铁皮石斛多糖及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于天然产物有效成分的提取技术领域，特别涉及一种铁皮石斛多糖的制备方法，以及由该制备方法提取得到的铁皮石斛多糖，还涉及该铁皮石斛多糖在护肤化妆类产品中的应用。


背景技术：

2.铁皮石斛作为我国传统名贵药材之一，被称为“中华九大仙草之首”，为兰科植物铁皮石斛(dendrobium officinalekimura et migo)的干燥茎。在安徽、广西、云南、浙江等地均有分布。其性甘，味微寒，具有益胃生津，滋阴清热的功效；主要用于热病津伤，口干烦渴，胃阴不足，食少干呕、病后虚热不退，阴虚火旺，骨蒸劳热，目暗不明，筋骨痿软等证。临床上主要用于增强免疫力、改善胃肠道功能、治疗糖尿病、高血脂及抗肿瘤等方面。铁皮石斛的主要成分有多糖、氨基酸类、生物碱、菲类等。
3.其中，多糖是铁皮石斛中主要化学成分及生物活性物质，2020版《中国药典》规定其含量(按干燥品计)不得少于25％，现有文献表明铁皮石斛中的多糖含量一般在25-35％之间，最高可达40％左右。多糖(polysaccharide)是由10个以上的单糖通过糖苷键结合而成的聚合糖高分子碳水化合物，是存在于多种植物中的一种高分子化合物，研究表明其具有抗降血脂、降血糖、增强免疫、抗肿瘤、抗凝血、抗炎等生物活性。皮肤是人体阻断外界有害物质入侵的的第一道防线，其中处于最外层的角质层含水量直接影响着皮肤的干燥与否，含水量在10％～20％之间认为是皮肤的最佳状态，若低于10％则皮肤粗糙、干燥。角质层中的水分对保持皮肤的健康，抑制或减缓衰老，减少皱纹的产生及抵御外界的侵害等方面具有不可或缺的作用。随着我国化妆品行业的快速发展，多糖在其中扮演着重要的角色，由于多糖中的多羟基和羧基结构，可与水分子形成氢键网络而锁住水分，促进水通道蛋白、中间丝聚蛋白表达增加，从而维护皮肤表皮屏障结构和水合功能。
4.目前从铁皮石斛中提取多糖的方法较多，如公开号为cn101015649a的中国专利申请公开了一种铁皮石斛多糖的提取方法，其多糖含量不低于25％，但工艺中采用有机溶剂处理；又如公开号为cn106317244a的中国专利申请中公开了一种铁皮石斛多糖的提取方法，采用碱性电解水浸提，减少了对环境的污染，但采用大孔吸附树脂柱进行纯化，工艺复杂，且成本较高。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明有必要提供一种铁皮石斛多糖的制备方法，以铁皮石斛鲜品作为原料，采用破壁匀浆、水提醇沉结合真空冷冻干燥等工序，制得分子量大于1000kd的铁皮石斛多糖，该方法获得的多糖含量在35-50％(质量分数)之间，提取率高，常温条件下可长期保存；且该方法中与其他现有技术相比未采用有毒有害的有机溶剂，工艺安全；且操作较其他石斛提取多糖方法简单、高效。
6.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明首先提供了一种铁皮石斛多糖的制备方法，包括以下步骤：
8.提供长度为0.5-1.0cm的鲜石斛小段；
9.将所述鲜石斛小段按照质量体积比1:20-1:50与蒸馏水混合，破壁匀浆5-10min，获得浆液；
10.将所述浆液依次经过粗过滤、精过滤、浓缩，获得浓缩液；
11.采用慢加快搅的方式向所述浓缩液中加入乙醇，静置过夜后，收集沉淀并用乙醇洗涤沉淀2-3次，获得醇沉物；
12.将所述醇沉物加水溶解，使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液；
13.真空冷冻干燥所述截留液的浓缩液，制得分子量大于1000kd的多糖冻干粉。
14.进一步方案，所述鲜石斛小段由铁皮石斛鲜品去除杂质并洗净沥干后，剪成；
15.其中，所述的铁皮石斛鲜品为人工栽培品铁皮石斛的茎。
16.进一步方案，所述粗过滤采用纱布或尼龙纱布；
17.所述精过滤采用滤纸板进行，所述滤纸板的孔径为15-35μm。
18.进一步方案，所述浓缩采用真空减压旋转蒸发仪进行，其中，水浴温度控制在40-60℃，转速20-70r/min，压力控制在0.02-0.07mpa。
19.进一步方案，在获得醇沉物的步骤中，向所述浓缩液中加入乙醇使得乙醇终浓度达到80％-95％。
20.进一步方案，在收集截留液的步骤中，所述醇沉物与水的质量体积比为1g：20-80ml。
21.进一步方案，所述真空冷冻干燥的温度为-55℃～-70℃、时间为24h-72h。
22.本发明进一步提供了一种铁皮石斛多糖，采用如前述任一项所述的制备方法制得。
23.本发明进一步提供了如前所述的铁皮石斛多糖在护肤化妆类产品中的应用。
24.本发明还提供了一种护肤化妆品，其包括如前所述的铁皮石斛多糖。
25.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
26.本发明采用铁皮石斛鲜品提取多糖，可最大限度的将铁皮石斛中大分子量(大于1000kd)多糖保留下来，多糖含量在35-50％之间；该制备方法高效便捷、避免了有机溶剂的使用，结合水提醇沉和真空冷冻干燥，使得脱水彻底，便于后续的加工使用和储存，适合大规模工业化生产。
