而控制囊泡的组成和运载物。
[0210]
材料和方法
[0211]
体外细胞来源的ecm的制备：人骨髓干细胞(bmsc)、人脂肪干细胞(asc)和人脐带干细胞(ucsc)ecm板由stembiosys(san antonio,texas)提供，并根据已发表的方案(lai等人，stem cells and development 19,1095-1107(2010))进行制备。简言之，将人bmsc、人asc或人ucsc以3,500个细胞/cm2的细胞密度接种到包被有人纤连蛋白的75cm2细胞培养瓶上(37℃下1h)，并在补充有20％胎牛血清(fbs)和1％青霉素-链霉素的α-mem培养基中培养14天。在初始接种后的第二天更换培养基，然后每3天换液一次。在第7天，将抗坏血酸2-磷酸(sigma aldrich)添加至培养基中，终浓度为50μm。在第14天，使用在20mm氢氧化铵中的0.5％triton对板进行脱细胞持续5分钟，用含有钙和镁的hank平衡盐溶液(hbss / )冲洗两次，并用超纯h2o冲洗一次。将鼠nih 3t3成纤维细胞以3,500个细胞/cm2的细胞密度接种到75cm2细胞培养瓶上，并在补充有外泌体耗竭的fbs(gv shelke等人，journal of extracellular vesicles 3,24783(2014))、1％青霉素-链霉素和终浓度为50μm的抗坏血酸2-磷酸(sigma aldrich)的dmem培养基中培养，持续7天。第7天，收集培养的3t3成纤维细胞的上清液，并将铺板的培养物用pbs洗涤3次，使用在20mm氢氧化铵中的0.5％triton脱细胞5分钟，然后用超纯h2o冲洗3次。
[0212]
mbv和液相ev的分离：分离mbv(l.huleihel等人，science advances 2,e1600502
(2016))。简言之，在缓冲液(50mm tris ph 7.5、5mm cacl2、150mm nacl)中用100ng/ml liberase dl(roche)在37℃下酶消化脱细胞的ecm 1小时。将含有液相ev的细胞培养上清和含有mbv的消化的ecm分别以500g(10分钟)、2500g(20分钟)和10,000g(30分钟)进行差速离心，并且上清液通过0.22μm过滤器(millipore)。然后将含有释放的mbv或液相ev的澄清上清液在4℃下以100,000
×
g(beckman coulter optima l-90k ultracentrifuge)离心70分钟以沉淀囊泡。然后将囊泡颗粒洗涤并重悬于1x pbs中，并在-20℃下储存备用。
[0213]
膀胱基质(ubm)的制备：ubm由上市体重的猪制备(tissue source；llc,lafayette,in)(l.huleihel等人,science advances 2,e1600502(2016))。简言之，通过机械脱层去除浆膜、外肌层、粘膜下层和粘膜肌层，并通过用去离子水洗涤使粘膜的尿路上皮细胞与基底膜分离。剩余的基底膜和固有层(统称为ubm)通过在0.1％过氧乙酸和4％乙醇中以300rpm的速度搅拌2h，然后用磷酸盐缓冲盐水(pbs)和1型水洗涤，使之脱细胞。然后将ubm冻干并使用带有#60目筛的wiley mill进行研磨。
[0214]
扫描电子显微镜(sem)：ubm在冷2.5％戊二醛中固定24小时，随后在1
×
pbs中洗涤3次，每次30分钟。然后将样本在分级酒精系列(30％、50％、70％、90％、100％乙醇)中每次洗涤脱水30分钟，然后在4℃下放置在100％乙醇中过夜。将样本在100％乙醇中再洗涤3次，每次30分钟，并使用leica em cpd030临界点干燥器(leica microsystems，buffalo grove，il，usa)用二氧化碳作为过渡介质进行临界点干燥。然后使用sputter coater 108 auto(cressington scientific instruments,uk)在样本上溅射4.5nm厚的金/钯合金涂层，并使用jeol jsm6330f扫描电子显微镜(jeol,peabody,ma,usa)成像
[0215]
透射电子显微镜(tem)：tem成像在负载在碳涂层网格上并在4％多聚甲醛中固定的mbv或液相ev上进行(l.huleihel等人，science advances 2,e1600502(2016))。网格在80kv下使用jeol 1210 tem和高分辨率advanced microscopy techniques数码相机进行成像。mbv的大小使用jeol tem软件从代表性图像中确定。
[0216]
纳米颗粒跟踪分析(nta)：使用配备快速视频捕获和颗粒跟踪软件的nanosight(ns300)仪器计算液相ev和mbv的颗粒大小和浓度。使用无颗粒水将样本按1:500稀释至终体积为1000μl。使用注射泵将样本分配到系统中。从每个样本45秒的三个捕获中进行测量。对于视频处理和颗粒计算，检测阈值校正为4。数据表示为每个评价样本的浓度与粒径。
[0217]
rna分离：根据生产商的说明，使用rneasy mini试剂盒(qiagen)从3t3细胞、液相ev和mbv中分离总rna。在rna分离之前，液相ev和mbv样本在37℃下用rnase a(10μg/ml)处理30分钟，以降解任何污染的rna。rna量使用nanodrop分光光度计测定，并且其量通过agilent bioanalyzer 2100(agilent technologies)测定。
[0218]
rna测序和生物信息学分析：按照生产商的说明使用每个样本100ng和qiaseq
tm mirna文库试剂盒(qiagen)开始mirna文库制备。简言之，成熟的mirna在其3'和5'末端与衔接子连接。然后使用具有独特分子索引(umi)的逆转录(rt)引物将连接的mirna逆转录为cdna。然后清除cdna以去除衔接子引物，然后用通用正向引物和分配样本索引的48个反向引物中的一个扩增文库。使用agilent rna screentape系统进行测序前质量控制。二代测序在nextseq 500仪上进行，进样浓度为2.5pm。生物信息学分析由genevia technologies(tampere,finland)进行。使用fastqc软件检查测序读数的质量。trimgalore！[版本0.4.5；]用于去除所有样本上的衔接子序列，使用默认设置。使用fastx_trimmer软件
