一种酸性多糖及其制备方法和应用

1.本发明属于食品与保健品技术领域，涉及一种酸性多糖及其制备方法和应用，具体涉及从三七花中提取分离得到一种结构新颖的酸性多糖及其制备方法和其在制备抗氧化剂中的用途。


背景技术：

2.生物体内的活性氧(ros)处于动态平衡之中，ros在体内过度积累会导致发生氧胁迫，对细胞内的蛋白质、核酸、糖类等大分子造成损伤，进而诱发组织器官衰老、引起各种心血管疾病。目前在食品与保健品行业使用的抗氧化剂多为合成的化合物，长期使用具有较大的毒副作用。近年来，天然抗氧化剂因其良好的抗氧化效果与较小的毒副作用而受到人们的广泛关注，开发利用天然抗氧化剂已成为食品与保健品技术领域发展的趋势，因此，天然抗氧化剂具有广阔的市场应用前景。
3.三七花为五加科人参属植物三七(panax notoginseng(burkill)f.h.chen)的伞形花序，其主要分布在我国的云南、广西与四川。传统中医药学认为，三七花性甘味凉，具有清热生津、平肝降压的功效。在《云南中草药选》与《中华本草》中，三七花用来治疗津伤口渴、咽喉发炎疼痛、高血压等病症。三七花中的活性成分有皂苷、黄酮、挥发油等，其中皂苷为主要功效成分；现代药理学研究表明三七花具有镇静、抗炎、降血压、抗肿瘤等作用。自2016年5月三七花被云南省卫生计生委正式作为地方特色食品原料进行管理以来，三七花进一步引起了人们的关注。目前有关三七花活性成分的研究主要集中在皂苷方面，本发明所涉及的三七花多糖及其抗氧化方面的研究报道的相对较少。


技术实现要素：

4.本发明要解决的问题是提供一种酸性多糖及其制备方法和用途。
5.本发明第一方面提供了一种酸性多糖的制备方法，所述的方法包括：
6.(1)将干燥三七花粉碎、脱脂、干燥后，经热水浸提法提取，将提取液进行浓缩、冻干获得三七花粗多糖；
7.(2)采用离子交换层析柱处理对步骤(1)中所述的三七花粗多糖的水溶液进行纯化，依次采用不同浓度的nacl溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液a后进行浓缩、透析，即得到初步纯化的三七花多糖片段。
8.进一步，所述的脱脂为石油醚脱脂。
9.进一步，所述的热水浸提法的提取温度为80-90℃。
10.进一步，所述的热水浸提法的提取时间为2-3h。
11.进一步，所述的热水浸提法的液料比为20:1～40:1。
12.进一步，所述的热水浸提法的提取次数为3次。
13.进一步，步骤(1)中所述的提取液为3次热水浸提法提取后合并的提取液。
14.在本发明中，所述的离子交换层析柱为阴离子交换层析柱，所述的阴离子交换层
析柱包括强阴离子交换层析柱、弱阴离子交换层析柱。所述的强阴离子交换层析柱包括但不限于q-sephadex a-25,q-sephadex a-50,q-sephadex c-25,q-sephadex c-50；所述的弱阴离子交换层析柱包括但不限于deae-cellulose de-22，deae-cellulose de-23，deae-cellulose de-51，deae-cellulose de-52，deae-cellulose de-53。
15.在本发明的具体实施例中，步骤(2)中所述的离子交换层析柱为deae-cellulose de-52。
16.进一步，所述的不同浓度的nacl溶液包括0、0.5m、1.0m与2.0m的nacl溶液。
17.进一步，步骤(2)中所述的洗脱液a为2.0m的nacl洗脱液。
18.进一步，步骤(2)中的透析为半透膜透析。
19.进一步，所述的半透膜为mw3000半透膜。
20.mw3000是指半透膜的分子量临界值。
21.进一步，所述的方法还包括步骤(3)，步骤(3)为：采用凝胶层析柱对初步纯化的三七花多糖片段进行进一步纯化，以去离子水为流动相进行洗脱，收集洗脱液b，经浓缩后低温冻干，得到的白色固体即为纯化的三七花酸性多糖。
22.进一步，所述的凝胶层析柱为sephadex g100凝胶层析柱。
23.进一步，所述的洗脱液b为最大洗脱峰的洗脱液。
24.进一步，所述的最大洗脱峰为第二个洗脱峰。
25.本发明第二方面提供了一种酸性多糖，所述的酸性多糖由
→
4)-α-d-galap-(1
→
、
→
3,4)-α-d-galap-(1
→
和
→
4)-β-d-glcap-(1
→
三种糖醛酸残基组成，这三者的比例为4：1：1。
26.进一步，所述的酸性多糖的重复结构单元的结构式如式(i)所示：
[0027][0028]
进一步，所述的酸性多糖的mw分子量为4.5
