提高数字PCR灵敏度的方法及其试剂盒与流程

提高数字pcr灵敏度的方法及其试剂盒
1.本技术是申请号为201710543861.8，申请日为2017年07月05日，发明名称为提高数字pcr灵敏度的方法及其试剂盒的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及基因检测领域，具体讲，涉及一种提高数字pcr灵敏度的方法及其试剂盒。


背景技术：

3.数字pcr定量分析技术是通过将单个dna分子分配到独立的反应室，使每个单元中只存在单个dna分子，pcr扩增反应后，对阳性荧光信号进行检测，实现单分子的定量。数字pcr技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度，是继实时定量pcr之后新兴发展起来的一种绝对定量分析技术。在基因突变检测、拷贝数变异检测、微生物检测等方面有着广泛应用前景。
4.数字pcr主要分为3种：微流体数字pcr(microfluidic digital pcr，mdpcr)、微滴数字pcr(droplet digital pcr，ddpcr)和芯片数字pcr(chip digital pcr，cdpcr)。分别通过微流体通道、微液滴或微流体芯片实现分液，分隔开的每个微小区域都可迚行单独的pcr反应，其中mdpcr基于微流控技术，对dna模板进行分液，微流控技术能实现样品纳升级或更小液滴的生成，但液滴需要特殊吸附斱式再与pcr反应体系结合，mdpcr已逐渐被其他方式取代；ddpcr技术，是相对成熟的数字pcr平台，利用油包水微滴生成技术，微滴经pcr扩增后，逐个对每个微滴进行检测；cdpcr利用微流控芯片技术，将样品的制备、反应、分离和检测等集成到一块芯片上，利用集成流体通路技术在硅片或石英玻璃上刻上许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合、pcr扩增，实现绝对定量。
5.在人的外周血系统中不但含有自身游离的dna(cell free dna，cfdna)，在肿瘤患者的外周血中也可含有循环肿瘤dna(circulating tumor dna，ctdna)，ctdna是原发肿瘤甚至是转移形成的新肿瘤上的肿瘤细胞破裂掉落到外周血循环系统中的dna片段，因此ctdna可以作为肿瘤诊断、药物疗效评估及预后的标志物。在孕妇外周血系统中不但含有自身游离的dna，还可含有来自胎儿的游离dna，检测孕妇外周血中胎儿的游离dna，可用于胎儿遗传性疾病的诊断。如无创产前检测(non-invasive prenatal testing，nipt)是对母体外周血中胎儿游离dna进行检测分析，可对胎儿进行非整倍体(21-三体、18-三体、13-三体及性染色体综合征)、性别鉴定、亲子鉴定、rh基因、染色体片段异常、妊娠相关疾病及单基因病等的检测。
6.尽管ddpcr具有非常高的灵敏度，但是在遇到样本中的核酸为痕量时，通常还是难以检出。大大限制了ddpcr临床应用的价值。
7.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的首要发明目的在于提出一种提高数字pcr灵敏度的方法。
9.本发明的第二发明目的在于提出用于提高数字pcr灵敏度的试剂盒。
10.为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：
11.根据本发明的第一发明目的，本发明提出提高数字pcr灵敏度的方法，至少包括以下步骤：在线性范围内同比例富集检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列，获得用于检测所述靶向核酸序列或所述待测基因突变位点的富集模板，用于进行所述数字pcr检测。
12.根据本发明的第二发明目的，本发明提出一种提高数字pcr灵敏度的试剂盒，其中含有用于扩增待检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列。
13.本发明的技术方案至少具有以下有益的效果：
14.本发明的方法通过富集模板即在线性范围内同比例富集突变和野生型，把富集模板做ddpcr，从而克服了由于样本中的dna片段的含量过低，低于数字pcr最低检测水平，从而造成假阴性的检测结果。采用本技术的预扩增方法后，对于疑似阳性的实验结果可直接得到有效的实验结果，无需重新检测，大大提高了检测的成功率，对于临床应用具有极大的现实意义。本发明的方法明显改善了检测样本靶向核酸序列痕量检出率低下的况状，大大提升了ddpcr灵敏度及用于临床检测的价值。
附图说明
15.图1为阳性对照的ddpcr结果图；
16.图2为阴性对照的ddpcr结果图；
17.图3为测试管的的ddpcr结果图；
18.图4为s-ddpcr和ddpcr实验数据统计柱状图。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
20.本发明实施例提出一种提高数字pcr灵敏度的方法，至少包括以下步骤：在线性范围内同比例富集检测样本中的靶向核酸序列或待测基因突变位点的突变型基因序列和野生型基因序列，获得用于检测靶向核酸序列或待测基因突变位点的富集模板，富集模板用于进行数字pcr检测。从而使突变的检出率即阳性的检出率大为提高，明显降低检出的假阴性。
21.其中，本发明实施例的检测样本选自外周血、组织、体液；组织优选新鲜组织或病理切片；体液优选胸水、腹水、脑脊液。
22.作为本发明实施例的一种改进，靶向核酸序列或所述待测基因突变位点包括微生物核酸、ctdna、自身cfdna和孕妇外周血的胎儿cfdna中的靶向核酸序列或待测基因突变位点；微生物优选包括细菌、真菌、病毒、支原体、衣原体和立克次氏体。
23.由于在外周血中ctdna或胎儿游离dna的含量极低，因此需要对样本进行富集或扩
增，然后，采用灵敏度极高的数字pcr(droplet digital pcr，简称ddpcr)进行检测。可大大增加ddpcr检测灵敏度，增加检出率，减少假阳性。当样本中感染微量微生物时，在对样本进行靶向核酸序列富集后，亦可大大提高ddpcr的阳性检出率。