27.本发明获得的铁皮石斛多糖含量高(高达35％-50％)，稳定性好，可常温下长期保存、运输。
附图说明
28.图1为鲜、干铁皮石斛不同分子量多糖dpph自由基清除率；
29.图2为鲜、干铁皮石斛不同分子量多糖
·
oh自由基清除率；
30.图3为鲜、干铁皮石斛不同分子量多糖透明质酸酶抑制率。
具体实施方式
31.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终
相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
32.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。
33.本发明第一方面公开了一种铁皮石斛多糖的制备方法，主要包括以下步骤：
34.铁皮石斛鲜品前处理
35.具体的说，取铁皮石斛鲜品，这里的鲜品指的是未经任何干燥或加工处理的天然物。鲜品是传统中医临床上的特色用药之一，中医讲究“鲜品为上”，其中《本草纲目》里，有关鲜品使用达1100多条；鲜品直接使用可保证其营养成分完整，药用功能不受影响，且易被人体吸收，比干品具有更好更独特的疗效。研究表明干品由于经过干燥等方法进行处理导致其化学成分及生物活性明显低于鲜品，因此本发明的实施例中采用铁皮石斛鲜品进行提取。根据本发明的实施例，采用的铁皮石斛鲜品为人工栽培品铁皮石斛的茎。进一步的，将这些铁皮石斛鲜品去除杂质后，洗净沥干，并剪成鲜石斛小段备用，在本发明的实施例中，鲜石斛小段的长度在0.5-1.0cm之间；可以理解的是，除杂以及洗净沥干的步骤均为本领域中的常规工艺，故这里不再具体阐述。
36.制备浆液
37.具体的说，将鲜石斛小段与蒸馏水混合后进行破壁匀浆，制得浆液，通过破壁匀浆粉碎铁皮石斛鲜品，从而避免加热对药材多糖成分产生的破坏、水解等现象，尽可能的保存铁皮石斛原本特有的多糖活性成分。根据本发明的实施例，鲜石斛小段和蒸馏水按照1:20-1:50的质量体积比(g/ml)进行混合，具体的破壁匀浆可在常规的匀浆机中进行，保证其完全匀浆即可，在本发明的一个或多个实施例中，匀浆机的搅拌功率为1200-1500w，匀浆时间为5-10min。
38.制备浓缩液
39.具体的说，将制得的浆液依次经过粗过滤、精过滤、浓缩，获得浓缩液。由于铁皮石斛鲜品纤维性强、色素含量高，本发明的实施例中，分别通过粗过滤和精过滤除去纤维残渣和色素，该步骤操作简单快捷。根据本发明的实施例，粗过滤和精过滤可分别采用本领域中常规的手段，其中，粗过滤采用纱布或尼龙纱布，精过滤采用滤纸板进行，优选的，滤纸板的孔径为15-35μm。进一步的，本发明中的浓缩优选的采用旋转蒸发仪进行，在本发明的一个或多个实施例中，旋转蒸发仪的水浴温度控制在40-60℃，转速20-70r/min，压力控制在0.02-0.07mpa。
40.制得醇沉物
41.具体的说，为了避免后续加入乙醇受热挥发，待浓缩液放冷后，采用慢加快搅的方式向所述浓缩液中加入乙醇，采用水提醇沉法分离多糖，缓慢加入乙醇使其终浓度达到80％～95％之间，从而使得铁皮石斛多糖最大化的沉淀下来；将加入乙醇后的溶液静置过夜后，使得多糖进行沉淀，由于温度较低时，多糖析出与沉降的速度会加快，因此优选的，在本发明的一些实施例中，该静置过程在低温(2-8℃)条件下进行，优选的如4℃。进一步的，将获得的沉淀物采用5000r/min离心，置于40-50℃烘箱中干燥，收集，并采用乙醇洗涤沉淀2-3次，从而去除醇溶性物质，提高多糖的纯度，获得醇沉物。
42.获得分子量大于1000kd的多糖溶液
43.具体的说，将所述醇沉物加水溶解，并在适当压力下使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液，即为分子量大于1000kd的多糖溶液。在本发明的实施例中，醇沉物与水的质量体积比(g/ml)在1:20-1:80之间，通过超滤膜的压力控制在0.2-1.0mpa。
44.制得分子量大于1000kd的多糖冻干粉
45.具体的说，真空冷冻干燥所述截留液，制得分子量大于1000kd的多糖冻干粉，该多糖冻干粉的多糖得率高、稳定性好，便于常温下长期保存、运输。在本发明的实施例中，真空冷冻干燥的温度在-55℃～-70℃之间，时间为24h-72h。
46.本发明第二方面提供了一种铁皮石斛多糖，采用如本发明第一方面所述的制备方法制得。该铁皮石斛多糖的多糖得率高，多糖得率高达45％-50％，且分子量大于1000kd。
47.本发明第三方面提供了如本发明第二方面所述的铁皮石斛多糖在护肤化妆类产品中的应用。
48.本发明第四方面提供了一种护肤化妆品，其包括如本发明第二方面所述的铁皮石斛多糖。
49.下面通过具体实施例对本发明进行说明，需要说明的是，下面的具体实施例仅仅是用于说明的目的，而不以任何方式限制本发明的范围，另外，如无特别说明，未具体记载条件或者步骤的方法均为常规方法，所采用的试剂和材料均可从商业途径获得。
50.实施例1铁皮石斛多糖的制备
51.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
