尾菜废水资源化菌剂及其在制备植物营养液中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种尾菜废水资源化菌剂及其在微生物处理植物废水制备植物营养液中的应用。


背景技术：

2.我国是一个尾菜废弃物产生大国，尾菜废弃物含水高达90%以上，尾菜废弃物在实现无害化、减量化、资源化的过程中必然会产生大量高浓度废水，即尾菜废水。尾菜产废水中cod高达30000mg/l，氨氮高达500mg/l，总磷高达120mg/l，如果作为污水处理，不论是达到地表水排放标准还是达到纳管标准，都面临巨大的处理压力。
3.微生物作为自然界分解者，可将尾菜残体分解为植物可吸收的成分返还给土壤，因此若采用能分解尾菜中多糖、蛋白、纤维等物质的菌种将其转化为植物可吸收的物质，将大大减轻环境压力，且可变废为宝，对蔬菜产业具有重要意义。


技术实现要素：

4.本发明目的是提供一种尾菜废水资源化菌剂，及其在在资源化微生物处理植物废水制备植物营养液中的应用。
5.本发明采用的技术方案是：一种尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002，由地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 01050、解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040、蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius ）cctcc no：m2017039和毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m2017044组成。
6.本发明微生物菌剂中的菌种选用《微生物肥料生物安全通用技术准则（ny1109-2006）》中免作毒理学试验的菌种及卫生部印发关于《可用于食品的菌种名单》的通知中的菌种，不含重金属和有毒害化学物质，实体产品无毒无刺激性。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品，并且，本菌剂储运和投放简便高效。本工艺操作简单，无外部化学药品添加，且发酵完成的植物营养液无外部化学药品添加，富含植物生长所需的大量及微量元素，对植物生长具有促进作用。
7.优选的，以培养至对数中后期的活菌数量占比计，组成如下：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 0105025~35%，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 25%~35%，蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m201703920%~30%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m201704415%~25%。
8.更为优选的，所述尾菜废水资源化菌剂组成如下：地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 0105030%，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 25%，蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m201703925%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m201704420%。
9.本发明尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002的制备方法如下：将各菌种接入到液体菌
种活化培养基，30℃~36℃好氧活化10h~16h制作成种子活化液，再以1%~3%体积比的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h~18h制作成种子液，然后将种子液按照各菌种比例混合后以3%~5%体积比的接种量接入到菌体发酵培养基，30℃~35℃好氧发酵18h~24h，制成尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002。
10.尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002的菌种活化培养基组成如下：0.8%~1.2%（w/v，1%表示100ml培养基中含有1g该物质，下同）蛋白胨，0.4%~0.6%酵母膏，1.8%~2.2%葡萄糖，0.8~1.2%氯化钠，1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，0.8
‰
~1.2
‰
氯化铵，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，0.048
‰
~0.052
‰
硫酸锰，ph调至约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。种子培养基组成如下：1.8%~2.2%蛋白胨，0.8%~1.2%葡萄糖，0.8%~1.2%糖蜜，0.8~1.2%氯化钠，1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，1.8
‰
~2.2
‰
氯化铵，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，0.048
‰
~0.052
‰
硫酸锰，ph调至约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。发酵培养基组成特征在于：60%~70%尾菜废水，0.8~1.2 % 糖蜜，0.4~0.6 % 蛋白胨，0.5~0.8%氯化钠，1.8
‰
~2.2
‰
磷酸氢二钾，0.18
‰
~0.22
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，115℃条件下灭菌30分钟。
11.本发明还涉及所述尾菜废水资源化菌剂在资源化微生物处理植物废水制备植物营养液中的应用。
12.具体的，所述植物废水为除杀菌类植物以外的植物废水。
13.具体的，所述应用为：在植物废水中添加所述尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002，在30℃~37℃下，进行好氧发酵，控制溶解氧2~4mg/l，发酵3~6天，发酵完成后稀释至cod 100~1000mg/l，即为所述植物营养液。
14.优选的，所述好氧发酵在33℃~36℃下进行。
15.本发明的有益效果主要体现在：本发明尾菜废水资源化菌剂能分解尾菜中多糖、蛋白、纤维等物质，可将尾菜废水发酵成植物营养液，发酵完成的植物营养液无外部化学药品添加，富含植物生长所需的大量及微量元素，对植物生长具有促进作用。
附图说明
16.图1为实施例4种子发芽实验第4天照片；图2为实施例4第5天种子发芽指数对比；图3为实施例4种子发芽实验第5天照片。
17.（五）具体实施方式为了加深对本发明的理解，下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
18.实施例1：尾菜废水资源化菌剂hqy-of-002的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
19.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
20.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在30℃~36℃好氧活化10h~16h
即可制作成活化液。
21.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
22.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
23.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 0105030%，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 25%，蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m201703925%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m201704420%比例混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基, 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-of-002。
24.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%尾菜废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
25.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-of-002，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定保存6个月，最佳应用条件温度：25~45℃；ph：4~8.5。