24.本发明通过富集血液样本的微生物靶向核酸序列，可大大提高ddpcr针对细菌感染的阳性检出率。
25.作为本发明实施例的一种改进，富集的方法选自核酸提取或核酸扩增；核酸提取可选用核酸富集装置，如核酸富集器、超顺磁性dna纳米富集器等，也可选自毛细管电泳核酸富集方法。
26.核酸扩增的方法优选pcr、核酸等温扩增技术、靶核酸信号放大扩增技术。
27.pcr包括单重pcr(single pcr)、多重pcr(mutiplex pcr)、实时荧光定量pcr(real-time fluorescent quantitative pcr，rt-pcr)、单分子pcr(sm-pcr)、原位pcr、不对称pcr(asymmetric pcr)、armspcr、热启动pcr(hot start pcr)、巢式pcr(nested pcr)、反转录pcr(reverse transcription pcr，rt－pcr)、锚定pcr(anchored pcr)、反向pcr(inverse pcr)、着色互补pcr(colour complementation assay)、免疫pcr(免疫多聚酶链反应，immuno－pcr)中的至少一种，原位pcr技术如玻片pcr(slide-pcr)。
28.还可选用核酸等温扩增技术(isothermal amplification technology)，具体包括链替代扩增技术、滚环扩增技术、依赖解旋酶dna扩增、依赖核酸序列扩增、环介导等温扩增、单引物等温扩增、快速等温检测放大技术、qβ复制技术。链替代扩增技术，又叫链置换扩增，是一种基于酶促反应的dna体外等温扩增技术，主要利用限制性内切酶剪切dna识别位点的能力和dna聚合酶在切口处向3’延伸并置换下游序列的能力，在等温条件下进行扩增。
29.滚环核酸扩增(rolling circleamolification，rca)是通过借鉴病原生物体滚环复制dna的方式而提出的，可分为线性扩增与指数扩增两种形式。线性rca是引物结合到环状dna上后，在dna聚合酶作用下被延伸，产物是具有大量重复序列(与环状dna完全互补)的线状单链。
30.依赖解旋酶dna等温扩增技术是美国neb公司于2004年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内dna复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开dna双链，再由dna单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在dna聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。
31.依赖核酸序列扩增技术是一项以核酸序列中rna为模板，由两个引物介导的、连续均一的特异性体外等温扩增核苷酸序列的酶促过程。
32.环介导等温扩增其扩增原理是基于dna在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链dna的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型dna聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板dna互补序列配对，启动链置换dna合成。
33.单引物等温扩增技术的核心是一条混合引物及可以切割dna/rna杂合链中rna部分的rna酶，由由3’端dna部分和5’端rna部分组成。切割酶作用后暴露出模板上与引物rna部分结合的位点，然后新引物结合上去进行链置换合成，经过rna降解、新引物结合、链置换的循环过程，实现模板互补序列的快速扩增。
34.快速等温检测放大技术的核心是在待检测样品的核酸中加入含有切刻内切酶识
别位点的单链检测探针及切刻内切酶，检测探针与目标基因序列杂交后形成切刻内切酶识别位点，该位点仅可使切刻内切酶在检测探针链切割，形成两小片段，小片段从目标序列脱落，另一dna探针再与目标序列结合产生小片段，如此循环可得。
35.qβ复制技术利用复制酶(q-beta replicase)催化rna模板自我复制的功能。qβ复制酶是qβ噬菌体产生的一种依赖于rna的rna聚合酶，以单链rna为模板，在体外大量复制单链rna，也可以指数式扩增重组dna分子。
36.靶核酸信号放大扩增技术可选自分支链dna信号放大技术(bdna)、杂交捕获(hybrid capture)、侵染(invader)中的至少一种。
37.dna信号放大技术(bdna)是分支链dna信号放大技术，该技术克服了传统的real time pcr技术中的缺陷与不确定因素，无需抽提纯化rna，无需反转录，无需pcr扩增，只要将样本用特定裂解液裂解后，经探针杂交与信号放大后即可迅速得到基因定量结果。
38.本发明实施例采用上述富集方法将突变型基因序列和野生型基因同时富集5～200倍，优选5～10倍。将突变型dna和野生型dna同时富集后，从而克服了由于样本中的dna片段的含量过低，低于数字pcr最低检测水平，从而造成假阴性的检测结果。同时，采用本发明的预扩增方法后，对于疑似阳性的实验结果可直接得到有效的实验结果，无需重新检测，大大提高了检测的成功率，对于临床应用具有极大的现实意义。本发明的方法结束了采用ddpcr技术无法获得有效实验结果或检出率低下的现状，使ddpcr这一技术可真正的实际应用于临床检测。由图4的实验结果可知，采用本发明预扩增的方法后，ddpcr技术检测的灵敏度大大提高，大大提高了疑似阳性或阴性样本的检出率，实现了采用外周血的临床检测。
39.本发明实施例pcr进行预扩增的条件为：94℃条件下保温4.5～5.5min；以93～94℃条件下保温14～16秒、59～61℃条件下保温24～26秒、71～72℃条件下保温39～41秒为一个循环，共循环7～9次；72℃条件下保温4.5min～5.5min。更优选的，pcr进行预扩增的条件为：94℃条件下保温5min；以94℃条件下保温15秒、60℃条件下保温25秒、72℃条件下保温40秒为一个循环，共循环8次；72℃条件下保温5min。在该条件内可保证线性范围内扩增。
