新型烟草胺外排基因的克隆及其应用

1.本发明属于基因工程技术领域，更具体地，本发明涉及新型烟草胺(na)外排 基因的克隆及其应用。


背景技术：

2.铁和铜不仅是植物生长发育必需的矿质营养元素，在植物体内多种生理代谢过 程中都发挥着重要作用。更为重要的是，因为植物来源的食品普遍存在铁含量较低， 抗营养因子较高的现象，从而导致以植物作为主食的人类铁营养缺乏的普遍问题。 因此，铁和铜的缺乏不仅会影响其本身生长发育，同时也影响植食性人类和动物的 营养获取。因此解析植物对cu和fe的稳态调控机制十分重要。铜和铁既能以离 子的形式直接被转运蛋白进行转运，也可以和金属螯合物进行结合形成复合物被金 属转运蛋白转运。烟草胺(nicotianamine，na)就是这些有机小分子中的一员，它在 植物体内可以和铁、锌、铜、锰、镍等多种金属离子螯合，参与这些金属离子的运 输和分布，维持植物体内金属离子的平衡。而且植物体内na含量和分配直接影 响植物对环境中金属离子的吸收以及金属离子在植物体内不同器官和组织的积累 水平。更为重要的是，近年来的研究发现，na可以解除食物中抗营养因子对于铁 的鏊合，增加动物和人类对于铁的生物可获得性和利用率。
3.目前植物参与na转运的基因很少被报道。在早期的研究中，科学家通过运用 酵母功能回补实验，从植物中克隆出了一些能参与na-metal复合物运输的家族成 员基因，例如yellowstripe1-like(ysl)，但是它们均被报道参与na往胞内的运 输。拟南芥zif1(zinc-induced facilitator 1)是种定位在液泡膜的转运蛋白，可以将 zn-na复合物转运至液泡中。有报道称，体外实验表明水稻转运蛋白ena1和ena2 具备na外排活性，但缺乏遗传学和体内证据。因此，具体参与na往胞外分泌的 蛋白对于本领域而言仍然未知。
4.基于na的分子特性，na既然能被ysl家族转运蛋白运输到胞内，那么必然 存在转运蛋白能将na转运到胞外或者存在na分泌的机制。因此，本领域亟待对 na的转运以及由此带来的植物性状变化进行更为深入的研究，以期应用于植物改 良。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供新型烟草胺外排基因的克隆及其应用。
6.在本发明的第一方面，提供一种烟草胺外排蛋白或其调节分子的用途，用于(i) 转运烟草胺，或(ii)调节植物地上部和地下部的cu和/或fe的分布，或(iii)提高单 细胞生物制备烟草胺的效率，简化单细胞生物制备烟草胺流程；其中，所述的烟草 胺外排蛋白包括：naet1或naet2。
7.在一个优选例中，所述的调节分子为上调分子，所述烟草胺外排蛋白或其上调 分子的用途包括选自：将细胞内的烟草胺转运到胞外；较佳地，所述烟草胺外排蛋 白通过将烟草胺转运到囊泡中，介导控制烟草胺向胞外转运；提高植物地上部的 cu和/或fe的量、降低地下部的cu和/或fe的量；较佳地，所述烟草胺外排蛋白 通过参与cu在木质部中的运输
和fe在韧皮部中的运输，调控cu和/或fe的分布。
8.在另一优选例中，所述的“cu在木质部中的运输和fe在韧皮部中的运输”为 长距离运输(长途转运)。
9.在另一优选例中，所述的烟草胺外排蛋白包括其同源物。
10.在另一优选例中，所述的上调分子包括：过表达所述烟草胺外排蛋白的表达盒 或表达构建物(包括表达载体)；或，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’utr上的上游开 放阅读框(upstream open reading frame；uorf)，提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率 的表达盒或表达构建物；或，与所述烟草胺外排蛋白相互作用、从而提高其表达或 活性的上调分子。
11.在另一优选例中，所述的调节分子为下调分子，其用途包括选自：抑制烟草胺 由细胞内向胞外的转运；较佳地，减少烟草胺向囊泡的转运，从而减少烟草胺向胞 外转运；降低植物地上部的cu和/或fe的量、提高地下部的cu和/或fe的量。
12.在另一优选例中，所述下调分子包括：敲除或沉默烟草胺外排蛋白的编码基 因的试剂，抑制烟草胺外排蛋白活性的试剂；较佳地，所述下调分子包括：针对所 述烟草胺外排蛋白的编码基因的基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所 述试剂将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变；或，特异性干扰烟草胺外排蛋白的 编码基因表达的干扰分子。
13.在另一优选例中，所述的下调分子为基因编辑试剂，其将naet1或将naet2 进行包括(但不仅限于)选自下组的突变：naet1第27位核苷酸处，其后插入碱基 使蛋白翻译移码；在naet2第21位核苷酸处，其后插入了碱基使蛋白翻译移码。
14.在另一优选例中，(i)中，所述转运烟草胺包括：在生产烟草胺的细胞中，促进 烟草胺由胞内向外分泌；较佳地，所述促进烟草胺由胞内向外分泌能够提高单细胞 生物制备烟草胺的效率，简化单细胞生物制备烟草胺流程。
15.在本发明的另一方面，提供一种调控烟草胺转运或植物中cu和/或fe分布的 方法，包括：在植物中调控烟草胺外排蛋白的表达或活性；其中，所述的烟草胺外 排蛋白包括：naet1或naet2。
16.在一个优选例中，所述的调控为将细胞内的烟草胺转运到胞外或提高植物地上 部的cu和/或fe的量、降低地下部的cu和/或fe的量；所述方法包括：在植物中 上调烟草胺外排蛋白的表达或活性。
17.在另一优选例中，所述的调控为抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运或降低植物 地上部的cu和/或fe的量、提高地下部的cu和/或fe的量；所述方法包括：在植 物中下调烟草胺外排蛋白的表达或活性。
18.在另一优选例中，所述在植物中上调烟草胺外排蛋白的表达或活性包括：在植 物中过表达烟草胺外排蛋白；或，以与烟草胺外排蛋白相互作用的上调分子进行调 控，从而提高烟草胺外排蛋白的表达或活性。
19.在另一优选例中，所述在植物中下调烟草胺外排蛋白的表达或活性包括：在植 物中敲除或沉默烟草胺外排蛋白的编码基因，或抑制烟草胺外排蛋白的活性；较佳 地包括：以crispr系统进行基因编辑从而敲除烟草胺外排蛋白的编码基因；以同 源重组的方法敲除烟草胺外排蛋白的编码基因；以特异性干扰烟草胺外排蛋白编码 基因表达的干扰分子来沉默；或将烟草胺外排蛋白进行功能丧失性突变。
20.在本发明的另一方面，提供一种生产烟草胺的方法，包括：在生产烟草胺的细 胞
中，引入烟草胺外排蛋白；其中，所述的烟草胺外排蛋白包括：naet1或naet2； 较佳地，所述生产烟草胺的细胞中包括外源的烟草胺合成酶；较佳地，所述烟草胺 外排蛋白促进烟草胺由胞内向外分泌。
21.在另一优选例中，所述的细胞包括真核细胞或原核细胞；较佳地，所述真核细 胞包括：酵母细胞、植物细胞、真菌细胞、昆虫细胞、霉菌细胞、哺乳动物细胞； 更佳地，所述的酵母细胞包括：酿酒酵母细胞或毕赤酵母细胞；更佳地，所述的植 物细胞包括：人参细胞；较佳地，所述的原核细胞包括：大肠杆菌、枯草杆菌细胞。
22.在另一优选例中，所述植物为表达烟草胺外排蛋白或其同源物的植物，或所述 植物为单子叶植物或多子叶植物；较佳地，所述的植物为或所述烟草胺外排蛋白来 自：十字花科植物，禾谷类作物，豆科植物，茄科植物。
23.在另一优选例中，所述地上部包括：花，果荚，籽粒，叶片，茎，种子；较佳 地，包括花和种子。
24.在另一优选例中，所述的地下部包括：根。
25.在另一优选例中，所述的naet1的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有seqid no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:2所示的氨基酸序列经过一 个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的，具有(i)多肽功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:2 所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述调 控性状功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v) 在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序 列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