7353(2011))。简言之，在dionex ultimate 3000hplc系统上以0.2ml/min的流速在正相柱(luna 3μm silica(2)150x2.0mm,(phenomenex))上分离磷脂。保持柱温在35℃。使用含有10mm醋酸铵的梯度溶剂(a和b)进行分析。溶剂a含有丙醇：己烷：水(285:215:5,v/v/v)，溶剂b含有丙醇：己烷：水(285:215:40,v/v/v)。所有溶剂均为lc/ms级。用10％至32％b的线性梯度洗脱柱0-23分钟；23-32分钟，线性梯度为32-65％b；32-35分钟，线性梯度为65-100％b；在100％b下保持35-62分钟；62-64分钟，线性梯度从100％至10％b，随后在10％b下平衡64至80分钟。以负离子模式采集光谱。氘代磷脂用作内标(avanti polar lipids)。对每个样本进行三个技术重复以评价重现性。使用软件包compound discoverer
tm
(thermofisher)进行lc/ms数据分析，该软件包具有内部生成的分析工作流程和非氧化/氧化磷脂数据库。通过保留时间进一步过滤脂质并通过碎片质谱确认。
[0223]
游离脂肪酸及其氧化产物的lc/ms分析：使用与q-exactive混合四极杆-轨道阱质谱仪(thermofisher scientific，san jose,ca)在线耦合的dionex ultimate
tm 3000 hplc系统通过lc/ms分析游离脂肪酸(yy tyurina等人，nature chemistry 6,542(2014).)。简言之，使用溶剂梯度(a：甲醇(20％)/水(80％)(v/v)和b：甲醇(90％)/水(10％)(v/v)，均含有5mm醋酸铵)通过c18柱(accliam pepmap rslc，300μm 15cm，thermo scientific)分离脂肪酸及其氧化衍生物。使用从30％溶剂b至95％溶剂b的线性梯度，在70分钟内以12μl/min的流速洗脱柱，在70至80分钟内保持95％b，随后在83分钟内返回初始条件分钟并再平衡7分钟。以负离子模式采集光谱。使用xcalibur软件采集和分析分析数据。每个样本至少运行三个技术重复，以提高重现性。
[0224]
结果
[0225]
液相ev和基质结合纳米囊泡的分离：进行扫描电子显微镜(sem)以提供嵌入源自猪膀胱基质(ubm)的ecm生物支架内的mbv的高分辨率、高放大率成像。sem图像显示分散在整个胶原纤维中的直径约100nm的离散球体(图1a)。为了检查沉积到固体ecm基底中的mbv是否是与分泌到液相中的ev分开的一类独特的细胞外囊泡，使用实现从液相或固相细胞外区室中选择性收获囊泡的体外3t3成纤维细胞培养模型(图1b)。来自相差显微镜的代表性图像以及h&e和dapi染色切片显示在细胞培养板脱细胞后没有可见残留细胞或完整细胞核(图1c)。从细胞培养上清液中收获的液相ev和从脱细胞ecm中分离的mbv的tem成像(图1d)显示这两个囊泡群具有相似的形态。此外，纳米颗粒跟踪分析(nta)分布图显示液相ev和mbv的囊泡大小相似，大多数囊泡的直径《200nm(图1e)。为了确定mbv是否含有通常归因于外泌体的标志物，针对cd63、cd81、cd9和hsp70进行免疫印迹分析(j.等人(taylor&francis，2014))。结果表明，与液相ev相反，mbv显示出cd63、cd81、cd9显著降低。mbv表达的cd9和cd81水平在免疫印迹分析中几乎不可检出，并且相对于ev中表达的水平显著降低。mbv还显示出比在ev中观察到的显著更低的cd63表达(图1f)。换言之，与mbv相比，液相ev(即外泌体)富含cd63、cd81、cd9的表达水平。此外，电泳分离蛋白的银染显示mbv含有与液相ev明显不同的蛋白运载物(图1g)，这表明mbv可能是纳米囊泡的独特亚群。
[0226]
mirna被选择性地包装至源自3t3成纤维细胞的液相ev和mbv中：采用全面二代rna测序(rna-seq)对mbv和液相ev中相对于这些囊泡来源的3t3成纤维细胞亲代细胞中差异表达的mirna进行分类。生物分析仪分析显示不存在18s和28s核糖体rna，并且从液相ev和mbv分离的总rna中富集小rna分子(《200nt)。然而，来自液相ev的小rna大小分布比mbv宽得多，
在液相ev中小rna分子在100-200nt之间显著富集(图2a)。通过对从亲代细胞rna、液相ev和mbv分离物(每组n＝3)产生的mirna文库进行二代测序，分析的重点是差异mirna特征。主成分分析(pca)显示在各个组内，复制的mirna谱彼此接近聚集(图2b)。
[0227]
在亲代细胞与液相ev和mbv分离物之间观察到mirna含量的广泛差异。总体上，与液相ev相比，发现28个(50.91％)mirna在mbv中差异表达至少两倍(图2c)。此外，各自的液相ev或mbv和亲代细胞mirna谱明显不同(图2b，图2c)。为了验证mirna测序的结果，进行rt-qpcr以检测与从3t3成纤维细胞分离的液相ev相比，mbv中3个上调的mirna(mir-163-5p、mir-27a-5p、mir-92a-1-5p)和3个下调的mirna(mir-451a、mir-93b-5p、mir-99b-5p)(图2d)。结果显示，与液相ev相比，mbv中mir-163-5p、mir-27a-5p和mir-92a-1-5p的水平上调，而mir-451a、mir-93b-5p和mir-99b-5p的水平下调，从而证实mirna测序数据的结果。与液相ev相比，mbv中差异富集的mirna的ingenuity通路分析(ipa)显示与器官和系统发育和功能密切相关。相反，与mbv相比，液相ev中差异富集的mirna与涉及细胞生长、发育、增殖和形态的通路相关(图2e)。
[0228]