26.实施例2：尾菜废水资源化菌剂hqy-of-003的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
27.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
28.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在30℃~36℃好氧活化10h~16h即可制作成活化液。
29.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
30.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
31.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照地衣芽孢杆菌（bacillus licheniformis ）accc 0105030%，解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 40%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m201704430%。混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基， 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-of-003。
32.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%尾菜废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
33.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-of-003，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定
保存6个月，最佳应用条件温度：25~45℃；ph：4~8.5。
34.实施例3：尾菜废水资源化菌剂hqy-of-004的制备该菌剂是经过以下步骤制备的：（1）-80℃冰箱中取出甘油冻管保藏的各菌种，在经紫外灭菌的超净工作台中融解，移液枪无菌吸取1 ml接入已灭菌的10 ml液体菌种活化培养基中，进行活化。
35.（2）本菌剂制备步骤（1）中所用液体菌种活化培养基其配制方法为：1.0%蛋白胨，0.5%酵母膏，2.0%葡萄糖，1.0%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，1.0
‰
氯化铵，0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
36.（3）本菌剂制备步骤（1）中菌种接入活化培养基后，在30℃~36℃好氧活化10h~16h即可制作成活化液。
37.（4）无菌条件下吸取（3）中活化好的菌种活化液，以3%的接种量接入到种子培养基，30℃~36℃好氧发酵12h制作成种子液。
38.（5）步骤（4）中所用种子培养基其配制方法为：2.0%蛋白胨，1.0%葡萄糖，1.0%糖蜜，1.0 %氯化钠， 2.0
ꢀ‰
磷酸氢二钾，2.0
‰
氯化铵0.2
‰
七水硫酸镁，0.05
‰
硫酸锰，ph调至约7.0。并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
39.（6）无菌条件下吸取（4）中发酵完成的种子液，种子液按照解淀粉芽孢杆菌（bacillus amyloliquefaciens）cctcc no：m2017040 40%，蔬菜芽孢杆菌（bacillus oleronius）cctcc no：m201703930%，毕赤酵母（pichia farinose）cctcc no：m201704430%。混合后以5%的接种量接入到菌体发酵培养基, 30℃~35℃好氧发酵24h即可制作成菌剂hqy-of-004。
40.（7）步骤（6）中所用菌体发酵培养基其配制方法为：70%尾菜废水，1.0 % 糖蜜，0.5 % 蛋白胨，0.6%氯化钠，2.0
‰
磷酸氢二钾，0.2
‰
七水硫酸镁，且调ph到约7.0，并将培养基在115℃条件下灭菌30分钟。
41.（8）步骤（6）中发酵完成的菌剂hqy-of-004，活菌数量》108cfu/ml，室温下能稳定保存6个月，最佳应用条件温度：25~45℃；ph：4~8.5。
42.实施例4：采用本工艺处理菜库所产尾菜：大娃菜、番茄、豆角、包菜、土豆、胡萝卜等混合尾菜废水（该废水cod值28500mg/l，氨氮含量431mg/l，总磷119mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-of-002，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在2mg/l~4mg/l条件下好氧发酵6天，发酵完成后纯水稀释至cod约100mg/l，即为所述植物营养液。
43.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取10ml营养液于铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽48h，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
44.发芽第4天测种子发芽率达到100%（参见图1），发芽第5天种子发芽指数达到126%（参见图2~3）。
45.实施例5：采用本工艺处理菜库所产尾菜：大娃菜、番茄、豆角、包菜、土豆、胡萝卜等混合尾
菜废水（该废水cod值28500mg/l，氨氮含量431mg/l，总磷119mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-of-003，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在2mg/l~4mg/l条件下好氧发酵6天，发酵完成后纯水稀释至cod约100mg/l，即为所述植物营养液。
46.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取10ml营养液于铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽48h，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
47.测种子发芽率达到84%，种子发芽指数达到92%。
48.实施例6：采用本工艺处理菜库所产尾菜：大娃菜、番茄、豆角、包菜、土豆、胡萝卜等混合尾菜废水（该废水cod值28500mg/l，氨氮含量431mg/l，总磷119mg/l），在废水中添加3
‰
菌剂hqy-of-004，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在2mg/l~4mg/l条件下好氧发酵6天，发酵完成后纯水稀释至cod约100mg/l，即为所述植物营养液。
49.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取10ml营养液于铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽48h，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
50.测种子发芽率达到78%，种子发芽指数达到80%。
51.实施例7：采用本工艺处理尾菜及植物废水：大娃菜、娃娃菜、黄瓜、番茄、豆角、包菜、土豆、胡萝卜、水生观赏植物等混合废水（该废水cod值26300mg/l，氨氮含量465mg/l，总磷104mg/l），在废水中添加4
‰
菌剂hqy-of-002，35℃，ph：5~8，溶解氧控制在2mg/l~4mg/l条件下好氧发酵6天，发酵完成后纯水稀释至cod约1000mg/l，即为所述植物营养液。
52.采用浙江省嘉兴市嘉丰种子有限公司的四季快菜（小白菜）种子，挑选出里面籽粒饱满种子进行测试。测试方法参考农业行业标准《蔬菜废弃物高温堆肥无害化处理技术规程（ny/t3441-2019）》中的种子发芽指数，发芽法试验进行操作。吸取10ml营养液于铺好滤纸的9cm培养皿中，每皿均匀放入50粒种子，之后放入30℃培养箱，避光发芽48h，统计发芽率及根长。每个样品做3个重复，以蒸馏水为对照组。
53.测种子发芽率达到100%，种子发芽指数达到142%。
54.本发明菌剂hqy-of-002不含致病菌，不含重金属和有毒害化学物质，实体产品无毒无刺激性。实际应用不会对环境造成二次污染，不会额外造成负担，属于环境友好亲和型微生物菌剂产品，并且，本菌剂储运和投放简便高效。本发明工艺操作简单，无外部化学药品添加，且发酵完成的植物营养液富含植物生长所需的大量及微量元素，对植物生长具有较好促进作用。
55.上述说明已经充分揭示了本发明的具体实施方式。需要指出的是，熟悉该领域的技术人员对本发明的具体实施方式所做的任何改动均不脱离本发明的权利要求书的范围。相应地，本发明的权利要求的范围也并不仅仅局限于前述具体实施方式。