一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14K蛋白及其在抗病毒中的用途

一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14k蛋白及其在抗病毒中的用途
技术领域
1.本发明属于农业科学技术领域，涉及农作物病毒病害的分子检测技术，具体涉及一种可诱导植物细胞坏死的小麦黄花叶病毒14k蛋白及其在抗病毒中的用途。


背景技术：

2.土传小麦病毒由土壤中的禾谷多黏菌(polymyxa graminis l.)传播，禾谷多黏菌是一种专性寄生于禾本科植物根部的原生生物。由禾谷多黏菌传播的禾谷类病毒小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,wymv)属于大麦黄花叶病毒属(bymovirus)。wymv广泛分布于安徽、河南、江苏、湖北、陕西、四川和山东等冬小麦生态区。上世纪60年代以前，小麦黄花叶病害仅在我国少数地区发生。自70年代至今，已成为河南、江苏、山东等省的重要麦类病害，蔓延迅速发病面积逐年增多，致使小麦病田严重减产。由于其传播介体禾谷多黏菌可在土壤中长期存活，且抗逆性极强，防治困难，因此目前防治土传小麦病毒病的最重要的方式是鉴定和推广抗性品种。
3.wymv为弯曲线状病毒粒子，由rna1和rna2两条正义单链的rna组成。rna1全长共7636个核苷酸，只编码一个由2404个氨基酸组成的多聚蛋白的开放阅读框(open reading frame，orf)，经蛋白酶切割后形成8个成熟的蛋白，分别为p3，7k，细胞质内含体蛋白(cytoplasmic inclusion，ci)，14k，基因组连接蛋白(viral genome-linked protein，vpg)，细胞核内含体蛋白a(nuclear inclusion a,nia)，细胞核内含体蛋白b(nuclear inclusion b，nib)和外壳蛋白(coat protein,cp)。wymv rna2全长共3651个核苷酸，整个基因组也仅有一个orf，编码一个904个氨基酸组成的约100kda的多聚蛋白，通过切割产生p1和p2两个成熟的非结构蛋白。14k是wymv中分子量较小的蛋白，富含疏水性氨基酸，具有一个跨膜结构域(transmembrane domains,tmd)，目前对wymv 14k蛋白功能解析还是未知的。
4.病毒属于专性寄生物，必须在宿主细胞内才能完成病毒的生活史，其中包括病毒的增殖和移动。病毒在侵染植物细胞过程中植物通过识别病毒致病因子激活植物免疫反应以抵抗病毒侵染，这其中包括细胞坏死反应。细胞坏死的特点是在病毒侵染的细胞周围诱导程序性细胞死亡以限制病毒扩散，该坏死症状通常从病毒侵染的叶片开始坏死，逐渐扩散到植物茎杆基部及周边叶片的坏死。因此，研究诱导植物细胞坏死的病毒蛋白可为农作物抗性品种的选育提供有效的候选靶标。