26.在另一优选例中，所述的naet2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i’)具有seqid no:4所示氨基酸序列的多肽；(ii’)将如seq id no:4所示的氨基酸序列经过 一个或几个(如1-20个，1-10个，1-5个，1-3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的，具有(i’)多肽功能的、由(i’)衍生的多肽；(iii’)氨基酸序列与seq id no: 4所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％、≥98％或≥99％)，具有所述 调控性状功能的多肽；(iv’)seq id no:4所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v’) 在seq id no:4所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序 列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
27.在本发明的另一方面，提供烟草胺外排蛋白或其编码基因的用途，用作鉴定植 物的地上部和地下部的cu和/或fe的分布的分子标记物；其中，所述的烟草胺外 排蛋白包括：naet1或naet2。
28.在一个优选例中，通过特异性检测烟草胺外排蛋白或其编码基因的抗体、引物 或探针进行所述的鉴定；较佳地，所述引物包括针对naet1的：seq id no:5和 seq id no:6；或所述引物包括针对naet2的：seq id no:7和seq id no:8。
29.在本发明的另一方面，提供一种定向选择或鉴定植物的地上部和地下部的cu 和/或fe的分布改变的植物的方法，所述方法包括：鉴定测试植物体内烟草胺外排 蛋白的表达或活性，若该测试植物中烟草胺外排蛋白的表达或活性高于该类植物 (对照植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均值，则其为地上部的cu和/或fe 的量高、地下部的cu和/或fe的量低的植物；或，若该测试植物中烟草胺外排蛋 白的表达或活性低于该类植物(对照
植物)中烟草胺外排蛋白的表达或活性的平均 值，则其为地上部的cu和/或fe的量低、地下部的cu和/或fe的量高的植物；其 中，所述的烟草胺外排蛋白包括：naet1或naet2。
30.在另一优选例中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活 性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、 60％、80％、90％或更高。
31.在另一优选例中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活 性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、 60％、80％、90％或更低。
32.在另一优选例中，所述量高是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义 的高，如高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
33.在另一优选例中，所述量低是指与同类或同种植物的量相比，有统计学意义 的低，如低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
34.在本发明的另一方面，提供一种筛选调节烟草胺转运或调节植物地上部和地下 部的cu和/或fe的分布的物质(潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表 达烟草胺外排蛋白的体系中；(2)检测所述体系，观测其中烟草胺外排蛋白的表达 或活性，若其表达或活性提高(显著提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、 90％或更高)，则表明该候选物质为可用于将细胞内的烟草胺转运到胞外或提高植 物地上部的cu和/或fe的量、降低地下部的cu和/或fe的量的物质；若其表达或 活性降低(显著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，则表明 该候选物质为可用于抑制烟草胺由细胞内向胞外的转运或降低植物地上部的cu和 /或fe的量、提高地下部的cu和/或fe的量的物质；其中，所述烟草胺外排蛋白 包括：naet1或naet2。
35.在一个优选例中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而 明确分辨测试组中所述烟草胺外排蛋白表达或活性与对照组的差异。
36.在另一优选例中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对所述烟草胺外排蛋白 或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、小分子化合 物基因编辑构建物等。
37.在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的烟 草胺外排蛋白的上调分子，所述上调分子包括选自：过表达所述烟草胺外排蛋白的 表达盒或表达构建物(包括表达载体)；或，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’utr上的 上游开放阅读框(upstream open reading frame；uorf)，提高所述烟草胺外排蛋白翻 译效率的表达盒或表达构建物；或，与所述烟草胺外排蛋白相互作用、从而提高其 表达或活性的上调分子。
38.在一个优选例中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。
39.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易 见的。
附图说明
40.图1、用实时定量pcr方法和gus组织化学染色方法研究naet1(a，c)和 naet2(b，d)在各个组织部位的表达模式。naet1和naet2在幼苗的叶子和根(a， b，f，g)，成苗的叶子(c，h)，成苗的茎(d，i)成苗的花和果荚(e，j)均有表达。图 cd和图di是茎的横切。
41.图2、naet1和naet2的亚细胞定位。图a为用pa7质粒将gfp分别连在 naet1和naet2的n端和c端，观察其在叶片原生质体中的亚细胞定位。图b 为用phms-naet1-gfp和phms-naet2-gfp转化naet1naet2得到的阳性苗观察 亚细胞定位，同时用bfa处理，观察其定位情况。图c和图d是将 1300-naet1-gfp和1300-naet2-gfp分别和高尔基标志物cd3-967，反式高尔基 标志物vhaα1-mcherry，pho1-mcherry共同转化烟草表皮细胞，观察共定位。
42.图3、naet1和naet2在酵母中和烟草胺合成酶共表达后，可以将na转运 到细胞外。a：pyes2-naet1-gfp转入野生型酵母by4741后，观察naet1在酵 母中亚细胞定位；b：pyes2-naet2-gfp转入野生型酵母by4741后，观察naet2 在酵母中亚细胞定位；c：naet1，naet2与空载在酵母中和烟草胺合成酶基因 ahnas3分别共表达和单转后，培养od＝1时，离心收集沉淀的菌体，检测na的 含量。