40.采用核酸等温扩增技术的条件为：在55～60℃条件下保温30～35min。更优选的，采用核酸等温扩增技术的条件为：在60℃条件下保温32～35min。
41.采用靶核酸信号放大扩增的条件为：95℃条件下保温9～11min；以93～94℃条件下保温14～16秒、59～61℃条件下保温58～62秒为一个循环，共循环35～45次；然后96℃～98℃条件下保温8min～12min，最后在3～5℃条件下保温4min～6min。更优选的，采用靶核酸信号放大扩增的条件为：95℃条件下保温10min；94℃条件下保温15秒、60℃条件下保温60秒为一个循环，共循环40次；然后998℃条件下保温10min，最后在5℃条件下保温5min。
42.本发明实施例设计引物对突变型dna和野生型dna进行扩增，扩增所述突变型dna的引物和扩增野生型dna的引物为相同的引物或扩增效率相近的引物；从而达到同比扩增的目的。
43.本发明实施例设计引物对靶向核酸序列进行扩增，扩增靶向核酸序列的引物为相同的引物或扩增效率相近的引物。
44.本发明实施例中的扩增效率相近是指扩增效率差值为
±
0.3范围内，优选为0.1。
45.采用本发明实施例的提高数字pcr灵敏度的方法，采用pcr方法设计预扩增试剂盒如下，应理解，采用本发明的思路所设计的试剂盒均在本发明的保护范围之内。同时，除pcr
方法外，本领域技术人员可根据实际需要选择其他的富集方式，例如核酸提取技术，或者其他核酸扩增方法，例如核酸等温扩增技术、靶核酸信号放大扩增技术等，并根据实际需要选择具体的实验条件。
46.本发明实施例还涉及用于数字pcr的预扩增试剂盒，预扩增试剂盒中含有braf基因扩增组、kras基因扩增组、egfr基因g719x位点扩增组、egfr基因e19del位点扩增组、egfr基因t790m位点扩增组、egfr基因l858r位点扩增组中的至少一组：
47.组1：braf基因扩增组
48.由seq id no:1所示的用于扩增braf基因野生型和突变型模板的上游引物；由seq id no:2所示的用于扩增braf基因野生型和突变型模板的下游引物；
49.组2：kras基因扩增组
50.由seq id no:3所示的用于扩增kras基因突变型模板的上游引物；由seq id no:4所示的用于扩增kras基因突变型模板的下游引物；
51.由seq id no:5所示的用于扩增kras基因野生型模板的上游引物；由seq id no:6所示的用于扩增kras基因野生型模板的下游引物；
52.组3：egfr基因g719x位点扩增组
53.由seq id no:7所示的用于扩增egfr基因g719x位点突变型模板的上游引物；由seq id no:8所示的用于扩增egfr基因g719x位点突变型模板的下游引物；
54.由seq id no:15所示的用于扩增egfr基因g719x位点与e19del位点野生型模板的上游引物；由seq id no:16所示的用于扩增egfr基因g719x位点与e19del位点野生型模板的下游引物；
55.组4：egfr基因e19del位点扩增组
56.由seq id no:9所示的用于扩增egfr基因e19del位点突变型模板的上游引物；由seq id no:10所示的用于扩增egfr基因e19del位点突变型模板的下游引物；
57.由seq id no:15所示的用于扩增egfr基因g719x位点与e19del位点野生型模板的上游引物；由seq id no:16所示的用于扩增egfr基因g719x位点与e19del位点野生型模板的下游引物；
58.组5：egfr基因t790m位点扩增组
59.由seq id no:11所示的用于扩增egfr基因t790m位点野生型或突变型模板的上游引物；由seq id no:12所示的用于扩增egfr基因t790m位点野生型或突变型模板的下游引物；
60.组6：egfr基因l858r位点扩增组
61.由seq id no:13所示的用于扩增egfr基因l858r位点野生型或突变型模板的上游引物；由seq id no:14所示的用于扩增egfr基因l858r位点野生型或突变型模板的下游引物。
62.引物的序列如表1所示：
63.表1：
[0064][0065][0066]
作为本发明实施例预扩增试剂盒的一种改进，预扩增试剂盒中的引物的浓度和含量如表2所为：
[0067]
表2：
[0068][0069]
进一步优选的，本发明实施例涉及用于数字pcr预扩增braf基因的试剂盒，即含有braf基因扩增组的引物序列。该试剂盒可与其他dd pcr试剂盒合用，用于提高dd pcr的检测灵敏度。
[0070]
进一步的，本发明实施例中将预扩增与数字pcr合并应用获得改进的数字pcr——super-ddpcr试剂盒(以下简称为s-ddpcr试剂盒)。采用本发明的提高数字pcr灵敏度的方法，设计s-ddpcr试剂盒如下，应理解，采用本发明的思路所设计的s-ddpcr试剂盒均在本发明的保护范围之内。
[0071]
本发明实施例还涉及一种检测人braf基因突变的s-dd pcr试剂盒，s-dd pcr试剂盒包括braf预扩增试剂、核酸扩增试剂和对照品，核酸扩增试剂包括braf ddpcr反应液；具体如表3所示：
[0072]
表3
[0073]
组分组分中的主要成分braf预扩增试剂用于扩增braf基因野生型和突变型模板的引物braf ddpcr反应液用于检测braf基因突变的引物和探针
[0074]
其中，用于扩增braf基因野生型和突变型模板的引物为：由seq id no:1所示的上游引物，由seq id no:2所示的下游引物。
[0075]
进一步优选的，braf ddpcr反应液中用于检测braf基因突变的引物和探针的序列可为：含有由seq id no:17、seq id no:2所示的引物；由seq id no:18、seq id no:19所示的探针；核苷酸序列如表4所示：