52.(2)取100g鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:20ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
53.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃，转速50r/min，压力控制在0.1mpa，浓缩至100ml，得到浓缩液；
54.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加入900ml乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
55.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
56.(6)沉淀用适量乙醇洗涤并重复步骤(5)中操作2-3次；
57.(7)将步骤(6)中的沉淀加200ml纯水溶解，使其通过分子量为100kd的超滤膜，收集滤液1(fp 100)，截留液在相同的压力下使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集滤过液2(fp 100-1000)；收集截留液3(fp 1000)。
58.对比例1铁皮石斛多糖的制备
59.(1)精密称取50.12g、50.03g、50.24g实施例1中的鲜铁皮石斛小段3份，放入电热鼓风干燥箱中60℃干燥至恒重，分别得干品11.02g、10.83g、10.67g，其中，铁皮石斛鲜品含水量为78.38％；
60.(2)取21.62g干铁皮石斛粉末，按1g:50ml加入蒸馏水，破壁匀浆10min，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
61.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃左右，转速50转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至100ml，得到浓缩液；
62.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加入900ml乙醇，并置4℃冰箱静置过夜；
63.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
64.(6)沉淀用适量乙醇洗涤重复(5)中操作2-3次；
65.(7)将沉淀加200ml纯水溶解，在适当压力下使其通过分子量为100kd的超滤膜，收集滤液1(dp 100)，截留液在相同的压力下使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集滤过液2(dp 100-1000)；收集截留液3(dp 1000)。
66.实施例2铁皮石斛多糖的制备
67.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
68.(2)取50g鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:30ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用200目尼龙纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，用15-35μm滤纸板过滤，得到精滤液；
69.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在45℃左右，转速55转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至50ml，得到浓缩液；
70.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加400ml乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
71.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
72.(6)沉淀用100ml乙醇洗涤重使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液；
73.(7)将滤过液浓缩后在-60℃进行真空冷冻干燥，得到鲜铁皮石斛分子量1000kd多糖冻干粉。
74.实施例3铁皮石斛多糖的制备
75.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
76.(2)取100g鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:20ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
77.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃左右，转速50转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至100ml，得到浓缩液；