43.图4、利用crispr-cas9技术构建naet1和naet2的突变体。a：naet1和 naet2单突变体和双突变体的突变类型。b：长日照四周正常土壤生长的naet1 和naet2单突变体和双突变体的叶片表型。
44.图5、a：长日照水培条件下7周，突变体与野生型中木质部汁液中na的含 量。b：长日照水培条件下7周，突变体与野生型中根部，老叶，新叶，花和种子 中na的含量。
45.图6、npf双突变体材料与野生型相比，cu和fe的稳态发生变化。双突变体 地上部cu积累量降低，根部积累升高。幼叶等幼嫩组织中的fe含量降低。a：长 日照水培条件下7周突变体与野生型中cu在各个组织中含量的变化；b：长日照 水培条件下7周突变体与野生型中fe在各个组织中含量的变化；c：长日照水培 条件下7周突变体与野生型中cu在木质部流中含量的变化；d：长日照水培条件 下7周突变体与野生型中fe在木质部流中含量的变化；
具体实施方式
46.本发明人经过深入的研究，克隆获得了一类新型的烟草胺(na)外排基因，包括 naet1和naet2，编码naet1和naet2蛋白。本发明首次揭示，naet1和naet2 蛋白能够定位于细胞内特定的位置，藉由囊泡进行烟草胺的转运，调控cu和/或fe 利用和/或增加cu和/或fe在植物不同部位的积累。
47.术语
48.如本文所用，所述的“长距离运输”或“长途转运”是指将cu和/或fe由地 下部(根部)转运至地上部的运输；较佳地，该cu藉由木质部进行运输，fe藉由韧 皮部进行运输。所述的“长距离运输”表明，本发明的蛋白并非仅能在细胞内或相 邻细胞间实现目标元素(cu和/或fe)的转运，而是能够将目标元素从地下部向地上 部转运。
49.如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织， 当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面 以上的部分。
50.如本文所用，所述的“地下部”也称为“地下部分”是指植物植株的部分组织， 当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面 以下的部分。
51.如本文所用，所述的“植物”包括表达naet1或naet2的植物。根据本领域 的知识，存在naet1或naet2的植物，其内在存在如本发明所主张的作用机制， 可以实现如本发明所
主张的技术效果。所述的植物可以是单子叶植物或双子叶植物。 例如，所述的“植物”可以是选自以下的植物：禾本科(gramineae)、十字花科 (brassicaceae)、茄科(solanaceae)、豆科(leguminosae)、葫芦科(cucurbitaceae)、菊 科(asteraceae)、杨柳科(salicaceae)、桑科(moraceae)、桃金娘科(myrtaceae)、石松科 (lycopodiaceae)、(selaginellaceae)、银杏科(ginkgoaceae)、松科(pinaceae)、苏铁科 (cycadaceae)、天南星科(araceae)、毛茛科(ranunculaceae)、悬铃木科(platanaceae)、 榆科(ulmaceae)、胡桃科(juglandaceae)、桦科(betulaceae)、猕猴桃科(actinidiaceae)、 锦葵科(malvaceae)、梧桐科(sterculiaceae)、椴树科(tiliaceae)、柽柳科(tamaricaceae)、 蔷薇科(rosaceae)、景天科(crassulaceae)、苏木科(caesalpinaceae)、蝶形花科 (fabaceae)、石榴科(punicaceae)、珙桐科(nyssaceae)、山茱萸科(cornaceae)、八角枫 科(alangiaceae)、卫矛科(celastraceae)、冬青科(aquifoliaceae)、黄杨科(buxaceae)、 大戟科(euphorbiaceae)、小盘木科(pandaceae)、鼠李科(rhamnaceae)、葡萄科 (vitaceae)、漆树科(anacardiaceae)，橄榄科(burseraceae)、桔梗科(campanulaceae)、 红树科(rhizophoraceae)、檀香科(santalaceae)、木犀科(oleaceae)、玄参科 (scrophulariaceae)、露兜树科(pandanaceae)、黑三棱科(sparganiaceae)、水蕹科 (aponogetonaceae)、眼子菜科(potamogetonaceae)、茨藻科(najadaceae、冰沼草科 (scheuchzeriaceae)、泽泻科(alismataceae)、花蔺科(butomaceae)、水鳖科 (hydrocharitaceae)、霉草科(triuridaceae)、莎草科(cyperaceae)、棕榈科(槟榔 科)(palmae(arecaceae))、天南星科(araceae)、浮萍科(lemnaceae)、须叶藤科 (flagellariaceae)、帚灯草科(restionaceae)、刺鳞草科(centrolepidaceae)、黄眼草科 (xyridaceae)、谷精草科(eriocaulaceae)、凤梨科(bromeliaceae)、鸭跖草科 (commelinaceae)、雨久花科(pontederiaceae)、田葱科(philydraceae)、灯心草科 (juncaceae)、百部科(stemonaceae)、百合科(liliaceae)、石蒜科(amaryllidaceae)、蒟 蒻薯科(箭根薯科)(taccaceae)、薯蓣科(dioscoreaceae)、鸢尾科(iridaceae)、芭蕉科 (musaceae)、姜科(zingiberaceae)、美人蕉科(annaceae)、竹芋科(marantaceae)、水玉 簪科(burmanniaceae)、藜科(chenopodiaceae)或兰科(orchidaceae)的植物。可通过鉴 定其中naet1或naet2或其同源物的存在情况，来确定适用的植物。
52.如本文所用，术语“提高”、“改良”或“增强”是相互可以交换的并且在应 用含义上应当意指与本文中定义的对照植物相比较，至少2％、3％、4％、5％、6％、 7％、8％、9％或10％、优选的至少15％或20％、更优选25％、30％更高的调节。
53.关于“对照植物”，选择合适的对照植物是实验设计的例行部分，可以包括对 应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种 或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失 转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括 种子和种子部分。
54.na外排蛋白
55.在本发明中，除非特别说明，所述na外排蛋白包括了naet1和naet2蛋 白或它们的同源物(同源蛋白)。所述naet1为具有seq id no:2所示氨基酸序列 的多肽，所述naet2为具有seq id no:4所示氨基酸序列的多肽。，该两个基因 的序列登录号也可分别见at5g14940和at3g01350。na外排基因naet1和naet2 是同源基因，氨基酸相似性为74.1％。
本发明还包括具有与na外排蛋白相同功能 的序列变异形式。
56.所述的变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个， 更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/ 或取代，以及在c末端和/或n末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较 佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。任何与所述的na外排蛋白同源性 高(比如与seq id no:2或seq id no:4所示的多肽序列的同源性为70％或更高； 优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％ 或99％)的、且具有所述na外排蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。