[0076]
表4
[0077]
引物、探针名称编号核苷酸序列修饰braf-fseq id no:17gcttgctctgataggaaaatgagatc—braf-rseq id no:2atccagacaactgttcaaactgatg—braf-wpseq id no:18tagctacagtgaaatc5'-vic，3'-mgbbraf-mpseq id no:19tagctacagagaaatc5'-fam，3'-mgb
[0078]
本发明实施例还涉及用于数字pcr预扩增kras基因的试剂盒，即含有kras基因扩增组的引物序列。该试剂盒可与其他dd pcr试剂盒合用，用于提高dd pcr的检测灵敏度。
[0079]
本发明实施例还涉及一种检测人kras基因突变的s-ddpcr试剂盒，s-ddpcr试剂盒包括预扩增试剂、核酸扩增试剂和对照品，核酸扩增试剂包括kras ddpcr反应液；具体如表5所示：
[0080]
表5
[0081]
组分组分中的主要成分kras预扩增试剂用于扩增kras基因野生型和突变型模板的引物kras ddpcr反应液用于检测kras基因突变的引物和探针
[0082]
其中，用于扩增kras基因野生型和突变型模板的引物为：由seq id no:3、5所示的上游引物，由seq id no:4、6所示的下游引物。
[0083]
进一步优选的，kras ddpcr反应液中用于检测kras基因突变的引物和探针的序列可为：含有由seq id no:4、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:20～seq id no:23所示的引物；由seq id no:24、seq id no:25所示的探针；核苷酸序列如表6所示：
[0084]
表6
[0085][0086][0087]
本发明实施例涉及用于数字pcr预扩增egfr基因的试剂盒，即含有egfr基因扩增组中任意一组的引物序列；即含有egfr基因e19del位点扩增组、egfr基因t790m位点扩增组、egfr基因l858r位点扩增组中的任意一组，优选同时含有上述扩增组。该试剂盒可与其他dd pcr试剂盒合用，用于提高dd pcr的检测灵敏度。
[0088]
本发明实施例还涉及种检测人egfr基因突变的s-ddpcr试剂盒，s-ddpcr试剂盒包括预扩增试剂、核酸扩增试剂和对照品，具体如表7所示：
[0089]
表7
[0090]
组分组分中的主要成分egfr预扩增反应液用于扩增egfr基因野生型和突变型模板的引物egfr(g719x)ddpcr反应液用于检测18号外显子突变的引物和探针egfr(e19del)ddpcr反应液用于检测19号外显子突变的引物和探针egfr(t790m)ddpcr反应液用于检测20号外显子突变的引物和探针egfr(l858r)ddpcr反应液用于检测21号外显子突变的引物和探针。
[0091]
其中，用于预扩增egfr基因野生型和突变型模板的引物：由seq id no:7～16所示的引物。
[0092]
进一步优选的，egfr ddpcr反应液中用于检测egfr基因突变的引物和探针的序列可为：
[0093]
(1)用于检测18号外显子突变的引物和探针为：由seq id no:7、seq id no:26～seq id no:28所示的引物，由seq id no:29所示的探针；
[0094]
(2)用于检测19号外显子突变的引物和探针为：由seq id no:9、seq id no:30～seq id no:31所示的引物，由seq id no:32所示的探针；
[0095]
(3)用于检测20号外显子突变的引物和探针为：由seq id no:33、seq id no:12所示的引物，由seq id no:34、seq id no:35所示的探针；以及
[0096]
(4)用于检测21号外显子突变的引物和探针为：由seq id no:14、seq id no:36所示的引物，由seq id no:37、seq id no:38所示的探针；
[0097]
(5)作为内参的引物和探针为：由seq id no:39所示的上游引物，由seq id no:16所示的下游引物，由seq id no:40所示的探针；
[0098]
核苷酸序列如表8所示：
[0099]
表8
[0100][0101][0102]
下面通过实施例进一步说明本发明的范围，应理解，以下实施例并不限制本发明的范围，采用本发明的思路所设计的试剂盒均在本发明的保护范围之内。
[0103]
实施例1预扩增试剂盒
[0104]
预扩增试剂盒的组成如表9所示：
[0105]
表9
[0106]
[0107][0108]
试剂盒的具体制备方法为：
[0109]
①
材料：引物和工艺用水
[0110]
②
引物稀释：将所有引物瞬时离心，按比例加入工艺用水，使其溶解后，浓度为100μmol，充分混匀，待用。
[0111]
③
配制：
[0112]
严格按照上表的浓度和用量，精确吸取相应各引物的量，配备预扩增反应液，每测试10μl，不足部分以工艺用水。充分混匀。标上配制日期、品名、体积、批号(上述所用原料均必须为检验合格)。
[0113]
④
储存条件：配制后的溶液存放于4℃避光保存，送质检，合格后，分装，贴签，存放于-20℃，待组装成品。
[0114]
实施例2试剂盒的使用方法
[0115]
1.体系配制
[0116]
取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：1.5μl预扩增反应液 7.5μl s-mix，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管9μl的量，分装于各pcr管内。
[0117]
取6μl cfdna以及试剂盒中对照品分别加入装有预混液的ep管。
[0118]
2.预扩增程序：
[0119]
42℃，5min；94℃，5min；(94℃，15sec；60℃，25sec；72℃，40sec)8个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为20μl。
