用于获得免疫抑制性树突细胞的方法

用于获得免疫抑制性树突细胞的方法1.本技术是申请号为201480003942.3的中国专利申请的分案申请，原申请是2014年1月2日提交的pct国际申请pct/ep2014/050012于2015年7月3日进入中国国家阶段的申请.
技术领域：
：2.本发明涉及用于产生免疫抑制性树突细胞的方法。本发明还涉及这种细胞用于治疗经历了实体器官移植和/或患有移植物抗宿主病、自身免疫病和超敏反应疾病之患者的用途。本发明特别地涉及相对于免疫刺激性树突细胞优先产生免疫抑制性树突细胞的方法。
背景技术：
：：3.树突细胞(dc)被认为是用于起始和控制人类中细胞免疫应答的有效抗原呈递细胞。因为根据dc与t细胞的响应特异性克隆相互作用时其所表达的潜在性能的情况，dc可以是免疫刺激性的或免疫抑制性的，所以dc被认为是t细胞介导的免疫反应中非常重要的关键成员.作为宽的但是广泛接受的概括，未成熟dc比其更成熟对应物更具“耐受原性”，而成熟dc被认为比其未成熟前体更具“免疫原性”。由单核细胞离体产生并且具有特定抗原的dc在任一免疫方向上有效作用的能力依赖于其返回患者后的生存力和活力。逻辑上推断，反作用的免疫刺激性和免疫抑制性dc之间的平衡是dc依赖性治疗性免疫应答的方向和效力的主要决定因素。4.本发明的目的是促进特别有利于产生强的以及临床相关的免疫应答之dc群的产生。虽然对基于dc的治疗有着很大的期望，例如在增强抗癌免疫力方面的努力，但是临床结果通常总是让人失望.例如，最近首个由fda批准的用于实体瘤的免疫疗法provenge是对由血液单核细胞离体产生dc的常规方法进行调整，其对患有晚期前列腺癌的患者产生仅4个月的存活的改善.此外，provenge迄今没有示出减小经治疗之前列腺癌的大小。在阻碍所得dc的体内活力和生存力的条件下，诱导dc的常规方法以及fda批准的用于“液体”恶性皮肤t细胞淋巴瘤(cutaneoustcelllymphoma，ctcl)的疗法体外光化学疗法(extracorporealphotopheresis，ecp)受到相对异质dc群产生的阻碍.通过使用更接近生理的条件来产生治疗性dc，本发明能够产生更加同步成熟的dc，其生存力和活力不受产生它们的方法固有的因素抑制。另外，这种方法可适用于人和动物二者的白细胞。5.dc引发cd8 细胞毒性t细胞(ctl)和cd4 t辅助细胞(th1)应答二者。dc能够捕获和加工抗原，并且迁移到局部淋巴结以呈递捕获的抗原并诱导t细胞应答。在人类中，dc是外周血中相对稀少的组分(＜白细胞的1％)。然而，可通过实验室程序由cd34 前体或血液单核细胞分化大量dc。6.由于前述性质，dc被认为是引起有效抗肿瘤免疫应答的一种重要细胞物质.想法是产生在其mhci类和mhcii类复合体上呈递肿瘤特异性抗原并可被(再)引入到患者中从而发起对肿瘤的免疫攻击的树突细胞。然而，产生这种免疫刺激性树突细胞通常需要使用复杂并且相当昂贵的细胞因子混合物(cytokinecocktails)使cd34 前体或血液单核细胞分化。在那些标准方法中，以比在生理条件下体内遇到的那些高得多(通常按数量级)的浓度使用细胞因子.因此，对于基于dc的免疫调节产生的整体上令人失望的临床结果，提出一种的原因是由普通细胞因子方法产生的dc可能无法在患者中实际上远远更低的细胞因子浓度下有效作用。选择在显著高生理浓度的生长因子(例如，细胞因子)下离体产生的dc将依赖于在患者的体内环境中重现的条件。7.除了前述免疫刺激性树突细胞外，已经描述了其他类型的树突细胞，即耐受原性树突细胞，其也被称为免疫抑制性树突细胞或免疫阻抑性树突细胞。这些类型的树突细胞在维持免疫耐受中具有重要作用，并且已经被讨论用于治疗情况如实体器官移植、移植物抗宿主病、自身免疫病和超敏反应疾病(参见，例如，hu等.immunology，(2010)，132，307-314)。8.经典体外光化学疗法(ecp)已被成功地用于治疗患者亚群中的皮肤t细胞淋巴瘤(ctcl)。在ecp中，患有ctcl的患者接受可光活化(photoactivatable)化合物8-甲氧基补骨脂素(8-mop)。然后对患者进行白细胞单采以获得血沉棕黄层并使这些血沉棕黄层(buffycoat)通过连续的闭合回路(circuit)紫外线暴露装置以辐照所述白细胞单采的血沉棕黄层，从而致死地损伤暴露的淋巴细胞。以这种方式，8-mop被诱导与dna的碱基对共价交联。ecp的理念是破坏ctcl的增殖中的转移性t细胞，然后静脉内重新向患者引入濒死细胞.已知这种方法还导致通过的血液单核细胞转化成dc而不需要通过添加外源细胞因子进行刺激。此外，假设这些ecp诱导的dc内化、加工并展示来自肿瘤细胞的抗原，其被8-mop和uv辐照的组合破坏。已经假设向患者重新引入这些负载的树突细胞至少部分地导致了ecp在治疗ctlc时的成功。事实上，还假设对于不使用8-mop或uv光辐照但是使包含单核细胞的体外血液样品在剪切应力下通过ecp装置的ecp样过程使单核细胞起始分化为dc。9.然而，还发现，ecp或ecp样过程导致截短的即免疫抑制性或耐受原性dc，其很可能强烈地有助于ecp在治疗移植物抗宿主病(通常在骨髓干细胞同种异体移植物之后)中的临床功效。对于ecp在单核细胞分化为免疫刺激性或免疫抑制性dc的精确机理方面依然不清楚(对于ecp过程的综述，参见girardi等(2002)，transfusionandapheresisscience，26，181-190).10.因此，目前的ecp和ecp样过程被设想为导致免疫刺激性dc和免疫抑制性dc的复杂混合物.当然，尤其从临床观点来看，重要的是理解如何改进ecp和ecp样过程以克服这些限制，以及如何有目的地以及选择性地相对于免疫刺激性dc可优先获得免疫抑制性dc(反之亦然)。另外，在原理上，经典ecp过程是一种体内方法，因为获得的树突细胞混合物被重新输注入患者中。然而，希望具有允许在人或动物体外相对于免疫刺激性dc优先产生免疫抑制性dc(反之亦然)的可用方法。11.因此，一直需要允许可预测地并且可重复地产生个体特异性即，自体免疫抑制性树突细胞的方法，其在重新引入到患者中后允许治疗例如自身免疫病(例如多发性硬化或移植物抗宿主病).技术实现要素：12.本发明的一个目的是提供用于产生免疫抑制性树突细胞的方法。13.本发明的另一个目的是提供用于产生免疫抑制性抗原呈递细胞的方法。14.本发明的另一个目的是提供用于在获自患者的体外量的血液中产生免疫抑制性树突细胞或免疫抑制性抗原呈递细胞的方法。15.本发明的另一个目的是提供不需要细胞因子混合物的用于在获自患者的体外量的血液中产生免疫抑制性树突细胞或者免疫抑制性抗原呈递细胞的方法。16.本发明的另一个目的涉及这种免疫抑制性树突细胞或免疫抑制性抗原呈递细胞用于治疗经历了实体器官移植和/或患有移植物抗宿主病、自身免疫病和超敏反应疾病之患者的用途。17.如通过下文随后的描述将变得明显的，这些和其他目的由独立权利要求的主题得以解决.本发明的一些优选实施方案形成了从属权利要求的主题。而本发明的另一些实施方案可由随后的描述获得.18.本发明在一定程度上基于用于小型化和可扩展装置的下文展现的数据，所述装置允许：(i)模拟经典ecp程序的一些方面，以及(ii)阐明诱导体外量的血液中单核细胞向免疫刺激性自体树突细胞分化的细胞和分子机理和生物物理条件。该数据表明血小板的活化以及在剪切力条件下单核细胞与这种活化血小板的结合是获得免疫刺激性自体树突细胞所必需的.如下文所述实验表明的，这些免疫刺激性自体树突细胞可由指示免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物的表达来表征.数据还表明，导致糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(glucocorticoid-inducedleucinezipper，gilz)的表达提高的条件将有利地允许单核细胞分化为免疫抑制性自体树突细胞.这些免疫抑制性树突细胞与用8-mop以及暴露于uva处理的单核细胞衍生的未成熟树突细胞的结果相比表现出gilz的表达增加，在与凋亡白细胞接触后将表现出甚至更强的gilz的表达。另外，这些树突细胞表现出il-10的表达提高，并且降低了多种促炎细胞因子和趋化因子的产生，如从il-10与il-12p70的比降低可以看到的。因此，这些发现允许用于通过仔细选择待使用装置的性质和过程参数来获得免疫抑制性树突细胞的合理方法。本发明的发现允许相对于免疫刺激性树突细胞优先产生免疫抑制性树突细胞，从而克服了经典ecp程序的限制，这是因为在经典ecp程序中，对产生哪类树突细胞以及如何在一定程度上可操纵其产生缺少理解，这阻碍了将这种方法用于经授权应用以外的范围(参见girardi等(2002)，transfusionandapheresisscience，26，181-190)。然而，不同于在可获自therakos的装置中使用的经典ecp程序，本发明允许在实验室环境下获得这种免疫刺激性树突细胞，其中体外量的血液不与身体持续联系。数据尤其表明，获得免疫刺激性树突细胞的过程包括整体单核细胞活化步骤和随后单核细胞向免疫刺激性抗原呈递细胞(例如，树突细胞)分化步骤。这些步骤似乎最初依赖于在例如初始纯化或富集足够活化的单核细胞期间物理力(physicalforce)对单核细胞的物理活化，即使例如使初始活化的单核细胞通过本文所述装置允许改善活化和分化。此外，数据表明，一旦单核细胞活化已经发生，通过应用可光活化剂(如8-mop)和uv-a从而提高gilz的表达，将分化引导向免疫抑制性抗原呈递树突细胞的方向。本发明数据表明，这些过程在不存在例如细胞毒性t细胞或其他外来细胞的凋亡的情况下进行，使得可在免疫抑制性抗原呈递树突细胞负载例如期望抗原之前获得它们.19.下文更详细地描述了基于该数据的一些实施方案。20.在第一个方面，本发明涉及用于包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性树突细胞的方法，所述方法包括至少以下步骤：21.a)使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，以使得活化所述单核细胞并诱导其分化可通过至少一种分子标志物来鉴定的免疫抑制性树突细胞，其中所述至少一种分子标志物指示免疫抑制性树突细胞.22.指示免疫抑制性树突细胞的合适的分子标志物包括gilz和/或il-10。因此，可通过本文所述方法获得的表现出gilz和/或il-10的表达提高的树突细胞被认为是免疫抑制性树突细胞.gilz是指示免疫抑制性树突细胞的一种优选分子标志物。应理解的是，表达提高是与经受本文所述方法之前的单核细胞相比确定的.这种免疫抑制性树突细胞还表现出gilz诱导的il-10与il-12p70之比的降低.23.此外，可将免疫抑制性树突细胞与免疫刺激性自体树突细胞区分开，区别在于其不表现出指示免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物的表达提高.应理解的是，表达是与经受本文所述方法之前的单核细胞相比确定的。24.指示免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物在下文中描述，并且可从例如表1得到.这些分子标志物可根据其已知功能分组，例如抗原呈递细胞的分子标志物、细胞粘附的分子标志物等。其表达被认为指示免疫刺激性树突细胞的优选分子标志物包括plaur、neu1、cd80、ccr7、lox1、cd83、adamdecysin、fprl2、gpnmb、icam-1、hla-dr和/或cd86。标志物如hla-dr、plaur和icam-1可被认为指示整体单核细胞活化，而例如cd83和adam-decysin的表达提高似乎指示单核细胞向树突细胞分化。因此，如果这些分子标志物表现为表达提高，并且特别地如果gilz表达不提高，则可通过本文所述方法获得的树突细胞将被认为是免疫刺激性自体树突细胞。反过来，如果其表现出gilz和/或il-10的表达提高，并且特别地如果来自表1的分子标志物不表现出表达提高，则可通过本文所述方法获得的树突细胞将被认为是免疫抑制性树突细胞.25.在该第一个方面的一个实施方案中，尤其如下实现单核细胞的活化：通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室或在其中循环来使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，所述装置允许调节通过所述装置的所述流动室的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力.26.因此，可通过以下来实现和影响单核细胞的活化以及向免疫抑制性树突细胞的分化的诱导：改变通过这种装置的流动室之体外量的哺乳动物对象血液样品的流力(flowforce)、改变流动室流路的几何结构、改变流动室的尺寸、改变流动室的温度以及因此改变体外量的哺乳动物对象血液样品的温度、改变流路的生物物理和几何表面性质、使流动室中的体外量的哺乳动物对象血液样品暴露于可见光或uv光，添加dna交联剂(如8-mop)等.27.如下文所示，可例如通过在单核细胞经受物理力的情形下单核细胞与活化的血小板和/或特定血浆组分的相互作用来调节单核细胞的活化和向免疫抑制性树突细胞分化的诱导，所述物理力可通过下文所述装置提供。28.因此，在该第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及经受物理力并且与活化的血小板和/或血浆组分(如纤维蛋白原或纤连蛋白)相互作用的单核细胞的活化。活化可以是相继步骤的过程，其包括以下步骤：(i)使作为分离的组分或作为体外量的哺乳动物对象血液样品的一部分的血浆组分(如纤维蛋白原或纤连蛋白)固定在所述装置的流动室中；(ii)使血小板通过所述流动室以使得血小板可与血浆组分相互作用并被活化，所述血小板可作为纯化级分获自体外量的哺乳动物对象血液样品或作为体外量的哺乳动物对象血液样品的一部分；以及(iii)使单核细胞通过所述流动室以使得所述单核细胞可与活化的血小板和/或血浆组分相互作用并被活化，所述单核细胞可作为纯化级分获自体外量的哺乳动物对象血液样品或作为体外量的哺乳动物对象血液样品的一部分。29.因此，除了和/或替代上文关于所述装置的结构和操作所述装置的条件描述的参数和变量外，可如下实现或影响单核细胞的活化和向免疫抑制性树突细胞分化的诱导：改变血浆组分的性质、纯度和浓度，改变血小板的性质、纯度和浓度，血浆组分和/或血小板通过流动室和/或布置在流动室上的步骤顺序，血浆组分和/或血小板涂布流动室的密度，体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是血小板和/或单核细胞通过这种装置的流动室的流力，体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是血小板和/或单核细胞通过这种装置的流动室的温度和/或时间等，添加到体外量的哺乳动物对象血液样品并且添加到特别是单核细胞的额外因子(如8-mop和/或细胞因子)的性质、纯度和浓度等.30.然而，需要理解的是，尽管在可光活化剂(如8-mop)和uva的存在下，这种装置在诱导单核细胞活化和向免疫抑制性树突细胞分化中可能特别有效，但是在初始纯化或富集(如下文所述ficoll-hypaque富集)期间单核细胞所经受的物理力可能已经足以活化单核细胞并诱导其分化。类似地，尽管活化的血小板和/或特定的血浆组分可能有助于提高单核细胞活化以及向抗原呈递细胞(如树突细胞)分化，但是其不是绝对必要的。因此，为了实现单核细胞活化以及向抗原呈递细胞(如树突细胞)分化，本发明考虑了作为最小需求的物理力的施加。一旦活化和分化过程已经开始，可光活化剂(如8-mop)和uva或提高gilz表达的其他手段(例如地塞米松)的应用可被用于选择性地将分化过程引导向免疫抑制性抗原呈递细胞，如树突细胞。31.因此，在上文和接下来的方面和实施方案中，体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是单核细胞可能是或不是通过白细胞单采获得的。32.除了或替代这些实施方案，本发明还特别地涉及这样的方法，其在有利于提高gilz的表达和/或增加cd4 cd25 foxp3 细胞的数目和/或下调cd80、cd86和cd83的条件下进行。因此，本发明涉及例如在存在可光活化剂(如8-mop)并且暴露于光(如uv-a)的情况下进行的方法。在一个实施方案中，本发明相应地涉及在避免活化单核细胞以及诱导免疫刺激性自体树突细胞的情况下进行的方法，如可通过确定gilz和/或il-10和/或表1的分子标志物的表达来鉴定.因此，在一个实施方案中，本发明不涉及例如在不存在可光活化剂(如8-mop)以及不暴露于光(如uv-a)的情况下进行的方法。33.另一个实施方案涉及下文所述用于获得自体免疫抑制性抗原呈递细胞和/或同种异体免疫抑制性抗原呈递细胞的方法，所述细胞可用于例如治疗自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植的排斥和移植物抗宿主病。34.另一个实施方案涉及下文所述用于产生免疫抑制性抗原呈递细胞并且优选免疫抑制性树突细胞的方法，所述细胞可以是哺乳动物细胞。尽管本发明的一些优选实施方案涉及产生人免疫抑制性抗原呈递细胞并且优选人免疫抑制性同种异体树突细胞，本发明还考虑了将所述方法用于产生动物免疫抑制性呈递细胞并且优选动物免疫抑制性树突细胞，例如用于小鼠、大鼠等。本发明的这些实施方案提供了有用的动物模型，因此本文所述方法和结果从例如小鼠向人的可扩展性。此外，由于存在遗传上相同的可用动物品系(例如小鼠)，可将动物免疫抑制性抗原呈递细胞并且优选动物免疫抑制性树突细胞(例如小鼠免疫抑制性抗原呈递细胞并且优选小鼠免疫抑制性树突细胞)引入到获得体外量的血液样品的个体(因此是严格意义上的自体)中或遗传上相同的个体中。这将允许例如测试这些细胞的任何未预期的效果。35.应理解的是，已经表明下文所述方法产生免疫抑制性细胞，这是由于其分子标志物似乎与通常被称为树突细胞的细胞相关(如果不是对应的话)。因此，根据本发明的免疫抑制性细胞被称为免疫抑制性树突细胞.然而，树突细胞代表可称为抗原呈递细胞的更广泛的一类细胞。因此，下文所述方法通常是指产生免疫抑制性抗原呈递细胞，优选免疫抑制性树突细胞。36.本发明的第二个方面涉及通过下文所述方法可获得的自体和/或同种异体免疫抑制性树突细胞或自体和/或同种异体免疫抑制性抗原呈递细胞，其用于治疗自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植的排斥和移植物抗宿主病。37.下文将描述更多的实施方案.附图说明38.图1血小板密度对单核细胞-血小板相互作用数目和随后的单核细胞表型的作用。使单核细胞通过涂布有低、中和高密度的血小板的平行板。(a)对于涂布有较高密度血小板的板，单核细胞-血小板相互作用的数目大幅增加.(b)在过夜孵育后，暴露于高水平血小板的单核细胞明显更可能形成符合dc分化的表型，如通过膜cd83和hla-dr的表达评估(高密度相对于中或低密度：p＜0.0001；中密度相对于低密度：p＜0.005)。示出的数据为至少6个独立实验的平均值( /-sd)。lpf，低倍视野(lowpowerfield)。39.图2暴露于血小板后的基因表达。使流动中的单核细胞暴露于高水平或低水平的血小板。在过夜孵育后，使用rt-pcr评估细胞的基因表达中的差异。图2示出了暴露于高水平血小板的单核细胞中基因表达相对于暴露于低水平的那些的变化。发现7个与dc分化和/或功能相关的基因上调，而3个基因下调。在下调的基因中，已知gpnmb和fprl2分别具有降低细胞因子产生和抑制性dc成熟的功能。在上调的基因中，全部具有促免疫(pro-immune)功能或在dc生物学中具有多种作用。参见基因的具体描述的文本.示出的数据为2个独立实验的平均值( /-sd)。40.图3静止条件下血小板对单核细胞分化的影响.将单核细胞与低、中或高浓度血小板在缺乏流动的静止条件下共培养18小时。在这些条件下，未观察到血小板对dc分化的影响；全部条件均导致表达dc标志物细胞之低的基线水平。此外，相对于含有未被凝血酶活化的血小板的那些培养物(红线)，在培养物中用凝血酶活化的血小板(蓝线)并不引起单核细胞分化中的可辨别差异。41.图4血浆蛋白对血小板粘附至板的影响。使血小板在x-轴指示的剪切应力水平下通过涂布有纤维蛋白原、血浆、纤连蛋白或rmpi的板。流动中的血小板最佳地粘附至纤连蛋白。对于所有蛋白质，血小板粘附以0.5至1.0达因/cm2最大地发生，lpf，低倍视野。示出的数据为至少2个独立实验的平均值( /-sd)。42.图5血浆蛋白对血小板粘附至涂布有纤维蛋白原(a)或纤连蛋白(b)的板影响。将血小板不经处理(基线)或者用rgd片段预处理( rgd)或用γ片段预处理( γ)，随后评估其对纤维蛋白原(左图)和纤连蛋白(右图)的粘附。γ片段使血小板与纤维蛋白原的结合降低(p＜0.05)，而rgd肽使血小板与纤连蛋白的结合降低(p＜0.001).lpf，低倍视野。示出的数据为至少2个独立实验的平均值( /-sd).43.图6参与单核细胞-血小板相互作用的蛋白质.使单核细胞在x轴指示的条件下以0.5达因/cm2的壁面剪切应力从血小板涂布的板之间通过：血小板用抗p选择蛋白(p-)或同种型对照(p )预处理；单核细胞用rgd肽(rgd-)或对照片段(rgd )预处理。