mbv mirna含量是细胞来源独特的：3t3成纤维细胞模型的结果显示，与分泌到细胞培养上清液中的液相ev相比，mirna在沉积在ecm中的mbv中的选择性包装。为了确定mbv mirna运载物是否是细胞来源所独特的，分离自ecm的mbv的mirna组成由从不同的人供体中分离的骨髓干细胞(bmsc)、脂肪干细胞(asc)和脐带干细胞(ucsc)体外产生，通过二代测序方法进行表征和比较。脱细胞的bmsc细胞培养板的代表性相差显微镜图像显示不存在细胞并且存在分支的纤维状结构(图3a)。从脱细胞的bmsc细胞培养板中分离的mbv的tem成像显示归因于细胞外囊泡的特征形态(图3b)。此外，纳米颗粒跟踪分析显示了bmsc、asc和ucsc来源的mbv之间的相似分布图，大多数囊泡的直径《200nm(图3c-3e)。从这些样本中分离总rna后，生物分析仪分析显示不存在核糖体rna和小rna分子(《200nt)的富集(图3f)。从样本生成mirna文库(bmsc，n＝3个人供体；asc，n＝3个人供体；ucsc，n＝3个人类供体)并进行mirna测序。主成分分析显示样本主要按其来源的细胞类型聚集(图3g)。尽管对用于产生mbv样本的每种细胞类型使用三个单独的人供体，但主成分分析显示各组内的mirna谱具有高度同质性(图3g)。此外，火山图显示，与bmsc-asc和ucsc-asc相比，bmsc和ucsc来源的mbv之间差异表达的mirna更少。
[0229]
液相ev、mbv和亲代细胞的磷脂谱：几项研究已经描述了ev的脂质组成((t.skotland等人，journal of lipid research 60,9-18(2019))。然而，没有关于mbv的磷脂组成的数据。因此，进行基于lc-ms的全局脂质组学和氧化还原脂质组学分析，以比较评价mbv和液相ev与其3t3成纤维细胞亲代细胞的磷脂组成(图4a，图4d)。在这三种样本中检测到9种主要磷脂类别，检测到的分子种类总数为536种，分布在以下主要类别之间：双-单酰基甘油磷酸酯(bmp)-59种，磷脂酰甘油(pg)-37种，心磷脂(cl)-117种，磷脂酰肌醇(pi)-33种，磷脂酰乙醇胺(pe)-102种，磷脂酰丝氨酸(ps)-45种，磷脂酸(pa)-26种，磷脂酰胆碱(pc)-107种，鞘磷脂(sm)-10种(图4d)。在它们的多不饱和脂肪酸(pufa)残基含量方面，pe、pi、pc和ps代表这些含有四-七个双键的多不饱和pl种类的主要储库(图4b)。这些pufa磷脂代表信号脂质介质的可能前体。介质的形成通过5-脂氧合酶或15-脂氧合酶对pufa磷脂的催化氧化产生氧化磷脂，随后被特化的磷脂酶a2中的一种水解以释放氧化脂肪酸(脂质介质)(z.zhao等人，endocrinology 151,3038-3048(2010)；y.y.tyurina等人，
journal of leukocyte biology,(2019))。此外，氧化的pufa磷脂充当信号传导分子，协调许多细胞内过程和细胞反应，包括细胞凋亡、铁死亡和炎症(y.y.tyurina等人，antioxidants&redox signaling 29,1333-1358(2018).)。在液相ev和mbv之间观察到这些磷脂的分子形态及其相对含量的显著差异(图4e)。sm明显除外，在所有磷脂中均检测到花生四烯酸(aa)-残基和二十二碳六烯酸(dha)-残基(图4e)。对于许多磷脂，mbv中的含量显著高于液相ev和亲代细胞(图4e)，这将mbv确定为富含pufa-磷脂的储库。pufa磷脂可以被pla2水解，导致释放游离pufa和lpl(v.d.mouchlis等人，biochimica et biophysica acta(bba)-molecular and cell biology of lipids 1864,766-771(2019))。前者可以被两种主要的加氧酶cox和lox进一步利用以产生具有促炎或抗炎能力的脂质介质(y.y.tyurina等人，redox(phospho)lipidomics of signaling in inflammation and programmed cell death.journal of leukocyte biology,(2019)；c.a.rouzer等人，chemical reviews 103,2239-2304(2003).；h.kuhn等人，biochimica et biophysica acta(bba)-molecular and cell biology of lipids 1851,308-330(2015))。该发现使mbv成为合成这些脂质介质的潜在前体，具体取决于细胞/组织环境(y.y.tyurina等人，journal of leukocyte biology,(2019).)。定量地，mbv富含pi、ps、pg和bmp(图4c和表2)。图4c中所示的磷脂含量也在表1中提供。
[0230]
表1.磷脂含量占总磷脂的百分比
[0231] 细胞evmbvpc，磷脂酰胆碱62.9541.5431.38pe，磷脂酰乙醇胺13.8424.4714.75pi，磷脂酰肌醇9.64.2133.58ps，磷脂酰丝氨酸6.4911.1812.68bmp，双-单酰基甘油磷酸酯0.130.130.55pa，磷脂酸0.110.640.42pg，磷脂酰甘油0.040.020.11sm，鞘磷脂5.8717.645.87cl，心磷脂0.970.170.66
[0232]