78.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加900ml乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
79.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
80.(6)沉淀用适量乙醇洗涤重复(5)中操作2-3次；
81.(7)将沉淀加200ml纯水溶解，使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液。
82.(8)将滤过液浓缩后在-60℃进行真空冷冻干燥，得到鲜铁皮石斛分子量1000kd多糖冻干粉。
83.实施例4铁皮石斛多糖的制备
84.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
85.(2)取100g鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:30ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
86.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃左右，转速50转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至100ml，得到浓缩液；
87.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加900ml乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
88.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
89.(6)沉淀用适量乙醇洗涤重复(5)中操作2-3次；
90.(7)将沉淀加200ml纯水溶解，使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液。
91.(8)将滤过液浓缩后在-60℃进行真空冷冻干燥，得到鲜铁皮石斛分子量1000kd多糖冻干粉。
92.实施例5铁皮石斛多糖的制备
93.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
94.(2)取500g鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:20ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
95.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃左右，转速50转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至500ml，得到浓缩液；
96.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加4500ml乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
97.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
98.(6)沉淀用适量乙醇洗涤重复(5)中操作2-3次；
99.(7)将沉淀加250ml纯水溶解，使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液。
100.(8)将滤过液浓缩后在-60℃进行真空冷冻干燥，得到鲜铁皮石斛分子量1000kd多糖冻干粉。
101.实施例6铁皮石斛多糖的制备
102.(1)将人工栽培的铁皮石斛鲜品除去杂质，洗净，剪成0.5-1cm小段备用；
103.(2)取1kg鲜石斛小段于匀浆机中，按1g:20ml加入蒸馏水，破壁匀浆，待其完全匀浆，先用3-5层纱布粗过滤，得粗滤液；取粗滤液，采用15-35μm孔径滤纸板过滤，得到精滤液；
104.(3)精滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩，水浴温度控制在50℃左右，转速50转/min，压力控制在0.06mpa，浓缩至1l，得到浓缩液；
105.(4)向浓缩液中采用慢加快搅的原则加9l乙醇，并置4℃冰箱放置过夜；
106.(5)取出，5000r/min离心，弃去上清液，得到沉淀；
107.(6)沉淀用适量乙醇洗涤重复(5)中操作2-3次；
108.(7)将沉淀加500ml纯水溶解，使其通过分子量为1000kd的超滤膜，收集截留液。
109.(8)将滤过液浓缩后在-60℃进行真空冷冻干燥，得到鲜铁皮石斛分子量1000kd多糖冻干粉。
110.测试例
111.(1)含水量测试：精密称取3g多糖冻干粉，平行测量3份，放入已恒重好的称量瓶中，精密称定，开启瓶盖在105℃干燥5小时，将瓶盖盖好，移置干燥器中，放冷30分钟，精密称定，再在上述温度干燥1小时，放冷，称重，至连续两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算含水量(％)。
