一种核酸检测芯片及其应用的制作方法

1.本发明属于核酸扩增技术领域，涉及一种核酸检测芯片及其应用。


背景技术：

2.病原微生物的检测主要分为核酸检测和免疫学检测两大类，由于免疫学检测灵敏度不高，漏检率大，故以核酸检测为主。目前主流的病原微生物核酸检测方法是荧光定量pcr(qpcr)技术，荧光定量pcr技术是指在pcr反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号不断累积而实现实时监测pcr全程，最后根据pcr反应溶液中的荧光信号来判断样品中是否有特异性目的基因。然而，目前的荧光定量pcr技术中样本提取过程较为复杂且对提取样本的质量要求较高，需要专门的实验室、实验设备和操作人员，并且荧光定量pcr需要温控严格、元件精密的复杂仪器。所以荧光定量pcr技术主要还是用在医院检验科、医学检测实验室等专业机构。
3.重组酶-聚合酶扩增技术(recombinase-polymerase amplification，rpa)的出现，极大程度的解决了以上荧光定量pcr仪的缺陷。rpa体系抗干扰性强，在25-42℃条件下即可发生反应。目前市面上已推出了基于rpa的便携式荧光定量仪，它对实验环境要求较低，适合于现场检测。然而，目前的rpa反应体系对荧光试剂质量要求较高，且依赖于较为大型昂贵的荧光测试仪器来完成核酸检测，很难应用于即时即地的检测poct(point-of-care testing)等应用场景。


技术实现要素：

4.本发明提供了一种核酸检测芯片及其应用，基于电子检测技术，使用全电子检测(半导体芯片技术)，集成微型加热器、rpa扩增技术，实现核酸检测芯片上的高效扩增，使仪器微型化，并得到更高的准确度，该检测方法时间短、灵敏度高，且不需要昂贵的光学设备。
5.为达此目的，本发明采用以下技术方案：
6.第一方面，本发明提供了一种核酸检测芯片，所述核酸检测芯片包含一个或多个电子传感器，所述电子传感器的表面修饰有一种或多种寡核苷酸引物，所述引物用于核酸等温扩增反应；
7.所述寡核苷酸引物为核酸等温扩增反应的上游引物和/或下游引物。
8.本发明中，引物为与dna模板结合的刺激pcr反应发生的一种核酸大分子，作为pcr扩增反应的起始点，dna聚合酶从引物的3’端开始合成新的核酸链；本发明通过在电子传感器的表面修饰一种或多种特异性引物，与dna模板结合发生等温扩增反应，实现了多重高通量的核酸检测。
9.优选地，所述多个电子传感器的表面修饰有多种寡核苷酸上游引物和/或下游引物，所述多种寡核苷酸上游引物和/或下游引物结合相同和/或不同的dna片段。
10.本发明中，在多个电子传感器的表面修饰多种寡核苷酸上游引物和/或下游引物，用以检测相同dna片段的不同位点、或检测不同的dna片段，实现了多重高通量dna检测。
11.优选地，所述电子传感器包括离子敏感场效应传感器、纳米线传感器、石墨烯、二硫化钼或电极对中的任意一种。
12.优选地，所述离子敏感场效应传感器的感应表面包被有金、三氧化二铝、五氧化二钽、二氧化铪、二氧化钛或氮化钛(tin)中的任意一种或至少两种的组合。
13.优选地，所述寡核苷酸上游引物和/或下游引物包括修饰基团、连接臂和dna结合序列。
14.优选地，所述连接臂包括核酸连接臂或肽连接臂，用于减小电子传感器对引物与核酸片段结合造成的空间位阻。
15.优选地，所述核酸连接臂的长度为4～8nt，例如可以是4nt、5nt、6nt、7nt或8nt，有利于等温扩增反应过程中模板与引物的高效结合，避免了电子传感器造成的空间位阻效应。
16.优选地，所述修饰基团包括巯基(-sh)和/或氨基(-nh2)，用于将引物修饰于电子传感器表面，作为等温扩增反应的特异性引物。
17.优选地，所述核酸检测芯片的表面还连接有表面封闭分子，用于降低等温扩增过程中的溶液分子表面吸附。
18.本发明中，表面封闭分子通过与电子传感器表面反应，修饰在电子传感器表面未结合引物的位点，实现对芯片的封闭作用，有效减小了等温扩增试剂组分和扩增后的产物在芯片表面的非特异性吸附，显著降低了芯片的背景值。
19.优选地，所述表面封闭分子包括巯基乙醇、巯基己醇或thiol-peg4中的任意一种或至少两种的组合。
20.第二方面，本发明提供了第一方面所述的核酸检测芯片的制备方法，具体为金芯片核酸检测芯片的制备方法、醛基芯片核酸检测芯片的制备方法和al2o3芯片核酸检测芯片的制备方法。
21.在一具体实施方式中，所述金芯片核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤：