使用数字显微术对每组条件下的单核细胞-血小板相互作用进行量化，并且在图中表示为p /rgd 条件下观察到的最大值的分数。相互作用分为持续小于3秒的那些(短持续时间，黑条)和持续大于3秒(包括稳定结合)的那些(长持续时间，灰条)。包含抗p选择蛋白(p-)阻断的所有条件导致短持续时间相互作用和长持续时间相互作用二者显著降低(＊＊，p＜0.01)；仅rgd(rgd-)的阻断导致长持续时间相互作用显著降低(＊，p＜0.05)，但是不改变短持续时间相互作用。示出的数据为3个独立实验的平均值( /-sd)。44.图7p选择蛋白暴露对单核细胞整联蛋白的作用。用血小板以x轴指示的相对密度涂布塑料板。然后将血小板用抗p选择蛋白(虚线)或同种型对照(灰线)预处理或不接受处理(黑线)。使单核细胞以0.5达因/cm2通过板，然后立即通过流式细胞术评估活性β1整联蛋白的表达。y轴指示与针对仅在整联蛋白处于开放构象(openconfirmation)时暴露的表位之抗体结合的单核细胞的百分比.示出的数据为3个独立实验的平均值( /-sd)。45.图8过夜孵育后p选择蛋白暴露对单核细胞表型的作用。将血小板涂布的板不经处理(第一柱)或者用同种型对照预处理(第二柱)或用抗p选择蛋白预处理(第三柱).使单核细胞以0.5达因/cm2通过板，然后孵育过夜.y轴指示形成符合dc分化的表型(即，膜hla-dr /cd83 )的单核细胞的百分比.示出的数据为3个独立实验的平均值( /-sd)。46.图9提出的诱导单核细胞向dc分化的机理.基于该图稿中存在的数据，假设了以下事件顺序：(1)血浆纤维蛋白原涂布流动室的塑料表面；(2)通过其αiibβ3受体，未活化的血小板与固定的纤维蛋白原的γ组分结合；(3)血小板被活化并且立即表达预先形成的p选择蛋白和另一些表面蛋白；(4)通过的单核细胞通过psgl-1与p选择蛋白瞬间结合，造成局部单核细胞活化以及整联蛋白受体构象改变；(5)局部活化的单核细胞现在能够进一步相互作用，结合另外的血小板表达的配体，包括含rgd结构域的那些；(6)最后，被如此影响的单核细胞在18小时内有效地进入dc成熟途径。应注意，在体内，上述步骤(1)在生理学上可被作用于局部内皮之来自组织的炎性信号代替，使其募集并以类似方式活化血小板。47.图10：gilz的表达随着单核细胞分化为未成熟modc而迅速下调，并且在暴露于地塞米松后上调.a.)cd11c modc中gilzmrna的表达呈现为相对于新鲜分离的单核细胞的倍数变化。b.)0小时和36小时后细胞内和细胞表面标志物的中位数荧光强度.c.)24小时后cd11c modc中gilzmrna的表达呈现为相对于不接受地塞米松的modc的倍数变化。d.)cd11c modc中gilzmrna的表达呈现为相对于0小时时modc的倍数变化。e.)24小时后cd11c modc中gilzmrna的表达呈现为相对于未处理modc的倍数变化。f.)cd11c modc中gilzmrna表达呈现为相对于未处理modc的倍数变化。所有数据表示为最少3个独立实验的平均值±标准差。对于差异基因表达：＊≥2.5倍数变化且p＜0.05，＊＊≥2.5倍数变化且p＜0.01，＊＊＊≥2.5倍数变化且p＜0.001。48.图11：8-mop加uva光以剂量依赖方式上调未成熟modc中的gilz。a.)在1j/cm2和2j/cm2uva光下，gilz表达呈现为8-mop浓度的函数。puva处理后24小时cd11c modc中gilzmrna表达呈现为相对于未接受8-mop的modc的倍数变化。b.)gilz表达呈现为8-mop浓度乘以uva剂量的函数。c.)24小时后早期凋亡cd11c 细胞的百分比。d.)24小时后晚期凋亡cd11c 细胞的百分比.e.)示出了4个代表性实验之一的uva剂量为1j/cm2和2j/cm2时cd11c 设门细胞的点图。指出了展示膜联蛋白v /7-aad-或膜联蛋白v /7-aad 表型的cd11c 细胞的百分比.在用8-mop(100ng/ml)和uva光(1j/cm2)处理后24小时量化表达早期凋亡标志物和晚期凋亡标志物的f.)cd11c 细胞和g.)cd3 细胞的百分比。所有数据表示为至少4个独立实验的平均值±标准差。对于差异基因表达：＊≥2.5倍数变化且p＜0.05，＊＊≥2.5倍数变化且p＜0.01。49.图12：8-mop加uva光以剂量依赖方式下调未成熟modc中的cd83、cd80和cd86，并上调hla-dr.在puva处理后24小时，a.)hla-dr和cd83以及b.)cd80和d86之膜表达的相对荧光强度呈现为8-mop浓度(0至200ng/ml)乘以uva剂量(1或2j/cm2)的函数。以未处理的modc作为对照，并且为其分配1的rfi值.数据表示为4个独立实验的平均值±标准差.＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。50.图13：暴露于凋亡淋巴细胞的未成熟modc上调gilz。a.)共培养后24小时cd11c modc中gilzmrna表达呈现为相对于单独培养的未处理modc的倍数变化.b.)共培养后24小时cd11c modc中gilzmrna表达呈现为相对于单独培养的未处理modc的倍数变化。c.)共培养后24小时细胞内gilz的相对荧光强度。如下计算d.)cd80和cd86以及e.)hla-dr和cd83的lps刺激后与lps刺激前的相对荧光强度：(lps处理后的mfi-lps处理前的mfi)/(lps未处理后的mfi-lps未处理前的mfd。数据表示为至少4个独立实验的平均值±标准差。对于差异基因表达：＊≥2.5倍数变化且p＜0.05.51.图14：表达gilz的modc提高il-10的产生，并且降低多种促炎细胞因子和趋化因子的产生。lps刺激后24小时，收获培养物上清液用于通过磁珠多重免疫测定(multipleximmunoassay)对以下细胞因子量化：a.)il-10和促炎细胞因子，b.)il-12p70和ifn-γ，c.)il-6和tnf-α。对于以下促炎趋化因子进行同样的分析：d.)il-8，以及e.)mcp-1、mip-1β和rantes。数据表示为3个独立实验的平均值±标准差.＊与未处理的modc组相比，p＜0.05。52.图15：sirna介导的gilz敲减(knockdown)消除了耐受原性树突细胞特有的提高的il-10与il-12p70的比.a.)与单独培养的未处理modc相比，gilzmrna表达呈现为倍数变化。＊≥2.5倍数变化且p＜0.05.b.)lps刺激后培养物上清液中il-10和il-12p70蛋白质水平的量化.数据代表3个独立实验的平均值±标准差.＊与未转染sirna的同样处理的modc相比，p＜0.05。53.图16：描绘了在uva和8-mop的存在下经典ecp过程中单核细胞的流动。中间的单核细胞比朝向通道表面的单核细胞经受较低uva暴露。54.图17：描绘了经典ecp过程中使用的装置的通道设计.55.图18：a)至d)描绘了可用于本发明方法之装置的流动室的不同几何结构。56.图19：a)描绘了一些实例中使用的装置的几何结构。b)描绘了一种替选装置的几何结构。57.图20：描绘了在通过图19的装置物理地活化单核细胞后，hla-dr表达的提高.58.图21：描述了在通过图19的装置物理地活化单核细胞后，fsc/ssc复杂度的提高。59.图22：描述了在通过使其通过图19的装置物理地活化单核细胞后，fsc/ssc复杂度的提高。60.图23：描述了在通过图19的装置物理地活化单核细胞后，hla-dr、cd86、icam-1、plaur的表达和域fsc/ssc复杂度的提高。61.示出通过图19的装置和应用8-mop和uva物理活化单核细胞后gilz的表达提高。具体实施方式62.在对于本发明一些优选实施方案详细描述之前，提供了以下的一般性定义。63.在下文说明性描述的本发明可适合在缺少本文没有特别公开的任何要素、限制的情况下实施。64.将参照一些特定实施方案以及某些附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而仅受权利要求的限制。65.当本说明书和权利要求书中使用术语“包括”时，其并不排除其他要素。对于本发明的目的，术语“由......组成”被认为是术语“包括”的一个优选实施方案.如果在下文中将组限定为包括至少一定数目的实施方案，这也被理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。66.出于本发明的目的，术语“获得的”被认为是术语“可获得”的一个优选实施方案。如果下文中例如抗体被限定为由特定来源可获得，这也被理解为公开了由该来源获得的抗体。67.没有数词限定的表述包括复数，除非有其他特别声明。本发明上下文中的术语“约”或“大约”表示本领域技术人员理解的依然保证所讨论特征的技术效果的精确度区间。该术语通常表示偏离指示的数值±20％，优选±15％，更优选±10％，甚至更优选±5％。68.此外，说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”或“(i)”、“(ii)”、“(iii)”、“(iv)”等用于区别类似要素，并且未必用于描述顺序次序或时间次序。应理解的是，这些如此使用的术语在合适的条件下可互换，并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文所描述或说明的其他顺序来操作.69.当术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”或“(i)”、“(ii)”、“(iii)”、“(iv)”等涉及方法或用途或测定的步骤时，在步骤之间没有时间或时间间隔相干性，即，这些步骤可同时实施，或者在这些步骤之间可存在数秒、数分钟、数小时、数天、数周、数月或甚至数年的时间间隔，除非在本技术中另外说明，如在上文或下文给出。70.技术术语以其通常含义使用。如果向某些术语传达了特定含义，将在下文使用所述术语的上下文中给出术语的定义。71.如已经提到的，本发明在一定程度上基于用于小型化装置的下文展现的数据，所述装置允许：(i)模拟经典ecp程序的一些方面，并且(ii)阐明诱导体外量的血液中单核细胞向免疫刺激性树突细胞分化的细胞、分子机理。如下文所述实验表明的，这些免疫刺激性自体树突细胞可由指示免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物的表达来表征。数据还表明，导致糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)的表达提高的条件将有利地允许单核细胞分化为免疫抑制性树突细胞。对于本发明的目的，这样的免疫抑制性树突细胞也称为免疫阻抑性自体树突细胞、耐受原性自体树突细胞或截短的自体树突细胞.该数据表明，例如在剪切力的条件下依次地活化血小板并且使单核细胞与这种活化的血小板结合对于使单核细胞分化成树突细胞并且根据所选择的特定条件特别分化成免疫刺激性树突细胞或免疫抑制性树突细胞来说是不可少的.此外，这些发现立即允许了获得免疫刺激性树突细胞和免疫抑制性树突细胞的合理方法。考虑到可模拟和仔细分析导致形成在经典ecp过程中获得的免疫刺激性自体树突细胞和免疫抑制性树突细胞的一系列分子事件，现在可设计这样的装置并且特别是流动室，其允许在适合于研究目的的规模上进一步仔细分析导致单核细胞分化成免疫刺激性自体树突细胞和免疫抑制性树突细胞的分子事件，而且其还允许获得免疫刺激性自体树突细胞和免疫抑制性树突细胞以用于治疗目的.这将进一步详细解释.72.在经典ecp程序中，通常通过单采血液成分术(如白细胞单采)从患有ctlc的患者获得2.5l至6l血液。该体外量的血液通常通过单采血液成分术(如白细胞单采)处理以得到包含包括单核细胞的白细胞以及血浆组分、血小板和癌性t细胞的约200ml至500ml的终体积，然后使其在剪切应力下通过具有透明塑料通道和可光活化药物8-mop的光提取(photopheresis)装置。然后通过使透明通道暴露于波长315至380nm的uv-a来辐照这种包含8-mop的体外量的血液。然后将经辐照的体外量的血液重新引入到患者中。这种程序对一些被治疗患者中ctlc进程的有益效果最初假设来自对癌性t细胞的破坏。基于该假设，推测患者将不得不经受重复的ecp循环。然而，对于一些患者观察到了长期的有益效果，这使得重复治疗不再必要，在下文中，发现了有趣的并且部分矛盾的效果，其可解释用于ctlc治疗的ecp的一些积极结果。73.例如，如在us6,524,855中描述的，在体外量的血液中观察到了dc的诱导，并且假设ecp对于ctlc的一些有益效果来自由癌性t细胞因8-mop诱导的这些细胞凋亡而脱落(shed)的癌症特异性抗原，以及负载了这些抗原的已经开始分化的dc。假设重新引入包含这种负载癌症抗原之自体dc的体外量的血液提供了疫苗接种样的长期持续治疗效果.然而，同时观察到在ecp程序期间形成了所谓的“截短”的dc，其不能提供免疫刺激作用，而是提供相反作用，即免疫抑制性作用。由同一过程诱导这种具有相反作用的不同dc分化类型令人迷惑，并且从实践角度看，对合理地使用ecp获得免疫刺激性dc或免疫抑制性dc形成了障碍。此外，需要单采血液成分术(如白细胞单采)来获得足够量的体外血液是不利地影响患者的治疗质量的另一个因素。74.下文展示的数据表明，剪切应力原则上是dc诱导的原因。通过使用下文所述小型模型装置，表明即使使用明显更低量的未通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的体外血液，并且如果不向体外量的血液添加8-mop，甚至即使不进行uv-a辐照，也能发生免疫刺激性dc的诱导。因此，即使省略经典ecp程序的中心步骤，也能发生dc的诱导。然而，剪切应力似乎是获得dc本身的一个关键因素。诱导树突细胞形成的其他关键步骤似乎是通过血浆组分活化血小板和通过这种活化的血小板活化单核细胞.数据进一步表明，如果在8-mop和uva辐照的存在下进行剪切应力诱导的树突细胞形成，则糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链(gilz)的表达提高，其继而激活形成截短的(即，免疫抑制性)耐受原性dc的途径(参见实施例2)。可通过施加剪切应力而不添加8-mop并且不用uv-a辐照来实现剪切应力诱导的免疫刺激性dc诱导的事实进一步表明，在经典ecp程序中，由于塑料通道的尺寸，一些初始剪切应力诱导的dc不能有效被辐照(可能是由于其在ecp装置的通道中间移动)，结果是这些dc可进一步发育成免疫刺激性dc(参见图16)。使用具有图17的一般结构的装置获得了该前述数据.但是，在经典ecp和ecp样程序中，获得了免疫刺激性自体dc和免疫抑制性自体dc的混合物。基于下文展现的数据，现在可以例如省略现有技术的ecp和ecp样过程中的一些要求，例如使用大量需要通过单采血液成分术(如白细胞单采)处理的血液.此外，现在可特意调整过程参数和用于向单核细胞施加物理力的装置的设计，以特意获得免疫刺激性自体dc或免疫抑制性自体dc。例如，通过选择流动室的设计和尺寸，可确保基本上所有dc与8-mop接触并被uva辐照，从而形成免疫抑制性dc。此外，随着指示通过本文所述方法可获得的免疫抑制性dc和免疫刺激性自体dc的分子标志物被解读，可通过例如对于同源性的facs分析进一步纯化树突细胞群，其根据所选的方法参数基本上已经仅为免疫抑制性dc或免疫刺激性自体dc.75.可不需分子混合物来进行下文所述方法，以实现单核细胞的成熟和向免疫抑制性树突细胞的分化。此外，由于本发明基于诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞的分化，所以该分化过程不限于可通过典型细胞因子混合物引起的分子事件。而且，利用下文所述方法可获得的树突细胞似乎具有更复杂的分子模式，其似乎代表了这些树突细胞较宽的功能。76.在第一个方面，本发明因此涉及用于诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性树突细胞的方法，所述方法包括至少以下步骤：77.a)使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，以使得活化所述单核细胞并诱导其分化成可通过至少一种分子标志物来鉴定的免疫抑制性树突细胞，其中所述至少一种分子标志物指示免疫抑制性树突细胞。78.如已经提到的，已经表明下文所述方法产生免疫抑制性细胞，因为其分子标志物似乎与通常被称为免疫抑制性树突细胞或耐受原性树突细胞的细胞相关(如果不是对应的话).因此，根据本发明的免疫抑制性细胞被称为免疫抑制性树突细胞。然而，树突细胞代表可称为抗原呈递细胞的更广泛的一类细胞.因此，下文所述方法通常是指产生免疫抑制性抗原呈递细胞，优选免疫抑制性树突细胞。79.因此，术语“免疫抑制性树突细胞”是指如本文所述可通过处理包含在体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞来由单核细胞衍生的细胞，并且可通过下文所述分子标志物鉴定，该术语与耐受原性树突细胞、免疫阻抑性树突细胞或截短的树突细胞同义使用。这些分子标志物包括gilz、ido(吲哚胺)、kmo(犬尿氨酸3-羟化酶)、转化生长因子β(tgfβ)和/或il-10(白介素10)，其中gilz是一种优选的分子标志物。因此，通过本文所述方法可获得的表现出gilz、ido、kmo、tgfβ和/或il-10(优选gilz)的表达提高的树突细胞被认为是免疫抑制性树突细胞。应理解的是，表达提高是与经受本文所述方法之前的单核细胞相比确定的.这种免疫抑制性树突细胞还可表现出gilz诱导的il-10与il-12p70之比的增加或多种促炎细胞因子和趋化因子(如il-12、tnf-α和il-6)的产生降低。目前被认为指示免疫抑制性树突细胞的优选分子标志物是gilz.如下将进一步详细解释，免疫抑制性树突细胞可以是自体和/或同种异体免疫抑制性树突细胞.自体免疫抑制性树突细胞可通过本文所述方法产生用于治疗例如自身免疫病。同种异体免疫抑制性树突细胞可通过本文所述方法产生用于治疗例如移植物抗宿主病.应理解的是，在本文提到免疫抑制性抗原呈递细胞(如树突细胞)时，是指在这些细胞与这些抗原接触后，已经能够在其表面展示例如疾病特异性抗原的免疫抑制性抗原呈递细胞(如树突细胞).还应理解，在一个实施方案中，可通过本文所述方法获得并且可通过本文所述分子标志物鉴定的免疫抑制性树突细胞可被认为是这样的树突细胞：其已经足够分化和内化，并且甚至展示例如来自参与自身免疫病的细胞的抗原或来自例如在移植物抗宿主病应用中之接受者的细胞的抗原，从而其可被更普遍地认为是免疫抑制性自体和/或同种异体抗原呈递细胞.但是，这些免疫抑制性自体和/或同种异体抗原呈递细胞将为耐受原性类型，因此抑制针对所展示抗原的免疫应答。因此，在一个实施方案中，术语“免疫抑制性自体和/或同种异体树突细胞”涵盖免疫抑制性自体和/或同种异体抗原呈递树突细胞。然而，该过程还可以一定方式进行以使得树突细胞表达尚未内化并展示抗原的指示免疫抑制性自体和/或同种异体树突细胞的分子标志物，因为例如细胞由未患有自身免疫病或移植物抗宿主病之供体的样品获得。然而，由本发明的数据和结论提供的理解允许产生免疫抑制性抗原呈递细胞(如树突细胞)，其随后可负载自身免疫病特有的抗原或来自处于移植环境下之供体的抗原，其单独地并且不与免疫抑制性抗原呈递细胞(如树突细胞)同时获得。然后可将这样的抗原与免疫抑制性抗原呈递细胞(如树突细胞)共孵育以实现其在随后治疗环境下的呈现.80.通过使用本文所述过程活化单核细胞获得的过表达gilz、ido、kmo、pdl1、pdl2、tgfβ和/或il-10(优选gilz)的树突细胞表现出可令人联想到耐受原性树突细胞的性能，尤其可来自以下观察结果：表达gilz的这种树突细胞对完全成熟有抗性，如可通过例如lps诱导并且通过hla-dr、cd83、cd80和cd86的表达提高确定。此外，gilz的上调和多种促炎因子和趋化因子(如il-12、tnf-α和il-6)的产生降低也令人联想到可用于获得耐受原性树突细胞的地塞米松的已知效果(cohen等，blood(2006)，107(5)，2037-2044).81.因此，还可将免疫抑制性树突细胞与免疫刺激性自体树突细胞区分开，区别在于其不表现出指示免疫刺激性自体树突细胞之分子标志物的表达提高。应理解的是，表达是与经受本文所述方法之前的单核细胞相比确定的.82.术语“免疫刺激性自体树突细胞”是指可通过使用本文所述方法活化单核细胞获得的表现出指示免疫刺激性自体树突细胞之分子标志物的表达提高的树突细胞。指示免疫刺激性自体树突细胞的这些分子标志物已经在可通过mhci和mhcii呈递抗原的树突细胞的文献中讨论。应理解的是，可通过本文所述方法获得并且可通过本文所述分子标志物鉴定的免疫刺激性自体树突细胞可被认为是这样的树突细胞：其已经足够分化和内化，并且甚至展示例如来自包含在体外量的各哺乳动物对象血液样品中之凋亡细胞(如细胞毒性t细胞)的肿瘤特异性抗原，或者例如包含在体外量的各哺乳动物对象血液样品中的病毒或细菌抗原，从而其可被认为是免疫刺激性自体抗原呈递树突细胞.然而，该过程还可以以一定方式进行以使得树突细胞表达指示尚未内化并展示抗原之免疫刺激性树突细胞的分子标志物。