112.(2)多糖含量的测定：取多糖冻干粉0.5g并定容至50ml，得鲜铁皮石斛多糖水溶液；精密量取1.0ml样品溶液并置于具塞试管中，再精密量取1.0ml 5％苯酚溶液加入试管，轻轻摇荡，充分混合均匀，再精密取5ml硫酸置于试管，轻轻摇荡，并充分混合均匀，放于沸水浴，加热反应20min后，置冰浴中冷却5min通过紫外-可见分光光度法，于488nm的吸收波长处测定和读取各样品溶液吸光度值，记录数据，并计算多糖的含量。
113.经过测试，实施例1-6中多糖冻干粉的含水量在3.8％-5.2％之间，多糖含量在41-50％之间。
114.通过上述测试可以看出，本发明中的制备方法制得的铁皮石斛多糖的含水量低，常温下可长期存储，且多糖含量高(在41-50％之间)。
115.本发明中制得的铁皮石斛多糖功效评价实验
116.功效评价实施例1人体皮肤保湿功效实验
117.经表皮水分流失是指通过表皮蒸发出的水分。tewl评估皮肤屏障功能的重要参数，皮肤屏障越完好，水分含量就越高，tewl值就越低，本实验使用ck公司tewameter tm 300，测定皮肤表面经表皮失水率，其单位为g/hm2。
118.皮肤中的含水量主要与角质层保持水分能力有密切关系，水分含量一般在10％-60％之间。采用corneometer cm 825型皮肤水分检测探头进行检测分析，水分含量就越高，mmv值就越低。
119.试液的配置：
120.取上述实施例1和对比例1中鲜、干铁皮石斛不同分子量多糖滤液分别置200ml容量瓶中，各加水定容至刻度，摇匀。分别得到干铁皮石斛多糖(dp 100、dp 100～1000、dp 1000)、鲜铁皮石斛多糖(fp 100、fp 100～1000、fp 1000)溶液。
121.实验方法：
122.采用tewameter tm 300、corneometer cm 825测试系统分别对皮肤经皮水分散失状况、皮肤水分含量进行测试。测试房间室温控制在25℃左右，相对湿度在35-55％之间恒定，测试前受试者应保持机体为稳定状态，将健康志愿受试者120名，随机分成6组。使用35℃左右的清水擦拭受试者双臂后，于测试环境下静坐30min后开始测试。在受试者手臂内侧距手腕8cm处为中心画一个直径为3cm的圆形标记作为受测区域；前三组左臂区域分别涂抹dp 100、dp 100～1000、dp 1000溶液1ml；右前臂相同位置涂抹1ml蒸馏水作为空白对照组，实例4-6组在左臂区域涂抹fp 100、fp 100～1000、fp 1000溶液1ml；右前臂相同位置涂抹1ml蒸馏水作为空白对照组，分别在使用前、0.5h、1h、2h、4h、8h测定受试区域的皮肤水分散失量值、皮肤水分含量值，各组求平均值。结果如表1和表2中所示的：
123.表1鲜、干石斛多糖溶液涂抹前后皮肤水分散失值
[0124][0125]
通过表1中的测试结果可以看出，使用前、后皮肤水分经表皮散值发生显著变化，使用后0.5h水分经表皮散值在5.26-6.67之间，其中fp 1000水分经表皮散值达到5.26，较使用前水分经表皮散值降低了28.63％。使用8h后fp 1000水分经表皮散值仍保持6.00以下，水分经表皮散值降低19.13％，其他组水分经表皮散值均低于15.00％，表明fp 1000更
具持久保湿效果，说明鲜铁皮石斛制得的多糖具有更持久的保湿效果。不同分子量鲜、干铁皮石斛多糖的水分经表皮散值存在差异，其中大分子多糖《中分子多糖《小分子多糖。
[0126]
表2鲜、干石斛不同分子量多糖溶液涂抹前后皮肤含水量
[0127][0128]
通过表2中的测试结果可以看出，使用前、后皮肤含水量发生显著变化，使用后0.5h皮肤含水量达到最大且均大于40.00，其中dp 1000和fp 1000皮肤含水量大于50.00，较使用前皮肤含水量分别增加92.85％、101.71％。使用8h后fp 1000皮肤含水量仍保持40.00以上，皮肤含水量增加49.06％，其他组皮肤含水量均低于40.00，表明不同分子量多糖即时保湿效果较好，但fp 1000更具持久保湿效果。不同分子量鲜、干铁皮石斛多糖的皮肤含水量值存在差异，其中大分子多糖》中分子多糖》小分子多糖。
[0129]
功效评价实施例2体外抗氧化实验(dpph
·
自由基法)
[0130]
dpph
·
是以氮为中心稳定的自由基，其无水乙醇溶液置于517nm波长处出现最大吸收。
[0131]
存在自由基清除剂时，可结合或替代dpph
·
使自由基数量减少导致吸光度减小。
[0132]
试液配制：精密称取dpph 3.0mg置10ml容量瓶中，加少量无水乙醇使其溶解，并定容至刻度，摇匀。另取2ml至100ml容量瓶中，定容摇匀，得浓度为0.006mg/ml dpph。
[0133]
分别取实验例1中鲜、干石斛不同分子量多糖溶液10ml加水分别定容至100ml，备用。
[0134]
实验内容：
[0135]