22.(1)滴加含有寡核苷酸引物的连接液至预处理的金芯片表面，进行连接反应；
23.(2)采用处理液处理金芯片；
24.(3)用去离子水清洗，得到所述金芯片核酸检测芯片。
25.优选地，步骤(1)所述连接液为含有寡核苷酸引物和nacl的磷酸盐缓冲液。
26.优选地，所述寡核苷酸引物为5’巯基修饰寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物从5’到3’依次为巯基-连接臂和特异性引物序列。
27.优选地，所述寡核苷酸引物在所述连接液中的浓度为1～5μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。
28.优选地，所述nacl在所述连接液中的浓度为0.1～1m，例如可以是0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m或1m。
29.优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾。
30.优选地，所述磷酸盐在所述连接液中的浓度为0.5～2m，例如可以是0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。
31.优选地，所述连接液的ph为3～5，例如可以是3、4或5。
32.优选地，所述连接液的配方为1m kh2po4(ph3.6)、2μm 5
‘
巯基修饰的寡核苷酸引物
和0.5m nacl。
33.优选地，步骤(1)所述连接反应的条件为室温避光处理1～5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h。
34.优选地，步骤(2)所述处理液为含有表面封闭分子巯基乙醇的磷酸盐缓冲液。
35.优选地，所述巯基乙醇在所述处理液中的浓度为0.5～2mm，例如可以是0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm。
36.优选地，所述磷酸盐包括磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾。
37.优选地，所述磷酸盐在所述处理液中的浓度为0.5～2m，例如可以是0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。
38.优选地，所述处理液的ph为3～5，例如可以是3、4或5。
39.优选地，所述处理液的配方为1mm巯基乙醇和1m kh2po4溶液(ph3.6)。
40.优选地，步骤(2)所述处理的时间为0.5～2h，例如可以是0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9h、1h、1.1h、1.2h、1.3h、1.4h、1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h或2h。
41.在另一具体实施方式中，所述金芯片核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤：
42.(1)采用含有巯基乙醇的处理液、预处理金芯片，处理后用去离子水清洗；
43.(2)滴加含有寡核苷酸引物、磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾的连接液至预处理的金芯片表面，进行连接反应；
44.(3)用去离子水清洗，得到所述金芯片核酸检测芯片。
45.优选地，步骤(1)所述巯基乙醇在所述处理液中的浓度为0.5～2mm，例如可以是0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm或2mm。
46.优选地，步骤(1)所述预处理金芯片的条件为室温避光处理1～5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h。
47.优选地，步骤(2)所述寡核苷酸引物为5’巯基修饰寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物从5’到3’依次为巯基-连接臂和特异性引物序列。
48.优选地，步骤(2)所述寡核苷酸引物在所述连接液中的浓度为1～5μm，例如可以是1μm、2μm、3μm、4μm或5μm。
