抗胃泌素释放肽的抗体、检测试剂与试剂盒的制作方法

1.本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗胃泌素释放肽的抗体、检测试剂与试剂盒。


背景技术：

2.胃泌素释放肽(gastrin-releasing peptide，grp)是一种调节分子，可以刺激胃g细胞分泌胃泌素、参与平滑肌细胞收缩、促进细胞间的相互作用。progrp(pro-gastrin-releasing peptide)是胃泌素释放肽的前体，共有3种变体，其氨基酸序列长度分别为115aa、118aa和125aa，分别称为亚型1、亚型2和亚型3，含量比为60∶5∶35。在人体内grp基因编码产生148个氨基酸的前蛋白质原，随着信号肽解离，它的148个前蛋白质原会进一步分解生成27个氨基酸的胃泌素释放肽和68个氨基酸的progrp。相比于grp在血液中很短的半衰期，progrp半衰期适中，可反映grp的水平和grp基因的表达。
3.胎儿和新生儿支气管上皮内分泌细胞grp含量丰富，而成人中仅存在于脑、胃肠的神经纤维及小部分肺的神经内分泌细胞中，且水平较低。除了肾功能不全、肺神经内分泌肿瘤和甲状腺髓样癌外，在其他恶性肿瘤或良性疾病患者中，progrp很少升高。
4.progrp对小细胞肺癌(sclc)诊断有很高的灵敏度和特异性，其水平可反映治疗的效果，判断疾病是否进展和消退。在监测sclc患者复发时progrp有较好的作用。对于患者预后评估中progrp水平与预后因素具有高度的相关性，可以更早的进行预后评价和对疗效进行预测。
5.出于经济成本等因素考虑，低剂量螺旋ct不适合大规模的肺癌人群筛查。肿瘤标志物的检测满足了临床快速、无创、经济的需求。自1989年成为sclc标志物以来，progrp检测几十年间建立起了酶联免疫法(1995)，化学发光免疫分析法，电化学发光法(2013)，时间分辨免疫荧光分析法等多种检测方法。不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于progrp的特异性抗体。优质的抗体对于临床检测grp至关重要。目前针对grp的单克隆抗体来源少，灵敏度、亲和力以及特异性都存在缺陷。
6.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种抗胃泌素释放肽的抗体、检测试剂与试剂盒，该抗体对胃泌素释放肽具有较好的特异性和灵敏度，可用于检测胃泌素释放肽以及用于以胃泌素释放肽为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。
8.本发明是这样实现的：
9.一方面，本发明提供一种抗胃泌素释放肽的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段具有如下互补决定区：
10.cdr-vh1：g-y-x1-f-x2-d-y-n-m-x3；其中：x1是r或k；x2是s或t；x3是n或d；
11.cdr-vh2：d-x1-n-p-x2-s-d-x3-t-x4-y-n-q-k-f-k-g；其中：x1是l或i；x2是n或d；
x3是g、a或v；x4是i或f；
12.cdr-vh3：x1-t-w-x2-h；其中：x1是s或t；x2是i、v或l；
13.cdr-vl1：s-a-x1-q-g-x2-s-n-y-x3-s；其中：x1是s或t；x2是i、v或l；x3是i、v或l；
14.cdr-vl2：x1-t-s-r-x2-y-s；其中：x1是h或y；x2是i、v或l；
15.cdr-vl3：x1-q-y-s-k-x2-p-w；其中：x1是q或h；x2是i、v或l。
16.本发明提供具有上述互补决定区结构的抗体或其功能性片段，该抗体可特异性结合胃泌素释放肽，对胃泌素释放肽抗原具有较好的亲和力，用该抗体检测胃泌素释放肽，具有较好的特异性和灵敏度。可用于检测胃泌素释放肽以及用于以胃泌素释放肽为标志物的相关疾病的诊断或辅助诊断。本发明为胃泌素释放肽的检测提供了更为丰富的抗体选择。
17.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是r；cdr-vh2中，x1是i；cdr-vh3中，x1是s；cdr-vl1中，x1是s；cdr-vl3中，x1是h。
18.本发明的发明人发现，在各互补决定区中的上述突变位点为上述氨基酸残基时，该抗体对胃泌素释放肽表现出更好的亲和力。
19.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是s。
20.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x2是t。
21.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是n。
22.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x3是d。
23.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是n。
24.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x2是d。
25.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是g。
26.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是a。
27.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x3是v。
28.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是i。
29.在可选的实施方式中，cdr-vh2中，x4是f。
30.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是i。
31.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是v。
32.在可选的实施方式中，cdr-vh3中，x2是l。
33.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是i。