因此，在一个实施方案中，术语“免疫刺激性自体树突细胞”涵盖免疫刺激性自体抗原呈递树突细胞.应理解的是，指定免疫刺激性树突细胞为免疫刺激性自体树突细胞取决于所获得的免疫刺激性树突细胞是否随后被重新引入到相同供体中。这可以通过连续方式或其中树突细胞在重新引入到供体中之前延长培养一段时间的不连续方式进行。下文关于免疫刺激性树突细胞讨论的所有问题是指免疫刺激性自体树突细胞。然而，应理解的是，这些实施方案的讨论始终包括所述过程用于产生免疫刺激性树突细胞本身并且仅随后施用这些细胞将使其潜在地成为免疫刺激性自体树突细胞的情形。83.本发明允许相对于免疫刺激性dc优先产生免疫抑制性dc.相对于免疫刺激性树突细胞优先产生免疫抑制性树突细胞意指，与例如对相同体外量的血液样品进行经典ecp程序的情形相比，从体外量的血液样品开始，可选择性获得比免疫刺激性dc更多的免疫抑制性树突细胞。虽然相对于免疫刺激性dc的产生将优先产生免疫抑制性dc，但是在进行根据本发明的方法后，可依然存在免疫刺激性dc。不过，本发明提供了可被操纵以相对于另一种树突细胞群倾向于产生一种树突细胞群的参数和变量。另外，最终剩余的免疫刺激性树突细胞可通过例如针对指示免疫刺激性树突细胞的分子标志物的亲和纯化移除.84.如在实施例中描述的，通过使用小型化装置将包含在来自每个健康志愿者的体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞进行处理来鉴定指示通过本文所述方法可获得之免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物(参见表1的标志物88至99)。此外，如在实施例中描述的，通过将包含在来自健康志愿者或者来自患有ctcl的患者的体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞进行ecp处理来鉴定指示免疫刺激性自体树突细胞的分子标志物.实施例中还描述了如何通过将来自健康志愿者或者来自患有gvh病(gvhd)的体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞进行ecp处理来鉴定指示免疫抑制性树突细胞的分子标志物(参见表1的标志物1至87)。然后分离树突细胞，并且分析已知或怀疑其在免疫刺激性树突细胞细胞中具有作用的分子标志物的上调表达。85.对于假设导致免疫刺激性树突细胞和免疫抑制性树突细胞的复杂混合物的ecp过程，鉴定的一些标志物与通过使用应当仅导致免疫刺激性树突细胞的小型化装置的过程获得的树突细胞中观察到的标志物一样。因此某种程度上，在ecp过程导致可能与树突细胞功能相关的分子标志物上调方面，似乎合理地假设这些标志物还适于鉴定通过本文所述过程(如用小型化装置)可获得的免疫刺激性树突细胞.对于通过本文所述方法可获得的免疫刺激性自体树突细胞，一组总共99种分子标志物被鉴定为是上调的.将来可能通过比较分析由另一些分子标志物来扩充该组.86.因此，实施例1和3的数据得到了1组99种被认为指示免疫刺激性自体树突细胞的标志物.将这些标志物总结在表1中。87.表188.89.[0090][0091]在代表免疫刺激性dc功能的表面标志物/功能介体的87种基因(标志物1至87)中，与“经典”树突细胞的表达数据库相比后，发现66种是在ecp诱导过程(通过板、过夜培养，参见实施例)树突细胞中独特鉴定的。这些是：abca1、acvr1b、atp6v0b、basp1、best1、cpm、crk、csf2ra、ctnnd1、ctsb、cxcl16、eng、flot1、gna15、gpr137b、gpr157、hexb、homer3、icam1、irak1、itga5、itgb8、kctd11、lamp2、leprot、marcksl1、mcoln1、mfap3、mgat4b、mr1、mras、msr1、neu1、olr1、omg、pi4k2a、plaur、pmp22、pvrl2、rab13、rab8b、rab9a、rala、rnase1、sc5dl、sema6b、sirpa、slc1a4、slc22a4、slc31a1、slc35e3、slc39a6、slc6a6、slc6a8、stx3、stx6、tm9sf1、tmbim1、tmem33、tnfrsf10b、tnfrsf11a、tnfrsf1a、tnfrsf1b、tnfsf14、tnfsf9、ykt6。[0092]因此，通过确定由本文所述方法可获得的免疫刺激性自体树突细胞的至少一种分子标志物的表达，并且比较其在体外量的哺乳动物对象血液样品中包含的单核细胞中的表达，可将免疫抑制性树突细胞与免疫刺激性树突细胞区分开.与单核细胞相比，如果未观察到在假定的免疫抑制性树突细胞中这些标志物的表达提高，则这指示单核细胞向免疫抑制性树突细胞分化。[0093]因此，除了gilz(seqidno.：100)、ido(seqidno.：101)、kmo(seqidno.：102)、tgfβ(seqidno.：103)和/或il-10(seqidno.：104)(优选gilz)的表达提高外，通过确定由本文所述方法可获得的免疫刺激性自体树突细胞的至少一种分子标志物的表达并且比较其在体外量的哺乳动物对象血液样品中包含的单核细胞中的表达，可鉴定免疫抑制性树突细胞。与单核细胞相比，如果未观察到树突细胞的这些分子标志物的表达提高，则这指示单核细胞向免疫抑制性自体和/或同种异体树突细胞分化.[0094]通过确定至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多种可选自表1的分子标志物的表达，可鉴定免疫刺激性自体树突细胞.例如，可通过确定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22种分子标志物的表达来鉴定免疫刺激性自体树突细胞，所述分子标志物可选自包含以下的组：plaur、neu1、ctsb、cxcl16、icam1、msr1、olr1、sirpa、tnfrsf1a、tnfsf14、tnfsf9、pmb22、cd40、lamp3、cd80、ccr7、lox1、cd83、adamdecysin、fprl2、gpnmb和/或cd86。更优选地，可通过确定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种分子标志物的表达来鉴定免疫刺激性自体树突细胞，所述分子标志物可选自包含以下的组：plaur、neu1、cd80、ccr7、lox1、cd83、adamdecysin、fprl2、gpnmb和/或cd86。可被认为指示免疫刺激性自体树突细胞的最优选标志物是plaur、neu1、cd80、cd83和/或cd86。本文提出的数据和结论表明，获得免疫刺激性树突细胞的过程似乎包括整体单核细胞活化步骤和单核细胞向免疫刺激性抗原呈递细胞(例如，树突细胞)分化步骤。这些不同步骤似乎可通过上述分子标志物和前向散射/侧向散射复杂度(fsc/ssc复杂度)追踪，所述前向散射/侧向散射复杂度可通过facs分析确定。此外，可根据其已知功能将分子标志物分组，例如，抗原呈递的分子标志物、细胞粘附的分子标志物等.hla-dr、cd86和cd80可被认为代表抗原呈递.plaur和icam-1可被认为代表细胞粘附。此外，标志物如hla-dr、plaur和icam-1以及fsc/ssc复杂度可被认为指示整体单核细胞活化，而例如cd83、adam-decysin、cd40、cd80、lamp-3和ccr7表达的提高似乎指示单核细胞向树突细胞分化。[0095]因此，可通过本文所述方法获得的免疫刺激性抑制性树突细胞不仅可通过指示免疫抑制性树突细胞的分子标志物(如gilz、ido、kmo、tgfβ和/或il-10)来肯定地鉴定，还可通过指示免疫刺激性树突细胞的分子标志物(如plaur、cd80和cd83)不上调来鉴定。此外，通过确定被认为指示单核细胞的分子标志物(如cd33、cd36和/或fcgr1a(iggfc片段1a的受体))的表达，可将这两种细胞类型(即，免疫抑制性树突细胞和免疫刺激性树突细胞)与经受物理力以诱导其分化过程的单核细胞区分开。如果发现这些因子的表达与经受物理力和本文所述过程之前的单核细胞的表达相比下调，则认为指示单核细胞已经进入了朝向免疫刺激性树突细胞和/或免疫抑制性树突细胞的成熟和分化途径。然后可通过确定分子标志物(如plaur、cd80、cd83和gilz)的表达来区分后面这两种树突细胞群。[0096]如上所述，可以进行下文所述方法而不需要分子混合物以实现单核细胞的成熟和向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的分化。这种混合物可包含因子例如地塞米松、il-10、il-4或tgf-β。然而，在一个实施方案中，考虑向可根据本发明方法获得的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞添加这种成熟混合物，例如以推动向可利用这种混合物获得的某些树突细胞谱的分化。[0097]考虑到现在已经理解并拥有相应地在手边的区分免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞与免疫刺激性自体树突细胞的工具(例如分子标志物)，现在可特意改变体外量的哺乳动物对象血液样品通过(因此单核细胞通过以经受物理力)之装置和流动室二者的设计，以及进行诱导单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞之过程的参数，以有目的地使单核细胞能够分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0098]如上文所述，使体外量的哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力。改变对单核细胞向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞分化具有影响的装置和流动室的设计包括改变流力，改变流动室流路的几何结构，改变流动室的尺寸，调节温度的可能性，使流动室中的体外量的哺乳动物对象血液样品暴露于可见光或uv光的可能性等。施加物理力不仅可通过例如使体外量的血液样品通过流动室实现，还可通过将这种体外量的血液样品放置在例如可获自macopharma的eva塑料袋中并且轻轻移动或摇动该装有血液样品的袋子(参见，例如，andreu等(1994)，trans.sci.，15(4)，443-454)来实现。[0099]如在上文还提到的以及在下文示出的，单核细胞的活化和向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞分化的诱导依赖于在单核细胞经受物理力的情形下，单核细胞与活化的血小板和/或特定血浆组分的相互作用，所述物理力可通过下文所述的装置提供。因此，改变过程参数包括：改变血浆组分的性质、纯度和浓度；改变血小板的性质、纯度和浓度；改变血浆组分和/或血小板通过流动室和/或布置在流动室上的步骤顺序；改变血浆组分和/或血小板涂布流动室的密度，体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是血小板和/或单核细胞通过这种装置的流动室的流力(flowforce)，体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是血小板和/或单核细胞通过这种装置的流动室的温度和/或时间等，添加到体外量的哺乳动物对象血液样品并且特别是添加到单核细胞的额外因子(如8-mop和/或细胞因子)的性质、纯度和浓度等。[0100]现在将对于其与单核细胞向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞分化的相关性来更详细地讨论与装置和流动室的设计以及过程参数相关的因素.应理解的是对于下文讨论的实现了单核细胞向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞分化的任何实施方案，其中可通过确定至少gilz、ido、kmo、tgfβ和/或il-10(优选gilz)的表达和/或确定表1的分子标志物的表达来鉴定免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。如果例如gilz的表达提高并且如果表1分子标志物的表达不提高，则认为这指示单核细胞已经分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。此外，对于下文讨论的所有实施方案，应理解的是使包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞经受物理力(如剪切应力)，以允许其例如在与活化的血小板和/或血浆组分相互作用后分化成树突细胞.[0101]在第一个方面的一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室来使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，其允许调节通过所述装置之所述流动室的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力。[0102]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室来使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，其允许调节通过所述装置之所述流动室的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力，并且其中所述装置的所述流动室具有允许向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力的设计.[0103]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室来使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，其允许调节通过所述装置之所述流动室的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力，并且其中所述装置还允许调节选自温度和光暴露的至少一个参数。[0104]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中如前所述通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室来使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，并且其中通过与活化的血小板和/或血浆组分相互作用来活化所述单核细胞并且诱导其分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0105]对于所有这些实施方案和所有下文讨论的实施方案，优选地使包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞在存在dna交联剂(如8-mop)和使所述单核细胞暴露于光(优选uva光)的情况下经受物理力(如剪切应力)，从而实现gilz的表达提高。应优选地选择用于所有这些实施方案之流动室的设计和尺寸，使得基本上所有单核细胞与dna交联剂(如8-mop)接触，并且基本上所有单核细胞暴露于光(优选uva)。[0106]例如，在第一个方面的一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：[0107]a)将包含至少一种单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可通过的流动室，[0108]b)使血小板活化，所述血小板可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液中，或者其可与包含至少一种单核细胞的所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0109]c)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中的包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品，以使得通过与在步骤b)中获得的所述活化的血小板结合来活化所述单核细胞并且诱导其分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0110]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：[0111]a)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可通过的流动室，[0112]b)使血浆组分通过，所述血浆组分可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中，或者其可与所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0113]c)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中的包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品，以使得通过与在步骤b)中获得的所述血浆组分结合来活化所述单核细胞并且诱导其分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0114]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：[0115]a)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可通过的流动室，[0116]b)使血浆组分通过，所述血浆组分可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中，或者其可与所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0117]c)使血小板活化，所述血小板可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中，或者其可与包含至少单核细胞的所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0118]d)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中的包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液，以使得通过与在步骤b)和c)中获得的所述活化的血小板和/或血浆组分结合来活化所述单核细胞并且诱导其分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0119]在第一个方面的另一个实施方案中，本发明涉及诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法，其中所述方法包括至少以下步骤：[0120]a)任选地使富集血小板的血浆通过装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可通过的流动室，[0121]b)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可通过的流动室，[0122]c)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中的包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液，以使得任选地通过与步骤a)获得的所述富集血小板的血浆结合来活化所述单核细胞并且诱导其分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0123]从本文所述实验可以看出，如果包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液中的血小板被活化，并且如果通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中的包含至少单核细胞的体外量的所述哺乳动物对象血液，从而通过与所述活化的血小板结合来活化所述单核细胞并且诱导其分化成树突细胞，则用于诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液中的单核细胞分化成免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的方法最佳地工作。然而，单核细胞的活化还可通过与血浆组分直接相互作用来实现，即不与活化的血小板相互作用。