×
103da。
[0029]
进一步，所述的酸性多糖的mp分子量为3.7
×
103da。
[0030]
进一步，所述的酸性多糖的mn分子量为3.1
×
103da。
[0031]
进一步，所述的酸性多糖由本发明第一方面所述的方法制备得到。
[0032]
本发明第三方面提供了一种组合物，所述的组合物包含本发明第二方面所述的酸性多糖。
[0033]
进一步，所述的组合物还包括药学上可接受的缓冲液、赋形剂或载体。
[0034]
术语“药学上可接受的”在本文中被限定为指在合理医学判断的范围内适合用于与受试者的组织相接触而无过度毒性、刺激过敏反应和其他问题并发症，并且与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
[0035]
在本发明中，术语“受试者”是指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于，人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等。“受试者”还包括寿命与衰老的模式生物
‑‑
秀丽隐杆线虫。
[0036]
进一步，所述的缓冲液包括trizma、bicine、tricine、mops、mopso、mobs、tris、hepes、hepbs、mes、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、aces、ada、酒石酸盐、amp、ampd、ampso、bes、cabs、卡可酸盐、ches、dipso、epps、乙醇胺、甘氨酸、heppso、咪唑、咪唑乳酸、pipes、ssc、sspe、popso、taps、tabs、tapso和tes。
[0037]
本文中使用的术语“赋形剂”，是指惰性物质，其被加入药物组合物用来进一步促进活性成分的给予
[0038]
进一步，所述的赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质或矿物。
[0039]
进一步，所述的载体包括抗微生物剂、等渗试剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂或增溶剂。
[0040]
本发明第四方面提供了如下任一项所述的应用：
[0041]
(1)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物在制备抗氧化的产品中的应用；
[0042]
(2)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物所述的酸性多糖在制备用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的产品中的应用。
[0043]
(3)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物在制备用于清除自由基的产品中的应用；
[0044]
(4)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物在制备增强sod活性的产品中的应用；
[0045]
(5)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物在制备降低ros水平的产品中的应用；
[0046]
(6)本发明第二方面所述的酸性多糖或本发明第三方面所述的组合物在制备降低mda水平的产品中的应用；
[0047]
进一步，所述的自由基包括abts 、
·
oh。
[0048]
进一步，在所述的应用(1)中，所述的酸性多糖的作用浓度为0.10-3.20mg/ml。
[0049]
如本文所述，本文提供的酸性多糖或组合物可用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病，是指任何抗衰老治疗。抗衰老治疗包括(但不限于)导致预防、改善或减轻衰老影响，减少或延缓生物学年龄增加、延缓衰老的治疗；治疗、预防、改善或减轻虚弱或与衰老相关的疾病和病症或衰退的影响、减缓这种衰退、病症或疾病的进展、健康期或寿命的延长、恢复活力、增加压力或恢复力、提高手术、放射疗法、疾病和/或任何其他压力后恢复率或其他增强、更年期综合症的预防和/或治疗、恢复生殖功能、消除或减少衰老细胞的扩散、降低与至少一种或至少两种年龄相关疾病或病症有关的所有或多种死亡风险或死亡风险的全因或多种原因或延迟此类风险增加、降低发病风险。