一种小麦过敏原特异性IgE的检测试剂盒及其检测方法与流程

一种小麦过敏原特异性ige的检测试剂盒及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种小麦过敏原特异性ige的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.2011-2012年世界变态反应组织(wao)关于变态反应(也称过敏反应，allergy)的白皮书中指出：“过敏性疾病的流行在全世界范围内呈上升趋势，过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎等，药物、食物及昆虫过敏反应，湿疹、荨麻疹和血管性水肿等。引起过敏的食物大约有160多种，其中小麦被fda认定为八大过敏食物之一；我国小范围调查表明在北京、广州等地，居民食物过敏的发生率为3.4％-5.0％，世界上超过0.4％人口受小麦过敏症困扰，有研究报道患荨麻疹、过敏性鼻炎、哮喘的患者中小麦过敏分别约占7％、16％、8％，摄取小麦后ige介导的过敏反应包括荨麻疹、血管性水肿、过敏性休克、小麦依赖性运动诱发过敏反应等。
3.免疫球蛋白e抗体(ige)是变态反应疾病的重要介质，介导i型速发型过敏反应。ige具有亲细胞性，其fc段与肥大细胞或嗜酸性粒细胞表面受体结合,使肥大细胞或嗜碱性粒细胞致敏，致敏状态的细胞，如遇到相应过敏原，其表面的ige抗体，会结合相应的抗原表位，使细胞膜发生复杂的级联反应，致敏细胞脱壳粒释放生物活性介质，活性介质作用于靶组织或器官导致临床症状。体内ige的水平可作为诊断ige介导型过敏反应的关键指标之一，通过检测过敏原特异性ige可辅助过敏疾病的诊断，定量检测可更准确地评估过敏风险，更早发现致敏患儿，提前规避风险，跟踪sige浓度变化，也可辅助决策食物再引入时机等。
4.目前小麦过敏原检测的试剂盒，主要有免疫印迹、胶体金、酶联免疫分析法、磁微粒化学发光法和荧光免疫分析法。小麦特异性检测试剂盒均有各自方法的优缺点，需要进一步优化。
5.使用的胶体金的方法，手工实验，操作复杂，通量小；使用的为定性的分析谷物过敏情况，不能准确定量。谷物过敏的准确定量，可以用于疾病的风险评估，过敏等级相同，不同量值的sige导致的疾病发生风险差异大；另外sige的定量浓度变幅，辅助决策食物再引入的时机。受到方法学的限制，胶体金的灵敏度较化学发光相比存在差异。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明提供了一种小麦过敏原特异性ige的检测试剂盒及其检测方法，本发明将小麦过敏原进行特定的预处理后进行生物素标记，利用链霉亲和素制备磁微球、辣根过氧化物酶标记抗人ige抗体的化学发光免疫分析法，全自动操作，保证了检测结果的准确性，提高了测试通量和检测结果的特异性、灵敏度。
7.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
8.一种小麦过敏原特异性ige的检测试剂盒，其特征在于，所包括磁微粒、酶标记抗
人ige抗体、生物素标记的小麦过敏原；
9.所述小麦过敏原由小麦蛋白提取物经热处理或预处理剂处理获得；
10.所述预处理剂包括叠氮化钠处理、l-半胱胺酸、l-半胱胺酸盐酸盐中的一种或多种。
11.本发明一些实施方案中，所述预处理剂为l-半胱氨酸盐酸盐；所述l-半胱氨酸盐酸盐的浓度浓度优选为0.5-100mm，具体可为0.5mm、2mm、5mm、10mm、50mm或100mm。
12.本发明中，所述热处理的温度优选为65-95℃，具体可为65℃、70℃、75℃、80℃、85℃或95℃，时间优选为20-60min；具体可为20min、30min、40min、50min或60min。