然后可通过使单核细胞另外暴露于dna交联剂(如8-mop)和光(如uva光)来使这些树突细胞开始向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞分化。[0124]活化血小板以及随后活化单核细胞以及使其分化成树突细胞的步骤将在下文实施方案中讨论：(i)使血浆组分(如血浆蛋白)通过装置的流动室，从而使这些组分粘附至流动室的壁，(ii)使血小板通过流动室并且通过与所述血浆组分结合而被活化，以及(iii)使含单核细胞的级分(如包含至少单核细胞的体外量的所述哺乳动物对象血液)通过流动室并且通过与所述活化的血小板结合而被活化以分化成树突细胞。然而，应理解的是，如果血浆级分或血浆蛋白或其片段、血小板级分以及含单核细胞的级分同时通过通道或通道样结构(例如如下所述如果获自体外量的血液的全血级分的情况)，这些活动也可发生.还应理解的是，可通过仅使血浆组分粘附于流动室的壁并使单核细胞与所述血浆组分相互作用来进行该过程，尽管效力不相同.不过，在下文中，将讨论这些方面的一个优选实施方案，即，实现步骤(i)、(ii)和(iii).[0125]对于第一步骤，可作为获自体外量的血液样品的级分，或以来自其他来源的纯化形式(如重组表达的蛋白质的形式)来提供包含蛋白质(如纤维蛋白原或纤连蛋白)或其片段(如纤维蛋白原的γ组分)的血浆组分.尽管通过血浆蛋白(如纤维蛋白原和纤连蛋白)活化血小板似乎是足够的(因此这些蛋白质的重组表达形式是足够的)，但是可以优选地使用由体外量的血液样品获得的血浆级分并且包含这些蛋白质，因为这些血浆级分具有更复杂的组成并且可能包含所有血浆组分，其提供了最佳的血小板活化。[0126]可使血浆蛋白级分、血浆蛋白或其片段通过流动室以便粘附至通道或通道样结构的壁，所述流动室可由塑料或不是塑料的材料(例如玻璃)制成。不要求血浆级分或血浆蛋白以特定物理力(如特定压力)通过流动室。然而，为了使过程流程化(streamline)，设想了使血浆级分或血浆蛋白以比得上(如果不等于)下文更详细描述的活化单核细胞所需剪切应力的剪切应力通过流动室。通常，首先将血浆级分或血浆蛋白泵送通过流动室以用血浆蛋白(包括纤连蛋白和纤维蛋白原)涂布其表面。控制通过流动室的血浆蛋白级分、血浆蛋白或其片段的流量，以在塑料表面获得期望的蛋白粘附水平。如果需要，可使流动停止一段时间，并且使血浆组分可“浸泡(soak)”流动室的表面。通过控制驱动血浆组分通过流动室的泵的速度和定时，可控制涂布程度.在一个方法中，使血浆级分或血浆蛋白暴露于流动室结构的表面约1至60分钟、约1至约30分钟、约1至约20分钟或约1至约10分钟的时期。为了增强血浆蛋白在流动室表面的粘附，可在所述程序的这个阶段期间临时中止流动(至多约60分钟)，然后恢复，或者可使流量从填充速率(至多约100ml/分钟)降低到低至5ml/分钟。[0127]还可设想这样的情形，其中使用具有流动室的装置，所述流动室的表面预涂布有例如纯化的血浆蛋白或其片段(如纤维蛋白原的γ组分).如果在包含提供被配制为例如一次性使用的流动室之筒的手持装置中执行整个过程，则可使用这种预涂布的装置。还可设想这样的情形，其中使用具有流动室的装置，所述流动室的表面预涂布有例如富集血小板的血浆.[0128]在血浆级分或血浆蛋白或其片段已经通过通道或通道样结构并且其表面已经被血浆蛋白涂布后，使血小板级分通过，例如通过将血小板级分泵送进入并通过流动室.选择流动室中血小板的流量和停留时间，使得血小板与之前已经粘附到流动室表面的血浆组分或蛋白或其片段结合并从而变得活化。[0129]本文展现的数据表明，通过血浆组分活化血小板是一个顺序过程，其中未活化的血小板首先与纤连蛋白的γ组分结合而被活化，然后可与在许多血浆蛋白(如纤连蛋白或纤维蛋白原)中发现的rgd基序(精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸)结合.如果使用纯化的和/或重组表达的血浆蛋白或其片段来活化血小板，那么可设想用至少纤维蛋白原的γ组分并且任选地还用rgd肽预先涂布通道或通道样结构。这些血浆蛋白片段和肽可允许有效活化血小板，同时最佳控制通道或通道样结构表面的涂布过程。当然，如果使用从体外量的血液获得的血浆级分来涂布和活化，则所有这些组分都存在。[0130]为了使血小板与血浆组分有效结合从而被活化，与血浆组分的涂布步骤相比可上调或下调流量，或者使流动停止一段时间，以获得期望的血小板与血浆组分的结合水平。用于血浆活化的流量通常为约5ml/分钟至约200ml/分钟、约10ml/分钟至约150ml/分钟、约10ml/分钟至约100ml/分钟、或约5ml/分钟至约50ml/分钟。通常，理想的是允许血小板与血浆组分结合约1至60分钟、约1至约30分钟、约1至约20分钟或约1至约10分钟.[0131]尽管剪切应力对于血小板的活化和对于单核细胞的活化的重要性似乎不同，可优选地使血小板级分在以下剪切力下通过流动室：约0.1至约20.0达因/cm2、约0.2至约15.0达因/cm2、约0.3至约10.0达因/cm2，例如约0.2至约0.4、至约0.5、至约0.6、至约0.7、至约0.8、至约0.9、至约1、至约2、至约3、至约4、至约5或至约6达因/cm2。通常，含血小板的级分的流量可以为约5ml/分钟至约200ml/分钟、约10ml/分钟至约150ml/分钟、约10ml/分钟至约100ml/分钟或约5ml/分钟至约50ml/分钟。流量在一定程度上依赖于流动室的尺寸和几何结构，并且特别地可在如果使用下述尺寸的流动室时使用.通常，将选择流量以取得前述剪切应力值.[0132]因此，预期使含血小板的级分以约10ml/分钟至约200ml/分钟的流量通过通道或通道样结构以产生约0.1至约10.0达因/cm2的剪切力.[0133]在血小板已经通过通道或通道样结构并且已经被布置在通道或其通道样结构的表面上的血浆蛋白或其片段活化之后，使含单核细胞的级分(例如体外量的所述哺乳动物对象血液样品或从体外量的血液样品获得的下述白细胞或血沉棕黄层级分)通过，例如通过施加物理力泵送进入并通过通道或通道样结构.应理解的是，通过与血浆组分相互作用活化血小板将导致血小板粘附至血浆组分.[0134]还应理解的是，如果使包含血小板和血浆组分的体外量的哺乳动物对象血液样品通过流动室，则将发生与上述相同的事件。在这种情况下，血浆组分将粘附至流动室的壁，然后使血小板活化。然而，在这种情形下，该过程可能较不可控，并且对此可考虑增加包含血小板和血浆组分的体外量的哺乳动物对象血液样品在流动室中的停留时间.[0135]还要注意的是，不是使用活化的血小板，而是使用衍生自血小板的因子，这对于单核细胞是足够的。这些因子包括例如纤连蛋白，还可包括因子如p选择蛋白、整联蛋白α5β1、c型凝集素受体、cd61、cd36、cd47以及补体抑制剂如cd55和cd59，或trem样转录物1.这些血小板衍生因子还可作为例如纯化组分的混合物或者作为通过例如裂解包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的血小板获得的组分的混合物直接布置在流动室的表面上。在这种情况下，需要例如用可能旁通(bypass)的血浆组分涂布流动室的表面。[0136]本文展现的数据表明，一旦血小板被活化，通过活化的血小板表达蛋白质(如p选择蛋白和含rgd的配体)，其然后可与单核细胞相互作用并且激活其向树突细胞的分化。而且，发现通过活化的血小板的单核细胞活化和树突细胞诱导并不发生在静态条件下。相反，需要在施加物理力下使单核细胞通过通道或通道样结构。考虑到活化后的血小板需要约60至约120分钟来表达因子如p选择蛋白(其然后活化单核细胞)，可将单核细胞的通过延迟直至血小板已经开始表达这些因子，例如约60至约120分钟。如果使包含单核细胞、血小板和血浆组分的体外量的哺乳动物对象血液样品通过流动室，可能不得不将该时间段调节至更长时间.[0137]应理解的是，在不同时施加物理力的情况下，单核细胞与活化的血小板、血小板衍生因子或血浆组分的相互作用不足以活化单核细胞并使其分化。[0138]施加物理力以使含单核细胞的级分移动通过流动室，优选地可意味着含单核细胞的级分(如体外量的哺乳动物对象血液样品)在剪切应力下移动通过流动室。通常，可在以下剪应力下使含单核细胞的级分通过流动室：约0.1至约20.0达因/cm2、约0.2至约10.0达因/cm2，例如约0.2至约0.3、至约0.4、至约0.5、至约0.6、至约0.7、至约0.8、至约0.9、至约1、至约1.5或至约2达因/cm2。通常，含单核细胞级分的流量可以为约5ml/分钟至约200ml/分钟、约10ml/分钟至约150ml/分钟、约10ml/分钟至约100ml/分钟或约5ml/分钟至约50ml/分钟。流量在一定程度上取决于流动室的尺寸和几何结构，并且特别地可在如果使用下述尺寸的通道或通道样结构时使用.通常，将选择流量以取得前述剪切应力值。[0139]因此，预期使含单核细胞的级分以约10ml/分钟至约200ml/分钟的流量通过通道或通道样结构以产生约0.1至约0.5达因/cm2的剪切力。在任何情况下，必须确保产生使得单核细胞能够与活化的血小板结合并且使这种活化的单核细胞能够分化成树突细胞的剪切力。[0140]本文展现的数据表明，通过光学显微镜检测，可将单核细胞-血小板相互作用分为短效相互作用和长效相互作用，前者任意地定义为发生小于3秒的接触，而后者定义为长于3秒的接触。似乎初始短效相互作用由在活化的血小板上表达的p选择蛋白介导。然后，这些初始接触随后可引发通过活化的血小板表达的由含rgd蛋白质介导的长效相互作用.[0141]通过允许单核细胞与血小板建立长效接触(例如通过给予单核细胞和血小板足够的时间来接触)，可积极地影响单核细胞的活化和向树突细胞的分化。随着单核细胞流动通过通道或通道样结构，其可在通过流动室的流动诱导的剪切力下交替地与血小板结合并从血小板解粘附(disadhere)。可通过改变流量(例如通过控制泵的速度)来控制单核细胞/血小板相互作用的停留时间。例如，可初始以慢速/低流量操作泵以增强单核细胞/血小板相互作用，然后可提高速度/流量以有利于从处理装置解粘附和收集经处理的单核细胞。似乎在约0.1至约2达因/cm2、约0.1至约1达因/cm2、并且优选地约0.1至约0.5达因/cm2下可最佳实现单核细胞和血小板的粘附，而可在提高的剪切水平下最佳实现单核细胞的解粘附和收集.[0142]应理解的是，单核细胞的活化导致固定，例如通过与活化的血小板、血小板衍生因子或血浆组分相互作用.为了收获诱导的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞，可将剪应力提高到例如20达因/cm2，和/或可通过添加因子(例如plavic、阿司匹林或其他血液稀释剂)用允许从活化的血小板、血小板衍生因子或血浆组分解粘附的因子来处理免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0143]温度是影响单核细胞的活化及其向树突细胞分化的另一个因素。根据本发明的方法可在约18℃至约42℃、优选约22℃至约41℃、更优选约37℃至约41℃下进行。[0144]也可被改变以调节单核细胞的活化的一个参数是血浆组分涂布流动室的密度，因此也是与血浆组分结合的血小板涂布流动室的密度.通常，血浆组分和血小板对流动室表面涂布得越密集，单核细胞的活化越有效。[0145]如上所述，血小板通过与血浆组分结合来活化。根据本发明的术语“活化的血小板”用于指表现出p选择蛋白、αiib-β3整联蛋白和/或含rgd的蛋白质(如纤连蛋白、纤维蛋白原或者因血小板与血浆组分如纤连蛋白和/或纤维蛋白原结合导致的玻连蛋白)的表达提高的血小板。可通过常规方法(如rt-pcr、western印迹或facs分析)来确定表达。根据本发明的术语“未活化的血小板”用于指不能通过与纤维蛋白原的γ组分预孵育血小板来降低与血浆蛋白(如纤连蛋白或纤维蛋白原)结合的血小板。[0146]如上所述，通过在剪切应力条件下与活化的血小板结合来活化单核细胞并且开始分化为树突细胞。根据本发明的术语“活化的单核细胞”用于指在剪切应力条件下与活化的血小板结合后表达提高水平之开放构象的β1整联蛋白并且开始表达成熟树突细胞的标志物(如hla-dr /cd83 )的单核细胞。作为确定单核细胞与活化的血小板的相互作用是否导致活化和树突细胞之分化的对照，可比较在不存在抗p选择蛋白抗体(活化)或存在抗p选择蛋白抗体(对照)的情况下，单核细胞在剪切应力下与活化的血小板结合后hla-dr /cd83 的表达。可通过常规方法(如rt-pcr、western印迹或facs分析)来确定表达。如果还施加dna交联剂(如8-mop)以及使活化的单核细胞暴露于光(如uva)，则可将分化过程引导向免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞，因此提高gilz的表达。由实施例2的数据可以看到，这种细胞即使用lps处理也依然抵抗分化为免疫刺激性自体树突细胞，因此不持续表达高水平的hla-dr、cd83、cd80和cd86，而是依然保持耐受原性状态。[0147]在通过根据本发明的方法使单核细胞活化后，其开始分化为免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞.如上所述使用根据本发明的术语“免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞”。这些免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞可通过例如gilz的表达提高，优选地额外通过表1分子标志物的表达不提高来鉴定。[0148]本文所述实验发现进一步直接建议了可提供不同优点的该第一个方面的多种实施方案。[0149]可在小型化装置中实现单核细胞的活化以及随后诱导这些单核细胞分化为免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞的发现允许用更少量的体外血液样品进行所述过程。如上所述，经典ecp程序需要处理通常通过单采血液成分术(如白细胞单采)从患者获得的2.5l至6l血液，以获得包含包括单核细胞的白细胞以及血浆组分和血小板的约200ml至500ml的终体积。[0150]然而，根据本发明的方法可需要明显更低量的血液样品，因此避免了对单采血液成分术(如白细胞单采)或其他处理的需要，其被认为增加患者负担。[0151]因此，可进行本发明方法而不需要单采血液成分术(如白细胞单采)，并且可在手持装置中进行获得这种免疫抑制性自体树突细胞的全部过程。[0152]因此，在本发明第一个方面的一个实施方案中，其可以与上述实施方案组合，预期根据第一个方面进行所述方法，其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液不是通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的。[0153]所述体外量的所述哺乳动物对象血液可以为约5ml至约500ml、约10ml至约450mi、约20ml至约400ml、约30ml至约350ml、约40ml至约300ml、或约50ml至约200ml或约50ml至约100ml的所述哺乳动物对象的体外血液，以得到约1ml至约100ml、约1ml至约50ml、约1ml至约40ml、或约1ml至约30ml的体外量的哺乳动物血液样品的终体积。[0154]抽出并且施加到装置的体外量的血液可以是全血。或者，所述体外量的所述哺乳动物对象血液可以通过从约5ml至约500ml、约10ml至约450ml、约20ml至约400ml、约30ml至约350ml、约40ml至约300ml、或约50ml至约200ml或约50ml至约100ml的所述哺乳动物对象的体外全血分离白细胞获得。[0155]所述体外量的所述哺乳动物对象血液还可通过从约5ml至约500ml、约10ml至约450ml、约20ml至约400ml、约30ml至约350ml、约40ml至约300ml、或约50ml至约200ml或约50ml至约100ml的所述哺乳动物对象的体外全血分离血沉棕黄层获得。[0156]在所有前述情况(全血、白细胞级分、血沉棕黄层)下，所述体外量的血液通常包含约1×104至约1×108单核细胞/ml，例如约5×106单核细胞/ml.[0157]本领域技术人员熟悉如何获得全血、其白细胞级分或其血沉棕黄层级分(参见，例如bruil等，transfusionmedicinereviews(1995)，ix(2)，145-166)，包括过滤、差速离心。优选方法依赖于过滤器，其可获自例如pall。可将这种过滤器整合到装置中，使得可在手持装置中对体外样品进行处理。作为来源，还可使用例如脐带血。[0158]如果使用离心，可通过具有例如17或18号针的注射器获得全血.可将这种全血样品离心以除去碎片和其他组分。然后可通过如获自pall的普通过滤器过滤所述全血样品.[0159]为了获得单核白细胞级分，可如所述获得全血样品，然后使样品在例如ficoll-hypaque上分层.随后，以例如约100g至约200g、如约180g进行离心步骤，然后可从界面收集单核白细胞级分并且用普通缓冲液(如hbss)洗涤。然后使经洗涤的单核白细胞重悬在无血清细胞培养基中，例如rpmi-1640培养基(gibco)。用于获得单核白细胞级分的其他方法包括淘析、过滤、密度离心等。[0160]如上文指出的，诱导树突细胞形成的关键步骤似乎包括通过血浆组分活化血小板以及通过这种活化的血小板活化单核细胞。原则上，可在剪切应力下使全血样品通过装置.然后这种样品的血浆组分将结合在流动室的表面上，并允许血浆组分粘附和活化这种样品中的血小板.然后这种样品的单核细胞将与活化的血小板结合并且自身被活化。[0161]类似地，可获得多种组分的组合，例如包含可如下获得之级分的富集血小板的血浆：将如上所述获得的全血样品在约100g至约180g(如约150g)下离心约10分钟至约20分钟(如约15分钟)，以分离全血样品的碎片.然后收集富集血小板的血浆层，并且在约700g至约1000g(如约900g)离心约3分钟至约10分钟(如约5分钟)。然后使所得沉淀重悬在无血清细胞培养基中。[0162]然而，为了对过程最好地控制，可能希望首先使血浆组分通过流动室并使其粘附，然后才是血小板，然后才是含单核细胞的级分。对于这种方法，可能希望获得包含含有单核细胞之单核细胞级分或血沉棕黄层级分的白细胞级分，其不包含血浆组分，并且其不包含血小板。这种不含血浆和不含血小板之含单核细胞的级分可如本领域中所述获得。如果如上所述获得白细胞级分或血沉棕黄层级分，为了本发明的目的，其可能完全不含血浆或血小板。对于这种方法，还可能希望具有血小板级分和/或血浆级分。[0163]因此，本发明预期在将所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前，使用从体外量的所述哺乳动物对象血液分离的血小板。然后可使这些血小板通过已经用血浆组分(如纤连蛋白)涂布的流动室.[0164]在另一个实施方案中，本发明考虑了在将所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前，使用从体外量的所述哺乳动物对象血液分离的血浆组分。然后可使这些血浆组分通过流动室以使得其可以粘附.[0165]除了使用从体外量的血液获得的血浆组分，还可使用从其他来源分离的血浆组分，例如通过重组蛋白表达。这种血浆组分包括纤维蛋白原、纤连蛋白、p-选择蛋白及其片段，例如纤维蛋白原的γ组分.[0166]虽然可优选使用不是通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的体外量的血液，但是使用通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的体外量的血液并不排除在本发明之外。[0167]因此，在本发明第一个方面的另一个实施方案中，预期了进行上文所述方法，其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得.[0168]单采血液成分术(如白细胞单采)可如本领域中已知那样进行。因此，可从对象获得体外量的血液(例如2.5l至6l)，并且通过常规白细胞单采处理以获得三种级分，即血浆、血小板和血沉棕黄层。包含蛋白质(如纤连蛋白和纤维蛋白原)的血浆是最轻的血液级分，因此是选择性从离心机中除去并通过通道或通道样结构的血液的第一部分。在血浆已经被泵送通过通道或通道样结构并且其表面已经被血浆蛋白涂布后，将白细胞单采离心机中第二最轻的组分血小板级分泵送进入并通过通道或通道样结构。待从白细胞单采离心机中洗脱的第三最轻级分是血沉棕黄层，其包含白细胞，包括血液单核细胞。然后将包含单核细胞的血沉棕黄层泵送通过通道或通道样结构。可使用therakos装置、spectra细胞分离器(参见，andreu等，(1994)，transf.sci.，15(4)，443-454)或来自macopharma的theraflex装置获得血液样品。[0169]因此，在本发明的一个实施方案中，本发明考虑使用血小板，所述血小板从通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的体外量的所述哺乳动物对象血液分离，所述分离在将包含单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前进行.