57.来源于拟南芥以外其它物种的与seq id no:2或seq id no:4所示序列的多 肽序列的同源性较高、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽也 包括在本发明中
58.本发明中，所述的“na外排蛋白”也包括它们的同源物。应理解，虽然本发 明中优选研究了获自特定物种的na外排蛋白，但是获自其它物种、特别是禾本科 植物的与所述na外排蛋白高度同源(如具有70％以上，更特别80％，85％、90％、 95％、甚至98％以上序列相同性)的其它多肽或基因也在本发明考虑的范围之内。
59.本发明还提供了分离的蛋白，其是na外排蛋白的片段或在两端添加其它蛋白 或标签等形成的。
60.本发明还涉及编码本发明的na外排蛋白或其序列变异形式的多核苷酸序列。 所述的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna 或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码 链。编码成熟多肽的编码区序列可以与seq id no:1或seq id no:3所示的编码 区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指 编码具有seq id no:2或seq id no:4序列的多肽，但与seq id no:1或seq idno:3所示的基因组序列或seq id no:2或seq id no:4所示的编码区序列有差别 的核酸序列。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体(变体)，其编码与本发明有相同 的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。
61.本发明也涉及包含所述的多核苷酸的载体，以及用所述的载体或多肽编码核酸 经基因工程产生的宿主细胞。
62.本发明中，编码本发明的多肽的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语
ꢀ“
重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、 哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和 载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因 和翻译控制元件。较佳地，所述表达载体还可选择性地加入抗性元件、筛选(选择) 元件或报告基因元件，如bar、gus。
63.所述的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将 会使转录得到增强。增强子是dna的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基 对，作用于启动子以增强基因的转录。
64.用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。转化植 物可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如喷洒法、叶盘法、水稻幼胚转化法 等。
65.植物改造
66.本发明通过系统研究，首次克隆获得na外排基因naet1和naet2的全长序 列，并鉴
定了它们的生物学功能。
67.在具体实施例中，本发明人利用荧光定量pcr和gus组织化学染色方法研究 naet1和naet2在中的表达，发现两个基因在根部与地上部均有表达，在根系的 表达量高于地上部。它们主要表达在根部木质部薄壁细胞和韧皮部，以及地上部的 维管组织，叶肉细胞和花粉中。
68.在具体实施例中，利用瞬时转化和稳定转化体系研究了naet1和naet2的亚 细胞定位，发现其定位在高尔基，反式高尔基和未知的小囊泡中，表明其可能参与 物质的运输或分泌。
69.在具体实施例中，本发明人分析了naet1和naet2的组织表达，发现其在根 部与地上部均有表达，在根系的表达量高于地上部。它们主要表达在根部木质部薄 壁细胞和韧皮部，以及地上部的维管组织，叶肉细胞和花粉中。
70.在具体实施例中，本发明人利用酵母异源表达体系，发现naet1和naet2 能够将酵母体内异源合成的na分泌到胞外。通过时空表达模式的分析，发现 naet1和naet2主要在的根，茎和页维管束的木质部薄壁细胞，韧皮部以及叶肉 细胞中表达。通过对naet1和naet2的突变体的分析发现，与野生型相比，naet1 和naet2的双突变体在正常情况下，地上部的cu减少而地下部的cu增多，种子 中cu和fe减少。
71.在具体实施例中发现，通过hplc方法检测na外排基因naet1和naet2敲 除突变体中na的含量，发现双突变体中木质部流中na显著降低，地下部na含 量升高，突变体中na从地下部往地上部的转运受阻。突变体中花和果荚组织中 na含量降低，表明突变体中na的韧皮部运输受阻。
72.在具体实施例中发现，通过icp-ms方法检测双突变体植株离子组变化，发现 双突变体各组织的cu和fe的稳态发生变化。因此naet1和naet2可被用于基因 工程改造用来调控cu和fe的长距离运输。
73.因此，本发明揭示了：细胞中na在细胞质中合成之后被naet1和naet2 转运到囊泡中进而被分泌到细胞外，螯合二价阳离子并协助它们的运输。参与cu 在木质部中的长距离运输和fe在韧皮部中的长距离运输。
74.基于本发明人的新发现，提供了一种na外排蛋白或其调节分子的用途，用于： (i)转运na，或(ii)调节植物地上部和地下部的cu和/或fe的分布。
75.同时，本发明也提供了一种调控na转运或植物中cu和/或fe分布的方法， 包括：在植物中调控na外排蛋白的表达或活性；其中，所述的na外排蛋白包括 其同源物。
76.应理解，在得知了所述na外排蛋白在na转运以及植物元素调控方面的作用 后，可以根据实际所需，采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的na外排蛋 白的表达或活性，这些方法均被包含在本发明中。
77.可以利用na外排蛋白的表达或活性的上调剂来上调na外排蛋白的活性。所 述的na外排蛋白的表达或活性的上调剂包括了促进剂、激动剂、激活剂。所述的
ꢀ“
上调”、“促进”包括了蛋白活性的“上调”、“促进”或蛋白表达的“上调”、
ꢀ“
促进”。任何可提高na外排蛋白蛋白的活性、提高na外排蛋白基因或蛋白的 稳定性、上调na外排蛋白基因的表达、增加na外排蛋白蛋白的有效作用时间的 物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调na外排蛋白或其编码的蛋白有用 的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分
子可以是核酸 水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。
78.作为一种优选的实施方式，提供一种上调植物中na外排蛋白的表达的方法， 所述的方法包括：将na外排蛋白或其编码的蛋白的表达构建物或载体转入植物 中。
79.优选地，提供了一种制备转基因植物的方法，包括：
80.(1)将外源的本发明的多肽的编码核酸转入植物器官或组织，获得转化入所述多 肽的编码核酸的植物组织或器官；和
81.(2)将步骤(1)获得的转入了外源的本发明的多肽的编码核酸的植物组织或器官 再生成植物植株。
82.作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：
83.(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有本发明的na外排蛋白 的编码核酸；
