一种北苍术组织培养及快速繁殖方法

1.本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的，涉及一种北苍术组织培养及快速繁殖方法。


背景技术：

2.苍术作为大宗中药材，源于菊科苍术属植物茅苍术atractylodes lancea(thunb.)dc.或北苍术atractylodes chinensis(dc.)koidz.的干燥根茎，主要分布在中国、朝鲜半岛、日本等远东地区，其药效受地理环境等因素影响很大，被多国药典所收载。2020年版《中华人民共和国药典》指标成分苍术素评价苍术质量。
3.北苍术作为苍术的重要来源，由于野生北苍术资源日益枯竭，但是市场对于苍术的需求量日益增加，供需缺口逐年加大，市场前景良好，现在进行大面积种植，但是由于种质资源多样、种植不规范等问题的存在，造成其产量、药用成分含量不能达到理想效果。因此急需破解制约当前北苍术产业发展的核心种质资源问题。
4.申请号为cn202110558788.8的专利申请一种北苍术快速育苗方法及其应用，提供了一种北苍术快速育苗方法，能够缩短育苗时限，提高成苗率和种苗质量，但是该方法仅从育苗的栽培技术上进行创新，并没有提及如何确保种质资源的一致性，提高北苍术的品质。
5.申请号为cn202110673205.6的专利申请一种高产量北苍术育苗种植方法，也是从栽培的角度提供了一种提高北苍术产量和品质的方法，解决了北苍术有效成分较低、出苗率低和产量较低等问题，但是该方法也没有改变北苍术来源的多样性，难以保证种植资源的一致性。
6.由于现在市场上北苍术的资源短缺，而需求量又比较大，但是传统的繁殖方法存在繁殖系数不高、生长周期长、品种退化等问题，限制了快速繁殖及新品种选育等工作。