[0170]在本发明的另一个实施方案中，考虑使用血浆组分，所述血浆组分从通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得的体外量的所述哺乳动物对象血液分离，所述分离在将包含单核细胞和/或血小板的所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前进行.[0171]除了使用从体外量的血液获得的血浆组分外，还可使用从其他来源分离的血浆组分，例如通过重组蛋白表达。这种血浆组分包括纤维蛋白原、纤连蛋白或p选择蛋白.还可使用血浆蛋白片段，例如纤维蛋白原的γ组分，其对应于氨基酸400-411(seqidno.：105，his-his-leu-gly-gly-ala-lys-gln-ala-gly-asp-val)。本文展现的数据表明，这种γ组分能够活化血小板。因此，优选地使用至少(如果不是主要)包含纤连蛋白的血浆级分。同样地，可优选地使用例如重组表达的和/或纯化的纤连蛋白或其γ组分来活化血小板。[0172]对于本发明第一个方面通过或不通过单采血液成分术(如白细胞单采)获得体外量的血液的两种实施方案中，可考虑使所有三种级分(即，血浆组分、血小板和含单核细胞的级分)一起(例如，甚至是以全血样品的形式或仅使用全血的预纯化级分)通过流动室，即使使这些级分以前述顺序通过流动室可对过程提供更好的控制。可通过例如对血袋离心和挤出上清液来获得全血的预纯化级分，其可富集白细胞和血小板。[0173]如上文提到的，通过流动室的流量以及因此导致的剪切应力将实现单核细胞向树突细胞的分化.此外，施加可光活化dna交联剂(如8-mop)和暴露于光(如uva光)可用于诱导gilz的表达提高.除流量外，可改变流动室的设计和尺寸以操纵甚至改善施加到单核细胞的物理力，以及确保基本上所有单核细胞均可与dna交联剂(如8-mop)接触并且暴露于光(如uva)。[0174]具有具通道或通道样结构之流动室的装置可以是合适的.这样的流动室具有可用于图17中描绘的经典ecp程序的一般结构，但是更小的装置尺寸.[0175]然而，也可使用其他几何结构，例如图18的a)至d)中描绘的那些.因此，本文所述发现允许考虑几何结构显著简化的流动室，其允许更好地控制在过程中发生的过程的湍流和剪切应力方面.[0176]具有多个流动室的装置可以是合适的。这样的流动室具有可用于图17中描绘的经典ecp程序的一般结构，但是更小的装置尺寸。[0177]通常，随着含单核细胞的级分通过，将在流动室(如通道)中产生流动梯度.单核细胞交替与血小板/或血浆组分结合并从上面脱离。通过这种增加单核细胞对于血小板和/或血浆组分的暴露从而提供了该成熟过程增加的信号传导的相互作用极大地增强单核细胞成熟为树突细胞。[0178]因此，为了尽可能获得均匀的免疫抑制性自体树突细胞群和/或同种异体树突细胞群，期望选择流动室(如通道)的设计和尺寸以避免在流动室中的不同流动区。[0179]原则上，流动室(如通道)可具有适于上述目的的任何横截面形状。因此，其可具有矩形、圆形、椭圆或其他横截面形式。虽然这种流动室的尺寸将在下文主要关于矩形横截面讨论，但是优选的是使用具有椭圆或圆形横截面的流动室(如通道)，因为这种横截面应允许例如血浆组分更均匀涂布和/或具有较少湍流的更连续流动性质。[0180]如果具有矩形横截面，流动室(如通道)的尺寸可为约5μm至至多约500μm高和约5μm至至多约500μm宽.通道或通道样结构的尺寸还可为约10μm至至多且包括约400μm高和约10μm至至多且包括约400μm宽，约10μm至至多且包括约300μm高和约10μm至至多且包括约300μm宽，约10μm至至多且包括约250μm高和约10μm至至多且包括约250μm宽，约10μm至至多且包括约100μm高和约10μm至至多且包括约100μm宽，或约10μm至至多且包括约50μm高和约10μm至至多且包括约50μm宽。[0181]如果使用椭圆横截面的流动室(如通道)，将对前述宽和高的尺寸进行相应调整以允许相当的体积。[0182]如果使用圆形横截面的流动室(如通道)，直径通常可以为约5μm至至多且包括约500μm，约10μm至至多且包括约400μm，约10μm至至多且包括约300μm，约10μm至至多且包括约250μm，约10μm至至多且包括约100μm，或约10μm至至多且包括约50μm.55mlrpmi进行第二次洗涤。然后将收集的活化的单核细胞合并并用于进一步分析。[0196]以这种方式，可获得免疫抑制性树突细胞和/或同种异体树突细胞以及免疫抑制性自体抗原呈递细胞和/或同种异体抗原呈递细胞，而不需要非常昂贵的细胞因子混合物来诱导单核细胞向树突细胞分化，所述细胞因子混合物还使用非生理的高浓度并且需要将细胞孵育几天以诱导单核细胞向树突细胞分化。尽管不必要，但是可考虑在孵育期间在具有一种或更多种细胞因子和/或趋化因子(如il-10、il4或tgf-β)的缓冲培养基中培养这些免疫抑制性树突细胞和/或同种异体树突细胞以及免疫抑制性自体抗原呈递细胞和/或同种异体抗原呈递细胞，以进一步增强向耐受原性状态的分化。如果考虑，培养可在标准条件(例如，37℃和5％co2)下在用于培养人细胞的标准培养基中进行，如在rpmi-1640培养基(可获自例如gibco)中，其补充有15％ab血清(可获自例如geminibio-products)。[0197]此外，然后可在向对象重新施用之前对这样的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞离体操作，以便为了期望治疗目的而对其进行特制.[0198]因此，在向对象重新施用之前，可将这样的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞例如离体处理，例如使其负载抗原，所述抗原来源于参与自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植排斥和移植物抗宿主病的细胞.这些抗原可以例如以包含这些抗原之凋亡细胞的形式提供。这将得到免疫抑制性自体抗原呈递细胞和/或同种异体抗原呈递细胞。通过本文的理解提供的本发明的一个优点在于，可使获得免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞与负载来源于参与自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植排斥和移植物抗宿主病之细胞的抗原分开。以这种方式，可分离免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞并进行特制以用于特定目的.[0199]特别地，可使免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞负载疾病抗原以产生抗原呈递树突细胞，其在重新引入到对象中后，将抑制针对所述抗原的免疫应答。[0200]为了治疗自身免疫病，可选择疾病的抗原，例如，其中自身免疫病选自包括类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、i型糖尿病和系统性红斑狼疮的组。[0201]将根据本发明获得的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞与疾病效应剂孵育足够的一段时间以使孵育细胞群中的功能性抗原呈递树突细胞的数目最大化.通常，将经处理的血液细胞浓缩物和可能的抗原孵育约1至约24小时的一段时间，优选的孵育时间持续约12至约24小时。在重新引入至对象之前，额外的孵育时间对于负载的免疫抑制性抗原呈递细胞的充分成熟是必需的.优选地，将血液细胞浓缩物和疾病效应剂在35℃至40℃的温度下孵育。在一个特别优选的实施方案中，孵育在约37℃进行。[0202]如上所述，通过使由本文所述方法可获得的免疫抑制性树突细胞负载抗原，允许产生免疫抑制性抗原呈递细胞.[0203]为了避免例如递送的抗原的蛋白质降解和树突细胞对可溶抗原的低效处理，预期通过将抗原包封在聚合物纳米颗粒(np)中来增强免疫抑制性抗原呈递细胞的形成，所述聚合物纳米颗粒可由可生物降解聚合物(如聚乳酸)制成(waeckerle-men等，advdrugdelivrev(2005)，57：475-82).这种np还用dec-205的靶向部分(如dec-205抗体)进一步修饰以改善受体介导的胞吞和抗原呈递。[0204]因此，本发明预期了使用包封在聚合物纳米颗粒中的抗原以任选地进一步增强免疫抑制性抗原呈递细胞的形成.[0205]根据上述方法诱导单核细胞分化提供了免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞，其数目等于或超过在细胞因子(如il-10、il-4或tgf-β)存在下通过昂贵且费力地培养白细胞几天获得树突细胞的数目。通过上述方法产生的大量功能性树突细胞提供了呈递所选材料(如凋亡细胞、疾病抗原、抗原、质粒、dna或其组合)的准备好的手段，因此有益于有效的免疫治疗。[0206]如上所述，可优选在存在可光活化dna交联剂(如8-mop)并且暴露于光(如uv-a)的情况下，通过根据本发明的方法获得免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0207]因此，本发明的目的在于获得个体特异性的在功能和成熟方面同步的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞。[0208]在第二个方面，本发明涉及通过本文所述方法可获得的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞，其优选地用于治疗自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植排斥和移植物抗宿主病.自身免疫病可选自类包括类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、i型糖尿病和系统性红斑狼疮的组。[0209]在第三个方面，本发明涉及通过向有此需要的患者施用通过本文所述方法可获得的免疫抑制性自体树突细胞和/或同种异体树突细胞来治疗自身免疫病、超敏反应疾病、实体器官移植排斥或移植物抗宿主病的方法。[0210]现参照一些具体实施例描述本发明，然而，这些实施例是用于说明目的，而不应以限制的方式解释.[0211]实验[0212]实验1-用于诱导单核细胞活化的剪切应力和血小板活化[0213]材料和方法[0214]白细胞和血小板的获得[0215]所有样品由未服用已知影响血小板功能的药物(包括阿司匹林)的年轻健康对象取得。根据yalehumaninvestigationalreviewboard指南获得样品，并根据赫尔辛基宣言(declarationofhelsinki)提供知情同意书。通过19号针从肘前静脉采集外周血试样到含有肝素的注射器中，然后在ficoll-hypaque(gallard-schlessinger，carleplace，n.y.)上分层。在180g下离心后，收集含单核白细胞级分的界面并且在hbss中洗涤两次，然后在rpmi-1640培养基(gibco)中重悬至5×106单核细胞/ml的终浓度。在获得细胞的1小时内使用。[0216]富集血小板的血浆的制备[0217]将全血在室温下150g离心15分钟.收集富集血小板的血浆(prp)层并且在900g下离心5分钟，使血小板沉淀在rpmi1640中重悬至期望浓度。[0218]平行板的制备[0219]使用两个类似的平行板流动室模仿ecp的流体动力学.使用较大的glycotech系统(glycotech，rockville，md)进行实验，其包括评估流动后细胞表型。该系统由测量值为20000×10000×254微米(长×宽×高)的体积流路组成。该系统底板由被垫片隔开并且与丙烯酸流动板(其形成上板)真空连接的15mm培养皿(bdbiosciences，durham，nc)构成.对于需用血小板预涂布板的实验，在组装流动室之前，将20滴期望浓度的prp置于培养皿的中央，并且允许血小板在室温下静止20分钟。将培养皿用2mlrpmi洗涤两次，然后组装流动室。[0220]对于不包括收集和流动后细胞表型分析的实验，使用vena8生物芯片(cellixltd，dublin，ireland)产生层流.vena8生物芯片通道的体积流路测量值为20000×400×100微米(长×宽×高)。这些芯片的蛋白质涂层在下文的适当部分中描述。[0221]使用平行板进行实验[0222]将平行板流动室安装在具有10×物镜的相差光学显微镜(ck40，olympus，japan)的载物台上。所有运行均在室温下进行。使用能够产生近似恒定的体积流量的注射泵(kdscientific，newhope，pa)模拟均匀层流场。设计配置的组件以最小化管。在将细胞混悬液输注通过板之前，用5mlrpmi以产生约1达因/cm2的壁面剪切应力的流量洗涤系统.然后使目的细胞混悬液以固定的流量和壁面剪切应力通过室。[0223]实时观察所有实验，使用dp200数码相机和软件(deltapix，maalov，denmark)以15.2帧每秒记录，并且使用imagej软件(nih)分析。[0224]过夜培养[0225]当需要过夜培养时，将细胞离心并且以5×106细胞/ml的终浓度重悬在补充有15％ab血清(geminibio-products)的rpmi-1640培养基中(gibco)。将细胞在12孔聚苯乙烯组织培养板(每孔2ml)中于37℃、5％co2下过夜培养18小时。[0226]免疫表型分析[0227]用于免疫表型分析的单克隆抗体包括cd14(lps受体；单核细胞)，cd11c(整联蛋白亚基；单核细胞和dc)、hla-dr(mhcii类分子)、cd83(dc标志物)、cd62p(p-选择蛋白；活化的血小板)和cd61(整联蛋白亚基；血小板)。抗体获自beckmancoulter(cd14，cd11c，hladr，cd83)或sigma(cd62p，cd61)，并且以其预先确定的最佳稀释度使用。用适当的同种型对照建立背景染色，并且使用fc500流式细胞仪(beckmancoulter)分析免疫荧光。通过添加预先确定的最佳浓度的两种直接与fitc或pe缀合的抗体并且在4℃下孵育20分钟来进行双色膜染色，然后洗涤以除去未结合抗体。根据制造商用于细胞固定和透化的说明书(intraprep试剂盒，beckmancoulter)进行组合的膜和细胞质染色。[0228]定量实时pcr[0229]比较在流动通过平行板期间暴露于低(10±5/低倍视野[lpf])和高(102±32/lpf)水平血小板然后过夜培养的细胞之间的基因表达.使用具有柱上dnasei处理的rneasyminikit柱(qiagen)分离细胞rna。使用nanodropnd-1000分光光度计和agilent2100生物分析仪测量rna产率和纯度。使用highcapacitycdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将rna逆转录成cdna.逆转录在96孔热循环仪(mjresearchptc-200)中以以下条件进行：25℃，10分钟；37℃，120分钟；85℃，5秒.使用taqman实时pcr检测dc-lamp、cd40、adamdecysin、lox1、ccr7、cd80、cd83、cd86、fprl2和gpnmb的转录物.由编目录(inventoried)的taqman基因表达测定(appliedbiosystems)获得用于各序列的引物和探针.使用hprt1作为参照基因。[0230]血小板与单核细胞的共培养[0231]如过夜培养部分中所述进行涉及单核细胞与另外的血小板之共培养的实验，只是进行了一些必要修改。在ficoll-hypaque分离之后，使单核细胞以10×106细胞/ml的终浓度重悬在30％ab血清/rmpi中，从其中向16孔平板的每个孔中分配1ml。然后向每个孔添加血小板相互作用，对于中密度板和低密度板，分别降低到了每秒18.3±14和3.4±1个相互作用(图1的a).[0243]在过夜孵育后，发现了发育出dc表型的细胞的百分比与前一天观察到的单核细胞-血小板物理相互作用的频率之间的相关性(图1的b)。增加的单核细胞-血小板相互作用数目与表达符合dc分化的标志物(膜hla-dr和cd83)的细胞增加的比例相关。在过夜孵育后，平均14.2％暴露于高密度血小板涂布板的单核细胞是hla-dr /cd83 ，相比之下分别有4.9％和0.8％的单核细胞暴露于涂布有中和低水平血小板的板。[0244]单核细胞暴露于血小板导致基因表达改变[0245]为了补充血小板暴露后观察到的单核细胞表型中描述的改变，进行rt-pcr以评估基因表达的改变。如前文部分所述使单核细胞通过涂布有高密度或低密度血小板的平行板。过夜孵育后，提取rna并且进行rt-pcr以确定与dc相关的10种基因的表达水平(图2)。cd40是一种已知在成熟树突细胞上表达的共刺激分子(cella等，1996，见参考文献列表)，相对于暴露于低水平血小板的单核细胞，发现暴露于高密度血小板的单核细胞中cd40上调超过567％。lamp3是一种dc分化特异性标志物(desaint-vis等，1998，见参考文献列表)，其被上调398％。cd80是一种已知在apc活化后上调的共刺激分子(slavik等，1999，见参考文献列表)，其在暴露于高水平血小板的单核细胞中上调220％。ccr7是一种已知在dc向淋巴器官迁移中具有作用的趋化因子受体，其被上调376％.lox1、cd83、ccr7和adamdecysin全部是与dc相关的基因(berger等，2010，见参考文献列表)，在暴露于高水平血小板的单核细胞中也被上调。fprl2、gpnmb和cd86在暴露于高水平血小板的单核细胞中全部被下调。fprl2是在活化时已知抑制dc成熟的一种受体(kang等，2005，见参考文献列表).gpnmb是参与减少细胞因子产生的蛋白质(ripoh等，2007，见参考文献列表)；cd86是apc表达的共刺激分子。[0246]在静态条件下不发生血小板存在下的dc诱导[0247]血小板可通过直接受体-配体相互作用或通过细胞因子和其他分泌介体潜在地影响单核细胞.为了确定血小板诱导单核细胞向dc分化是否需要流体动力学，在静态条件下测试了血小板的作用。将单核细胞与低(＜50,000/mm3)、中(100-200,000/mm3)和高(＞400,000/mm3)浓度的血小板共培养，其中血小板为非活化或活化状态(通过添加凝血酶诱导).在静态条件(剪切应力＝0)下过夜孵育后，发现在不流动的情况下无论是活化的血小板还是非活化的血小板均不能诱导单核细胞向dc分化(参见图3).[0248]悬浮在流中的血小板与吸附在板上的血清蛋白结合[0249]众所周知，大量存在于血浆中的包括纤连蛋白和纤维蛋白原在内的多种蛋白质吸附在玻璃和塑料表面上；因此评估了粘附血浆蛋白对血小板粘附和活化的贡献。用纤维蛋白原、纤连蛋白、血浆或盐水预涂布平行板。然后使未活化的血小板以产生0.2至6.0达因/cm2的壁面剪切应力的剪切率通过。最高浓度的血小板粘附于预涂布有纤维蛋白原的板(图4)。还观察了与纤连蛋白涂布、血浆涂布和未涂布板的粘附，但是程度显著降低(p＜0.05)。在不流动下，所有蛋白质底物上的血小板粘附相等。[0250]纤维蛋白原和纤连蛋白二者均包含具有氨基酸序列精氨酸(r)-甘氨酸(g)-天冬氨酸(d)rgd的片段.众所周知，rgd片段与许多整联蛋白受体相互作用，特别是在整联蛋白处于活性构象时暴露的β亚基的i/a结构域(xiong等，2002，参见参考文献)。在使用纤维蛋白原涂布的板的实验中，用rgd肽预孵育的血小板并未显著改变血小板粘附；然而，通过用对应于纤维蛋白原的氨基酸400-411的肽片段(蛋白质的γ组分)预孵育血小板，粘附显著降低(p＜0.05)(图5的a).在使用纤连蛋白涂布的板的实验中，用rgd肽预孵育血小板显著降低了粘附，而用对应于纤维蛋白原的氨基酸400-411的肽片段预孵育血小板没有效果(图5的b)。有趣的是，应注意，不同于整联蛋白的i/a结构域(已知其与蛋白质的rgd结构域相互作用)，发现与纤维蛋白原的γ组分相互作用的整联蛋白区域在整联蛋白的非活性状态下暴露(weisel等，1992，参见参考文献)。因此，该数据表明，流中的非活化血小板与纤维蛋白原γ组分涂布的板结合。未活化状态的血小板与纤维蛋白原结合的潜力可解释之前段落中解释的在纤维蛋白原涂布板上见到的较高水平的血小板粘附。[0251]通过粘附至板活化血小板[0252]血小板生理上以非活性状态循环，其中大量蛋白质储存在细胞内颗粒中。在经受刺激(如损伤的内皮或凝血酶)后，血小板被活化，并且几乎立刻将这些细胞内蛋白质转移到质膜(kaplan等，1979，参见参考文献)。假定粘附于塑料板/吸附的蛋白质的血小板引起类似于公知刺激引起的血小板活化。为了检验这种假设，评估粘附之前和之后p选择蛋白的表面表达，其是一种公知的血小板活化标志物.粘附前，发现6±3％的血小板表达p选择蛋白，平均荧光强度(mfi)为12.4±6.9；粘附后，p选择蛋白阳性增加到64±13％(mfi98.2±14)。阳性对照是凝血酶活化的血小板，其为71±18％p选择蛋白阳性(mfi108.3±23)。在血小板粘附后30、60和90分钟进一步评估了p选择蛋白的表达；在所有时间点p选择蛋白表达保持稳定，粘附后90分钟72±11％的血小板为p选择蛋白阳性，表明在该过程期间血小板保持活性状态。