84.(s2)将植物组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使所述多肽的编码核 酸转入并且整合到植物细胞的染色体上；
85.(s3)选择出转入所述na外排蛋白的编码核酸的植物组织或器官；以及
86.(s4)将步骤(s3)中的植物组织或器官再生成植物。
87.本发明还包括利用前述任一种方法获得的植物，所述的植物包括：转入了所述 多肽的编码核酸的转基因植物。
88.作为一种尤其优选的方式，敲除所述烟草胺外排蛋白的5’utr上的上游开放阅 读框(upstream open reading frame；uorf)，提高所述烟草胺外排蛋白翻译效率的表 达盒或表达构建物。uorf广泛存在于真核生物mrna中，其为一种翻译调控元 件。通常，uorf的翻译优先于morf(主要开放阅读框)，导致morf翻译受阻。 本发明中，靶向敲除所述烟草胺外排蛋白的5’utr上的uorf，从而可有效提高所 述烟草胺外排蛋白翻译效率，提高其表达。
89.本发明中，所述的na外排蛋白或其编码基因的下调剂是指任何可降低na外 排蛋白的活性、降低na外排蛋白或其编码基因的稳定性、下调na外排蛋白的表 达、减少na外排蛋白有效作用时间、抑制na外排基因的转录和翻译的物质、或 降低蛋白的磷酸化/激活水平，这些物质均可用于本发明，作为对于下调na外排蛋 白有用的物质。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以 是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的。例如，所述的下调剂是： 特异性干扰na外排蛋白或其它信号通路基因表达的干扰rna分子或反义核苷酸； 或是特异性编辑na外排基因的基因编辑试剂，等等。
90.作为本发明的一种优选方式，提供一种下调植物中na外排蛋白的方法，包括 对na外排蛋白进行靶向性地突变、基因编辑或基因重组，从而实现下调。作为一 种更为具体的实施例方式，藉由上述任一的方法，使na外排蛋白转变为其突变体， 从而使其不再发挥作用。作为一种更为具体的实施例方式，采用crispr/cas9系统 进行基因编辑。合适的sgrna靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进 行基因编辑前，可以设计并找到合适的靶位点。在设计特异性靶位点后，还需要进 行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。本发明的实施例中提供 了优选的基因编辑试剂。
91.作为其它可选的方式，所述下调植物中na外排蛋白的表达的方法可包括：(1) 将干扰na外排基因表达的干扰分子转入植物细胞、组织、器官或种子，获得转化 入所述干扰分子的植物细胞、组织、器官或种子；(2)将步骤(1)获得的转入了所述干 扰分子的植物细
是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、 聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分 子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选 择适用的筛选方法。
103.检测蛋白与蛋白之间相互作用以及相互作用的强弱可采用多种本领域技术人 员熟知的技术，比如gst沉降技术(gst-pull down)、双分子荧光互补实验、酵母双 杂交系统或免疫共沉淀技术等。
104.经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于na外排蛋白或其编码基因， 对植物细胞的na转运或cu和/或f分布有调控作用的潜在物质。
105.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通 常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社， 2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。在不背离本发明精神和本质 的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
106.序列信息
107.naet1的核苷酸序列(seq id no:1)：
108.atggctggaggagagaaaagaagaggacttagtaaatcttgtgctcttctcatagtgattgct gggatagagagatatgcattcaaaggagttgcatcaaacttagtgacatatctaactgatgt agtgaagatgagcaattcaagagcagccacgactgtgaacacttggagtggcttcactttca tgttgcctctcttctctgctccttttgccgattcttattgggacagattcttcaccatccttgct tcttcttctctctactttgtgggtctagtgggattgacatttacggcatttgctgggtcacgtt cgactacaaaaacaatctctctttacttcctctacacttcactttccctcgtcgctctaggcct tggcgtcttaaacccatctctacaagcctttggtgctgaccagctcgactacgaccttgacca tgacaatgaccacgagccatcctcagagaacaaagaagtcaaatcgaaccgcaagactcagt ttttccaatggtggtattttggtgtctgcgccggtagtcttctaggagtcaccgtcatggctta catccaagacacgtttggatgggttatcggttttgcaatcccaaccgcttcgatgttgttgttg atcttcttgttcttgtgtggctgcggggtctatgtttatgctgatccagacctcaaagctaaac catttcaaaggatattagagattatcaaagaaagagtgtgtggaagaaataagatcactctt gttaacgaccacgatttaaatgccatggaactagagctgcaagatcagaagcctctatgtaa ctgtagcaacactgaagctaatactactaccaagagcttacctgatgatcataaaagctgca aaaccggtttttcggggcttgaaaccgtcaagctattgcttcgacttttacctatatggacga tgcttcttatgtttgcagttatattccaacaacccgcgacctttttcacaaagcaaggtatgac tatgaagagaaacatcggaccaaacttcaagatcccaccagcaacactacaaagcactatca ctttatccataatccttcttatgcccttctacgacaaaatcttgataccgatcgccaaaaaact aacgaaaaacgaaaagggtatttctgtgaaggaaagaatggggattgggatgttcctgtcca tcatcgccattgttattgccgcgttagtcgaaagaaaaagactaaagataagcaaaatgatg aagactacacctaatttggaccccgtaagcatattgtggctcctacctcagtacattctattg ggaatctcggacattttcacagttgttggaatgcaagagttcttctacagcgaggttcctgtt agcatgagaacaatgggatttgctttgtacacaagcgttttcggtgtggggagttttgtgagt gctgcgttgatttcgataatagagacttacacgagctcaagaggtggaaaacataactggttt gcagatgatatgtcggaagctagacttgataactattattggcttttggctttcacaagtgct attagcttcttgatgtatattgttatttgcaagcatttcaagagtagaagtgatgatgatgat caatgtgatacaaattgttaa