49.优选地，步骤(2)所述磷酸二氢钠和/或磷酸二氢钾在所述连接液中的浓度为0.5～2m，例如可以是0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m或2m。
50.优选地，步骤(2)所述连接液的ph为3～5，例如可以是3、4或5。
51.优选地，步骤(2)所述连接反应的条件为室温避光处理1～5h，例如可以是1h、2h、3h、4h或5h。
52.在一具体实施方式中，所述醛基芯片核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤：
53.(1)芯片清洗：将芯片插入聚四氟乙烯玻片架上，放入芯片表面精处理溶液中浸泡10～20小时；
54.(2)芯片氨基化：将清洗好的芯片放入氨基化反应溶液中，于摇床上室温摇动反应1小时，反应到时后取出芯片用95％乙醇清洗，清洗后的芯片以1200rpm离心3min甩干，将离
心后的芯片放入干燥箱中110℃加热30min后转至室温下保存；
55.(3)芯片醛基化：将制备好的氨基化芯片浸入1.25％戊二醛溶液中，在摇床上室温摇动反应3小时，反应到时后取出芯片用纯化水清洗芯片，清洗后的芯片以1200rpm离心3min；
56.(4)引物固定：将含有寡核苷酸引物用纯化水溶解，震荡混匀，使用移液器在芯片点样含有寡核苷酸引物的溶液；
57.(5)芯片封闭：待摇洗结束后将芯片放入封闭液中，以75rpm速度摇洗5min，待摇洗结束后取出芯片用纯化水清洗干净即得到所述核酸检测芯片。
58.优选地，步骤(1)所述放入芯片表面精处理溶液中浸泡10-20h，例如可以是10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h或20h。
59.优选地，步骤(4)所述寡核苷酸引物为5’氨基修饰寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物从5’到3’依次为氨基-连接臂和特异性引物序列。
60.优选地，步骤(5)所述封闭液为含有磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钠和氯化钾的混合溶液；
61.优选地，所述磷酸氢二钠在所述混合溶液中的浓度为0.5～1m，例如可以是0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m或1m。
62.优选地，所述磷酸二氢钾在所述混合溶液中的浓度为0.01～0.1m，例如可以是0.01m、0.02m、0.03m、0.04m、0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m或0.1m。
63.优选地，所述氯化钠在所述混合溶液中的浓度为2.0～3.0m，例如可以是2.0m、2.1m、2.2m、2.3m、2.4m、2.5m、2.6m、2.7m、2.8m、2.9m或3.0m。
64.优选地，所述氯化钾在所述混合溶液中的浓度为0.01～0.1m，例如可以是0.01m、0.02m、0.03m、0.04m、0.05m、0.06m、0.07m、0.08m、0.09m或0.1m。
65.优选地，步骤(5)所述封闭液的ph为6.0～7.0，例如可以是6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0。
66.在一具体实施方式中，所述al2o3芯片核酸检测芯片的制备方法包括以下步骤：
67.(1)用piranha溶液清洁芯片的传感器区域；
68.(2)检验：芯片处理后变得清水(水滴接触角低于30度)；
69.(3)用tesu制备无水甲苯溶液，并将混合物超声处理，混合均匀；
70.(4)将芯片浸入无水甲苯溶液中1.5小时以上(也可以把溶液滴入芯片孔内)；
71.(5)用大量无水甲苯冲洗芯片，或将芯片泡在无水甲苯烧杯内清洗；
72.(6)dna连接：将含有寡核苷酸引物的连接液滴入芯片3小时以上；
73.(7)将修饰的芯片在纯水中冲洗，去除物理吸附的寡核苷酸引物；
74.(8)存储：将制备好的核酸检测芯片放在芯片盒内或tube管中，4℃冰箱内避光放置。
75.优选地，步骤(6)所述连接液为含有寡核苷酸引物、tris、氯化钾和氰基硼氢化钠的混合溶液。
76.优选地，所述寡核苷酸引物为5’氨基修饰寡核苷酸引物，所述寡核苷酸引物从5’到3’依次为氨基-连接臂和特异性引物序列。
77.优选地，所述tris在所述混合溶液中的浓度为1-10mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、