相反地，液相ev中pe、pa和sm的含量较高。pc是细胞和液相ev中的主要磷脂。与mbv和亲代细胞相比，液相ev中独特的线粒体磷脂心磷脂(cl)的含量显著降低(图4f)。因为cl是独特的线粒体特异性磷脂，主要定位于线粒体内膜(m.schlame等人，biochimica et biophysica acta(bba)-molecular and cell biology of lipids 1862,3-7(2017))，该发现代表mbv生物发生与细胞线粒体区室的可能联系。缩醛磷脂(或醚磷脂)在结构上与二酰基磷脂(或酯磷脂)不同(m.schlame等人，biochimica et biophysica acta(bba)-molecular and cell biology of lipids 1862,3-7(2017))。在缩醛磷脂中，乙烯基醚键将sn-1饱和或单不饱和链连接到磷脂的甘油主链(n.e.braverman等人，biochimica et biophysica acta(bba)-molecular basis of disease 1822,1442-1452(2012))。已显示醚类脂、pe和pc缩醛磷脂可以促进膜融合(p.e.glaser等人，biochemistry 33,5805-5812(1994))并增加细胞外囊泡的膜厚度(x.han等人，biochemistry 29,4992-4996(1990)；t.rog等人，biochimica et biophysica acta(bba)-biomembranes 1858,97-103(2016))，
因此可能在细胞吸收纳米囊泡中起作用。详细的ms/ms分析表明，液相ev和mbv中均含有高水平的醚pe和pc种类(纤溶酶原)。这些种类分别被鉴定为pe-16:0p/20:4、pe-16:1p/20:4、pe-18:1p/20:4、pe-18:1p/22:6和pc-16:0p/20:4、pc-18:0p/20:4、pc-20:0p/20:4、pc-18:0p/22:6(图4e)。
[0233]
表2.mbv、外泌体和亲代3t3细胞中心磷脂、磷脂酸、磷脂酰甘油和双甘油磷酸的含量。数据以pmol/nmol磷脂表示，平均值
±
s.d.，*p《0.05 vs细胞，#p《0.05 vs液相ev。
[0234] 3t3细胞液相evmbv心磷脂，cl0.97
±
0.060.17
±
0.01*0.66
±
0.20*磷脂酸，pa0.11
±
0.010.64
±
0.29*0.42
±
0.21磷脂酰甘油，pg0.04
±
0.010.02
±
0.02*0.11
±
0.02**双-单甘油磷酸酯，bmp0.13
±
0.010.13
±
0.040.55
±
0.12#*
[0235]
液相ev、mbv和亲代细胞的溶血磷脂谱：溶血磷脂(lpl)是由磷脂酶a产生的磷脂的水解代谢物，是调节多种生理反应的生物活性信号分子，包括巨噬细胞活化(r.ray等人，blood 129,1177-1183(2017))、炎症和纤维化(a.m.tager等人，nature medicine 14,45(2008))、组织修复和重塑(k.masuda等人，the febs journal 280,6600-6612(2013))和伤口愈合(k.m.hines等人，analytical chemistry 85,3651-3659(2013))等。lc-ms分析显示，lpl存在于所有三种类型的样本中，尽管它们在mbv和液相ev中的总含量是亲代细胞的1.7-1.8倍。更具体地，已经鉴定了七类lpl：溶血磷脂酰乙醇胺(lpe)、溶血磷脂酰胆碱(lpc)、溶血磷脂酰丝氨酸(lps)、溶血磷酸肌醇(lpi)、溶血磷脂酸(lpa)、溶血磷脂酰甘油(lpg)和单溶血心磷脂(mcl)(图5a)。与亲代细胞相比，mbv富含lpe、lpa和lpg(图5b)。与细胞相比，mbv和液相ev中lpi和mcl的含量显著降低。mbv中lpa和lpg的含量明显高于ev。mbv中的mlcl和lpi水平比ev高3倍和6.3倍，但比细胞低3.3倍和1.9倍(图5c，图5d)。mbv和ev之间lpe、lpc和lps的含量没有显著变化。含有16:0、16:1、18:0和18:1的不可氧化分子种类是在所有检测到的lpl种类中发现的主要类型(图5c)。这些发现表明，高水平的溶血磷脂，对巨噬细胞分化、组织修复、重塑和伤口愈合很重要的生物活性分子是mbv的特征。
[0236]
mbv和液相ev的游离和含氧脂肪酸分析：由于小鼠骨髓来源的巨噬细胞暴露于mbv导致m2样标志物fizz1和arg1表达，它们与构成型巨噬细胞表型相关(l.huleihel等人，science advances 2,e1600502(2016))，对mbv相比于液相ev和亲代细胞中的pufa及其含氧产物进行lc/ms分析。mbv富含花生四烯酸(20:4,aa)、二十二碳六烯酸(22:6,dha)和二十二碳五烯酸(22:5,dpa)脂肪酸(图6a)。换言之，mbv代表底物库，用于通过各自的酶机制-cox和lox进行信号脂质介质的生物合成。在液相ev中，主要的pufa是亚油酸(18:2)和亚麻酸(18:3)(图6a)。
[0237]
由于细胞外囊泡含有用于生物合成aa衍生脂质介质的酶促机制(e.boilard,journal of lipid research 59,2037-2046(2018))，因此对含氧脂肪酸进行氧化还原脂质组学分析。相比于mbv，在液相ev中发现更高水平的aa代谢物，例如12-hete、15-hete、脂氧素a4(图6b)。在组织修复的情况下，脂氧素a4(lxa4)和d系列消退素d1(rvd1)-由花生四烯酸(20:4,aa)和二十二碳六烯(22:6,dha)酸产生的12/15-lox-刺激m2样表型的巨噬细胞活化(cn serhan,the american journal of pathology 177,1576-1591(2010))。最后，表征mbv和液相ev中含有氧化aa和dha的氧化磷脂。mbv中含氧物质的水平高于液相ev，其中ps、
pi和pc由单含氧物质代表。bmp、pg和cl含有单氧化和双氧化aa-残基和dha-残基；仅在pe中发现三氧化的pufa(图6c)。总体上，脂质组学和氧化脂质组学结果显示，与液相ev相比，mbv中游离aa、dha和dpa和含有pufa的磷脂及其氧化修饰分子种类的水平更高。mbv，但不是液相ev，富含pufa非氧化和氧化磷脂，因此代表氧化和可氧化酯化pl种类的潜在储库，代表了由不同磷脂酶激活的脂质介质的潜在来源，依赖于细胞外环境的促炎/抗炎环境。
[0238]
进行上述基于lc-ms的脂质组学和氧化还原脂质组学研究，以对液相ev和mbv磷脂进行详细比较。结合对囊内运载物的全面rna测序和生物信息学分析，这些数据反映mbv是ev的不同且独特的亚群，不同于液相ev(即外泌体)，并且是基于ecm的生物材料的显著特征，具有限于囊泡的大小和形状的相似性。
[0239]