在评估纤维蛋白原结合整联蛋白αiib-β3时发现了类似趋势，这种蛋白质的表面表达从粘附前的4±ꢀ3％提高到粘附后的49±18％。[0253]单核细胞与在活性血小板上表达的p选择蛋白以及含rgd配体的相互作用[0254]在视频下观察到的单核细胞-血小板相互作用分为两类：(1)短效，任意地定义为发生小于3秒的接触(46帧)，和(2)长效，定义为超过3秒的接触，包括稳定结合。由于之前已经确定了ecp系统中的血小板是活化状态，并且活化的血小板表达大量蛋白质(包括p选择蛋白和含rgd的蛋白质(例如，纤连蛋白、纤维蛋白原和玻连蛋白)，因此试图确定这些蛋白质参与(如果有的话)短持续时间相互作用或长持续时间相互作用。用血小板预涂布板，并且测试4个条件：(1)用不相干同种型对照预处理的血小板，和未处理的单核细胞(p rgd )；(2)用不相干同种型对照预处理的血小板，和用rgd肽预孵育的单核细胞(p rgd-)；(3)用抗p选择蛋白预处理的血小板，和未处理的单核细胞(p-rgd )；(4)用抗p选择蛋白预处理的血小板，和用rgd肽预处理的单核细胞(p-rgd-)。假设用rgd肽预处理单核细胞将导致可用于与血小板表达之含rgd的蛋白质相互作用的游离rgd识别受体数目的降低。因此，所测试的四个条件代表了与两种血小板配体p选择蛋白和含rgd蛋白质的潜在相互作用的每一种排列。如图6所示，在rgd或p选择蛋白均未被阻断(p rgd )时，短效和长效相互作用均最大；将在所有其他条件下相互作用的水平表示为该最大值的百分比。单独用抗p选择蛋白阻断(p-rgd )导致短和长单核细胞-血小板相互作用均降低到几乎为0(p＜0.01；图6，还通过视频分析证实).相比之下，单独rgd阻断(p rgd-)不显著改变短持续时间相互作用的数目，但是使长持续时间单核细胞-血小板相互作用降低44％(p＜0.05；图6)。同时阻断p选择蛋白和rgd二者(p-rgd-)导致与在仅阻断p选择蛋白时所见类似的模式，长和短持续时间相互作用二者均降低至接近0。基于在4种条件中的每一种观察到的相互作用模式，最适当的结论如下：(1)p选择蛋白主要负责短持续时间相互作用；(2)血小板表达的含rgd蛋白质参与长持续时间相互作用，但是不参与短持续时间相互作用；(3)单核细胞与p选择蛋白的相互作用必须发生在单核细胞与血小板表达的含rgd蛋白质相互作用的上游.最后的结论基于以下观察：p-rgd 条件使短和长持续时间相互作用二者均降低至接近0，而p rgd-条件仅降低长持续时间相互作用。如果相互作用不是顺序的，p-rgd 条件在长持续时间相互作用方面应产生类似于p rgd 的结果.此外，通过发现p rgd-条件仅影响长持续时间相互作用，而p-rgd 条件产生类似于p-rgd-的结果，相互作用的顺序(即p选择蛋白作用于rgd相互作用的上游)是明显的.[0255]单核细胞暴露于p选择蛋白导致下游单核细胞的整联蛋白活化[0256]已知开放构象的整联蛋白受体与含rgd配体相互作用(ruoslathi等，1996，参见参考文献)。使用识别仅在β1整联蛋白处于开放构象时才暴露之表位的抗体，评估了流过模型之前和之后单核细胞整联蛋白的构象。图7表明，随着短效单核细胞-血小板相互作用数目增加，流动后表达开放构象的整联蛋白的单核细胞的百分比立即相应增加.黑线表明相比于9％接受了低数目血小板相互作用(＜5.1 2/lpf×秒)的单核细胞，平均71％接受了高数目血小板相互作用(＞61±19/lpf×秒)的单核细胞表达活性形式的β1。用不相干同种型对照预处理粘附血小板并不显著影响这些结果(灰线).相比之下，用抗p选择蛋白预处理血小板使单核细胞‑ꢀ血小板相互作用降低至接近0，从这些条件中的流出现的单核细胞(虚线)表现出低水平的活性β1整联蛋白，而不论其所暴露的血小板的密度。值得注意的是，通过板之前的所有细胞群展示类似的低基线整联蛋白活性水平(＜10％)；因此，在短持续时间单核细胞-血小板相互作用中看到的差异不是由流动前整联蛋白构象的差异导致。[0257]dc分化需要单核细胞暴露于p选择蛋白[0258]考虑到单核细胞-血小板相互作用对血小板p选择蛋白的依赖性，开始确定在时间为0时单核细胞暴露于p选择蛋白与随后在过夜孵育后18小时时单核细胞发育的表型之间是否有关系(图8)。使单核细胞通过涂布有高密度(108±36/lpf)未处理(未阻断)的血小板或者用抗p选择蛋白或同种型对照预处理之血小板的平行板。在过夜孵育后，15.5±4％暴露于未阻断血小板的单核细胞变为膜hla-dr /cd83 (成熟dc的标志物)，而13±4％暴露于用不相干同种型对照阻断之血小板的那些变为膜hla-dr /cd83 。相比之下，在过夜孵育后，仅3±2％暴露于用抗p选择蛋白阻断之血小板的单核细胞变为hla-dr /cd83 。[0259]实验2-免疫抑制性树突细胞之另一些分子标志物的鉴定[0260]材料和方法[0261]样品收集和单核细胞富集[0262]根据yalehumaninvestigationalreviewboard的指南由健康对象获得外周血试样，并根据赫尔辛基宣言提供知情同意书。通过在ficoll-hypaque梯度(isolymph，ctlscientific)上离心分离pbmc。如下由新鲜分离的pbmc富集单核细胞：1)用于地塞米松剂量滴定实验的塑料粘附(纯度：71.6±5.6％cd14 )；2)用于puva剂量滴定实验的cd14磁珠阳性选择(miltenyibiotec)(纯度：88.1±3.5％cd14 )，和3)用于lps刺激实验的单核细胞分离试剂盒ii(miltenyibiotec)(纯度：83.8±3.8％cd14 )。[0263]单核细胞衍生树突细胞(modc)的产生[0264]在37℃、5％co2下将单核细胞以5×106细胞/ml的密度培养在6孔和12孔聚苯乙烯组织培养板中，所述培养在补充有热灭活的15％ab血清(gemini)和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640(gibco)(现在称为完全培养基)中进行。向培养物添加800iu/ml重组人gm-csf(r&dsystems)和1000iu/ml重组人il-4(r&dsystems)持续36小时，以诱导如所述的单核细胞向dc分化。[0265]8-mop和uva光处理[0266]将培养物在黑暗中用8-mop(uvadex，20μg/ml)孵育30分钟，然后用含一系列12个线性荧光管的台式uva灯箱辐照。所述管发射320至400nm的uva光。使用光电二极管测量uva辐照(功率，w/m2).给出测量的副照度和系统多个组件的吸收性质，可确定递送给定剂量uva辐射(j/cm2)所需的细胞暴露时间(秒，sec)。[0267]modc/淋巴细胞共培养[0268]在塑料粘附期间除去的非粘附细胞(纯度：66.0±4.5％cd3 )现在一般称为淋巴细胞。用8-mop(100ng/ml)和uva(1j/cm2)处理淋巴细胞，用pbs洗涤，并且以5或10个淋巴细胞与1modc的比与puva处理的或未处理的modc在完全培养基中于37℃和5％co2下共培养。用100nm地塞米松(sigma)处理modc24小时用作阳性对照组.24小时后，收获细胞并且再纯化modc.为了确保不从淋巴细胞分离显著量的rna，关键是使用cd11c磁珠(miltenyibiotec)阳性选择(纯度：96.4±ꢀ1.0％cd11c )从所有培养物中再纯化modc。将cd11c modc以0.5-1.0ꢀ×106细胞/ml再铺板在完全培养基中并且用100ng/mllps(sigma)刺激。lps刺激后24小时，收获细胞用于rna分离和免疫表型分析，并且收集上清液用于细胞因子量化。作为阴性对照，平行组不接受lps.[0269]sirna实验[0270]用脱靶预测算法的沉默子选择预设计和验证的gilzsirna(invitrogen)用于敲减gilz表达。使用lipofectaminernaimax试剂(invitrogen)转染mo-树突细胞.将rnai双链体和lipofectamine试剂一起孵育20分钟，然后添加至modc培养物并且在37℃和5％co2下孵育2小时。以与modc/淋巴细胞共培养所述相同的方式处理转染的modc.还用乱序(scramble)sirna转染modc。[0271]免疫表型分析[0272]单克隆抗体包括hla-dr、cd80、cd83、cd3、cd86、cd14、cd11c和gilz。抗体获自beckman-coulter和ebioscience，并且以其预先确定的最佳稀释度使用.使用具有识别凋亡细胞表面上之磷脂酰丝氨酸(ps)的膜联蛋白v的膜联蛋白v凋亡检测试剂盒(ebioscience)评估凋亡。7-aad代替pi作为细胞生存力染料。展现膜联蛋白v /7-aad-表型的细胞被归类为早期凋亡细胞，而展现膜联蛋白v /7-aad 表型的细胞被归类为晚期凋亡细胞。使用intraprep固定和透化试剂盒(beckman-coulter)进行膜和胞质内双染色.用合适的同种型和荧光扣除对照(fluorescenceminusonecontrol)建立背景染色.在用2％多聚甲醛固定2小时内使用facscaliburl(bdbiosciences)分析免疫荧光。每组收集最少10,000个事件。[0273]定量实时pcr[0274]使用具有柱上dnasei处理(qiagen)的qiashredder柱(qiagen)和rneasyminikit(qiagen)从cd11c modc分离rna。使用nanodropnd-1000分光光度计评估rna产率和纯度。使用highcapacitycdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)在96孔热循环仪(mjresearchptc-200)中获得cdna。使用taqman实时pcr检测gilz、cd80和cd86的转录物。按照预设计和验证的taqman基因表达测定(appliedbiosystems)获得引物和探针。使用sybr绿色实时pcr(appliedbiosystems)检测il-12、il-10、il-6、tnf-α和tgf-β的转录物。使用primer3plus设计引物以跨越内含子接点.获得引物熔化曲线以证实单个产物.使用hprt-1和gapdh作为参照基因。样品在7500实时pcr系统(appliedbiosystems)上一式三份地运行.使用a-ac(t)方法计算倍数变化。[0275]细胞因子量化[0276]利用il-6、il-8、il-10、il-12p70、ifn-γ、tnf-α、rantes、mcp-1和mip-1β的磁珠(bioradlaboratories)以多重格式分析培养物上清液.对于sirna实验，用il-10(r&dsystems)和il-12p70(enzolifescience)的酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒分析上清液。所有样品和标准品一式两份地运行，并且使用luminex200(luminex)或biotekel800(biotek)分析.[0277]绕计分析[0278]使用学生t-检验进行组间统计学比较，认为p值＜0.05是统计学显著的。a≥2.5倍数变化并且p值＜0.05时认为差异基因表达是统计学显著的.[0279]结果[0280]随着单核细胞分化为未成熟modc，gilz的表达迅速下调[0281]新鲜分离的cd14 单核细胞表达gilz，但是随着其分化为未成熟modc，gilz迅速下调超过99％(图10的a)。gilz蛋白水平下降61％证实了gilzmrna的减少(图10的b)。gilz下调与cd14(单核细胞特异性标志物，参见zhou等，参考文献)的表达下降以及细胞质cd83(未成熟modc标志物，参见klein等，参考文献)的表达提高相关。重要的是，modc保持未成熟，表达低膜cd83(成熟dc标志物，参见renzo等，参考文献，p＝0.16).在用地塞米松(dex)处理后，modc以剂量依赖方式上调gilz(图10的c)。选择用100nmdex处理24小时作为阳性对照以诱导modc(dex-树突细胞)中的gilz表达(图10的d).[0282]单独8-mop或uva处理不影响gilz表达(图10的e)。然而，当用8-mop和uva光的组合(puva-树突细胞)处理modc时，gilz表达增加5.5倍。gilz的诱导表现为慢的时间过程，峰在处理后24小时，并且保持显著的提高72小时(图10的f)。相比之下，dex-树突细胞上调的gilz短至处理后2小时.[0283]用8-mop和uva光的组合处理的未成熟modc上调了gilz，并且呈现耐受原性免疫抑制性表型[0284]接下来检查是否对gilz表达具有puva剂量依赖的作用。用1j/cm2uva和100或200ng/ml8-mop处理的modc分别使gilz上调了2.9倍和4.4倍(图11的a)。从50ng/ml浓度的8-mop开始，用2j/cm2观察到了类似剂量依赖现象。在8-mop浓度达到200ng/ml之前，用0.5j/cm2处理对gilz表达没有影响，并且用4j/cm2处理导致高水平的非特异性细胞死亡(数据未示出).每106碱基对形成的光加合物的数目与8-mop浓度和uva剂量的乘积直接相关，参见gasparro等，参考文献。随着8-mop和uva的乘积达到100，gilz上调3倍，并且随着所述乘积增加到200和400，gilz分别上调4.8倍和8.6倍(图11的b).[0285]对于测试的所有8-mop剂量，与1j/cm2相比，在2j/cm2下早期凋亡cd11c 细胞的百分比最低限度(p＞0.05)地较高(图11的c).与未处理的modc相比，在2j/cm2和200ng/ml下的早期凋亡cd11c 细胞的百分比增加(图11的c).对于测试的所有8-mop剂量，晚期凋亡cd11c 细胞的百分比保持为在1j/cm2下小于13％，并且在2j/cm2下小于16％(图11的d)。此外，点图突出了modc对逐步升高剂量的puva的促凋亡作用的相对抗性(图11的e).在用1或2j/cm2处理的任何组中，从培养物回收的细胞数没有统计学差异(数据未示出)，并且在处理后收获了大于90％的cd11c 细胞(91.0-97.5％)。[0286]相比之下，淋巴细胞早在用1j/cm2和100ng/ml处理后2小时就展现膜联蛋白v(数据未示出)。与用100ng/ml和1j/cm2处理的modc相比(图11的f)，用相同剂量的puva处理后24小时，早期凋亡淋巴细胞的百分比从未处理modc中的6.6％增加到了puva-树突细胞中的44.3％，而晚期凋亡淋巴细胞的百分比从4.5％增加到33.7％(图11的g)。考虑到处理后24小时64.3±3.2％的淋巴细胞是膜联蛋白v ，后面将puva处理的淋巴细胞称为凋亡淋巴细胞(apol)。[0287]puva剂量依赖地诱导gilz与cd80、cd86和cd83之细胞表面表达的降低相关(图12的a，3b)。这些标志物的下调与gilz的诱导平行(参见图11的b)，对于1和2j/cm2二者，均是以100ng/ml浓度的8-mop开始。随着8-mop和uva的乘积超过100，cd83、cd80和cd86表达分别降低31％、30％和54％，而hla-dr表达增加38％。[0288]modc暴露于凋亡淋巴细胞上调gilz，并且对于lps诱导的完全成熟有抗性[0289]为了仔细分析puva和暴露于凋亡细胞的各自贡献，首先与不同比的apol共培养modc。gilz以apol剂量依赖的方式上调(图13的a)。当puva-树突细胞暴露于apol时，gilz以比单独puva-树突细胞培养更高的水平表达(图13的b).暴露于apol的puva-树突细胞还以比暴露于apol的未处理modc更高的水平表达gilz(分别为6.7倍高和3.6倍高)。在所有gilzmrna上调的组中，gilz蛋白水平响应地提高1.5倍(图13的c).gilz的诱导与早期或晚期凋亡cd11c 细胞数目的增加没有相关性，因为在证明gilz上调的所有组中有＜12％早期凋亡(3.8-11.4％)和晚期凋亡(6.3-11.5％)cd11c 细胞。[0290]表达比未处理modc高2.5倍gilz的modc对于通过lps完全成熟有抗性，并且表现为半成熟的耐受原性表型。lps刺激使上调gilz之modc中cd80表达提高至lps处理后在未处理modc中观察到之水平的仅50％(图13的d，0.48-0.57％)，并且使cd86表达提高至未处理modc的仅45％(图13的d，0.42-0.47％)。对于hla-dr和cd83获得了类似结果(图14的e，分别为lps后未处理modc的47-65％和23-57％)。另外，上调gilz之modc表达6％的未处理modc的cd80mrna(4.5-7.5％)，并且表达50％的未处理modc的cd86mrna(12.4-85.1％)，如通过qrt-pcr评估的。[0291]表达gilz的modc表现耐受原性细胞因子谱，并且敲减gilz降低了il-10与il-12p70的比[0292]从图13的b中所述共培养物收获上清液。dex-树突细胞使gilz上调4.29倍(参见图13的b)，增加il-10产生(图14的a)，并且降低所有测试的促炎细胞因子(图14的b，14的c)和趋化因子(图14的d，14的e)的产生。相比之下，puva-树突细胞使gilz上调2.78倍(参见图13的b)，增加il-10产生并且降低除tnf-α和ifn-γ外的所有测试的促炎细胞因子和趋化因子的产生。暴露于apol的puva-树突细胞或未处理的modc表达比单独培养的puva-树突细胞更高水平的gilz(分别高3.6和6.7倍，参见图13的b)。这两组增加il-10产生并且降低所有测试的促炎细胞因子和趋化因子的产生。在rna水平上确认细胞因子水平，上调gilz的modc也证明使il-10mrna比未处理modc上调8倍(5.5-11.8，p＜0.01).还在rna水平确认了il-12、tnf-α和il-6的减少(数据未示出)。在上调gilz的modc中，tgf-β上调2.5倍(数据未示出)。tgf-β并不包括在多重分析中，因此仅在mrna水平分析。[0293]il-10与il-12p70的比是耐受原性的有用指标，因为耐受原性树突细胞以提高的il-10与il-12p70的比为特征(参见，steinman等，参考文献)。il-10与il-12p70的比从未处理modc中的6.7提高到了dex-树突细胞中的67.7.类似地，l-10与il-12p70的比在puva-树突细胞中提高到38.7，以及在暴露于apol的未处理modc和puva-树突细胞中分别提高到89.4和114.9(p＜0.05)。[0294]为了评估gilz的诱导是否介导耐受原性细胞因子谱，用sirna转染modc以敲减gilz表达。用gilzsirna转染使mo-树突细胞中的gilz表达降低68％(图15的a，59-79％)。用乱序sirna转染并不显著改变gilz表达。与未转染组相比，从转染sirna的任何组回收的细胞数也没有显著差异(数据未示出)。[0295]使gilz上调比未处理modc高2.5倍的经处理的modc产生更高水平的il-10(图15的b)，并且gilz敲减使il-10产生降低39％(34-48％，p＜0.05)。使gilz上调比未处理modc高2.5倍的经处理的modc还产生更低量的il-12p70(图15的c)，而且gilz敲减使il-12p70产生提高188％(149-214％，p＜0.05).用乱序sirna处理对il-10或il-12p70的产生没有可感知的作用.gilz敲减使gilz诱导后已经提高的il-10与il-12p70的比降低。用gilzsirna处理的dex-树突细胞证明il-10与il-12p70的比从未转染modc中的15.3降低到了转染dex-树突细胞中的3.9.在puva-树突细胞中，观察到所述比从未感染modc中的8.4降低到了puva-树突细胞中的2.9，并且在暴露于apol的未处理的modc和puva-树突细胞中，所述比分别从18.1降低到7.8以及从28.4降低到8.3。[0296]这些结果证明，与其他免疫抑制性介体一样，puva诱导gilz的表达并产生耐受原性免疫抑制性树突细胞，所述细胞的特征在于低表达共刺激分子cd80和cd86和成熟标志物cd83。gilz诱导对于向耐受原性细胞因子谱的极化是必需的，所述细胞因子谱特征在于提高的il-10产生和降低的促炎细胞因子和趋化因子产生(包括il-12p70)。这些结果进一步暗示gilz作为分子开关介导凋亡细胞的免疫抑制作用。[0297]实验3-免疫刺激性树突细胞之另一些分子标志物的鉴定[0298]患者样品[0299]根据yalehumaninvestigationalreviewboard的指南获得来自使用uvarxts光提取系统(therakos)进行了ecp之患者的白细胞。根据赫尔辛基宣言提供知情同意书。在1l血小板储存袋(pl-2410；baxter)中在以下三个时间点获得等分试样：处理前(preecp)、紧接8-mop/紫外a(uva)暴露后(ecp第0天)或将处理的血液单核白细胞孵育18小时后(ecp第1天)。[0300]正常对象[0301]为了确定ecp是否诱导来自健康对象的单核细胞转化为dc，将来正常对象的单核白细胞以两种方式检查。