4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm和10mm。
78.优选地，所述氯化钾在所述混合溶液中的浓度为1-10mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm和10mm。
79.优选地，所述氰基硼氢化钠在所述混合溶液中的浓度为1-10mm，例如可以是1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm和10mm。
80.优选地，步骤(6)所述连接液的ph为8.0～9.0，例如可以是8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9或9.0。
81.第三方面，本发明提供了一种核酸等温扩增检测方法，所述核酸扩增检测方法包括将核酸等温扩增反应体系添加到第一方面所述的核酸检测芯片上，进行核酸等温扩增反应的步骤。
82.优选地，所述核酸等温扩增反应体系包括核酸等温扩增反应的上游引物和下游引物、模板、结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶和mg
2
。
83.优选地，所述核酸等温扩增反应的温度为30～45℃，例如可以是30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。
84.优选地，所述核酸等温扩增反应的时间为5～30min，例如可以是5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min或30min。
85.优选地，所述核酸扩增检测方法还包括对等温扩增反应的核酸检测芯片进行实时电信号检测的步骤，或包括对等温扩增反应前和等温扩增反应后的核酸检测芯片进行电信号检测的步骤，获得核酸等温扩增反应中芯片的电信号变化。
86.优选地，在对等温扩增反应后的核酸检测芯片进行电信号检测前，还包括清洗核酸检测芯片的步骤，用于去除吸附于芯片表面的溶液分子。
87.优选地，采用外接电极以锯齿波电压扫描的方式对所述核酸检测芯片进行电信号检测以获得电信号数据。
88.优选地，所述电信号检测中采用的电信号检测液为1～100mm磷酸盐缓冲液，例如可以是1mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm。
89.优选地，所述电信号检测中采用的电信号检测液的ph为5～9，例如可以是5、6、7、8或9。
90.优选地，所述电信号检测中采用的电信号检测液的配方为10mm磷酸盐缓冲液(ph7.0)。
91.作为优选技术方案，本发明提供了一种核酸等温扩增检测方法，所述核酸扩增检测方法包括以下步骤：
92.(1)将核酸等温扩增反应体系添加到权利要求1-6任一项所述的核酸检测芯片上，30～45℃孵育5～30min，进行核酸等温扩增反应，所述核酸等温扩增反应体系包括核酸等温扩增反应的上游引物和下游引物、模板、结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶和mg
2
；
93.(2)采用外接电极以锯齿波电压扫描的方式对进行等温扩增反应的核酸检测芯片
进行实时电信号检测以获得电信号数据，或
94.采用外接电极以锯齿波电压扫描的方式对等温扩增反应前核酸检测芯片进行电信号检测，随后进行等温扩增反应，待等温扩增反应结束后清洗核酸检测芯片，滴加1～100mm、ph＝5～9磷酸盐缓冲液、用外接电极以锯齿波方式的电压扫描所述核酸检测芯片获得电信号数据。
95.优选地，所述核酸扩增检测方法根据核酸检测芯片的电信号差别，进行核酸检测的阴性和阳性判定；
96.所述核酸检测芯片中，阳性区域(ptc区域)vout呈s型上升趋势，阴性区域(ntc区域)vout有微弱上升(由电信号检测误差造成)，说明ptc区域的dna发生了扩增，判定为阳性。
97.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
98.(1)本发明中，在组成芯片的一个或多个电子传感器表面修饰一种或多种扩增引物，获得核酸检测芯片，通过向芯片表面添加等温扩增反应体系，实现了简单快速的等温扩增反应，并采用电信号的形式检测芯片上核酸扩增的结果；
99.(2)本发明在等温扩增芯片未修饰等温扩增引物的位点，采用表面封闭分子进行封闭处理，有效降低了等温扩增引物或等温扩增产物的非特异性吸附，显著降低了芯片的背景值；