在本文中囊泡群基于它们的区室划分为液相细胞培养基或固相ecm基质。在组成方面，与液相ev和亲代细胞相比，从3t3成纤维细胞的ecm中分离的mbv含有不同的mirna和脂质特征。这些数据表明在囊泡生物发生过程中发生分子分选以将mirna和脂质特异性分配到运往不同细胞外位置的囊泡的情况。此外，细胞区分液体界面和固体基质的能力，以及选择性地将具有不同脂质特征的定制囊泡亚群沉积到这些不同的区室中的能力，为来自分泌到液相中的ev的生物发生的mbv的不同且独立的膜生物发生提供了证据。考虑到mbv被证明整合在细胞外基质的致密纤维状网络中，mbv应该由细胞在组织发育和稳态期间以及在损伤后的动态基质重塑期间的基质沉积过程中与ecm组分协同分泌。此外，鉴于ecm是蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖的复杂混合物，以组织特异性3d结构排列(hussey等人，nature review materials,3(7):159-173,2018)，mbv运载物和脂质含量也应该是组织和细胞来源独特的。从解剖学上不同的来源组织来源的ecm生物支架中分离的mbv具有不同的mirna特征(huleihel等人，science advances,2,e1600502，2016)。本研究的结果进一步显示，从来自不同人供体的骨髓干细胞、脂肪干细胞和脐带干细胞体外产生的ecm中分离出的mbv含有特定于细胞来源的独特mirna特征。此外，与bmsc-asc和ucsc-asc相比，在bmsc和ucsc来源的mbv之间差异表达的mirna更少，该发现可能归因于脂肪干细胞的组织特异性分化潜能(l.xu等人，stem cell research&therapy 8,275(2017))。这些发现进一步强调了mbv mirna谱的细胞特异性特征，其不受供体内在变异性的显著影响。然而，鉴于三个人供体均是男性，有必要进一步研究以确定干细胞样本中mbv的mirna运载物中与性别相关的变异。重要的是，主成分分析显示来自不同人供体的特定细胞类型沉积的mbv mirna运载物具有批间高度一致性，支持mbv和ecm生物材料生产作为研究工具或临床治疗。本研究确定整合到基质中的mbv是ev的独特亚群。此外，mbv显示通常归因于外泌体的蛋白(例如cd63、cd81、cd9)显著减少。
[0240]
与分泌到体液中并易于用于细胞间通讯的ev相比，嵌入组织ecm中的mbv与基质稳定结合，并且仅在ecm材料降解后才能分离(huleihel等人，science advances 2,e1600502(2016))。基质降解以释放mbv的要求可能部分定义了它们的作用机制，包括与它们产生促分解脂质介质的能力有关的那些。因为即使在脱细胞后mbv仍保持完整并附接在ecm上，其组成磷脂的分子形态可能促进这种mbv-ecm相互作用。使用基于lc-ms的脂质组学和氧化还原脂质组学方法，对mbv磷脂、溶血磷脂以及氧化和非氧化pufa的分子形态进行详细表征。高水平的溶血磷脂是对巨噬细胞分化、组织修复、重塑和伤口愈合很重要的生物活性分子，是mbv的特征。此外，作为融合脂质，溶血磷脂可以促进囊泡内容物向细胞内靶点的转移。
mbv(而非液相ev)富含pufa非氧化和氧化磷脂，因此代表氧化和可氧化酯化pl种类的潜在储库。值得注意的是，富含pufa的mbv是由依赖于细胞外环境的促炎/抗炎背景的不同磷脂酶激活的脂质介质的重要来源。
[0241]
实施例2：mbv用于治疗降植烷诱导的关节炎的用途
[0242]
使用如实施例1中所述的方法制备膀胱基质。
[0243]
通过在缓冲液(50mm tris ph7.5，5mm cacl2，150mm nacl)中的liberase tl(高度纯化的胶原酶i和胶原酶ii)在摇床上在室温下酶解24小时从实验室生产的猪ubm中分离mbv。然后将消化的ecm以10,000xg离心30分钟以去除ecm碎片。然后将含有释放的mbv的澄清上清液在4℃下以100,000xg(beckman coulter optima l-90k ultracentrifuge)离心2小时以沉淀mbv。
[0244]
已建立降植烷诱导的大鼠关节炎模型作为用于研究类风湿性关节炎的临床相关动物模型(tuncel等人plos one.2016；11(5):e0155936)。在研究的第0天，在8周龄雌性sprague-dawley大鼠中，通过在距基部1cm的尾部背侧皮内注射300μl的降植烷(2,6,10,14-四甲基十五烷)来诱导降植烷诱导的关节炎。在第0天，阴性对照动物未接受皮内注射降植烷。在第4天，在距背侧尾基部远端约1cm处皮内施用第二剂300μl的降植烷。接受降植烷的动物一起在笼中饲养。接受降植烷的动物被随机分为以下实验组：仅使用降植烷 pbs、降植烷 i.p.甲氨蝶呤(mtx)、降植烷 关节周围注射(p.a.)mbv和静脉内注射(i.v.)mbv。图7显示了关节周围注射和静脉内注射mbv施用途径的描述。
[0245]
在第7、10、14、17、21、28天和之后的每周，通过每只动物的100天终点确定关节炎评分。分别从掌侧和足底的角度拍摄每个前爪和后爪的照片。定性关节炎严重程度由两名独立评审员使用60分关节炎评分标准进行评价：每个发炎的指关节或脚趾给予1分，受影响的脚踝最多给予5分(每爪15分，每只大鼠60分)。指定为仅使用降植烷 pbs的动物在第7、10、14、17和21天未接受任何处理。降植烷 i.p.甲氨蝶呤动物在第7、10、14、17和21天腹腔(i.p.)接在1x无菌pbs(ph 7.4)中的0.1mg/kg甲氨蝶呤。降植烷 关节周围注射mbv动物分别接受25μl的500μg/ml猪来源的ubm mbv(1
×
10
11
个颗粒/ml)，分别在后爪和前爪的足底和掌侧表面递送。静脉内注射mbv组接受100μl的500μg/ml ubm mbv(1
×
10
11
个颗粒/ml)静脉内递送至动物的侧尾静脉中。(图12a)每组中的四只动物被分配到为期28天的短期研究中，并且四只动物被分配到为期100天的研究中。使用先前公开的甲氨蝶呤效应量确定样本量，预先确定α0.05和β0.80。关节炎评分表示为平均值 /-平均值的标准误。第7-21天代表每组的n为8，然后第28天及以后代表每组的n为4。使用tukey事后校正的双向方差分析分析组间差异。在研究前显著性确定为p《.05。