在处理前(pre-ecp)、紧接ecp后(ecp第0天)和ecp后18小时(ecp第1天)，研究来自正常对象(n＝3)的白细胞单采的白细胞。整合了uva光源和塑料曝光板的台式设备能够使得实验室再现临床ecp系统，并且对样品进行平行rna分离、免疫表型分析和功能研究。或者，以与经治疗对象(n＝3)相同的方式，从正常对象抽取单位血液到转移袋中并通过ecp处理设备。将从正常血液单位获得的细胞用于微阵列和抗原呈递测定。[0302]补骨脂素添加[0303]如在ecp期间常规进行的，将标准8-mop浓缩溶液(therakos)直接添加至临床ecp设备和实验室模型系统。该引入模式使得在整个临床程序和实验中浓度精确为100-200ng/ml。[0304]过夜培养[0305]在ecp中，无法检验经处理的单核细胞的表型和功能改变，因为这些细胞被立即再输注到患者中。因此，在ecp后，将细胞培养18小时(rpmi1640/15％自体血清)以研究诱导的单核细胞基因活化、成熟和功能.在ecp之前(pre-ecp)以及紧接ecp之后(ecp第0天)，通过在ficoll-hypaque梯度上离心来分离患者和正常对象样品.使细胞重悬在补充有7.5％ab血清、7.5自体血清(geminibio-products)的rpmi-1640培养基(gibco)中，并且以5＊106细胞/ml的密度培养(对于患者)在6孔聚苯乙烯组织培养板和培养在baxter血小板储存袋(对于正常对象，37℃，5％co2)中。在过夜培养后(ecp第1天)，收获细胞然后进行单核细胞富集。为了产生dc用于竞争性表型分析，将细胞在1mlgmcsf和il4(25ng/ml；r&dsystems)的存在下在15％血清的rpmi1640中培养6天。[0306]单核细胞群的磁珠富集[0307]为了能够确定ecp是否活化指导单核细胞到树突细胞成熟途径的基因，有必要开发消除了淋巴细胞对转录组分析的作用同时使单核细胞物理或细胞膜干扰最小化的温和阴性单核细胞富集方法。通过穿过亲合柱的单通道从单核细胞库中富集单核细胞。该阴性选择方法限制了物理干扰，而粘附在与相关单核细胞抗体(抗cd4、cd8、cd19)缀合的磁性微珠(miltenyibiotec)的淋巴细胞被消耗。然而，使ecp第1天单核细胞富集超过60％-80％具有挑战性，因为通过ecp损伤的淋巴细胞减少淋巴细胞标志物的表面展示允许一部分t和b细胞逃离在柱中的停留。重复通过亲和柱以进一步提高单核细胞纯度不是一个选择，因为该方法掺和了被动过滤的单核细胞的物理干扰。偶然地，一系列分析揭示了ecp对淋巴细胞的优先损害排除了完全纯化单核细胞以用于精确评估dc基因活化水平的必要性.由于其对于uva活化的8-mop极其敏感，因此99％ecp处理的淋巴细胞在过夜孵育后凋亡(如通过apo2-pe、台盼蓝和/或膜联蛋白-荧光素异硫氰酸盐/酯fitc/碘化丙啶染色确定)。由于ecp引起整体淋巴细胞凋亡，所以ecp第1天级分中90％-95％的存活单核白细胞是单核细胞.这种现象解释以下观察，对凋亡淋巴细胞的多步磁珠移除(其如下进行并且产生了纯度大于95％的单核细胞)并不改变所研究细胞群中观察的基因表达的水平.为了实现该比较，使用磁珠和easysep磁体通过调整阴性选择方案修改了单核细胞纯化过程。对外周血单核细胞进行低速离心(120g10分钟)以除去血小板。然后使用单核细胞分离试剂盒ii(miltenyibiotec)根据进行了以下修改的制造商程序对细胞进行标记：(1)缓冲液由含2％自体血清和1mmedta(乙二胺四乙酸)的冰冷磷酸盐缓冲盐水组成；(2)封闭时间延长至10分钟；(3)生物素抗体混合物的标记延长至20分钟；并且(4)在用生物素抗体混合物和抗生物素微珠标记之间洗涤一次细胞。为了避免在单核细胞通过柱时刺激单核细胞，使用easysep磁体(stemcelltechnologies)使磁性标记细胞与未标记单核细胞替代分离(insteadseparate)。将5-ml聚苯乙烯管中的2ml缓冲液中的细胞放在磁体中10分钟，然后小心地将未标记细胞倒入新管中。该过程重复2×，以最大化提高单核细胞纯度。此时，由于纯度依然不够，将细胞用单核细胞分离试剂盒ii试剂标记并且在easysep磁体中另外放置10分钟，洗脱未标记单核细胞。通过cd14染色的流式细胞术分析评估最终纯度(x＝96％ 4.5)。[0308]免疫表型分析[0309]单核细胞和树突细胞特异性的单克隆抗体包括：cd14(脂多糖[lps]受体，单核细胞)；cd36(凋亡细胞受体，单核细胞)；人白细胞抗原dr-1(hla-dr；ii类主要组织相容性复合体[mhc]分子)；cd83(树突细胞标志物)；胞质树突细胞-溶酶体相关膜蛋白(dc-lamp；树突细胞标志物)；以及cd80和cd86(b7.1和b7.2共刺激分子)。抗体获自beckmancoulter并且以其预先确定的最佳稀释度使用。用适当的同种型对照建立背景染色，并且使用fc500流式细胞仪(beckmancoulter)分析免疫荧光。根据制造商用于细胞固定和透化的说明书(intraprep试剂盒，beckmancoulter)进行组合的膜和细胞质染色。[0310]抗原呈递测定[0311]在破伤风类毒素(10μg/ml，100μl/孔)和rpmi培养基1640/15％自体血清的存在下，将从志愿者新鲜分离、磁珠富集、抗原刺激的cd4 群(2＊106/ml，50μl/孔)添加至单核细胞(2＊106/ml，50μl/孔).在培养5天后，细胞接受1μci的[3h]-胸苷并且孵育过夜、收获并且在β液体闪烁计数器(perkinelmer)中计数。结果呈现为5个重复培养的平均值和标准差。[0312]mlr/cml测定[0313]为了评估ecp处理的单核细胞是否能够在功能上刺激cd8t细胞的mhci类受限的细胞毒性，研究了来自3位正常对象的单核白细胞。由3位hla-a2阳性志愿者中每一位新鲜获得的1单位抗凝血液在通过临床ecp设备以与真实ecp程序相同的方式处理之前和之后作为刺激单核细胞/树突细胞的来源.在临ecp处理之前(pre-ecp)以及紧接ecp之后(ecpd0)，从血液中分离单核细胞级分。在γ辐照(3000rad，铯源)以确保单向t细胞刺激之膈，将preecp级分在rpmi1640/15％自体血清中连续稀释，将含25000至250个细胞的100μl一式5份地铺板在圆底微量滴定板孔中。将ecpd0级分在大孔板中孵育18小时，并且通过刮擦孔以使粘附细胞游离来收获。然后将重悬细胞连续稀释并且如上铺板。a-2阴性正常供体作为响应cd4和cd8t细胞的来源，其通过在miltenyi磁珠柱上的阳性选择纯化(平均纯度98％)。然后将响应t细胞(100μl中50000/孔)添加至含pre-ecp或ecp-d0刺激物的孔，将板在co2培养箱中于37℃下培养7天.对于靶细胞，将a-2阳性t-b杂交瘤成淋巴细胞系174xcwm.t1用51cr标记并且以104细胞/孔添加至mlr培养物.在孵育4小时后，将板离心，从每个孔移出100μl上清液用于在γ计数器中计数.“百分比特异性裂解”定义为100乘以以下分数：[0314]平均cpm(样品)-平均cpm(仅t细胞)[0315]平均cpm(去垢剂最大释放)-平均cpm(仅t细胞)[0316]rna分离和微阵列杂交[0317]使用具有柱上dnasei处理的rneasyminikit柱(qiagen)分离总rna。使用nanodropnd-1000分光光度计和agilent2100bioana-lyzer测量rna产量和纯度。使片段化的crna杂交在affymetrixhgu133plus2.0人芯片上，并且通过yaleuniversityw.m.keckresourcelaboratory进行约47400个人基因和est的筛选。微阵列结果可在geneexpressionomnibus的登录号gse23604下获得。[0318]数据分析[0319]使用genespring软件7.2(agilenttechnologies-silicongenetics)分析由affymetrix基因芯片操作软件1.2版(gcos1.2；affymetrix)产生未经归一化的原始数据.使用robustmulti-array将数据归一化。仅分析与在单采血液成分术(如白细胞单采)或经处理样品中的平均信号强度为500或更高组合的最小倍数变化＞2.0的探针组.差异基因表达被认为是倍数变化≥2且p≤.05。通过标准方法进行诱导的转录组的主成分分析(pca)。用metacore软件1.0版(genego)鉴定涉及的信号转导途径.[0320]定量实时pcr[0321]使用定量实时聚合酶链式反应(pcr)在相同rna样品的等分试样中确认所选基因的微阵列表达。使用highcapacitycdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems)将rna逆转录成cdna。逆转录在96孔热循环仪(mjresearchptc-200)中以以下条件进行：25℃，10分钟；37℃，120分钟；85℃，5秒。使用taqman实时pcr检测dc-lamp、ccr7、cd80、cd86和cd14的转录物。根据编目录的taqman基因表达测定(appliedbiosystems)获得用于各序列的引物和探针。使用hprt1作为参照基因。[0322]结果[0323]单个基因表达中ecp诱导的大的变化[0324]单核细胞中单个基因活化ecp的刺激表现为在ecp第1天与pre-ecp相关基因表达的比。为了排除单核细胞富集期间偶然的基因诱导，使用阴性柱纯化方法，从而使淋巴细胞保留，而使单核细胞被动过滤.结果表明来自患者和正常对象二者的ecp处理的单核细胞均保持足够的活力，以可重复地表达共有的转录组信号。[0325]如果与preecp相比倍数变化为≥2并且显著性为p≤.05，则认为基因被ecp显著上调或下调.在每个患者组和正常对象中，来自约3000个基因的rna转录物水平显著变化(表2)。总的来说，在来自ctcl和gvhd患者二者以及来自正常对象之ecp处理的单核细胞共同地上调或下调1129个基因，表明ecp诱导的基因活化的共性。[0326]表2.在ecp后具有改变的表达的单核细胞基因数[0327]单核细胞来源合计上调下调正常对象(单独)：n＝63,6661494(41％)2172(59％)ctcl(单独)：n＝34,3152613(61％)1702(38％)gvhd(单独)：n＝34,3502658(61％)1692(39％)[0328]被ecp显著诱导或抑制的基因数.[0329]许多与树突细胞分化、粘附和功能相关的基因的表达提高(表3)进一步支持ecp刺激单核细胞进入该途径。[0330]表3：ecp增强的dc标志物基因的表达，ecp后/ecp前水平的比＊[0331][0332]＊比＝(ecp前基因表达)比(ecp后基因表达)，ecp诱导参与dc成熟和功能的多个基因表达的成倍提高.处理对基因表达的影响呈现为诱导的表达比(相关基因的ecp后与ecp前表达的比).在相关时间点从3位ctcl患者和3位gvhd患者以及6位正常对象分离rna.[0333]表1示出了被发现其表达提高以及可以被认为是免疫刺激性树突细胞的分子标志物的另外一些基因。[0334]如在单核细胞向树突细胞成熟期间可以预期的，cd14(单核细胞标志物)表达减少，如在对ecp处理的单核细胞过夜培养后，通过测量所有患者和正常对象之单核细胞群上的平均荧光强度评估.该结果在患者的ecp后细胞的rt-pcr研究中得以证实(结果未示出)。表4中示出了其表达降低指示单核细胞向树突细胞成熟的另一些因子。[0335]表4：ecp降低的单核细胞标志物基因的表达，ecp后/ecp前水平的比＊[0336][0337][0338]＊比＝(ecp前基因表达)比(ecp后基因表达)，随着单核细胞分化为dc，ecp诱导的单核细胞特有基因的表达的成倍降低.处理对基因表达的影响呈现为诱导的表达比(相关基因的ecp后与ecp前表达的比).在相关时间点从3位ctcl患者和3位gvhd患者以及6位正常对象分离rna.[0339]表5中示出了其表达降低并因此指示单核细胞向免疫抑制性树突细胞成熟的另一些因子.[0340]表5：ecp增强的免疫抑制相关基因的表达，ecp后/ecp前水平的比＊[0341][0342]＊比＝(ecp前基因表达)比(ecp后基因表达)，ecp诱导的对dc抑制t细胞介导的免疫反应的能力有贡献之基因的表达的成倍提高.处理对基因表达的影响呈现为诱导的表达比(相关基因的ecp后与ecp前表达的比).在相关时间点从3位ctcl患者和3位gvd患者以及6位正常对象分离rna.[0343]实验4-免疫刺激性dc的表面分子标志物和功能介体[0344]对ecp诱导的树突细胞转录组进行进一步分析以鉴定作为免疫刺激性树突细胞的标志物和功能介体的表面分子基因产物的亚组。将在ecp诱导的树突细胞中上调的466个基因与约2000个已知或假设的全长人跨膜基因相互参照，以鉴定87种共有的表面蛋白。[0345]材料和方法[0346]白细胞和血小板的获得[0347]所有样品由未服用已知影响血小板功能的药物(包括阿司匹林)的年轻、健康对象取得.根据yalehumaninvestigationalreviewboard的指南获得样品，并根据赫尔辛基宣言提供知情同意书。通过19号针从肘前静脉采集外周血试样到含有肝素的注射器中，然后在ficoll-hypaque(gallard-schlessinger，carleplace，n.y.)上分层。在180g下离心后，收集含单核白细胞级分的界面并且在hbss中洗涤两次，然后在rpmi-1640培养基(gibco)中重悬至5×106单核细胞/ml的终浓度。在获得细胞的1小时内使用。[0348]富集血小板的血浆的制备[0349]将全血在室温下150g离心15分钟。收集富集血小板的血浆(prp)层并且在900g下离心5分钟，使血小板沉淀在rpmi1640中重悬至期望浓度。[0350]板的制备[0351]使用glycotech系统(glycotech，rockville，md)进行板通道.该系统由测量值为20000×10000×254微米(长×宽×高)的体积流路组成。该系统底板由被垫片隔开并且与丙烯酸流动板(其形成上板)真空连接的15mm培养皿(bdbiosciences，durham，nc)构成。对于用血小板的预涂布，在组装流动室之前，将20滴期望浓度的prp置于培养皿的中央，并且允许血小板在室温下静置20分钟。将培养皿用2mlrpmi洗涤两次，然后组装流动室.[0352]过夜培养[0353]当需要过夜培养时，将细胞离心并且以5×106细胞/ml的终浓度重悬在补充有15％ab血清(geminibio-products)的rpmi-1640培养基(gibco)中。在37℃、5％co2下将细胞在12孔聚苯乙烯组织培养板(每孔2m1)中过夜培养18小时。[0354]免疫表型分析[0355]用于免疫表型分析的单克隆抗体包括cd14(lps受体；单核细胞)、cd11c(整联蛋白亚基；单核细胞和dc)、hla-dr(mhcii类分子)、cd83(dc标志物)、cd62p(p选择蛋白；活化的血小板)和cd61(整联蛋白亚基；血小板)。抗体获自beckmancoulter(cd14，cd11c，hladr，cd83)或sigma(cd62p，cd61)，并且以其预先确定的最佳稀释度使用.用适当的同种型对照建立背景染色，并且使用fc500流式细胞仪(beckmancoulter)分析免疫荧光。通过添加预先确定的最佳浓度的两种直接与fitc或pe缀合的抗体并且在4℃孵育20分钟来进行双色膜染色，然后洗涤以除去未结合抗体。根据制造商用于细胞固定和透化的说明书(intraprep试剂盒，beckmancoulter)进行组合的膜和细胞质染色.[0356]结果[0357]通过板和/或pbmcd1群示出所分析sirpa、icam1、cxcl16、light、plaur(cd87，纤溶酶原活化剂，尿激酶受体)、msr1、neu1(唾液酸酶)、cd137l和catb(ctsb，组织蛋白酶b)的表面表达显著上调。[0358]实验5-在单核细胞通过流动室后确定分子标志物的表达和fsc/ssc复杂度[0359]材料和方法[0360]使单核细胞通过图19中所示装置.简言之，使血液样品旋转低速通过ficoll梯度，以得到外周血单核细胞(pbmc)浓度为例如1010细胞/ml的8ml样品。用血小板预涂布室.使样品以约0.028pa通过室。然后将所述室用约3mlrpmi在0.028pa下洗涤.用30-55mlrpmi在约1.2pa下进行第二次洗涤.合并收集的活化单核细胞，孵育一天并用于进一步分析(ppd1pbmc).作为对照，pbmc不通过装置并且孵育一天(d1pbmc)。作为另一个对照，在gm-csf和il-4的存在下通过直接培养pbmc获得未成熟快速dc(未成熟快速dc)。此外，在收获后通过ficoll梯度直接分析pbmc(新鲜(ficoll)pbmc)。[0361]然后分析细胞和对照中hla-dr、cd86、icam-1和plaur的表达。进一步分析其fsc/ssc复杂度。hla-dr的结果在图20中示出，而fsc/ssc复杂度在图21和图22中示出.图23中示出了总结。[0362]结果[0363]结果表明，通过ficoll梯度经历了离心的细胞似乎已经经受了足够的物理力以开始分化，从孵育这些细胞1天(d1pbmc)变得明显。然而，在使板通过装置后(ppd1pdmc)，活化和分化更突出。而且，在不存在例如8-mop和uv-a的情况下，通过根据本发明的方法获得的树突细胞具有比用细胞因子混合物获得的未成熟快速dc更复杂和独特的模式。[0364]实验6-确定8-mop和uva对活化的单核细胞的影响[0365]材料和方法[0366]使单核细胞通过来源于therakos系统的装置。流动室的尺寸为30mm宽，1600mm长，1mm高.简言之，使血液样品低速旋转通过ficoll梯度，以得到外周血单核细胞(pbmc)浓度为例如1.5＊106细胞/ml的80ml样品。用血小板预涂布室。使样品以约24ml/分钟的流量通过室，持续60分钟，所述流量对应于约0.13pa的剪切应力。将收集的活化的单核细胞低速旋转并重悬在含8-mop的小体积培养基中并且与辐照组合，孵育1天以用于进一步分析(第1天ppmc pp)。作为对照，pbmc不通过所述装置但是孵育1天(第1天ppmc)。另外，在通过ficoll梯度收获后直接分析pbmc(第0天pbmc)。然后用8-mop和uva(puva)进一步处理第1天pbmc pp.[0367]然后分析细胞和对照的gilz表达。[0368]结果[0369]该结果表明，通过应用8-mop和uva，可分化成免疫刺激性树突细胞的活化的单核细胞可被引导成为免疫抑制性树突细胞。[0370]以下内容对应于母案申请中的原始权利要求书，现作为说明书的一部分并入此处：[0371]1.用于诱导包含在体外量的哺乳动物对象血液样品中的单核细胞分化成免疫抑制性抗原呈递细胞的方法，所述方法包括至少以下步骤：[0372]a)使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，以使得活化所述单核细胞并诱导其分化成可由至少一种分子标志物来鉴定的免疫抑制性抗原呈递细胞，其中所述至少一种分子标志物指示免疫抑制性抗原呈递细胞。[0373]2.根据项1所述的方法，[0374]其中所述免疫抑制性抗原呈递细胞是这样的免疫抑制性树突细胞，其可由gilz、ido、kmo和/或il-10的表达提高来鉴定。[0375]3.根据项1或2中任一项所述的方法，[0376]其中所述免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞可由gilz诱导的il-10与il-12p70之比的增加来鉴定。[0377]4.根据项1、2或3中任一项所述的方法，[0378]其中所述免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞可通过确定至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60种分子标志物的表达来鉴定，所述分子标志物指示免疫刺激性抗原呈递细胞或树突细胞。[0379]5.根据项1、2、3或4所述的方法，[0380]其中所述至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60种分子标志物可选自表1，所述分子标志物不示出表达提高.[0381]6.根据项5所述的方法，[0382]其中所述至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60种分子标志物包括plaur、neu1、ctsb、cxcl16、icam1、msr1、olr1、sirpa、tnfrsf1a、tnfsf14、tnfsf9、pmb22、cd40、lamp3、cd80、ccr7、lox1、cd83、adamdecysin、fprl2、gpnmb和/或cd86.[0383]7.根据项1、2、3、4、5或6中任一项所述的方法，[0384]其中活化所述单核细胞并诱导其分化成所述免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞而不需要添加包含细胞因子和/或趋化因子的分子混合物。[0385]8.