100.(3)本发明的核酸检测方法可使仪器微型化，并得到更高的准确度，该检测方法时间短、灵敏度高，且不需要昂贵的光学设备。
附图说明
101.图1为本发明中核酸检测芯片的切面示意图和多重扩增示意图，其中，11-第一待测dna模板，12-第一特异性引物，13-第一电子传感器，14-第一扩增dna，21-第二待测dna模板，22-第二特异性引物，23-第二电子传感器，24-第二扩增dna，31-源极，32-介电材料，33-漏极，34-硅晶圆，35-绝缘材料，36-感应层，37-反应溶液，data1-等温扩增(rpa)前数据，data2-等温扩增(rpa)后数据；
102.图2a为核酸检测芯片的表面化学处理示意图，图2b为核酸检测芯片使用rpa试剂进行等温扩增的示意图，图2c为rpa技术的原理示意图(引自于twistdx公司的dna amplification kits combined instruction manual)，其中，41-待测dna模板，42-寡核苷酸引物，43-连接臂，44-封闭分子，45-重组酶，46-链置换dna聚合酶，47-单链dna结合蛋白；
103.图3a为等温扩增前后ptc阳性区域的热力差值图和iv曲线图，图3b为等温扩增前后ntc阴性区域的热力差值图和iv曲线图，其中，data1-等温扩增(rpa)前数据，data2-等温扩增(rpa)后数据；
104.图4为ptc区域和ntc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况，其中，51-ptc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况，52-ntc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况；
105.图5为等温扩增后核苷酸染色的ntc区域和ptc区域荧光显微镜图片，其中，61-ntc区域，62-ptc区域。
具体实施方式
106.为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
107.实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
108.实施例1
109.图1所示为核酸检测芯片的切面示意图和多重扩增示意图，在第一电子传感器13和第二电子传感器23的感应层36上分别修饰有第一待测dna模板11的第一特异性引物12和第二待测dna模板21的第二特异性引物22，向核酸检测芯片上添加包含dna样品、结合单链核酸的重组酶、单链dna结合蛋白、链置换dna聚合酶和mg
2
的核酸等温扩增反应体系后，30～40℃孵育5～30min进行等温核酸扩增反应，在此过程中第一待测dna模板11与第一特异性引物12结合，第二待测dna模板21与第二特异性引物22结合，核酸检测芯片的电信号发生变化，阳性区域(ptc区域)的iv曲线向右移动，vout呈s型上升趋势，阴性区域(ntc区域)的iv曲线不发生移动，vout保持稳定，表明ptc区域的dna发生了扩增，判定为阳性。
110.实施例2
111.本实施例首先制备核酸检测芯片，再进行等温扩增反应，其中，核酸检测芯片的表面化学处理示意图如图2a所示，向电子传感器表面添加寡核苷酸引物42和连接臂43形成的特异性引物，加入封闭分子44进行封闭处理后添加待测dna模板41，使用核酸检测芯片进行rpa反应，示意图如图2b所示，rpa的原理示意图如图2c所示：重组酶45与特异性引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，阻止细胞核内核酸酶对单链dna的降解，同时负责基本的碱基配对，当特异性引物在待测dna模板41上搜索到与之完全互补的序列时，在单链dna结合蛋白(single stranded dna binding，ssb)47的帮助下，使待测dna模板解链形成，在链置换dna聚合酶46的作用下，形成新的dna互补链，反应产物以指数级增长，在15～20min内得到扩增片段。
112.具体步骤如下：
113.(1)滴加1m kh2po4(ph3.6)、2μm 5
‘
巯基修饰的上游引物sh-l1和0.5m nacl至预处理的金芯片表面的一半，作为阳性区域(ptc区域)，金芯片的另一半不作处理，作为阴性区域(ntc区域)，室温避光处理2h进行连接反应；