[0120]
3.预扩增产物取1μl做为模板，进行ddpcr反应。
[0121]
实施例3
[0122]
一种检测人egfr基因突变的s-dd pcr试剂盒，其组成如表10所示：
[0123]
表10：
[0124][0125]
s-ddpcr试剂盒各组分的包装及含量如表11所示：
[0126]
表11：
[0127][0128]
本发明试剂盒的使用方法为：
[0129]
1、ddpcr检测
[0130]
1.1预扩增：
[0131]
1.1.1取出预扩增反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：1.5μl预扩增反应液 7.5μl s-mix，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管9μl的量，分装于各pcr管内。
[0132]
取6μl cfdna以及试剂盒中对照品分别加入装有预混液的ep管。
[0133]
1.1.2.预扩增程序：
[0134]
42℃，5min；94℃，5min；(94℃，15sec；60℃，25sec；72℃，40sec)8个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为20μl。
[0135]
1.1.3.预扩增产物取1μl做为模板。
[0136]
1.2扩增试剂准备：
[0137]
从试剂盒中取出相应的ddpcr反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：4μl ddpcr 10μl ddpcr mix3，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管14μl的量，分装于各pcr管内。
[0138]
1.3加样：
[0139]
取出试剂盒中对照品以及步骤1获得的模板，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别取1μl预扩增产物 5μl工艺用水，，加至装有上述pcr预混液的pcr管中。每个反应体系的总体积为20μl。将盖紧pcr管盖，2000rpm离心10s后，进行微滴制备。
[0140]
1.4制备微滴：
[0141]
将8个20μl反应体系加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔内。在dg8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μl ddpcr微滴发生油，盖上胶垫，将dg8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
[0142]
1.5封膜
[0143]
微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。
[0144]
1.6pcr扩增：
[0145]
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，升降温速度≤2℃/s。
[0146]
1.7微滴读取：
[0147]
先打开电脑，再打开droplet reader电源，将之前完成pcr的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，完成后即可进行run。
[0148]
其中：supermix选择“ddpcr supermix for probes”；
[0149]
dye set选择“fam/vic”。
[0150]
1.8结果分析：
[0151]
检测完成后，点击“2d amplitude”查看通道1和通道2聚类图。点击“auto analyze”重设阈值；手工指定阈值：使用阈值十字线指定整个点图的分类区域，以阳性对照组和阴性对照组的ddpcr结果作为对照，其中，阳性对照组的ddpcr结果如图1所示，阴性对照组的ddpcr结果如图2所示；根据阳性对照组和阴性对照组的液滴荧光信号的分布，划定测试管的微滴信号阈值，如图3所示。
[0152]
2、结果判定
[0153]
2.1突变百分比的计算方式如表12所示：
[0154]
表12：
[0155]
反应液egfr l858r\t790megfr 19del\g719x突变拷贝数ch1ch1基因组dna拷贝数ch1 ch2ch2突变比例计算ch1/(ch1 ch2)ch1/ch2
[0156]
2.2本发明试剂盒的有效性判定：
[0157]
1)微滴生成有效性判断：每个反应管的total微滴数≥8000，若total微滴数＜8000个，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成。
[0158]
2)阴性对照有效性判定：“ch1 ”区的点＜3个且落在“ch2 ”区的点＜5个。
[0159]
3)阳性对照有效性判定：突变比例≥0.1％且落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个。
[0160]
2.3本发明试剂盒的结果判定：
[0161]
(1)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定egfr基因有相关位点突变。
[0162]
(2)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna≥50拷贝，则判定egfr基因无相关位点突变或低于最低检测限值。
[0163]
(3)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，且样本的突变比例≥0.1％，则判定egfr基因相关位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定egfr基因有相关位点突变。反之，判定egfr基因无相关突变或低于最低检测限值。
[0164]