技术实现要素：

7.本发明提出一种北苍术组织培养及快速繁殖方法，解决了相关技术中的组织培养方法不适用于北苍术，出现繁殖系数不高、生长周期长、品种退化的问题。
8.本发明的技术方案如下：
9.一种北苍术组织培养及快速繁殖方法，包括以下步骤：
10.s1、获取外植体：将北苍术无菌苗叶片切成块状；
11.s2、将外植体冲洗后进行灭菌消毒；
12.s3、将步骤s2消毒后的外植体接种于激素组合培养基，进行愈伤组织诱导，激素组合培养基为ms 2.0mg/l 6-ba 1mg/l naa；
13.s4、将所述愈伤组织继代培养得到幼苗；
14.s5、将s4所得幼苗诱导生根、炼苗。
15.作为进一步的技术方案，所述步骤s1具体为将北苍术无菌苗叶片切成0.3cm
×
0.3cm大小。
16.作为进一步的技术方案，所述步骤s2灭菌消毒具体为75％酒精灭菌20-30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌5-6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌2.5-3.5min，无菌水冲洗5遍。
17.作为进一步的技术方案，所述步骤s2灭菌消毒具体为将外植体冲洗后进行消毒，75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌3min，无菌水冲洗5遍。
18.作为进一步的技术方案，所述步骤s3中，愈伤组织培养时培养温度为25℃，光照1500-3000lx，光照时间为12h/d，培养20d。
19.作为进一步的技术方案，所述步骤s4中，培养温度为25℃，光照1500-3000lx，光照时间为12h/d，培养20d。
20.作为进一步的技术方案，所述步骤s4中，接种时叶片朝下平铺在培养基表面。
21.作为进一步的技术方案，所述步骤s5中，炼苗具体为：北苍术组织培养幼苗转入土培培养基进行炼苗，幼苗放置于12000lx，光照、黑暗各12h，25℃培养箱培养15d。
22.本发明的有益效果为：
23.1、传统的繁殖方法限制了北苍术的快速繁殖，但是本发明中对北苍术进行组织培养很好的解决了这个问题，本发明中作为外植体的北苍术为冀北山区野外采集得到的株型大小、株龄、生育期一致的北苍术，通过建立北苍术种苗诱导愈伤和分化的再生体系，为北苍术种群的人工复壮、资源保护以及合理开发利用提供技术支撑。
24.2、本发明以北苍术的叶片为外植体，必须通过特定的灭菌条件和激素培养基才能实现北苍术快速繁殖，建立了北苍术的组织培养再生体系，解决了行业难题和技术空白。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
26.实施例1
27.s1、外植体获取：将北苍术无菌苗叶片切成0.3cm
×
0.3cm大小。
28.s2、外植体消毒：水冲洗15min，洗洁精冲洗4次，除去水分，转至超净工作台进行消毒处理，先用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌3min，无菌水冲洗5遍。
29.s3、愈伤组织的诱导：叶片外植体每个培养皿接种10个，平行培养4组。接种时叶片朝下平铺在培养基表面，略微用力使其与培养基充分接触。培养温度为25℃，光照控制在2000lx之间，光照时间为12h/d，培养20d后，统计愈伤组织诱导结果。其中的激素组合培养基为ms 2.0mg/l 6-ba 1mg/l naa。
30.愈伤率＝诱导愈伤数/总数
×
100％
31.s4、愈伤组织的分化：接种时选取生长旺盛、大小0.5cm
×
0.5cm的愈伤组织，在相同的激素组合培养基中继代培养，培养温度为25℃，控制光照在2000lx左右，光照时间为12h/d，培养20d。
32.s5、诱导生根：将健壮的幼苗逐个分开，再转入生根培养基，培养温度为25℃，控制光照1500-3000lx之间，光照时间为12h/d，培养20d。
33.s6、炼苗。将生长健壮、状态一致，生根数在5～8条的北苍术组织培养幼苗转入土培培养基进行炼苗。土培培养基使用普通花卉营养土作为培养基质，培养基使用121℃灭菌20min后使用，幼苗放置于12000lx、光照、黑暗各12h，25℃培养箱培养15d。
34.实施例2
35.其他步骤与实施例1相同，不同之处在于外植体消毒方法：75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌3.5min，无菌水冲洗5遍。
36.实施例3
37.其他步骤与实施例1相同，不同之处在于外植体消毒方法：75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌5.5min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌3min，无菌水冲洗5遍。
38.实施例4
39.其他步骤与实施例1相同，不同之处在于外植体消毒方法：75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌2.5min，无菌水冲洗5遍。
40.实施例5
41.其他步骤与实施例1相同，不同之处在于外植体消毒方法：75％酒精灭菌20s，无菌水冲洗3遍，0.1％氯化汞灭菌6min，无菌水冲洗7遍，3％次氯酸钠灭菌3min，无菌水冲洗5遍。
42.实施例1-5的培养过程中，在消毒结束后，观察杀菌效果，结果如表1所示。
43.表1实施例1-5无菌情况
44.实施例无菌情况实施例1最好实施例2较好实施例3较好实施例4较好实施例5较好
45.表面没有菌落长出—无菌情况最好；表面有1-2个菌落长出—无菌情况较好
46.灭菌方法对于组织培养时起到决定性的作用，灭菌不到位会导致菌落生长，从而影响实验结果。对于不同的外植体，采用相同的灭菌方法结果是完全不同的。本发明实施例的灭菌方法都能在不同程度上起到灭菌的效果，可以保证叶片的质量，如果采用其他的灭菌方法，会导致外植体黑化，影响愈伤组织生长情况。而且通过实施例1-5可以发现，实施例1中的消毒方法能够起到最佳的灭菌效果，可见灭菌时间、冲洗次数的不同会对消毒效果带来比较大的影响。
47.对比例1
48.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 2.0mg/l 2,4-d 1.0mg/l naa，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
49.对比例2
50.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 4.0mg/l 2,4-d 0.4mg/l naa 0.4mg/l kt，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
51.对比例3
52.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 2.0mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 0.5mg/l kt，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
53.对比例4
54.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 3.0mg/l 6-ba 0.4mg/l naa，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
55.对比例5
56.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 2.0mg/l 6-ba 0.25mg/l naa，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
57.对比例6
58.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 2.0mg/l6-ba 0.25mg/l naa，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
59.对比例7
60.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 0.3mg/l 6-ba 0.5mg/l naa 1.5mg/l 2,4-d，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
61.对比例8
62.按照实施例1中s1、s2、s3方法进行培养，不同之处在于激素组合培养基为ms 0.5mg/l 6-ba 0.5mg/l iba，按照该方法进行培养后发现愈伤组织不生长。
63.只有按照实施例1中的激素组合培养基才能诱导北苍术的叶片生长，改变激素的比例或者改变激素类型均无法起到诱导作用，愈伤组织无法生长。而且即便采用灭菌效果最佳的方法，对激素进行微调也无法使北苍术快速繁殖。
64.对比例9
65.以种子为外植体：
66.用清水浸泡0.5小时后，75％乙醇浸泡30s，0.1％氯化汞消毒15-18min，冲洗5遍，随即接种在1/2ms培养基中。该灭菌方法不理想，菌落尚未控制住。
67.对比例10
68.以叶柄为外植体，按照实施例1中s2、s3方法进行培养，但进行培养后发现愈伤组织不生长。
69.本发明中灭菌方法和激素培养基仅适用于叶片做外植体时的组织培养，当采用其他组织器官做外植体进行组织培养时，也无法诱导愈伤组织，无法进行后续培养。
70.以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。