109.naet1的氨基酸序列(seq id no:2；552aa)
110.maggekrrglskscalliviagieryafkgvasnlvtyltdvvkmsnsraattvntwsgftfml plfsapfadsywdrfftilassslyfvglvgltftafagsrsttktislyflytslslvalglgvln pslqafgadqldydldhdndhepssenkevksnrktqffqwwyfgvcagsllgvtvmayiqdt fgwvigfaiptasmllliflflcgcgvyvyadpdlkakpfqrileiikervcgrnkitlvndhdlna melelqdqkplcncsnteantttkslpddhkscktgfsgletvklllrllpiwtmllmfavifqq patfftkqgmtmkrnigpnfkippatlqstitlsiillmpfydkilipiakkltknekgisvkermgig mflsiiaiviaalverkrlkiskmmkttpnldpvsilwllpqyillgisdiftvvgmqeffysevpvs mrtmgfalytsvfgvgsfvsaalisiietytssrggkhnwfaddmsearldnyywllaftsaisf lmyivickhfksrsddddqcdtnc
111.naet2的核苷酸序列(seq id no:3)
112.atggatttagaacagaagacaagaggacttagcaagtcatgtgcccttctcatagtgattgc gggaatggagagatatgcattcaaaggagttgcatcaaacttagtgacatatctaacagatg tagtgaagatgagtaattcaagagcagccaaaactgttaacacttgggctggtttcacttcta tgttgcctctcttctctgctcctttggctgatacttattgggacagattcttcaccatccttgct tcttcttccgtctactttgtgggactagtgggattgacatggacggcatttgctgggtcacgtt cagctactaagactatctcttcttactttctctactcttcactatgtcttgtctcaatcggttta ggcgtcttaaacccttctcttcaagcctttggtgcagaccaactcgaccacgacctcgataag aatttcgatctttcctcgggtgatcaaaaggacgcgaaagctacccgaaagactcagtttttc caattgtggtactttggcgtctgcaccggcagccttatgggtgtcacagtcatggcttatatt caagacacttttggttgggttctcggtttcgccattcctggtatcgtgatattcctgtcgattt tggtgttcatgtcgggttgtggaatttatgtttatgctccgggcgcccgtctgaagaagaaaa caactactacaccttttgagaagattcttaaattcattaaagggagagtagtgaagcagaga agcatatatacacttgcagatgagaaagatttggatgctatggagcttgagctagaggagag gcctctctgtaaatgtgagaccgaagacattgagactccttcaacaacctccaaaggattgga agatgacgagagctcgaaaacggttttctctggaattgataatgttaagttagtgattcgcct tttccccatatggatgatgcttctcatgttcgcggttatcttccagctaccagcaacctttttc accaaacaaggtgtgactatgaagagaaacattgggtccaacttcaaaatcccacctgcaac cctgcaaagcacgatcacattatcaatcatcctgcttatgccattatatgataagattttgat acctattaccaagagaatcaagaaaaacggtacaggtatctctgtgatggagagaatgggag tcggaatgtttctatccatcattgccattgttattgcggcaatagtcgaaaggaaaagactag ccataagccaaaagatgaagactttacctgattatgatccagaaaccgtcccactgagcatct tctggctgctgcctcagtacatcctcttgggaatctcagatatattcacagtcgttgggatgc aagagtttttctacagtgaggttcctgtaagaatgagaacaatgggatttgctctctacacaa gtgtttttggtgttggaagctttgtgagcgccgcactgatctcaattgtcgaggcttactcga gctcaacaggtgaccgacaaaactggtttgcagatgatatgtcggaagctcggcttgacaaa tactactggcttcttgctcttacaagtacaataagctttgtagtctacatatttctatgcaagt ttttcaagagtagcagtgatcaaggcgatgaaaaagaagaagcccctaaatga
113.naet2的氨基酸序列(seq id no:4；563aa)
114.mdleqktrglskscalliviagmeryafkgvasnlvtyltdvvkmsnsraaktvntwagftsm lplfsapladtywdrfftilasssvyfvglvgltwtafagsrsatktissyflysslclvsiglgvl npslqafgadqldhdldknfdlssgdqkdakatrktqffqlwyfgvctgslmgvtvmayiqdt fgwvlgfaipgiviflsilvfmsgcgiyvyapgarlkkkttttpfekilkfikgrvvkqrsiytlade kdldameleleerplckcetedietpsttskgleddessktvfsgidnvklvirlfpiwmmllmfa vifqlpatfftkqgvtmkrnigsnfkippatlqstitlsiillmplydkilipitkrikkngtgisvmer mgvgmflsiiaiviaaiverkrlaisqkmktlpdydpetvplsif
wllpqyillgisdiftvvgmqef fysevpvrmrtmgfalytsvfgvgsfvsaalisiveayssstgdrqnwfaddmsearldkyywl laltstisfvvyiflckffksssdqgdekeeapk
115.实施例1、naet1和naet2基因在中的表达特征
116.1、总rna的提取
117.将种子经70％乙醇消毒1min、10％次氯酸钠溶液消毒5min后，用无菌水洗涤 4-5次，然后用1/2ms培养基培养至2周左右，选择大小一致的幼苗转移至培养 桶中，用hogland营养液培养5周后，取不同组织的样品于液氮中保存，利用植物 总rna提取试剂盒(北京百泰克公司)提取rna。
118.2、总cdna的合成
119.使用反转录试剂盒(南京诺唯赞公司)进行总cdna的合成。
120.3、荧光定量pcr
121.反转录合成总cdna第一链后，以其为模板进行荧光定量pcr扩增，并以泛 素蛋白基因(ubiquitin5)为内参基因进行表达量校正。基因ubiquitin5，naet1 和naet2基因的定量pcr程序如下：95℃预变性5min，94℃变性30s，55℃复性 30s，72℃延伸30s，40个循环后，72℃7min。基因名称和引物设计如表1。
122.表1
[0123][0124][0125]
4、gus染色分析naet1和naet2的组织特异性表达
[0126]
(1)pronaet1-gus和pronaet2-gus植物表达载体的构建和转化
[0127]