(4)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna＜50拷贝，则提示加入的dna质量不佳或者含有pcr抑制剂，需要重新提取dna后或重新取样后再做。
[0165]
实施例4egfr的s-ddpcr的样本线性检测
[0166]
选取已知浓度的nci-h1975细胞株dna(egfr-790与egfr-858阳性)，nci-h1650细胞株dna(egfr-e19阳性)，sw48细胞株dna(egfr-719阳性)作为阳性样本。
[0167]
1、制备egfr(exon18)ddpcr反应液的线性质控品
[0168]
选用sw48细胞株dna和egfr阴性的ht-1080细胞株基因组dna，按一定比例混合，分别配置突变比例为10％、1％、0.1％、0.5％的l1～l4，具体如表13所示。
[0169]
表13：
[0170][0171]
2、扩增试剂准备：
[0172]
2.1 s-ddpcr
[0173]
以抽提得到的细胞株dna为模板进行预扩增(同实施例3)，使用预扩增产物取1μl做为模板，进行ddpcr实验；
[0174]
2.2 ddpcr
[0175]
以抽提得到的细胞株dna为模板直接进行ddpcr实验(同实施例3)。
[0176]
以理论突变比例对数值为y，检测突变比例对数值为x，进行线性拟合，计算其线性相关系数符合“线性相关系数︱r︱≥0.980”的要求。
[0177]
按照同样的方法，将nci-h1975细胞株dna和阴性的ht-1080细胞株基因组dna按比例混合，制备得到总基因组dna浓度均分别为6000、6000、6000、3000拷贝/μl，突变比例分别为10％、1％、0.1％、0.5％的e19线性质控品，按照相同的方法进行检测，计算其线性相关系数符合“线性相关系数︱r︱≥0.980”的要求。
[0178]
按照同样的方法，将nci-h1975细胞株dna和阴性的ht-1080细胞株基因组dna按比例混合，制备得到总基因组dna浓度均分别为6000、6000、6000、3000拷贝/μl，突变比例分别为10％、1％、0.1％、0.5％的t790m和l858r线性质控品，按照相同的方法进行检测，计算其线性相关系数符合“线性相关系数︱r︱≥0.980”的要求。
[0179]
实验方法同实施例3；检测得到的实验结果如表14所示。
[0180]
表14
[0181][0182]
实施例5 egfr外周血样本对比实验结果：
[0183]
选取36个来自临床的外周血样本，同实施例4使用两种方法进行实验。
[0184]
实验结果如表15～18所示。
[0185]
表15
[0186][0187][0188]
表16
[0189][0190][0191]
表17
[0192][0193]
表18
[0194]
[0195][0196]
以上数据标*组为ddpcr检测结果为疑似阳性或阴性样本，同时s-ddcr检测结果为阳性的数据。阳性结果经组织结果验证，准确率为100％。实验统计柱状图如图4所示。
[0197]
实施例6
[0198]
一种检测人kras基因突变的s-dd pcr试剂盒，其组成如表19所示：
[0199]
表19
[0200][0201]
s-ddpcr试剂盒各组分的包装及含量如表20所示：
[0202]
表20：
[0203][0204]
该试剂盒的使用方法为：
[0205]
1、ddpcr检测
[0206]
1.1预扩增：
[0207]
1.1.1取出预扩增反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：1.5μl预扩增反应液 7.5μl s-mix，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管9μl的量，分装于各pcr管内。
[0208]
取6μl cfdna以及试剂盒中对照品分别加入装有预混液的ep管。
[0209]
1.1.2.预扩增程序：
[0210]
42℃，5min；94℃，5min；(94℃，15sec；60℃，25sec；72℃，40sec)8个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为20μl。
[0211]
1.1.3.预扩增产物取1μl做为模板。
[0212]
1.2扩增试剂准备：
[0213]
从试剂盒中取出相应的ddpcr反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：4μl ddpcr 10μl ddpcr mix3，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管14μl的量，分装于各pcr管内。
[0214]
1.3加样：
[0215]
取出试剂盒中对照品以及步骤1获得的样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别取1μl预扩增产物 5μl工艺用水，加至装有上述pcr预混液的pcr管中。每个反应体系的总体积为20μl。将盖紧pcr管盖，2000rpm离心10s后，进行微滴制备。
[0216]
1.4制备微滴：
[0217]
将8个20μl反应体系加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔内。在dg8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μl ddpcr微滴发生油，盖上胶垫，将dg8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
[0218]
1.5封膜
[0219]
微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。
[0220]
1.6 pcr扩增：
[0221]
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，升降温速度≤2℃/s。