34.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是v。
35.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x2是l。
36.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是i。
37.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是v。
38.在可选的实施方式中，cdr-vl1中，x3是l。
39.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是h。
40.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x1是y。
41.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是i。
42.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是v。
43.在可选的实施方式中，cdr-vl2中，x2是l。
44.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是i。
45.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是v。
46.在可选的实施方式中，cdr-vl3中，x2是l。
47.在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合1-47中的任意一种：
48.49.50.。
51.在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段与胃泌素释放肽以kd≤3
×
10-7
mol/l的亲和力结合。
52.在可选的实施方式中，kd≤2
×
10-7
mol/l、kd≤1
×
10-7
mol/l、kd≤9
×
10-8
mol/l、kd≤8
×
10-8
mol/l、kd≤7
×
10-8
mol/l、kd≤6
×
10-8
mol/l、kd≤5
×
10-8
mol/l、kd≤4
×
10-8
mol/l、kd≤3
×
10-8
mol/l、kd≤2
×
10-8
mol/l、kd≤1
×
10-8
mol/l、kd≤9
×
10-9
mol/l、kd≤8
×
10-9
mol/l、kd≤7
×
10-9
mol/l、kd≤6
×
10-9
mol/l、kd≤5
×
10-9
mol/l、kd≤4
×
10-9
mol/l、kd≤3
×
10-9
mol/l、kd≤2
×
10-9
mol/l或kd≤1
×
10-9
mol/l。
53.在可选的实施方式中，kd≤7.7
×
10-9
mol/l。
54.在可选的实施方式中，1.22
×
10-9
mol/l≤kd≤7.73
×
10-9
mol/l。
55.kd的检测参考本发明实施例中的方法进行。
56.在可选的实施方式中，cdr-vh1中，x1是k；cdr-vh2中，x1是l；cdr-vh3中，x1是t；cdr-vl1中，x1是t；cdr-vl3中，x1是q。
57.在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的各互补决定区选自如下突变组合48-53中的任意一种：
58.。
59.在可选的实施方式中，所述抗体包括序列依次如seq id no:1-4所示的轻链骨架区fr1-l、fr2-l、fr3-l及fr4-l，和/或，序列依次如seq id no:5-8所示的重链骨架区fr1-h、fr2-h、fr3-h及fr4-h。
60.通常情况下，重链可变区(vh)和轻链的可变区(vl)可由以下编号的cdr与fr按如下组合排列连接获得：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。
61.需要说明的是，在其他的实施例中，本发明提供的抗体或其功能性片段的各骨架区氨基酸序列可以与上述对应骨架区(seq id no:1、2、3、4、5、6、7或8)可以具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性。
62.在可选的实施方式中，所述抗体还包含恒定区。
63.在可选的实施方式中，所述恒定区选自igg1、igg2、igg3、igg4、iga、igm、ige和igd中的任意一者的恒定区。
64.在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
65.在可选的实施方式中，所述恒定区来源于小鼠。
66.在可选的实施方式中，所述恒定区的轻链恒定区序列如seq id no:9所示，所述恒定区的重链恒定区序列如seq id no:10所示。
67.在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的vhh、f(ab’)2、fab’、fab、fv和scfv中的任意一种。
68.上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
69.上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如applied biosystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
70.另一方面，本发明提供一种检测胃泌素释放肽的试剂或试剂盒，其包括如上任一项所述的抗体或其功能性片段。
71.在可选的实施方式中，上述试剂或试剂盒中所述抗体或其功能性片段标记有可被检测的标记物。
72.可被检测的标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
73.在可选的实施方式中，所述可被检测的标记物包括但不限于荧光染料、催化底物显色的酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
74.在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