13.本发明的一些实施方案中，所述小麦过敏原预处理剂为叠氮化钠，质量分数优选为1％-20％，具体可为1％、5％、10％、15％或20％。
14.本发明中，所述小麦过敏原的浓度优选为0.1-40.0μg/ml；具体可为0.1μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、20μg/ml、40.0μg/ml。
15.本发明中，所述生物素标记的小麦过敏原的制备方法包括：将所述小麦过敏原与活化的生物素混合、反应，反应物经透析获得生物素标记的小麦过敏原。其中，所述活化采用的活化剂包括edc和nhs，包括但不仅限于此，溶剂优选为二甲基亚砜，包括但不仅限于此；所述反应优选在室温下进行，反应的时间优选为0.5～4h，具体可为0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h或4h；所述活化的生物素与小麦过敏原的摩尔比优选为1:3-1:30，具体可为1:3、1:5、1:10、1:15、1:20:、1:25或1:30。
16.本发明中，所述链霉亲和素包被的磁微粒的浓度为0.1-3.0mg/ml。
17.本发明中，所述酶标记抗人ige抗体优选为辣根过氧化物酶标记的抗人ige抗体；所述抗人ige抗体的来源没有特殊限定，包括但不仅限于鼠抗人、兔抗人等等。
18.本发明还提供一种非诊断目的地检测小麦过敏原特异性ige的方法，利用本发明的检测试剂盒进行检测，具体包括如下步骤：
19.步骤1：取小麦蛋白提取物热处理或用预处理剂处理，获得小麦过敏原；将所述小麦过敏原与活化的生物素混合、反应，反应物经透析获得生物素标记的小麦过敏原；其中，所述预处理剂包括叠氮化钠处理、l-半胱胺酸、l-半胱胺酸盐酸盐中的一种或多种；
20.步骤2：将待测样本、链霉亲和素包被的磁微粒和生物素标记的小麦过敏原混合孵育，然后去上清；
21.步骤3、加入辣根过氧化物酶标记的抗人ige抗体，混合孵育后去上清；
22.步骤4：加入底物溶液，测定化学发光强度；
23.步骤5：根据标准曲线，计算得到所述待测样本中ige的浓度。
24.本发明步骤2和步骤3中所述孵育的温度优选为15-40℃，具体可为15℃、37℃或40℃；时间优选为5-40min，具体可为5min、15min或40min。
25.本发明步骤5中，以ige标准品浓度值为横坐标，以其对应的化学发光信号值为纵坐标建立标准曲线。
26.本发明提供的试剂盒包括包括磁微粒、酶标记抗人ige抗体、生物素标记的小麦过敏原和小麦过敏原预处理剂；所述小麦过敏原预处理剂包括叠氮化钠处理、l-半胱胺酸、l-半胱胺酸盐酸盐中的一种或多种。本发明对小麦过敏原进行了优化，选择特定预处理剂处理的小麦过敏原进行生物素标记，利用链霉亲和素制备磁微球、辣根过氧化物酶标记抗人
ige抗体的化学发光免疫分析法，全自动操作，保证了检测结果的准确性，提高了测试通量和检测结果的灵敏度，灵敏度为0.1iu/ml。
具体实施方式
27.本发明提供了一种小麦过敏原特异性ige的检测试剂盒及其检测方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
28.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
29.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
30.实施例1本发明试剂盒的制备
31.1、生物素标记的小麦过敏原的制备：
32.(1)用0.5-100mm的l-半胱胺酸将小麦蛋白提取物处理20-60min，获得小麦过敏原；
33.(2)用二甲基亚砜将生物素溶解，浓度为2-6mg/ml；
34.(3)用二甲基亚砜将edc和nhs分别溶解，浓度为2-6mg/ml；