[0222]
1.7微滴读取：
[0223]
先打开电脑，再打开droplet reader电源，将之前完成pcr的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，完成后即可进行run。
[0224]
其中：supermix选择“ddpcr supermix for probes”；
[0225]
dye set选择“fam/vic”。
[0226]
1.8结果分析：
[0227]
检测完成后，点击“2d amplitude”查看通道1和通道2聚类图。点击“auto analyze”重设阈值；手工指定阈值：使用阈值十字线指定整个点图的分类区域，以阳性对照组和阴性对照组的ddpcr结果作为对照，其中，阳性对照组的ddpcr结果如图1所示，阴性对照组的ddpcr结果如图2所示；根据阳性对照组和阴性对照组的液滴荧光信号的分布，划定测试管的微滴信号阈值，如图3所示。
[0228]
2、结果判定
[0229]
2.1突变百分比的计算方式如表21所示：
[0230]
表21：
[0231]
突变拷贝数ch1基因组dna拷贝数ch2突变比例计算ch1/ch2
[0232]
2.2有效性判定：
[0233]
1)微滴生成有效性判断：每个反应管的total微滴数≥8000，若total微滴数＜8000个，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成。
[0234]
2)阴性对照有效性判定：“ch1 ”区的点＜3个且落在“ch2 ”区的点＜5个。
[0235]
3)阳性对照有效性判定：突变比例≥0.1％且落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个。
[0236]
2.3结果判定：
[0237]
(1)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定kras基因有相关位点突变。
[0238]
(2)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna≥50拷贝，则判定kras基因无相关位点突变或低于最低检测限值。
[0239]
(3)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，且样本的突变比例≥0.1％，则判定kras基因相关位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定kras基因有相关位点突变。反之，判定kras基因无相关突变或低于最低检测限值。
[0240]
(4)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna＜50拷贝，则提示加入的dna质量不佳或者含有pcr抑制剂，需要重新提取dna后或重新取样后再做。
[0241]
实施例7kras的s-ddpcr的样本线性检测
[0242]
选用kras基因阳性的lovo细胞株dna和kras阴性的ht-1080细胞株基因组dna，按一定比例混合，分别配置突变比例为7％、1％、0.1％、0.5％的l1～l4，具体如表22所示。
[0243]
表22
[0244][0245]
2.1s-ddpcr
[0246]
以抽提得到的细胞株dna为模板进行预扩增(同实施例6)，使用预扩增产物取1μl做为模板，进行ddpcr实验；
[0247]
2.2ddpcr
[0248]
以抽提得到的细胞株dna为模板直接进行ddpcr实验(同实施例6)。
[0249]
实验方法同实施例6；检测得到的实验结果如表23所示。
[0250]
表23
[0251][0252]
以理论突变比例对数值为y，检测突变比例对数值为x，进行线性拟合，计算其线性相关系数结果符合“线性相关系数︱r︱≥0.980”的要求。
[0253]
实施例8：kras的外周血样本对比实验结果：
[0254]
选取7个来自临床的外周血样本，使用实施例7的两种方法进行实验。实验结果如表24所示。
[0255]
表24
[0256][0257]
以上数据标*组为ddpcr检测结果为疑似阳性或阴性样本，同时s-ddcr检测结果为阳性的数据。阳性结果经组织结果验证，准确率为100％。实验统计柱状图如图4所示。
[0258]
实施例9
[0259]
一种检测人braf基因突变的s-dd pcr试剂盒，其组成如表25所示：
[0260]
表25
[0261][0262]
s-ddpcr试剂盒各组分的包装及含量如表26所示：
[0263]
表26：
[0264]
编号品名管子类别标识体积(管/μl)实际分装体积(管/μl)1预扩增反应液0.6ml无色压盖管18202s-mix1.5ml白色螺旋管901003braf ddpcr1.5ml橙色螺旋管96120
4ddpcr mix31.5ml蓝色螺旋管2402805阴性对照0.6ml无色压盖管1001106braf阳性对照0.6ml无色压盖管3040
[0265]
该试剂盒的使用方法为：
[0266]
1、ddpcr检测
[0267]
1.1预扩增：
[0268]
1.1.1取出预扩增反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：1.5μl预扩增反应液 7.5μl s-mix，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管9μl的量，分装于各pcr管内。
[0269]
取6μl cfdna以及试剂盒中对照品分别加入装有预混液的ep管。
[0270]
1.1.2.预扩增程序：
[0271]
42℃，5min；94℃，5min；(94℃，15sec；60℃，25sec；72℃，40sec)8个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为20μl。
[0272]
1.1.3.预扩增产物取1μl做为模板。
[0273]