75.在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(fitc)羟基光素(fam)、四氯光素(tet)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(rbitc)、四甲基罗丹明(tamra)、罗丹明b(tritc)等或其类似物)、cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于cy2、cy3、cy3b、cy3.5、cy5、cy5.5、cy3等或其类似物)、alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(pe)、藻蓝蛋白(pc)、别藻蓝蛋白(apc)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(precp)等)。
76.在可选的实施方式中，所述催化底物显色的酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
77.在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于
212
bi、
131
i、
111
in、
90
y、
186
re、
211
at、
125
i、
188
re、
153
sm、
213
bi、
32
p、
94
mtc、
99
mtc、
203
pb、
67
ga、
68
ga、
43
sc、
47
sc、
110
min、
97
ru、
62
cu、
64
cu、
67
cu、
68
cu、
86
y、
88
y、
121
sn、
161
tb、
166
ho、
105
rh、
177
lu、
172
lu和
18
f。
78.在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
79.在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
80.在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
81.在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金、胶体银和胶体硒。
82.另一方面，本发明提供如上所述的抗体或其功能性片段在制备用于诊断或辅助诊断以胃泌素释放肽为标志物的相关疾病的试剂或试剂盒中的应用。
83.任何以胃泌素释放肽为标志物的相关疾病(例如肾功能不全、肺神经内分泌肿瘤和甲状腺髓样癌等)的诊断或辅助诊断均可以采用本发明提供的抗体或其功能性片段。
84.另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
85.另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
86.另一方面，本发明提供含有上述载体的重组细胞。
87.另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的重组细胞，从培养产物中分离纯化得到所述抗体或其功能性片段。
88.在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、杂交瘤细胞)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
附图说明
89.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
90.图1为实施例1的抗胃泌素释放肽抗体的还原性sds-page的结果。
具体实施方式
91.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
92.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
93.除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。
文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第二版(sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(oligonucleotide synthesis)》(m.j.gait编，1984)；《动物细胞培养(animal cell culture)》(r.i.freshney编，1987)；《酶学方法(methods in enzymology)》(学术出版社有限公司(academic press，inc.)；《实验免疫学手册(handbook of experimental immunology)》(d.m.weir和c.c.blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(gene transfer vectors for mammalian cells)》(j.m.miller和m.p.calos编，1987)；《当代分子生物学方法(current protocols in molecular biology)》(f.m.ausubel等人编，1987)；《pcr:聚合酶链反应(pcr:the polymerase chain reaction)》(mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(current protocols in immunology)》(j.e.coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
94.以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
95.实施例中限制性内切酶、prime star dna聚合酶购自takara公司。magextractor-rna提取试剂盒购自toyobo公司。bd smart
tm
race cdna amplification kit试剂盒购自takara公司。pmd-18t载体购自takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由invitrogen公司完成。
96.实施例1
97.1重组质粒的构建
98.(1)抗体基因制备