35.(4)将溶解好生物素、edc和nhs按照比例混合，室温反应，反应比例为1：1：1，反应时间为1-3h；
36.(5)将(1)-(3)步骤活化后的生物素分别与步骤(1)获得的小麦过敏原进行反应，摩尔比为1:5-1:20，反应时间为为1-3h；反应后进行透析。
37.(6)用含5％马血清、2％甘油及5％蔗糖的磷酸盐缓冲液(ph＝7～8)配制成1～10μg/ml溶液，即得生物素标记的小麦过敏原。
38.2、磁微粒混悬液的制备：
39.将100mg/ml链霉亲和素包被的磁微粒进行磁分离，用含5％马血清、2％甘油及5％蔗糖的磷酸盐缓冲液(ph＝7～8)重悬，反复洗涤2次(5-10min/次)，磁分离，最终将磁微粒重悬于含5％马血清、2％甘油及5％蔗糖的磷酸缓冲液(ph＝7～8)，即得到浓度为0.5-3mg/ml的链霉亲和素包被的磁微粒悬浮液。
40.2、酶标记抗人ige抗体的制备：
41.将抗人ige标记的辣根过氧化物酶用含5％马血清的磷酸盐缓冲液(ph＝7～8)配制成1mg/ml的浓度，即得。
42.实施例2
43.与实施例1不同之处在于小麦过敏原的制备方法不同，所述小麦过敏原的制备方法为：用1％-20％叠氮化钠溶液将小麦蛋白提取物处理20-60min。其他试剂盒组分及其制备方法均相同。
44.实施例3
45.与实施例1不同之处在于小麦过敏原的制备方法不同，所述小麦过敏原的制备方法为：将小麦蛋白提取物65-95℃加热处理20-60min；其他试剂盒组分及其制备方法均相同。
46.实施例4
47.与实施例1不同之处在于小麦过敏原的制备方法不同，所述小麦过敏原的制备方法为：用0.5-100mm的l-半胱胺酸将小麦蛋白提取物处理20-60min；其他试剂盒组分及其制备方法均相同。
48.实施例5本发明检测方法
49.步骤1：取小麦蛋白提取物按照实施例1～4的方法进行预处理，获得小麦过敏原；将所述小麦过敏原与活化的生物素混合、反应，反应物经透析获得生物素标记的小麦过敏原；
50.步骤2：将待测样本、链霉亲和素包被的磁微粒和生物素标记的小麦过敏原混合孵育，然后去上清；
51.步骤3、加入辣根过氧化物酶标记的抗人ige抗体，混合孵育后去上清；
52.步骤4：加入底物溶液，测定化学发光强度；
53.步骤5：根据标准曲线，计算待测样本中ige的浓度。
54.测试例1
55.采用实施例1～4的试剂盒按照实施例5的方法进行检测，结果见表1。
56.表1对小麦本底的影响(rlu)
[0057][0058]
结果显示，不同的处理工艺显示热变性、叠氮化钠处理及l-半胱胺酸盐酸盐工艺处理后对抗原引入的酶促本底存在差异，其中，热变性、叠氮化钠处理、l-半胱胺酸盐酸盐工艺处理后抗原本身引入的酶促本底显著降低。
[0059]
测试例2不同小麦过敏原对试剂盒灵敏度的影响
[0060]
采用实施例1～4的试剂盒按照实施例5的方法进行检测，结果见表2。
[0061]
表2对试剂盒性能的影响(rlu)
[0062][0063]
结果显示，不同预处理的小麦过敏原对反应性无显著的影响，0值样本降低显著，信噪比显著增加，阴性性样本的反应梯度上l-半胱胺酸盐酸盐处理的效果最佳。
[0064]
测试例3灵敏度分析试验
[0065]
采用本发明实施例1～4的试剂盒，对阴性样本进行20次重复检测，测定结果取平均值加2倍标准偏差，即为试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为0.1iu/ml～0.23iu/ml。
[0066]
表3不同预处理对试剂盒灵敏度的影响
[0067][0068][0069]
结果显示，热变性、叠氮化钠处理及l-半胱胺酸盐酸盐工艺处理后l-半胱胺酸盐酸盐工艺空白限显著降低，检出能力增强，灵敏度明显增加。
[0070]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。