1.2扩增试剂准备：
[0274]
从试剂盒中取出相应的ddpcr反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的pcr预混液：4μl ddpcr 10μl ddpcr mix3，将上述配制好的pcr预混液，分别按每管14μl的量，分装于各pcr管内。
[0275]
1.3加样：
[0276]
取出试剂盒中对照品以及步骤1获得的样本处理液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s。分别取1μl预扩增产物 5μl工艺用水，加至装有上述pcr预混液的pcr管中。每个反应体系的总体积为20μl。将盖紧pcr管盖，2000rpm离心10s后，进行微滴制备。
[0277]
1.4制备微滴：
[0278]
将8个20μl反应体系加入到dg8 cartridge中间一排的8个孔内。在dg8 cartridge最底一排8个孔中各加入70μl ddpcr微滴发生油，盖上胶垫，将dg8 cartridge轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μl)转移到96孔板中。
[0279]
1.5封膜
[0280]
微滴转入96孔板内后，用预热好的px1热封仪对其进行封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr。
[0281]
1.6pcr扩增：
[0282]
95℃，10min；(94℃，15sec；58℃，60sec)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μl，升降温速度≤2℃/s。
[0283]
1.7微滴读取：
[0284]
先打开电脑，再打开droplet reader电源，将之前完成pcr的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中打开quantasoft软件，对96孔板中样品信息进行setup，完成后即可进行run。
[0285]
其中：supermix选择“ddpcr supermix for probes”；
[0286]
dye set选择“fam/vic”。
[0287]
1.8结果分析：
[0288]
检测完成后，点击“2d amplitude”查看通道1和通道2聚类图。点击“auto analyze”重设阈值；手工指定阈值：使用阈值十字线指定整个点图的分类区域，以阳性对照组和阴性对照组的ddpcr结果作为对照，其中，阳性对照组的ddpcr结果如图1所示，阴性对照组的ddpcr结果如图2所示；根据阳性对照组和阴性对照组的液滴荧光信号的分布，划定测试管的微滴信号阈值，如图3所示。
[0289]
2、结果判定
[0290]
2.1突变百分比的计算方式如表27所示：
[0291]
表27：
[0292]
突变拷贝数ch1基因组dna拷贝数ch1 ch2突变比例计算ch1/(ch1 ch2)
[0293]
2.2有效性判定：
[0294]
1)微滴生成有效性判断：每个反应管的total微滴数≥8000，若total微滴数＜8000个，该反应孔的微滴生成不理想，需重新进行微滴生成。
[0295]
2)阴性对照有效性判定：“ch1 ”区的点＜3个且落在“ch2 ”区的点＜5个。
[0296]
3)阳性对照有效性判定：突变比例≥0.1％且落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个。
[0297]
2.3结果判定：
[0298]
(1)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定braf基因有相关位点突变。
[0299]
(2)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna≥50拷贝，则判定braf基因无相关位点突变或低于最低检测限值。
[0300]
(3)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，且样本的突变比例≥0.1％，则判定braf基因相关位点突变疑似阳性，需重新检测。重新检测的结果，若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点≥3个，则判定braf基因有相关位点突变。反之，判定braf基因无相关突变或低于最低检测限值。
[0301]
(4)若样本落在“ch1 ch2
‑”
区的点＜3个，样本的突变比例＜0.1％且总基因组dna＜50拷贝，则提示加入的dna质量不佳或者含有pcr抑制剂，需要重新提取dna后或重新取样后再做。
[0302]
实施例10braf的s-ddpcr的样本线性检测
[0303]
选用braf基因阳性的rko细胞株dna和braf阴性的ht-1080细胞株基因组dna，按一定比例混合，分别配置突变比例为7％、1％、0.1％、0.5％的l1～l4，具体如表28所示。
[0304]
表28
[0305][0306]
2.1s-ddpcr
[0307]
以抽提得到的细胞株dna为模板进行预扩增(同实施例9步骤1.1)，使用预扩增产物取1μl做为模板，进行ddpcr实验；
[0308]
2.2ddpcr
[0309]
以抽提得到的细胞株dna为模板直接进行ddpcr实验。实验方法同实施例9；检测得到的实验结果如表29所示。
[0310]
表29
[0311][0312]
实施例11：braf的外周血样本对比实验结果：
[0313]
选取7个来自临床的外周血样本，使用实施例7中的两种方法进行实验。实验结果如表30所示。
[0314]
表30
[0315][0316][0317]
*以上数据*部分为ddpcr检测结果为疑似阳性或阴性样本同时s-ddcr检测结果为阳性的数据。实验统计柱状图如图4所示。
[0318]
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。