[0246]
通过靶向pa(关节周围)和全身iv施用，mbv施用显著降低大鼠关节炎的严重程度，显示出与黄金标准治疗甲氨蝶呤相似的有效性。虽然所有大鼠在第7天显示关节炎评分为0(图8a)，但早在第10天，在仅使用降植烷的大鼠中观察到高关节炎评分，并且所有接受处理的大鼠显示较低的关节炎评分(图8b)。出乎意料地，从第13天开始，mbv处理与关节炎治疗的金标准甲氨蝶呤同样有效(图8c和图8d)。直至第21天，mbv处理的大鼠(iv和pa处理的)显示出比甲氨蝶呤处理的大鼠更低的关节炎评分(图8e)。拍摄的大鼠爪照片表明仅使用降植烷以及甲氨蝶呤和mbv处理的大鼠在红斑和水肿方面存在差异(图9a-图9b)。实验前21天处理组的平均关节炎评分如图10所示。虽然与仅使用降植烷的大鼠相比，mbv施用的pa施用显
示出关节炎评分相当的降低，并且关节炎评分与甲氨蝶呤处理相当，但意外地发现静脉施用在降低关节炎评分方面与pa和甲氨蝶呤具有相同的有效性。虽然预期iv施用导致mbv效力的稀释，因此对发炎的关节有有限的影响(若有)，但未观察到这一点。出乎意料地，与仅使用降植烷的大鼠相比，mbv施用的pa和iv途径均显示出相当程度的关节炎评分降低，并且与甲氨蝶呤处理相比，两者均降低关节炎评分。由于在炎症部位的关节周围注射是疼痛的，并且个体的许多关节可能发炎，因此意外发现mbv静脉内施用与pa施用同样有效，这表明全身施用途径可用于微创但同样有效的治疗效果，每次施用仅需单次注射(而不是每个关节多次注射)，因此对患者而言更舒适。
[0247]
出乎意料地，通过iv和pa施用接mbv的大鼠的炎症复发也减少。通过实验第77天收集的数据支持mbv治疗作为有效治疗慢性炎症和复发阶段关节炎的方法。如图11a中的照片所示，在表型上，接受pa或iv mbv处理的大鼠爪表现出与接受甲氨蝶呤处理的那些相同的红斑和水肿。pa和iv mbv以与甲氨蝶呤(类风湿性关节炎的金标准护理)相同的有效性降低在炎症的慢性期和复发期中的降植烷诱导的关节炎临床评分(图11b)。类风湿性关节炎大鼠模型的组织分析导致组织炎症和组织之间的空间减少。在mbv处理的样本中，与甲氨蝶呤处理相比，空间恢复和炎症减少，揭示了mbv在有机体和组织水平上具有有效性。
[0248]
在疾病的急性期，指定为第0-42天，溶媒处理的患病动物(降植烷 pbs)的目测疾病严重程度在第17天达到峰值，峰值疾病评分为14.8
±
0.8。在第10、14、17和21天，患病动物的腹腔注射(i.p.)mtx处理(降植烷 i.p.mtx)降低急性疾病严重程度，在第21天达到峰值疾病评分(9.8
±
0.8)(图12c，p《.05)。在第10、14、17、21和28天，局部、关节周围(降植烷 p.a.mbv)施用降低疾病的严重程度，在第10天的疾病评分峰值为6.9
±
0.9(图12d.，p《.05)。在第10、14、17、21和28天，全身静脉内(降植烷 i.v.mbv)施用降低疾病的严重程度，在第10天的疾病评分峰值为8.0
±
0.6(图12e，p《.05)。急性期三个处理组之间无显著差异(p》.05)；所有三个处理组均不同于无病对照组(p》.05)。总之，i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv在减轻疾病急性期的ra疾病严重程度方面同样有效。
[0249]
由于ra是具有慢性复发缓解表型的疾病，因此在急性期后观察动物以辨别mbv施用对慢性疾病发展的长期影响。第28天后，直至第100天完成研究，未施用另外的mtx或mbv处理。在慢性期开始时(第42天)，疾病严重程度已经消退，并且从第42天至第63天，以下组之间没有差异(p》.05)：降植烷 pbs、降植烷 i.p.mtx、降植烷 p.a.mbv和降植烷 i.v.mbv。在第70天，降植烷 pbs组开始出现第二次疾病发作，持续上升直至第100天，此时最终疾病严重程度评分为17.3
±
5.1。相反地，降植烷 mtx、降植烷 p.a.mbv和降植烷 i.v.mbv组在第100天没有出现这种上升趋势。进一步相反地，mtx施用，p.a.mbv和i.v.mbv导致mtx从第84-100天的疾病严重程度显著降低(图12c，p《.05)，对于p.a.mbv从第70-100天开始(图12d，p《0.05)，以及对于i.v.mbv从第70-100天开始(图12e，p《.05)。虽然所有三种处理条件均防止第100天疾病严重程度的复发，但三个处理组之间的疾病评分没有差异(p》.05)。该数据出乎意料地显示，全身施用是有效且无毒的，并且未表现出预期的稀释效应。
[0250]
数据表明，mbv局部施用和全身施用可预防降植烷引起的关节炎的急性和慢性发展，其有效性与甲氨蝶呤相当。出乎意料地，mbv的初始疗程，无论是全身的还是局部的，mbv可以在mbv初始疗程结束后的数周至数月内具有缓解关节炎症状的治疗效果，从而降低随后类风湿性关节炎症状发作的严重程度或频率或甚至消除，导致缓解。此外，出乎意料地发
现全身施用的mbv未出现稀释效应，并且与关节周围局部施用的mbv同样有效。
[0251]
实施例3：基质结合纳米囊泡减少前列腺素诱导的关节炎中的滑膜炎症浸润、关节软骨破坏和关节蛋白聚糖丢失。
[0252]
滑膜炎症、软骨破坏和蛋白聚糖丢失是ra疾病进展中发生的基本组织病理学变化。为了确定mbv处理对这些组织病理学参数的影响，在研究结束时从实施例2的动物中收集大鼠后爪用于组织病理学成像和分析(第100天)。
[0253]
每只动物的一只后爪用于组织病理学分析。组织标本用pbs中的10％福尔马林固定，ph 7.4，用5％甲酸脱钙，并包埋在石蜡中。切片经苏木素和伊红(h&e)染色，通过光学显微镜检查关节组织学和病理学。切片用甲苯胺蓝和伊红复染剂染色，以通过光学显微镜检查以评估关节软骨的蛋白聚糖组成。
[0254]