将至少一种衰老的生物标记物调节为更年轻状态或减慢其转变为“老年”状态的治疗也被视为抗衰老治疗，包括但不限于可见衰老的迹象，如皱纹、灰色头发等的衰老的生物标记物。在一些实施方案中，年龄相关疾病或紊乱选自：动脉粥样硬化、心血管疾病、关节炎、白内障、骨质疏松症、2型糖尿病、高血压、神经退行性变(包括但不限于阿尔茨海默氏病、亨廷顿氏病和其他随年龄进行性痴呆；帕金森氏病；以及肌萎缩性侧索硬化症[als])、中风、萎缩性胃炎、骨关节炎、nash、躯干前驱症、慢性阻塞性肺疾病、冠状动脉疾病、多巴胺失调综合征、代谢综合征、劳累性尿失禁、桥本甲状腺炎、心力衰竭、老年抑郁、免疫衰老(包括但不限于与年龄相关的对疫苗的免疫反应下降、
与年龄相关的免疫疗法反应下降)、心肌梗塞、急性冠状动脉综合征、肌肉减少症、肌肉减少性肥胖、老年骨质疏松症、尿失禁等。癌症幸存者、接受化学疗法和放射疗法的患者以及其他可比的压力以及艾滋病毒患者可能会加速衰老，针对这种加速衰老或其后果的治疗也被视为抗衰老治疗以及对其的预防措施。
[0050]
进一步，所述的用于延缓衰老、或预防或治疗衰老相关疾病的产品包括用于延缓秀丽隐杆线虫衰老的产品，在本发明的具体实施例中，将所述的酸性多糖或组合物用于制备延缓秀丽隐杆线虫衰老的产品时，所述的酸性多糖的作用浓度为0.20-0.80mg/ml。
[0051]
进一步，所述的产品包括药物、固体饮料、液体饮料、乳制品、调味粉料、营养品，
[0052]
进一步，所述的药物的剂型包括溶液、混悬液、乳剂、浸膏、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊。
[0053]
本发明所述的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括(但不限于)：静脉内、腹膜内、眼内、动脉内、肺内、口服、小泡内、肌肉内、气管内、皮下的、通过皮肤、通过胸膜、局部的、吸入、通过粘膜、皮肤、肠胃、关节内、心室内、直肠、阴道、颅骨内、尿道内、肝内、瘤内，在某些情况下，可以系统地给药，在某些情况下可以局部地给药。
[0054]
在本发明中，所述的药物的用药对象不受限制，可以是任何动物，包括但不限于人类、非人灵长类、犬、猫、啮齿动物等，还包括寿命与衰老的模式生物
‑‑
秀丽隐杆线虫。
[0055]
本发明的所述的药物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。
[0056]“包含”或“包括”或“具有”无论在本文中何处使用都不意味着仅限于该术语后面所述的要素，而是包括一种或多种未特别提及的具有或没有功能重要性的其它成分，即所列的步骤、要素或选项无需穷尽。与此相比，可以使用“含有”，其中要素限于“含有”后面具体的那些。
[0057]
本发明的优点和有益效果：
[0058]
本发明首次从三七花分离得到一种酸性多糖，该酸性多糖具有较强的抗氧化活性，可作为一种新的抗氧剂被开发利用。
附图说明
[0059]
图1是三七花酸性多糖的结构重复单元结构图；
[0060]
图2是三七花酸性多糖的1h nmr谱；
[0061]
图3是三七花酸性多糖的
13
c nmr谱；
[0062]
图4是三七花酸性多糖的dept135
°
nmr谱；
[0063]
图5是三七花酸性多糖的hhcosy nmr谱；
[0064]
图6是三七花酸性多糖的hsqc nmr谱；
[0065]
图7是三七花酸性多糖的hbmc nmr谱；
[0066]
图8是三七花酸性多糖的noesy nmr谱。
具体实施方式
[0067]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
[0068]
实施例1三七花多糖的提取与纯化
[0069]
方法1
[0070]
所用原料为三年生三七花，采自云南省文山州砚山县三七种植基地，阴干后粉碎，过40目筛，采用石油醚(60-90℃)在索氏提取器中进行脱脂处理，脱脂后的三七花粉在室温下晾干后备用。准确称取预处理后的三七花粉的三七花粉100g,加入蒸馏水2.4l，在85℃下回流提取2h,共提取3次。合并三次提取液，减压浓缩至1.2l，在真空冻干机中冻干，得三七花粗多糖粉末2.97g。将三七花粗多糖配制成浓度为3mg/ml的溶液后，首先采用deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱，依次采用0、0.5m、1.0m与2.0m的nacl溶液进行梯度洗脱，收集2.0m的nacl洗脱液，浓缩后采用半透膜(mw3000)透析，真空低温冻干，得到经初步纯化的三七花多糖片段1.02g。将经deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱纯化的三七花多糖配制成浓度为3mg/ml的水溶液后，采用sephadex g100凝胶柱层析进一步纯化，流动相为去离子水，收集第二个洗脱峰的洗脱液(最大洗脱峰)的洗脱液，浓缩后低温冻干，得到白色粉末0.53g，即为纯化的三七花酸性多糖。