技术实现要素：

5.本发明鉴定了小麦黄花叶病毒14k蛋白的功能。利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)介导的基因过表达体系，明确了小麦黄花叶病毒基因组中14k蛋白诱导植物细胞坏死并抑制trv病毒系统侵染。本发明公开了一种氨基酸序列：lvyvicllilinliyrll(seq.no.15,14k蛋白跨膜结构域)。
6.进一步的，本发明公开了一种含有上述seq.no.15的氨基酸序列：sndmltdetlsnalgifnpktnlflllatkgfklvyvicllilinliyrllshwrawlknkndnvnpdaltntmtvqegseilkevlkmtpamrrevtkdmkvavadndstfsfvfphehidle(seq.no.16,14k蛋白)。
7.同时，本发明公开了一种编码所述14k蛋白的核苷酸序列:tcaaacgacatgttgactgatgaaacactgtcaaacgctctaggcatcttcaacccaaagaccaacctcttcctccttctcgcaaccaaaggttttaaacttgtttacgttatctgcctgcttatattaataaacctcatctaccgcttgctctcccactggagagcttggttgaagaacaagaacgataacgtgaatcccgatgccctcaccaacaccatgacagttcaggaaggaagcgaaattctcaaggaagtattgaagatgactccagcgatgcgcagggaggtgaccaaggatatgaaagttgcagttgctgataacgacagcacattctctttcgtgttccctcacgaacacattgacctcgag(seq.no.17,14k蛋白核苷酸序列)。
8.另一方面，本发明公开一种用于扩增所述基因(seq.no.17)的一对引物：tcaaacgacatgttgact(seq.no.18)和tcactcgaggtcaatgtgt(seq.no.19)。
9.另外，本发明提供了一种trv-14k重组载体。
10.再一方面，本发明提供了所述14k蛋白跨膜结构域和14k蛋白在制备抗病毒剂中的用途。
11.本发明的具体研究过程如下：
12.1.将ncbi中wymv rna1(genbank:nc_002350.1)和rna2(genbank：nc_002349.1)分别划分18和9个核酸片段(编为1-1至1-18，2-1至2-9，每个片段约500-600bp，连续的两个片段之间含有重叠片段)，并将这些核苷酸序列正义链连接到trv载体(trv-rna2)中，并与trv-rna1农杆菌共浸润本氏烟，设置报告基因gus片段构建于trv载体中，以过表达trv-gus作为阴性对照，持续观察本氏烟症状表型。实验结果表明农杆菌浸润5天后，与对照组相比，过表达1-9片段(trv-1-9)引起本氏烟接种叶片及茎基部的明显细胞坏死反应，并且显著抑制trv病毒系统性侵染(图1)。
13.2.为明确诱导坏死反应的因子是1-9产生的多肽或病毒来源的小干扰rna(vsirna)，本研究将1-9的反向互补序列构建到trv载体，发现其并未引起明显坏死症状，表明引起本氏烟坏死症状的不是vsirna。另外我们将1-9序列中对应wymv的7个翻译起始密码子及其5’端的延伸序列进行缺失突变，分别构建到trv过表达载体中(trv-1-9m1至trv-1-9m7)(图2)，并通过农杆菌共浸润法侵染本氏烟并持续观察症状。
[0014][0015][0016]
结果表明，侵染5天后除了trv-1-9m1可以诱导细胞坏死外，其余突变体和对照相比均无明显变化。鉴于1-9中包含有wymv 14k完整orf，因此将14k构建到trv载体中(trv-14k)并侵染本氏烟，发现14k在本氏烟上出现明显的坏死症状，表明1-9诱导细胞坏死的因子为14k蛋白。为进一步明确14k诱导的细胞坏死是否由其编码的氨基酸引起，本实验对14k基因序列进行碱基缺失突变，使其翻译提前终止。利用缺失突变后的14k基因序列构建trv重组载体，农杆菌侵染本氏烟5天后观察症状，结果表明缺失突变后的14k并未引起本氏烟叶片及茎基部坏死(图2)，结果表明14k诱导的细胞坏死反应确实是由其编码的蛋白引起。
[0017]
3.通过软件预测14k蛋白具有一个跨膜结构域，本研究将跨膜结构域中疏水性氨基酸用脯氨酸替代，从而破坏跨膜结构域的功能，构建突变体至trv载体中(trv-m14k)，其中m14k氨基酸序列为：sndmltdetlsnalgifnpktnlflllatkgfklvyvicppppinliyrllshwrawlknkndnvnpdaltntmtvqegseilkevlkmtpamrrevtkdmkvavadndstfsfvfphehidle(seq.no.31)。同时，将跨膜结构域两端区域(n端及c端)分别单独缺失，构建突变体trv-14k(
△
n)、trv-14k(
△
c)，其中14k(
△
n)氨基酸序列为：shwrawlknkndnvnpdaltntmtvqegseilkevlkmtpamrrevtkdmkvavadndstfsfvfphehidle(seq.no.32)，14k(
△
c)氨基酸序列为：sndmltdetlsnalgifnpktnlflllatkgfk(seq.no.33)。农杆菌浸润后持续观察本氏烟上引起的
for qpcr说明书，两步法合成cdna备用。
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实施例2：引物设计
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根据ncbi中wymv两条rna链rna1(genbank:nc_002350.1)和rna2(genbank：nc_002349.1)的序列设计全基因组随机引物，用于筛选和鉴定wymv细胞坏死区域。在设计引物时需要在每个序列前加入psti序列及其同源臂序列(cctgcag)。具体引物列表见表1。
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表1.载体构建的引物序列
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实施例3：目的片段的扩增及回收
[0035]
根据wymv-cp序列，设计检测小麦植株是否带毒的检测引物序列为(wymv-detected-f(seq.no.31):5'-ccgccaccaaagagaaatgg-3'，wymv-detected-r(seq.no.32):5'-tcggaggtgagcatggtatt-3')。以感病小麦cdna为模板，进行扩增反应。
[0036]
50μl克隆体系如下：
[0037][0038][0039]
混匀后按以下反应程序进行pcr扩增：1)94℃预变性5min；2)，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；3)，72℃终延伸10min。pcr产物经1％(质量体积比)的
琼脂糖凝胶电泳检测后，用紫外凝胶成像系统拍照记录。若扩增谱带明显，并具有特异性，在长波紫外灯下切取特异的扩增谱带，按照genstar公司的starprep gel exraction kit试剂说明书进行回收。回收产物与单酶切回收后的载体用诺唯赞同源重组酶进行连接，连接产物全部转化大肠杆菌感受态细胞，后用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落于150μl含kan(50μg/ml)的lb液体培养基中，37℃，200rpm/min震荡培养3h，待菌液浑浊进行菌液pcr检测。将含有目的条带大小的菌液送往擎科生物公司进行dna测序以验证序列的准确性。
[0040]
实施例4：农杆菌共浸润烟草
[0041]
取上述连接成功的表达载体质粒1μg加入到农杆菌gv3101电击感受态中，电击转化后用含有kan(50μg/ml)和rif(20μg/ml)抗生素的平板筛选阳性克隆。将含有目的基因重组载体质粒的农杆菌于瞬时缓冲液(10mm mes、10mm mgcl2和200μm乙酰丁香酮，现配现用)中洗脱重悬，调至od
600
为1.0左右，与trv-rna1按照1:1的比例混匀，28℃放置2小时后，选取叶片平整，9-10叶期的适龄本氏烟，用去掉针头的针管将菌液均匀缓慢地注射在叶片背面。目的基因及对照组均设置3个重复。将浸润后的本氏烟置24℃温室环境中培养，每日观察并记录烟草生长状况。
[0042]
实施例5：荧光定量pcr(rt-qpcr)
[0043]
根据trv cp基因序列，利用ncbi primer designing tool设计特异性定量引物，内参基因为烟草ubc。引物序列见表2.2。
[0044]
表2.2 rt-qpcr涉及引物及序列
[0045][0046][0047]
参照上海翊圣生物科技有限公司hieff
tm qpcrgreen master mix(low rox plus)说明书进行定量pcr检测，10μl检测体系如下：
[0048][0049]
将上述试剂依次加入384孔定量板(applied biosystems)中，混匀后，在实时荧光定量pcr仪中按照以下三步法程序进行反应：
[0050][0051]
定量结果采用2-δδct
的相对定量方法分析，各基因mrna的表达量对持家基因ubc的表达量进行归一化。本实验共设置3次独立实验，每次独立实验设置3个生物学重复，每个生物学重复分别进行两个技术重复。