样品管中加入3.0ml dpph溶液和0.5ml不同分子量多糖溶液；对照管中加入3.0ml乙醇溶液和0.5ml不同分子量多糖溶液；空白管中加入3.0ml dpph溶液和0.5ml纯水，混匀避光30min后，用3.0ml乙醇和0.5ml蒸馏水调零，在517nm波长处测吸光值；设3个平行，求平均值。结果如图1。按下式计算自由基清除率(％)：
[0136][0137]
由数据分析可知，不同组别的dpph
·
自由基清除率存在差异，干铁皮石斛多糖自由基清除率在35.5-41.6％之间，鲜铁皮石斛多糖自由基清除率在15.3-60.2％之间，fp 100自由基清除率最低15.3％，而fp 1000最高达到60.2％，相当于fp 100的3.9倍；因此鲜铁皮石斛多糖大分子多糖的dpph
·
自由基清除效果最好。
[0138]
功效评价实施例3体外抗氧化实验(
·
oh自由基法)
[0139]
羟自由基(
·
oh)可使组织中的糖类、蛋白质等物质发生氧化，使人体遭受氧化性损伤与破坏。故可加入羟自由基抑制剂减少其对机体的损伤，进而保护肌肤，减缓衰老。羟
自由基抑制率越高表明抗衰老作用越强，反之越弱。
[0140]
溶液配制：分别取实验例1中鲜、干石斛不同分子量多糖溶液10ml加水分别定容至100ml，备用。
[0141]
实验内容：
[0142]
采用fenton反应产生羟自由基。反应体系中先加入feso4溶液(9.0mmol/l)、水杨酸-乙醇溶液(9.0mmol/ml)、不同分子量铁皮石斛多糖溶液、h2o2溶液各1ml，于37℃水浴30min，以无水乙醇为空白对照，于510nm处测定其吸光度，计算各铁皮石斛多糖溶液对
·
oh的清除率：
[0143][0144]
式中：a2：样品反应的吸光度；
[0145]
a1：不加h2o2的样品的吸光度(无水乙醇代替)；
[0146]
a0：空白对照无水乙醇的吸光度。
[0147]
由数据分析(图2)可知，不同组别的
·
oh自由基清除率存在差异，干铁皮石斛多糖
·
oh自由基清除率在37.6-40.3％之间，鲜铁皮石斛多糖在20.8-68.8％之间，其中fp 100最低20.8％，而fp 1000最高达到68.8％，相当于fp 100的3.3倍；因此鲜铁皮石斛多糖大分子多糖的
·
oh自由基清除效果最好。不同分子量鲜、干铁皮石斛多糖的
·
oh自由基清除率存在差异，其中大分子多糖》中分子多糖》小分子多糖。
[0148]
功效评价实施例4透明质酸酶活性抑制实验
[0149]
透明质酸酶与炎症、过敏存在密切联系，能使体内的透明质酸酶解为低分子量的酸性刺激源，引发敏感症状。透明质酸酶抑制剂可有效调节透明质酸的平衡关系，抑制率表示样品对透明质酸酶的抑制能力，抑制率越高表示其舒敏抗炎效果越好。
[0150]
溶液配制：
[0151]
透明质酸酶溶液：称取10mg透明质酸酶加入4ml醋酸缓冲溶液使其溶解。
[0152]
透明质酸钠溶液：称取10mg透明质酸钠加入20ml醋酸缓冲溶液使其溶解。
[0153]
将鲜、干石斛不同分子量多糖溶液10ml加去离子水分别定容至100ml，采用0.45μm滤膜过滤，备用。
[0154]
实验内容：
[0155]
具体试验步骤如下：
[0156][0157]
备注：“0”为不添加，但用醋酸缓冲溶液代替。
[0158]
按表中所示向试管中加入相应试液充分震荡，30℃放置30min，转至96孔板中，在
582nm处测定吸光值。具体公式如下：
[0159][0160]
式中：a—对照组的吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；
[0161]
b—对照空白组吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；
[0162]
c—样品组吸光度值；
[0163]
d—试样空白组吸光度值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)
[0164]
由数据分析(图3)可知，不同组别的透明质酸酶抑制率存在差异，干铁皮石斛多糖透明质酸酶抑制率在36.2-60.5％之间，鲜铁皮石斛多糖在23.47-75.1％之间，其中fp 100最低36.2％，而fp 1000最高达到75.1％，相当于fp 100的2.1倍；因此鲜铁皮石斛多糖大分子多糖的透明质酸酶抑制效果最好。
[0165]
使用本发明所述的不同分子鲜、干铁皮石斛多糖溶液的涂抹手臂内侧发现，与空白对照相比皮肤水分散失量、含水量均明显改善，其中鲜铁皮石斛大分子多糖溶液的皮肤水分散失量、含水量及抗氧化效果较好，而鲜铁皮石斛小分子多糖溶液较差；自由基清除率、透明质酸酶活性抑制实验结果与人体保湿功效评价实验存在一致性。这与鲜石斛样品中多糖分子量较为均一，主要集中在大分子片段，而干石斛由于加工方法及人为因素的影响，大分子多糖片段被分解成中、小分子量片段有一定关系。将不同分子量多糖皮肤含水量、皮肤水分散失、自由基清除及透明质酸酶活性抑制实验结果对比，发现大分子多糖的效果最好，中分子次之，小分子最差。因此鲜铁皮石斛大分子多糖溶液的保湿、舒敏抗衰功效较明显。
[0166]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0167]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。