114.(2)采用1mm巯基乙醇和1m kh2po4溶液(ph3.6)处理金芯片1h；
115.(3)用去离子水清洗，得到核酸检测芯片；
116.(4)将2μl预先配制的核酸等温扩增反应体系(表1)添加到核酸检测芯片上，置于all in one(aio)设备上39℃孵育20min，进行核酸等温扩增反应，20min后取出芯片，用去离子水清洗；
117.(5)向等温扩增反应后的核酸检测芯片上添加10mm、ph7磷酸盐缓冲液，用外接电极以锯齿波方式的电压扫描核酸检测芯片，获得电信号数据，用qctool软件进行分析。
118.表1
119.组分用量
上游引物l1(1μm)0.5μl(0.01μm)下游引物s1(10μm)3μl(0.6μm)dna模板1ng/μl缓冲液29.5μlmg
2
2.5μl
120.结果如图3a和图3b所示，data1为等温扩增(rpa)前数据，data2为等温扩增(rpa)后数据，可以看出等温扩增前后，ptc区域的iv曲线相对于ntc区域的iv曲线发生右移，说明ptc区域的dna发生了扩增，导致电信号右移。
121.实施例3
122.本实施例首先制备核酸检测芯片，再进行等温扩增反应，步骤如下：
123.(1)采用0.5mm巯基乙醇和0.5m kh2po4溶液(ph3)处理金芯片2h，并用去离子水清洗；
124.(2)滴加0.5m kh2po4(ph3)、1μm 5
‘
巯基修饰的上游引物sh-l1和0.1m nacl至预处理的金芯片表面，室温避光处理5h进行连接反应；
125.(3)用去离子水清洗，得到核酸检测芯片；
126.(4)将2μl预先配制的核酸等温扩增反应体系(表2)添加到核酸检测芯片上，置于all in one(aio)设备上30℃孵育30min，进行核酸等温扩增反应；
127.(5)扩增开始前选择不同的固定电压，寻找芯片最佳vg值；
128.(6)根据最佳vg值采样点，边扩增边采样，分析ptc区域和ntc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况。
129.表2
130.组分用量上游引物l1(1μm)0.5μl(0.01μm)下游引物s1(10μm)3μl(0.6μm)dna模板1ng/μl缓冲液29.5μlmg
2
2.5μl
131.结果如图4所示，51为ptc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况，52为ntc区域在rpa扩增过程中vout平均值变化情况，ptc区域vout呈s型上升趋势，ntc区域vout有微弱上升(由电信号检测误差造成)，说明ptc区域的dna发生了扩增，电信号右移，vout逐渐增大，最后逐渐达到饱和，曲线趋于平稳。
132.实施例4
133.本实施例首先制备核酸检测芯片，再进行等温扩增反应，步骤如下：
134.(1)采用2mm巯基乙醇和2m kh2po4溶液(ph5)处理金芯片0.5h，并用去离子水清洗；
135.(2)滴加2m kh2po4(ph5)、5μm 5
‘
巯基修饰的上游引物sh-l1和1m nacl至预处理的金芯片表面，室温避光处理1h进行连接反应；
136.(3)用去离子水清洗，得到核酸检测芯片；
137.(4)将2μl预先配制的核酸等温扩增反应体系(表3)添加到核酸检测芯片上，置于all in one(aio)设备上40℃孵育10min，进行核酸等温扩增反应，10min后取出芯片，用去
离子水清洗；
138.(5)将等温扩增后的核酸检测芯片采用核苷酸染料染色15min，置于荧光显微镜(型号ne910-fl)下放大400倍进行荧光观察并拍摄照片(曝光时间：2s)，核苷酸染料结合到dna双链上，导致dna在荧光显微镜下发出荧光。
139.表3
140.组分用量上游引物l1(1μm)0.5μl(0.01μm)下游引物s1(10μm)3μl(0.6μm)dna模板1ng/μl缓冲液29.5μlmg
2
2.5μl
141.结果如图5所示，ptc区域62经过核苷酸染料染色后，在荧光显微镜下发出荧光，说明ptc区域62rpa扩增成功，生成了双链dna；ntc区域61没有连接引物，不能扩增，经过核苷酸染料染色后不发荧光。
142.综上所述，本发明的核酸检测芯片表面修饰有5’巯基等温扩增引物，实现了简单快速的等温扩增反应，所述核酸检测芯片的背景值低，有利于提供准确的检测结果。
143.申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。