99.从分泌抗胃泌素释放肽抗体的杂交瘤细胞株中提取mrna，通过rt-pcr方法获得dna产物，该产物用rtaq dna聚合酶进行加a反应后插入到pmd-18t载体中，转化到dh5α感受态细胞中，长出菌落后分别取heavy chain及light chain基因克隆各4个克隆送基因测序公司进行测序。
100.(2)抗体可变区基因的序列分析
101.将上述测序得到的基因序列放在imgt抗体数据库中进行分析，并利用vnti11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中light chain扩增出的基因片段中，vl基因序列为324bp，属于vkii基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；heavy chain引物对扩增出的基因片段中，vh基因序列为336bp，属于vh1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
102.(3)重组抗体表达质粒的构建
103.pcdna
tm
3.4vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入hindiii、bamhi、ecori等多克隆酶切位点，并命名为pcdna3.4a表达载体，后续简称3.4a表达载体；根据上述pmd-18t中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的vl和vh基因特异性引物，两端分别带有hindiii、ecori酶切位点和保护碱基，通过pcr扩增方法扩出0.73kb的light chain基因片段和1.43kb的heavy chain基因片段。
104.heavy chain和light chain基因片段分别采用hindiii/ecori双酶切，3.4a载体采用hindiii/ecori双酶切，将片段和载体纯化回收后heavy chain基因和light chain基因分别连接3.4a表达载体中，分别得到heavy chain和light chain的重组表达质粒。
105.2稳定细胞株筛选
106.(1)重组抗体表达质粒瞬时转染cho细胞，确定表达质粒活性
107.质粒用超纯水稀释至40ug/100μl，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
108.包被液稀释grp抗原到1μg/ml，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100μl/孔，37℃，30min(部分上清1h)；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠igg-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含柠檬酸 醋酸钠 乙酰苯胺 过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含柠檬酸 edta
·
2na tmb 浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含edta
·
2na 浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应od仍大于1.0，未加细胞上清孔反应od小于0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体对grp抗原有活性。
109.(2)重组抗体表达质粒线性化
110.准备下述试剂：buffer 50μl、dna 100μg/管、puvⅰ酶10μl、无菌水补至500μl，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积(水相)3m醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
111.(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
112.质粒用超纯水稀释至40ug/100μl，调节cho细胞1.43
×
107cells/ml于离心管中，100μl质粒与700μl细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/l msx 96孔加压培养约25天。
113.显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔,并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5
×
106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3
×
106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转tpp保种传代。
114.3重组抗体生产
115.(1)细胞扩培
116.细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％dynamis培养基。之后每72h扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
117.(2)摇瓶生产及纯化
118.摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，hyclonetm cell boosttm feed 7a每天流加初始培养体积的3％，feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/l。第13天收样。用proteina亲和层析柱进行亲和纯化。取4μg纯化的抗体进行还原性sds-page，4μg外来对照抗体作为对照，电泳图如下图1所示，在还原性sds-page后显示两条带，1条mr为50kd(重链，seq id no:14)，另一条mr为28kd(轻链，seq id no:13)。
119.实施例2
120.抗体的性能检测
121.(1)实施例1抗体及其突变体的活性检测