[0071]
方法2
[0072]
所用原料为三年生三七花，采自云南省文山州砚山县三七种植基地，阴干后粉碎，过40目筛，采用石油醚(60-90℃)在索氏提取器中进行脱脂处理，脱脂后的三七花粉在室温下晾干后备用。准确称取预处理后的三七花粉的三七花粉300g,加入蒸馏水9l，在90℃下回流提取2.5h,共提取3次。合并三次提取液，减压浓缩至2.5l，在真空冻干机中冻干，得三七花粗多糖粉末8.53g。将三七花粗多糖配制成浓度为5mg/ml的溶液后，首先采用deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱，依次采用0、0.5m、1.0m与2.0m的nacl溶液进行梯度洗脱，收集2.0m的nacl洗脱液，浓缩后采用半透膜(mw3000)透析，真空低温冻干，得到经初步纯化的三七花多糖片段3.07g。将经deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱纯化的三七花多糖配制成浓度为5mg/ml的水溶液后，采用sephadex g100凝胶柱层析进一步纯化，流动相为去离子水，收集第二个洗脱峰的洗脱液(最大洗脱峰)的洗脱液，浓缩后低温冻干，得到白色粉末1.75g，即为纯化的三七花酸性多糖。
[0073]
方法3
[0074]
所用原料为三年生三七花，采自云南省文山州砚山县三七种植基地，阴干后粉碎，过40目筛，采用石油醚(60-90℃)在索氏提取器中进行脱脂处理，脱脂后的三七花粉在室温下晾干后备用。准确称取预处理后的三七花粉的三七花粉50g,加入蒸馏水2.0l，在90℃下回流提取2h,共提取3次。合并三次提取液，减压浓缩至0.8l，在真空冻干机中冻干，得三七花粗多糖粉末1.42g。将三七花粗多糖配制成浓度为4mg/ml的溶液后，首先采用deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱，依次采用0、0.5m、1.0m与2.0m的nacl溶液进行梯度洗脱，收集2.0m的nacl洗脱液，浓缩后采用半透膜(mw3000)透析，真空低温冻干，得到经初步
纯化的三七花多糖片段0.54g。将经deae-52cellulose阴离子交换纤维素柱纯化的三七花多糖配制成浓度为3mg/ml的水溶液后，采用sephadex g100凝胶柱层析进一步纯化，流动相为去离子水，收集第二个洗脱峰的洗脱液(最大洗脱峰)的洗脱液，浓缩后低温冻干，得到白色粉末0.29g，即为纯化的三七花酸性多糖。
[0075]
实施例2三七花酸性多糖结构的鉴定
[0076]
经提取纯化得到酸性多糖经hpgpc的洗脱曲线为一对称峰，表明该白色粉末为均一多糖，其mp、mw与mn分子量分别为3.7
×
103da、4.5
×
103da与3.1
×
103da。采用离子色谱仪(ics5000)对其单糖组成进行了测定，表明该多糖主要由半乳糖醛酸与葡糖糖醛酸组成。采用gc-ms对甲基化产物进行了分析，甲基化分析数据见表1，表明该多糖主要有
→
4)-α-galp-(1
→
、
→
4)-β-glcp-(1
→
和
→
3,4)-α-galp-(1
→
三种单糖残基组成，其比例约为4：1：1。
[0077]
表1三七花酸性多糖甲基化分析数据
[0078][0079]
结合三七花酸性多糖的甲基化分析结果，从dept135
°
与
13
c nmr谱可知，组成该多糖的残基均为糖醛酸残基；根据1h、
13
c与hsqc nmr谱，对三种键型的糖醛酸残基的1h与
13
c进行了化学位移归属，结果见表2。
[0080]
表2糖残基的1h和
13
c核磁共振谱的化学位移归属
[0081][0082][0083]
在hbmc和noesy图谱中，结合核磁一维二维图谱，我们对多糖的糖苷键信号进行归属；糖苷键
→
4)-α-d-galap-(1
→
的异头氢与其自身的h4有相关信号峰；表明存在
→