根据项1、2、3、4、5、6或7中任一项所述的方法，[0386]其中通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室而使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，所述装置允许固定地或可调地调节所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过所述装置的所述流动室的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力.[0387]9.根据项1、2、3、4、5、6、7或8中任一项所述的方法，[0388]其中通过使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过装置的流动室而使所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品经受物理力，所述装置允许调节所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过所述装置的所述流动室的流量，从而向包含在所述哺乳动物对象血液样品中的所述单核细胞施加剪切力，并且[0389]其中所述装置还允许调节选自包括温度和光暴露的至少一个参数.[0390]10.根据项1、2、3、4、5、6、7、8或9中任一项所述的方法，[0391]其中通过与活化的血小板和/或血浆组分相互作用来活化所述单核细胞并诱导其分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞.[0392]11.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9或10中任一项所述的方法，[0393]其中可以通过以下因素影响所述单核细胞的活化和分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞：所述流动室的设计和尺寸，所述单核细胞通过所述流动室的流量，在dna交联剂如8-mop存在或不存在下所述单核细胞暴露的光，单核细胞、血小板、血小板衍生因子和/或血浆组分通过所述流动室的温度，所述单核细胞、血小板、血小板衍生因子和/或血浆组分通过所述流动室的顺序，血浆组分涂布所述流动室之表面的密度，血小板和/或血小板衍生因子粘附于所述流动室之表面和/或所述流动室之血浆组分的密度，和/或单核细胞粘附于粘附在所述流动室之表面的所述血小板和/或血小板衍生因子和或血浆组分的密度。[0394]12.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的方法，[0395]其中所述方法包括至少以下步骤：[0396]a)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可以通过的流动室，[0397]b)使血小板活化，所述血小板可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液中，或者所述血小板可以与包含至少单核细胞的所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0398]c)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品，以使得通过与步骤b)中获得的所述活化的血小板结合来活化所述单核细胞并诱导其分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞。[0399]13.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的方法，[0400]其中所述方法包括至少以下步骤：[0401]a)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可以通过的流动室，[0402]b)使血浆组分通过，所述血浆组分可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中，或者所述血浆组分可以与所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0403]c)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品，以使得通过与步骤b)中获得的所述血浆组分结合来活化所述单核细胞并诱导其分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞。[0404]14.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11中任一项所述的方法，[0405]其中所述方法包括至少以下步骤：[0406]a)将包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品施加到装置，所述装置被配置为提供所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品可以通过的流动室，[0407]b)使血浆组分通过，所述血浆组分可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液中，或者所述血浆组分可以与所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0408]c)使血小板活化，所述血小板可包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中，或者所述血小板可以与包含至少单核细胞的所述哺乳动物对象血液样品分开提供，[0409]d)通过向包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的单核细胞施加物理力来处理所述装置中包含至少单核细胞的所述体外量的所述哺乳动物对象血液，以使得通过与步骤b)和c)中获得的所述活化的血小板和/或血浆组分结合来活化所述单核细胞并诱导其分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞.[0410]15.根据项12、13或14中任一项所述的方法，[0411]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品不是通过获得的。[0412]16.根据项15所述的方法，[0413]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品为约10ml至约500ml所述哺乳动物对象的体外全血.[0414]17.根据项15至16中任一项所述的方法，[0415]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过从约10ml至约500ml所述哺乳动物对象的体外全血分离白细胞获得。[0416]18.根据项15、16或17中任一项所述的方法，[0417]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品通过从约10ml至约500ml所述哺乳动物对象的体外全血分离血沉棕黄层获得。[0418]19.根据项15、16、17或18中任一项所述的方法，[0419]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品不包含血浆组分。[0420]20.根据项15、16、17、18或19中任一项所述的方法，[0421]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品不包含血小板。[0422]21.根据项20所述的方法，[0423]其中在将所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前，已从所述体外量的所述哺乳动物对象血液分离出所述血小板。[0424]22.根据项12、13或14中任一项所述的方法，[0425]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液通过获得.[0426]23.根据项22所述的方法，[0427]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液通过分离白细胞获得.[0428]24.根据项22至23中任一项所述的方法，[0429]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液通过分离血沉棕黄层获得。[0430]25.根据项22、23至24中任一项所述的方法，[0431]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液不包含血浆组分。[0432]26.根据项22、23、24或25中任一项所述的方法，[0433]其中所述体外量的所述哺乳动物对象血液不包含血小板。[0434]27.根据项26所述的方法，[0435]其中在将所述体外量的所述哺乳动物对象血液施加到所述装置之前，已从所述体外量的所述哺乳动物对象血液分离出所述血小板。[0436]28.根据项12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27中任一项所述的方法，其中所述流动室的尺寸为约1μm至至多约400μm高和约1μm至至多约400μm宽。[0437]29.根据项28所述的方法，其中所述流动室的尺寸为约5μm至至多且包括约300μm高和约5μm至至多且包括约300μm宽。[0438]30.根据项29所述的方法，其中所述流动室的尺寸为约10μm至至多且包括约250μm高和约10μm至至多且包括约250μm宽。[0439]31.根据项30所述的方法，其中所述流动室的尺寸为约50μm至至多且包括约200μm高和约50μm至至多且包括约200μm宽。[0440]32.根据项31所述的方法，其中所述流动室的尺寸为约50μm至至多且包括约100μm高和约50μm至至多且包括约100μm宽。[0441]33.根据项28、29、30、31或32中任一项所述的方法，其中所述流动室被配置为容纳约1ml至约50ml体积的所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品.[0442]34.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一项所述的方法，其中所述流动室的材料不是塑料。[0443]35.根据项34所述的方法，其中所述不是塑料的材料选自玻璃。[0444]36.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32或33中任一项所述的方法，其中所述流动室的材料是塑料。[0445]37.根据项36所述的方法，其中所述塑料材料选自丙烯酸类、聚碳酸酯、聚醚酰亚胺、聚砜、聚苯砜、苯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯或任意其他合适的医用级塑料.[0446]38.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37中任一项所述的方法，其中所述流动室被配置为允许光透过。[0447]39.根据项38所述的方法，其中所述流动室被配置为允许uv光透过。[0448]40.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39中任一项所述的方法，其中如下实现所述血小板的活化：将包含在所述体外量的所述哺乳动物对象血液样品中的血浆组分布置在所述流动室的表面上，以使得至少一些所述血小板可以与所述血浆组分相互作用并被固定在所述流动室的表面上。[0449]41.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40中任一项所述的方法，其中如下实现所述血小板的活化：将蛋白质布置在所述流动室的表面上，以使得至少一些所述血小板可以与所述蛋白质相互作用并被固定在所述流动室的表面上，所述蛋白质选自包括纤维蛋白原、纤连蛋白和纤维蛋白原γ组分的组。[0450]42.根据项41所述的方法，其中如下实现所述血小板的活化：将纤连蛋白布置在所述流动室的表面上，以使得至少一些所述血小板可以与所述纤连蛋白相互作用并被固定在所述流动室的表面上。[0451]43.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中任一项所述的方法，其中使所述血小板在约0.1至约10.0达因/cm2，优选约0.1至约2.0达因/cm2的剪切力下通过所述流动室。[0452]44.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42或43中任一项所述的方法，其中使所述单核细胞以约10ml/分钟至约200ml/分钟的流量通过所述流动室，以产生约0.1至约20.0达因/cm2的剪切力。[0453]45.根据项10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43或44中任一项所述的方法，其中血小板的活化可以通过p选择蛋白和/或αiib-β3整联蛋白的表达来监测。[0454]46.根据项8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45中任一项所述的方法，其中如下活化所述单核细胞并诱导其分化成免疫抑制性抗原呈递细胞或树突细胞：使所述单核细胞在约0.1至约10.0达因/cm2的剪切力，优选约0.1至约1.0达因/cm2的力下通过所述流动室，以使得所述单核细胞可以与所述活化的血小板结合。[0455]47.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46中任一项所述的方法，其还包括孵育活化的单核细胞以允许形成免疫抑制性树突细胞的步骤。[0456]48.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47中任一项所述的方法，其用于获得个体特异性的在功能和成熟方面同步的自体抑制性抗原呈递细胞或树突细胞。[0457]49.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47或48中任一项所述的方法，其中在dna交联剂存在下使所述单核细胞暴露于uv光以实现gilz的表达提高.[0458]50.根据项49所述的方法，[0459]其中在8-mop存在下使所述单核细胞暴露于uva光以实现gilz的表达提高。[0460]51.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中任一项所述的方法，其用于获得免疫抑制性自体抗原呈递细胞或树突细胞。[0461]52.根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50中任一项所述的方法，其用于获得免疫抑制性同种异体抗原呈递细胞或树突细胞.[0462]53.可通过根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51中任一项所述的方法获得的免疫抑制性自体树突细胞，其用于治疗自身免疫病。[0463]54.根据项53所述使用的免疫抑制性自体树突细胞，其中所述自身免疫病选自包括以下的组：类风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化、i型糖尿病和系统性红斑狼疮.[0464]55.可通过根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或51中任一项所述的方法获得的免疫抑制性自体树突细胞，其用于治疗超敏反应疾病.[0465]56.可通过根据项1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50或52中任一项所述的方法获得的免疫抑制性同种异体树突细胞，其用于治疗实体器官移植排斥和/或移植物抗宿主病.[0466]参考文献[0467]1.bergerc，hoffmannk，vasquezjg，manes，lewisj，fillerretal.rapidgenerationofmaturationallysynchronizedhumandendriticcells：contributiontotheclinicalefficacyofextracorporealphotochemotherapy.blood2010；116(23)：4838-4847.[0468]2.cellam，scheideggerd，palmerlehmannk，lanep，lanzavecchiaa，alberg.ligationofcd40ondendriticcellstriggersproductionofhighlevelsofinterleukin-12andenhancestcellstimulatorycapacity：t-thelpviaapcactivation.journalofexperimentalmedicine1996；184(2)：747-752.[0469]3.desaint-visb，vincentj，vandenabeeles，vanbervlietb，pinjj，ait-yahiasetal.anovellysosome-associatedmembraneglycoprotein，dc-lamp，inducedupondcmaturation，istransientlyexpressedinmhcclassiicompartment.immunity1998；9(3)：325-336.[0470]4.slavikjm，hutchcroftje，biererbe.cds0andcd86arenotequivalentintheirabilitytoinducethetyrosinephosphorylationofcd28.journalofbiologicalchemistry1999；274(5)：3116-3124.[0471]5.kanghk，leehy，kimmk，parkks，parkym，kwakjyetal.thesyntheticpeptidetrp-lys-tyr-met-val-d-metinhibitshumanmonocyte-deriveddendriticcellmaturationviaformylpeptidereceptorandformylpeptidereceptor-like2.journalofimmunology2005；175(2)：685-692.[0472]6.ripollvm，irvinekm，ravasit，sweetmj，humeda.gpnmbisinducedinmacrophagesbyifn-gammaandlipopolysaccharideandactsasafeedbackregulatorofproinflammatoryresponses.joumalofimmunology2007；178(10)：6557-6566.[0473]7.chensq，springerta.selectinreceptor-ligandbonds：formationlimitedbyshearrateanddissociationgovernedbythebellmodel.proceedingsofthenationalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica2001；98(3)：950-955.[0474]8.thomaswe.understandingthecounterintuitivephenomenonofcatchbonds.currentnanoscience2007；3：63-83.[0475]9.xiongjp，stehlet，zhangrg，joachimiaka，frechm，goodmansletal.crystalstructureoftheextracellularsegmentofintegrinalphavbeta3incomplexwithanarg-gly-aspligand.science2002；296(5565)：151-155.[0476]10.weiseljw，nagaswamic，vilaireg，bennettjs.examinationoftheplateletmembraneglycoprotein-iib-iiiacomplexanditsinteractionwithfibrinogenandotherligandsbyelectron-microscopy.journalofbiologicalchemistry1992；267(23)：16637-16643.[0477]11.kaplankl，broekmanm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