以野生型col-0的基因组dna为模板，通过pcr扩增naet1和naet2，包 括基因区加上游启动子2kb区域(naet1
pro
或naet2
pro
)的基因组序列pcr产物经 电泳回收后克隆到植物表达载体pcambia1300(简称p1300或1300)-gus载体上。
[0128]
阳性克隆进行测序验证正确后保存，并转化农杆菌，通过农杆菌浸花转化法转 化野生型col-0植株，利用潮霉素筛选阳性苗。
[0129]
(2)转基因阳性苗不同组织样品gus活性染色
[0130]
gus染液配方如表2。
[0131]
表2
[0132][0133]
gus染色步骤：
[0134]
向50ml塑料管中加入30ml的配置好的gus染液(x-gluc现用现加)，将培养 的幼苗放入染液中。在真空泵中抽真空10min，重复三次，最后幼苗应完全沉入 培养皿底部。将培养皿放置在37℃培养箱避光静置5-8h后，使用75％乙醇对幼苗 进行脱色处理，在体视显微镜下进行观察(图1c和d)。
[0135]
用实时定量pcr方法对naet1和naet2表达分析。结果发现，naet1和 naet2在各个组织中均有表达，根部表达量相对较高(图1a和b)。
[0136]
gus染色结果显示，naet1和naet2在根，茎和叶的维管束，叶肉细胞，花 粉和果荚中均有表达。
[0137]
实施例2、naet1和naet2亚细胞定位
[0138]
naet1和naet2在原生质体中瞬时表达步骤如下：
[0139]
1、根据naet1和naet2的cdna序列，以cdna为模板利用高保真酶 kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增，同时设计相应的引物扩增gfp片段，用 overlappcr的方式分别将naet1，naet2在n端和c端和gfp片段融合。连接 成功pcr产物经电泳回收后克隆到瞬转载体pa7上，阳性克隆进行测序验证正确 后保存。
[0140]
35s:naet1-gfp：以35s启动子驱动naet1-gfp的表达；
[0141]
35s:gfp-naet1：以35s启动子驱动gfp-naet1的表达；
[0142]
35s:naet2-gfp：以35s启动子驱动naet2-gfp的表达；
[0143]
35s:gfp-naet2：以35s启动子驱动gfp-naet2的表达。
[0144]
2、将瞬时表达载体利用peg-ca
2
的方法转化到原生质体中，利用zeiss sp8 激光共聚焦显微镜进行观察(图2a)。
[0145]
3、根据naet1和naet2的基因序列，以基因组dna为模板利用高保真酶 kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增，序列长度包括启动子2kb和基因全长。 利用同源重组的方式构建到双元载体phms-gfp载体上，得到phms-naet1pro： naet1-gfp质粒和phms-naet2pro：naet2-gfp质粒。阳性克隆进行测序验证 正确后保存。
[0146]
4、将phms-naet1pro：naet1-gfp(对应图2中pnaet1:naet1-gfp组)和 phms-naet2pro：naet2-gfp(对应图2中pnaet2:naet2-gfp组)质粒通过农杆 菌介导的浸花法转化到双突变体naetnaet2(其中naet1和naet2均发生缺失，具 体建立方法见实施例4)中，抗生素筛选鉴定到的2周的阳性苗叶片利用zeiss sp8 激光共聚焦显微镜进行亚细胞定位的观察。用bfa(brefeldina)处理30min的叶片 同样用显微镜观察，观察naet1-gfp和naet2-gfp的定位改变(图2b)。
[0147]
5、本发明人利用用另一个载体p1300-gfp载体，以35s驱动建立质粒。将 1300-naet2-egfp质粒通过农杆菌介导的方法打入烟草表皮细胞中，同时与高尔 基标记物cd3-967，反式高尔基标记物vhaα1-mcherry(图2中对应 1300-naet2-egfp、1300-vhaα1-mcherry组)，pho1-mcherry(图2中对应 1300-naet2-egfp、1300-pho1-mcherry组)共同转化，用激光共聚焦显微镜观察 定位情况(图2c)。
[0148]
瞬时转化原生质体实验显示，naet1和naet2在细胞中呈现点状分布(图2a)。
[0149]
bfa实验处理稳定转化的叶表皮细胞内可以形成bfa小体，提示naet1和 naet2参与囊泡运输过程(图2b)。
[0150]
烟草共定位实验表明，naet1和naet2部分共定位于高尔基体，反面高尔基 体管网状结构(tgn)以及未知的小囊泡中(图2c-d)。
[0151]
实施例3、naet1和naet2在酵母中和烟草胺合成酶共表达后，可以将烟草 胺转运到细胞外
[0152]
(1)naet1和naet2酵母表达表达载体的构建
[0153]
根据naet1和naet2的cdna序列，分别设计去掉终止密码子的特异引物， 以cdna为模板利用高保真酶kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增，同时设计 相应的引物扩增gfp片段，用overlappcr的方式分别将naet1，naet2和gfp 片段融合。连接成功pcr产物经电泳回收后克隆到酵母表达载体pyes2上。阳性 克隆进行测序验证正确，从而获得pyes2-naet1-gfp和pyes2-naet2-gfp质粒。
[0154]
根据naet1和naet2的cdna序列，以col-0根部的cdna为模板利用高 保真酶kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增，将naet1和naet2的cds序列 连接到ppr3-n载体上，从而获得ppr3-n-naet1，ppr3-n-naet2质粒。
[0155]
根据烟草胺合成酶基因ahnas3(genbank登录号cae45015.1；物种来源：叶 芽鼠耳芥arabidopsis halleri)的cdna序列，以arabidopsis helleri根部的cdna 为模板利用高保真酶kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增，将ahnas3的cds 序列连接到pbt-ste(pbt3-ste)载体(购自上海唯地公司)上。阳性克隆进行测序验 证正确，从而获得pbt-ste-ahnas3质粒。
[0156]
(2)酵母转化
[0157]
将pyes2-naet1-gfp和pyes2-naet2-gfp质粒转化到野生型酵母by4741 中，用缺ura缺陷型培养基筛选。
[0158]
将ppr3-n-naet1，ppr3-n-naet2和ppr3-n空载分别与pbt-ste-ahnas3 质粒共转化到nmy51酵母中，用缺leu和trp缺陷型培养基筛选。
[0159]
(3)酵母亚细胞定位观察
[0160]
转化pyes2-naet1-gfp和pyes2-naet2-gfp质粒阳性的by4741酵母在 sd-ura( glucose)酵母培养基中过夜培养到od＝2～3，用sd-ura( galactose)酵母 培养基稀释到od＝0.2，摇到od＝1时用激光共聚焦显微镜观察亚细胞定位(图3a)。
[0161]
(4)酵母细胞中na含量检测
[0162]
将ppr3-n-naet1，ppr3-n-naet2和ppr3-n空载分别与pbt-ste-ahnas3 质粒共转化的nmy51酵母用sd-leutrp的酵母培养基摇到od＝1(100ml)，1500g， 离心15min，分别收集菌体和上清，菌体统一定容到500μl，上清统一低温浓缩到 1ml，之后80℃水浴，萃取
30min；13400g，4℃离心10min；用1ml规格注射器取 上清，注射器连接水系0.22μm滤膜，用力将上清液打过滤膜，滤液用1.5ml进口 离心管收集，立即进行质谱检测。(na含量采用lc-ltq orbitrap xl ms/msthermo fisher scientific进行检测)(图3b和图3c)。
[0163]