通过使用适应的三参数评分系统研究胫距关节的炎症和关节损伤。根据滑膜组织中炎症细胞的相对比例，以0-3的等级对炎症进行评分(0表示没有炎症，3表示重度发炎的关节)。软骨破坏的评分为0-3，结果范围从出现死软骨细胞和空腔到关节软骨完全损失。软骨中蛋白聚糖丢失以0-3的等级评分，这里的结果范围从甲苯胺蓝染色完全染色的软骨到关节软骨的完全损失。对于每组，计算所有参数的综合评分。组织学评分表示为平均值
±
标准误。
[0255]
溶媒处理的动物发展以增加的滑膜炎性细胞浸润、关节软骨退化和关节蛋白聚糖丢失为特征的大量关节病理学(图13a)。与对照组 pbs组相比，降植烷 pbs组滑膜炎症(2.7
±
0.3 vs 0.0
±
0.0)、软骨破坏(2.0
±
1.0 vs 0.0
±
0.0)和蛋白聚糖丢失(2.7
±
0.3 vs 0.0
±
0.0)与阴性对照动物组相比增加(图13a-13e，p《.05)。与降植烷 pbs组(2.7
±
0.3)相比，所有处理组-降植烷 mtx(0.7
±
0.3)、p.a.mbv(1.7
±
0.7)和i.v.mbv(0.7
±
0.3)-通过组织学评分显示滑膜浸润和炎症减少(图13a-13e，p《.05)。虽然在软骨破坏和蛋白聚糖丢失方面，降植烷 pbs组和三个处理组之间没有显著差异，但所有三个处理组均显示出这些参数的降低(图13c和d.，p》.05)。与降植烷 pbs组相比，所有处理组-再次降植烷 mtx、p.a.mbv和i.v.mbv-显示所有三个参数的累积评分降低(降植烷 pbs(7.3
±
1.2)vs降植烷 mtx(2.3
±
0.3)和降植烷 i.v.mbv(2.3
±
0.3))(图2.e.，p《.05)。在所有三个组织学参数上，三个处理组之间未观察到差异(图12a-13e，p》.05)。该数据表明全身施用是有效且无毒的。
[0256]
实施例4：基质结合纳米囊泡减少炎症细胞浸润并促进促炎性滑膜m1样巨噬细胞向抗炎m2样巨噬细胞的调节。
[0257]
使用来自前面提到的样本的组织切片，使用免疫组织化学评估接近胫距关节的滑膜组织中的巨噬细胞表型。石蜡包埋的组织切片使用二甲苯三次洗涤进行脱蜡，然后使用从100％至70％乙醇的乙醇交换减少进行再水合。根据生产商的方案(biogenex)，使用市售的decal溶液进行抗原修复。然后在室温下使用在1x tris缓冲盐水(ph 7.4)中的5％牛血清白蛋白封闭切片一个小时。封闭后，切片在4℃下与以下一抗和稀释液一起孵育～18小时：山羊抗cd68(1:100)、兔抗tnfα(1:100)和小鼠抗cd206(1:100)。一抗孵育后，切片在室温下与以下荧光偶联的二抗孵育1小时：抗兔300、抗小鼠488和抗山羊594。切片用draq5进行核染色和图像复染。
[0258]
促炎性m1样巨噬细胞和m2样巨噬细胞之间的不平衡是ra病理学的关键组成部分。
与对照 pbs相比，降植烷 pbs增加滑膜tnf-α /cd68 、m1样巨噬细胞相对于滑膜cd206 /cd68 、m2巨噬细胞的比率(3.9
±
0.9 vs 1.5
±
0.2，图14a和14b，p《.05)。与降植烷 pbs相比，降植烷 mtx(0.7
±
0.4，图14a和14b，p《.05)、降植烷 p.a.mbv(1.0
±
0.4，图14a和14b，p《.05)和降植烷 i.v.mbv(0.7
±
0.4，图14a和14b.，p《.05)中m1样：m2样巨噬细胞的比率降低。m1样：m2样巨噬细胞的比率在处理条件之间没有显著差异，并且在处理条件和对照 pbs组之间没有显著差异(图14a和14b，p》.05)。关于m2样：m1样巨噬细胞的比率，在处理组、对照 pbs组和降植烷 pbs组之间没有差异(图14a和14c)。虽然没有统计学显著性，但与对照 pbs和降植烷 pbs相比，在所有三个实验吹组的动物滑膜中均观察到m2样：m1样巨噬细胞的比率增加(图14a和14c)。
[0259]
实施例5基质结合纳米囊泡在降植烷诱导的类风湿性关节炎模型中防止不利的骨重塑和关节破坏
[0260]
在实施例2中研究的动物的第100天处死后获得后爪的显微计算机断层扫描(microct)图像。使用复合连续切片图像呈现3-d图像并显示在图15a-b中。
[0261]
与降植烷 pbs组相比，通过显微ct成像和关节的3-d重建观察到，所有三个处理组均显著减少定性骨损伤和关节退化。在前爪中，与溶媒对照相比，i.p.mtx、p.a.mbv和i.v.mbv施用显著预防不利的骨重塑。这些预防性变化发生在动物的前爪和后爪中。在前爪中，观察到尺骨和桡骨与前爪的小腕骨的关节损伤，更远侧的指间关节和腕-指关节的变化很小(图15a)。在后爪中，主要在胫骨和距骨的关节处观察到不利的重塑，这可以通过显微ct上的融合(联合)和该关节的缺失来证明(图15b)。同样，该数据表明全身施用mbv显著降低ra引起的定性骨和关节损伤。效果类似于mbv的关节周围施用，表明出乎意料地，mbv的全身施用没有稀释效应。
[0262]
实施例6：基质结合囊泡(mbv)用于治疗胶原蛋白诱发的关节炎的用途
[0263]
源自ubm的ubm和mbv使用实施例2中所述的方法制备。
[0264]
在研究的第0天，在8周龄的雌性sprague-dawley大鼠中，通过在尾背侧、距基部远端1cm处皮下注射100μl 200μg/ml ii型牛胶原蛋白乳液和弗氏不完全佐剂来诱导胶原蛋白诱导的关节炎。对照动物在第0天不接受皮内注射ii型胶原乳液。在第7天，皮下注射第二剂100μl 200μg/ml ii型胶原蛋白乳液，距背侧尾基部远端约1cm。接受ii型胶原乳液的动物一起在笼中饲养。接受ii型胶原乳液的动物随机分为以下实验组：ii型胶原蛋白乳剂、甲氨蝶呤、关节周围注射mbv和静脉内注射mbv。关节炎评分在第7、10、14、17、21、28天以及此后每周至100天对每只动物进行测定。每只前爪和后爪的照片分别从掌侧和足底的角度拍摄。关节炎使用60分关节炎评分标准进行评估：每个发炎的指关节或脚趾给予1分，受影响的脚踝最多给予5分(每只爪15分，每只大鼠60分)。仅指定为ii型胶原乳液的动物在第7、10、14、17和21天不接受任何处理。在第7、10、14、17和21天，甲氨蝶呤动物腹腔递送1x无菌pbs中的0.1mg/kg甲氨蝶呤。关节周围注射mbv动物接受25μl的500μg/ml猪来源的ubm mbv，分别在后爪和前爪的足底和掌侧表面递送。静脉内注射mbv组接受100μl的500μg/ml ubm mbv，静脉内递送至动物的侧尾静脉中。每组中的四只动物被分配到为期28天的短期研究中，四只动物被分配到为期100天的研究中。样本量使用先前公开的甲氨蝶呤效应量确定，预先确定的α0.05和β0.80。关节炎评分表示为平均值 /-平均值的标准误。使用tukey事后校正的双向方差分析来分析组间的差异。在研究之前使用0.05的α确定显著性。