4)-α-d-galap-(1
→
4)-α-d-galap-(1
→
的链接方式。
→
4)-α-d-galap-(1
→
的异头氢分别与糖苷键
→
3,4)-α-d-galap-(1
→
的h4有相关峰，表明两者间通过(1
→
4)糖苷键连接。
→
4)-β-d-glcap-(1
→
的异头氢与
→
3,4)-α-d-galap-(1
→
的h3有相关峰，表明两者间通过(1
→
3)糖苷键相连。综上所述，可以推断，图1为该多糖的主要糖苷键重复结构单元。
[0084]
实施例3三七花酸性多糖的抗氧化能力评价
[0085]
本发明公开的酸性多糖抗氧化活性分别采用体外抗氧化与体内抗氧化两种方式进行评价，体外抗氧化通过测定其对atbs 与
·
oh两种自由基的清除能力进行评价，体内抗氧化以秀丽隐杆线虫为模式生物，测定该多糖对秀丽隐杆线虫的寿命、体内sod的活性与
mda和ros的含量进行评价。
[0086]
(1)体外抗氧化评价方法与结果
[0087]
a.abts 清除能力
[0088]
精确量取5ml 7mmol/labts溶液与88μl 140mmol/l过硫酸钾溶液混合，在室温避光条件下静置过夜，形成abts储备液。使用前用溶剂稀释，要求其在734nm下吸光值0.7
±
0.002。2ml样品溶液加入8mlabts 工作液，混合10s，在室温下静置6min，于734nm下测定吸光值。分别以蒸馏水和vc作空白和阳性对照，试验重复三次。按照下式计算abts 清除率：abts

清除率＝(空白组od值-样品组od值)/空白组od值
×
100％
[0089]
b.
·
oh清除能力
[0090]
精确量取2ml样品溶液分别加入0.5ml 9mmol/l的水杨酸和0.5ml 9mmol/l的硫酸亚铁，最后向混合溶液中加入0.5ml 8.8mmol/l的双氧水启动反应，反应30min，在波长510nm下测定各溶液的吸光值。分别以蒸馏水和vc作空白和阳性对照，试验重复三次。按照下式计算
·
oh清除率：
[0091]
·
oh清除率＝[空白组od值-(样品组od值-底色组od值)]/空白组od值
×
100％
[0092]
不同浓度下三七花酸性多糖的对两种自由基的清除率如表3所述，结果表示为平均值
±
标准差。结果表明在一定的浓度范围内，三七花酸性多糖对abts 与
·
oh的清除具有浓度依赖效应，随着浓度的增加，清除率逐渐升高。经进一步分析，三七花酸性多糖与vc清除abts 的ic50分别为0.49mg/ml和0.20mg/ml,清除
·
oh的ic50分别为0.44mg/ml和0.13mg/ml。
[0093]
表3不同浓度的三七花酸性多糖体外抗氧化
[0094][0095]
(2)体内抗氧化研究方法与结果
[0096]
a.秀丽隐杆线虫寿命的测定
[0097]
随机挑选l4阶段的线虫分为空白对照组、阳性对照组(0.05mg/ml egcg)、三七花酸性多糖低剂量组(0.20mg/ml)、中剂量组(0.40mg/ml)和高剂量组(0.80mg/ml)，每组100条，置于各组对应的固体ngm培养基上，于20℃下恒温培养。每天观察各组线虫生存状况，记录死亡条数和丢失条数，计算各组线虫的平均存活时间，试验重复3次。
[0098]
b.生化指标的测定
[0099]
随机挑选l4阶段的线虫，分别设置空白对照组、阳性对照组(0.05mg/ml egcg)、三七花酸性多糖低剂量组(0.20mg/ml)、中剂量组(0.40mg/ml)和高剂量组(0.80mg/ml)，每组
100条，置于各组对应的固体ngm培养基上培养48h后，将线虫从培养皿表面洗脱至2ml离心管中，匀浆后离心，取上清，备用。按试剂盒说明书测定线虫体内超氧化物歧化酶(sod)、丙二醛(mda)、活性氧自由基(ros)的含量。
[0100]
三七花酸性多糖体内抗氧化结果如表4所示，数据表示为平均值
±
标准差，组间比较采用单因素方差分析，p《0.05表示有统计学差异。
[0101]
据表4中试验结果可看出，在一定的浓度范围内，随着三七花酸性多糖浓度的增大，秀丽隐杆线虫的寿命越长，sod活性越强，ros与mda含量越低，表明三七花酸性多糖在体内具有较好抗氧化活性。
[0102]
表4三七花酸性多糖体内抗氧化
[0103][0104]
注*表示p《0.05，与空白对照组相比，存在显著差异；**表示p《0.01，与空白对照组相比，差异极显著。
[0105]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。