酵母中亚细胞定位观察发现，naet1和naet2在酵母中也呈现点状分布(图 3a)，与在植物细胞中定位一致，提示其参与到囊泡运输过程中。将酵母细胞内异 源表达nas合成酶之后，发现表达naet1和naet2的菌体内烟草胺(na)的含量 显著低于空载组(图3b)，而上清中na含量显著高于空载(图3c)。
[0164]
实施例4、naet1和naet2 crispr载体的构建与naet1和naet2突变 体的鉴定
[0165]
本实施例中，建立naet1和naet2纯合的单突变体和双突变体：
[0166]
naet1：突变在naet1第27位核苷酸处，其后插入了5个碱基导致蛋白翻译 移码。
[0167]
naet2：突变在naet1第21位核苷酸处，其后插入了1个碱基导致蛋白翻译 移码。
[0168]
naet1naet2：通过naet1和naet2杂交，f2代中分离出纯合。
[0169]
1、naet1和naet2 crispr载体的构建
[0170]
设计点突变体载体的引物：
[0171]
dt1-bsf：ggtctcgtgctggaggagagaaaagaaggtt(seq id no:11)
[0172]
dt1-f0：tgctggaggagagaaaagaaggttttagagctagaaagc(seq id no:12)
[0173]
dt2-r0：aaccttgtcttctgttctaacactcttagtcgactctac(seq id no:13)
[0174]
dt2-bsr：ttggtctcgaaaccttgtcttctgttctaac(seq id no:14)
[0175]
pcr扩增：以稀释100倍的pcbc-dt1t2为模板(来自中国农业大学陈其军实 验室)进行四引物pcr扩增。-bsf/-bsr为正常引物浓度；-f0/-r0稀释20倍。
[0176]
纯化回收pcr产物，建立如下酶切-连接体系如表3。
[0177]
表3
[0178][0179][0180]
取5ul转化大肠杆菌感受态。利用kan抗性培养板筛选。
[0181]
u626-idf u629-idr＝726bp菌落pcr鉴定采用如下引物：
[0182]
u626-idf：tgtcccaggtagagtaggc(seq id no:15)，
[0183]
629-idr：agccctcttctttcgcccaac(seq id no:16)。
[0184]
用u626-idf测序鉴定。将正确的载体转入农杆菌备用。
[0185]
2、naet1和naet2突变体的鉴定
[0186]
扩增包含naet1靶位点的片段，应用的引物如下：
[0187]
cri8-f：gtagtttgttttctaggaac(seq id no:17)，
[0188]
cri8-r：ctgtcccaaagacggcaa(seq id no:18)。
[0189]
扩增包含naet2靶位点的片段，应用的引物如下：
[0190]
cri9-f：ccactcacaaccaac(seq id no:19)，
[0191]
cri9-r：cttgcacaagttaaccc(seq id no:20)。
[0192]
提取叶片的总dna，以dna为模板，利用设计的扩增引物进行pcr验证突 变体的纯合性(图4a)。
[0193]
3、纯合突变体和野生型苗期生长表型拍照
[0194]
将naet1和naet2纯合的单突变体和双突变体和野生型在长日照正常土壤培 养四周，取地上部拍照，纯合突变体呈现株型的显著减小(图4b)。
[0195]
4、纯合突变体和野生型植株的组织中na的含量
[0196]
长日照水培条件下7周，检测突变体与野生型中木质部汁液中na的含量， 如图5a，纯合突变体在木质部汁液中na大大降低。
[0197]
长日照水培条件下7周，检测突变体与野生型中根部、老叶、新叶、花和种 子中na的含量，如图5b，与野生型相比，纯合突变体的na聚集于根中；叶组 织中则na含量接近；在花和种子中，纯合突变体的na含量大大低于野生型。因 此，naet1、naet2调控植物中na的分布。
[0198]
实施例5、naet1naet2突变体和野生型的na分布或转运情况分析
[0199]
对naet1naet2突变体和野生型中各个组织中na总量的测定，具体实施过程 如下：
[0200]
(1)选取突变体材料(naet1naet2)以及背景野生型col-0。利用1/2ms萌发2周。
[0201]
(2)将幼苗移至500ml的水培盒中，用hogland营养液培养5周，期间每3天 更换一次营养液。
[0202]
(3)收集突变体和野生型各个组织样品，包括根，老叶，新叶，花和果荚，液 氮速冻，存于超低温冰箱。
[0203]
(4)收集突变体和野生型植株木质部流。将突变体和野生型植株从薹基部往上 约1cm处剪断，将苗放在高湿度，22℃培养箱，收集植株吐出的木质部流。第一 滴丢弃，收集之后4h内吐出的木质部流，取等量体积的样品冻存。
[0204]
(5)液氮研磨组织鲜样，充分研磨。
[0205]
(6)称取0.2g研磨成的样品粉末至1.5ml进口离心管。
[0206]
(7)300ul超纯水(18.25ω)至离心管，反复震荡混匀。
[0207]
(8)离心管放入80℃水浴，萃取30min。13,400x g、4℃离心10min。
[0208]
(9)用l规格注射器取上清，注射器连接水系0.22μm滤膜，用力将上清液打过 滤膜，滤液用1.5ml进口离心管收集，立即进行质谱检测(na含量采用lc-ltqorbitrap xl ms/ms thermo fisher scientific进行检测)。
[0209]
结果表明，naet1naet2双突变体材料与野生型相比，根中富集更多的na，木 质部流中的na含量降低(图6a；b)，表明突变体中na从地下部往地上部的转运 受阻。突变体中老叶和新叶中的na含量并无变化(图6c；d)，但是花和果荚组织 中na含量降低，表明突变体中
na的韧皮部运输受阻。
[0210]
总的结果表明，突变体中质外体即胞内往外分泌的na减少，导致库组织花 和果荚中na降低，源组织根中na含量升高。
[0211]
实施例6、naet1naet2双突变体与野生型的金属转运分析
[0212]
对naet1naet2突变体和野生型中各个组织中cu和fe总量的测定，具体实施 过程如下：
[0213]
(1)选取突变体材料(naet1naet2)以及背景野生型col-0。利用1/2ms萌发2周。
[0214]
(2)将幼苗移至500ml的水培盒中，用hogland营养液培养5周，期间每3天 更换一次营养液。
[0215]
(3)收集突变体和野生型各个组织样品，包括根，茎，老叶，新叶，花，果荚， 用去离子水清洗5遍，称取2-5mg样品放入玻璃管中，与65℃烘箱烘3d。
[0216]
(4)收集突变体和野生型植株木质部流。将突变体和野生型植株从薹基部往上 约1cm处剪断，将苗放在高湿度，22℃培养箱，收集植株吐出的木质部流。第一 滴丢弃，收集之后4h内吐出的木质部流，取等量体积的样品进行后续消解。
[0217]
(5)向放各个组织玻璃管中添加1ml 65％hno3，在115℃石墨炉中消煮4h。
[0218]
(6)用去离子水将样品消煮液定容至10ml，充分混匀。
[0219]
(7)利用icp-ms测定各样品中cu和fe含量。
[0220]
结果表明，naet1naet2双突变体材料与野生型相比，根中富集更多的cu，地 上部各组织中的cu降低，包括木质部流(图6a；c)；而fe只在幼嫩的组织如幼叶， 茎，花，果荚组织中降低，老叶和木质部流中并未变化(图6b；d)。表明naet1 和naet2参与调控cu和fe的长距离运输过程，包括但不限于cu在木质部流中 运输和fe在韧皮部中的运输。
[0221]
同时，本发明人试验将naet的翻译效率提高来使得蛋白过表达，从而促进 提高植物地上部的cu和/或fe的量。具体地，考虑到uorf可抑制下游翻译，本 发明人敲除naet2的5’utr上的一uorf，使得naet2在它自身表达的位置翻 译效率提高，其蛋白表达量的提高提示种子中cu和fe离子含量提高的表型。
[0222]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域 技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利 要求书所限定的范围。