122.分析实施例1的抗体(wt)序列，其重链可变区如seq id no:12所示，其中，其中，重链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
123.cdr-vh1：g-y-k(x1)-f-s(x2)-d-y-n-m-d(x3)；
124.cdr-vh2：d-l(x1)-n-p-n(x2)-s-d-a(x3)-t-i(x4)-y-n-q-k-f-k-g；
125.cdr-vh3：t(x1)-t-w-i(x2)-h；
126.其轻链可变区如seq id no:11所示，其中，轻链可变区上的各互补决定区的氨基酸序列如下：
127.cdr1-vl：s-a-t(x1)-q-g-v(x2)-s-n-y-i(x3)-s；
128.cdr-vl2：h(x1)-t-s-r-v(x2)-y-s；
129.cdr-vl3：q(x1)-q-y-s-k-i(x2)-p-w。
130.在实施例1的抗胃泌素释放肽抗体(wt)基础上，在互补决定区中对于抗体活性有关的位点进行突变，其中，x1、x2、x3、x4均为突变位点。见下表1。
131.表1与抗体活性有关的突变位点
[0132][0133]
对表1中的抗体结合活性检测：
[0134]
包被液(主要成分nahco3)稀释grp抗原到1μg/ml进行微孔板包被，每孔100μl，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％bsa 80％pbs)，每孔120μl，37℃，1h，拍干；加入稀释后的grp单克隆抗体，100μl/孔，37℃，30min-60min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠igg-hrp，每孔100μl，37℃，30min；洗涤液(pbs)清洗5次，拍干；加入显色液a液(50μl/孔，含2.1g/l柠檬酸、12.25g/l柠檬酸、0.07g/l乙酰苯胺和0.5g/l过氧化脲)，加入显色液b液(50μl/孔，含1.05g/l柠檬酸、0.186g/ledta
·
2na、0.45g/l tmb和0.2ml/l浓hcl)，10min；加入终止液(50μl/孔，含0.75g/edta
·
2na和10.2ml/l浓h2so4)；酶标仪上450nm(参考630nm)处读od值。结果见下表2。
[0135]
表2 wt抗体及其突变体的活性数据
[0136]
抗体浓度(ng/ml)37.5018.759.384.692.340.00wt1.3110.9240.4100.2200.0230.123突变12.0271.3760.7910.4480.2220.019突变21.9781.3260.7400.4930.1990.019突变31.9511.360.6810.4790.1820.017
突变40.2460.125
----
突变50.2830.193
----
突变60.2790.182
----
[0137]
根据表2结果，突变4-突变6抗体基本没有结合活性，而wt以及突变1-突变3抗体具有更好的结合活性，其中，以突变1抗体的结合活性最高。
[0138]
(2)抗体及其突变体的亲和力检测
[0139]
(a)在突变1的基础上，对其他位点进行突变，各突变的序列见下表3。
[0140]
表3与抗体亲和力有关的突变位点
[0141]
[0142][0143]
亲和力分析
[0144]
利用amc传感器，将纯化出来的抗体用pbst稀释到10ug/ml，grp抗原(0.699mg/ml)用pbst进行梯度稀释：1.8μg/ml、0.9μg/ml、0.45μg/ml、0.23μg/ml、0.11μg/ml和0.056μg/ml。
[0145]
运行流程：缓冲液1(pbst)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(pbst)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离1200s，用10mm ph 1.69gly溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。结果见下表4。kd表示平衡解离常数即亲和力；kon表示结合速率；kdis表示解离速率。
[0146]
表4亲和力检测数据
[0147]
[0148][0149]
从表4结果，可以看出，突变1及其系列突变体对grp抗原都具有较高的亲和力，说明在突变1的基础上，按表3的突变方式突变得到的抗体都具有较高的亲和力。
[0150]
(b)在wt的基础上，对其他位点进行突变，并检测各突变体的亲和力，各突变的序列见下表5，对应的亲和力数据见表6。
[0151]
表5以wt为骨架进行的突变
[0152][0153]
表6 wt抗体及其突变体的亲和力检测结果
[0154] kd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)wt1.53e-073.60e 045.50e-03wt 13.06e-071.93e 045.91e-03wt 21.57e-073.93e 046.18e-03wt 31.13e-073.56e 044.03e-03wt 41.14e-073.96e 044.52e-03wt 51.18e-073.03e 043.59e-03
[0155]
根据表6结果，可以看出，wt及其系列突变体也都具有不错的亲和力，说明在wt的基础上，根据表5的突变方式进行突变，得到的抗体也都具有不错的亲和力。
[0156]
(3)裸抗稳定性考核
[0157]
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表7突变1抗体为考核21天的酶免活性检测od结果。
[0158]
表7
[0159]
样品浓度(ng/ml)30804℃，21天样品1.8530.6660.026-80℃，21天样品1.7830.6370.02337℃，21天样品1.8420.5620.027
[0160]
(4)应用性能评价
[0161]
将以上抗体进行双抗体夹心法配对实验，在化学发光平台上检测，分别与另一株progrp抗体(可获自菲鹏生物)配对使用。突变1及其系列抗体检测线性范围在3-5000pg/ml，不同抗原浓度下的检测相关性可达到0.96以上，灵敏度可达1.3-1.5pg/ml，具有良好的线性和灵敏度。
[0162]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。