[0265]
结果表明，与未处理的对照动物相比，接受mbv处理的动物的关节炎评分显著降低，并且mbv处理的动物的关节炎评分与甲氨蝶呤处理的动物的关节炎评分相当。此外，发现静脉内mbv处理与关节周围mbv处理同样有效。这些数据表明，mbv处理关节炎与治疗关节炎的金标准：甲氨蝶呤同样有效。此外，数据表明mbv的全身施用与局部施用在治疗类风湿性关节炎方面具有相似的疗效，并且mbv的初始施用，无论是全身的还是局部的，均可以在初始施用mbv后的数周至数月内缓解关节炎症状，从而降低类风湿性关节炎症状随后发作的严重程度或频率，甚至消除。
[0266]
实施例7：基质结合囊泡(mbv)用于治疗银屑病的用途
[0267]
膀胱基质(ubm)的制备：ubm如前所述制备(mase vj等人orthopedics.2010；33(7):511)。来自上市体重的动物的猪膀胱获自tissue source,llc。简言之，机械去除浆膜、外层肌层、粘膜下层和粘膜肌层。通过用去离子水洗涤，使被膜粘膜的管腔尿路上皮细胞与基底膜分离。剩余的组织由基底膜和下层粘膜固有层组成，并通过在0.1％过氧乙酸和4％乙醇中以300rpm搅拌2小时进行脱细胞。然后用pbs和无菌水彻底冲洗组织。然后将ubm冻干并使用带有#60目筛的wiley mill研磨成颗粒。
[0268]
基质结合纳米囊泡的分离：通过在缓冲液(50mm tris ph7.5，5mm cacl2，150mm nacl)中用liberase tl(高度纯化的胶原酶i和胶原酶ii)在摇床上于室温下酶消化24h从实验室生产的猪膀胱基质(ubm)中分离mbv。然后将消化的ecm以10,000
×
g(30分钟)离心以去除ecm碎片。然后在4℃下以100,000
×
g(beckman coulter optima l-90k超速离心机)将含有释放mbv的澄清上清液离心2小时以沉淀mbv。
[0269]
银屑病的诱导和处理方案：在8周龄雌性c57/bl6小鼠中，通过每天将62.5mg的5％咪喹莫特乳膏外用涂至小鼠剃毛的背部和右耳廓，持续7天，诱导银屑病。7天后动物的背部和右耳廓剃毛的图像显示在图16中。对照动物在整个研究过程中未接受外用咪喹莫特，而是将凡士林外用施用至剃毛的背部和右侧耳廓。处理组和治疗范式分为银屑病发作的预防和现有发作的管理。接受预防性治疗的那些动物在研究的第0-16天之间接受处理，而接受管理治疗的那些动物在研究的第7-16天之间接受处理。接受静脉内注射mbv的动物在研究的每一天接受500μg/ml猪来源的ubm mbv，如处理时间表所指定。从第0天至第7天，红斑、鳞屑和厚度由两名独立评审员使用根据临床银屑病面积和严重程度指数(pasi)修改的客观评分系统进行评分。红斑和鳞屑评分为0-4，评分为0＝无、1＝轻度、2＝中度、3＝明显、4＝极明显。每天使用千分尺测量右耳耳廓的厚度，并根据与当天相比厚度的增加对皮肤的厚度进行评分-(1表示20-40％，2表示40-60％，3表示60-80％，4表示》80％)。将每个指标的总评分与以12分总分(0-12)表示的银屑病炎症总分相加。动物从第0天至第7天的累积银屑病评分(pasi)显示在图17中。
[0270]
统计分析：使用先前公开的阿曲汀效应量确定样本量，预先确定α0.05和β0.80。银屑病面积和严重程度指数(pasi)评分表示为平均值 /-平均值的标准误。使用tukey事后校正的双向方差分析分析组间差异。在研究之前用0.05的α确定显著性。
[0271]
如所提供的动物的pasi评分和图像所证明的，mbv的全身施用减少咪喹莫特诱导的银屑病的红斑和鳞屑。此外，全身施用mbv可减少咪喹莫特诱导的银屑病的皮肤厚度。mbv处理动物的pasi评分显著低于未处理动物，这表明全身施用mbv是治疗银屑病的可行疗法。
[0272]
实施例8：mbv未产生免疫抑制作用
[0273]
keyhold limpet hemocyanin(klh)大鼠免疫抑制和免疫毒性模型用于评估全身施用mbv的免疫毒性。将8周龄的sprague-dawley大鼠分为四组：klh对照用于证明用klh免疫后的正常抗klh反应，溶媒对照用于对照与处理或klh免疫无关的任何潜在作用，环磷酰胺阳性对照作为有效的免疫抑制剂，并且mbv处理组用于评估mbv施用对全身免疫的作用。在第0天，环磷酰胺处理的动物接受200mg/kg i.p.，并且在第0、3和6天，mbv处理的动物接受静脉内递送1mg/ml ubm mbv。在第7天，除溶媒对照外，所有组均接受0.4ml的在弗氏不完全佐剂中1000μg/ml复溶的klh进行i.p.免疫。在第14、21和28天(免疫后第7、14和21天)，从侧尾静脉收集全血并分离血清用于分析抗klh igm和igg。使用elisa评估所有动物血清中的抗klh igm和igg。结果显示在图18(抗klh igm水平)和图19(抗klh igg水平)中。
[0274]
如图18和19所示，在用klh免疫之前全身施用mbv不影响宿主动物对klh抗原产生正常igg或igm抗体应答的能力。与溶媒 klh对照相比，在第7、14和21天，已知的免疫抑制剂环磷酰胺显著降低抗klh igg和igm水平。在产生的igg或igm水平方面，溶媒 klh对照和mbv处理的动物之间没有显著差异。
[0275]
这些结果表明，全身施用mbv不抑制生理性抗体免疫应答，并且与其他免疫抑制性自身免疫疾病的标准治疗(如甲氨蝶呤和环磷酰胺)相比，mbv可用于治疗ra和其他自身免疫不抑制免疫系统的疾病。因此，使用mbv治疗自身免疫性疾病可以避免免疫抑制疗法的副作用，例如感染和癌症。
[0276]
鉴于可以应用所公开主题的原理的许多可能的实施方案，应当理解，所示实施方案仅是本发明的实例，不应视为对本发明范围的限制。相反，本公开的范围由以下权利要求限定。