一种过表达SDF-1的BMSCs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用的制作方法

一种过表达sdf-1的bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用
技术领域
1.本发明生物技术领域，具体涉及一种过表达sdf-1的bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用。


背景技术：

2.口腔种植是用外科手段将人工材料设计的种植体在颌骨内植入的技术，目前已成为临床上口腔缺牙的常规修复手段。由于口腔种植较传统的义齿修复，具有无异物感，提高患者的咀嚼功能，无需损伤邻牙且功能和美学效果好等优点，给广大的口腔缺牙患者带来满意疗效。现在越来越多的患者要求种植义齿修复，但是患者当中特别是糖尿病种植患者往往伴随有不同程度的牙列缺损、牙列缺失或者骨密度低，影响着种植体周围的骨结合(骨结合是指种植体表面和周围健康骨组织之间没有任何纤维结缔组织间隔的直接连接，具有分散功能性负重的能力，并且不会对邻近组织及全身产生不利的影响)，易造成种植失败，糖尿病患者种植的高失败率问题一直困扰着口腔临床医生，所以糖尿病被列为口腔种植手术的相对禁忌症。
3.糖尿病(diabets)影响种植体周骨结合的机理尚不十分清楚。糖尿病是一组以血葡萄糖水平增高为特征的代谢紊乱疾病群，高血糖是由于胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用缺陷引起的。2013年international diabetes federation(idf)公布全球糖尿病患者达3.83亿，糖尿病已成为全球性的公共健康问题,是严重威胁人类健康的慢性病之一，其中90％以上为2型糖尿病患者。近年来糖尿病发病率逐年提升,目前我国糖尿病患病人数已成为世界第一。在我国，糖尿病患病率已达 9.7％。研究已证实糖尿病会导致人或者动物模型的骨组织钙磷流失,骨代谢异常, 以及骨结构和骨质量发生改变，而颌骨的质量是人工种植体修复成功的基础,糖尿病无疑会影响到种植的成功率。种植体植入后或功能性负重后，种植体-骨界面的骨组织将进行一系列吸收、重建和改建，形成纤维骨性结合或骨结合。种植体植入后或功能性负重后，这种种植体-骨结合形式既能够满足负重的需要又可保证周围组织的健康，是牙种植成功的关键，是目前牙种植体的一个重要的生物学基础。糖尿病引起种植失败的病理因素有抑制成骨细胞功能、微血管动脉硬化、抑制免疫细胞活性、促进胶原分解等，可使软硬组织对局部致病因子的抵抗力下降，影响骨结合。ana menado valero等对2型糖尿病患者种植体周围的骨组织进行组织学上分析认为骨结合异常是由于骨重建的改变和矿化不足导致。mccracken等研究表明，与血糖控制良好的实验性糖尿病大鼠相比，糖尿病大鼠骨形成量相似，但与种植体接触面积减少。糖尿病组种植体周围的骨结合和碱性磷酸酶减少，但血清钙是增加的。hasegawa等研究发现2型糖尿病大鼠的胫骨远端种植体表面新形成的骨连续性很差，大量的软组织在种植体的内表面，同时较为广泛的软组织介入种植体和骨组织之间，从而影响种植体的骨结合。种植成功与否最重要的标准就是种植体与骨组织之间是否形成骨结合，而糖尿病抑制了种植体周围的骨结合，因此如何促进2型糖尿病患者种植体周围的骨结合就成了提高种植体成功率的关键，对糖尿病患者种植成功具
有重大意义。
4.目前，应用于口腔修复功能重建的种植技术虽然己较为成熟，如branemark、 iti、camlog、cdic等多种种植体系均有较高的临床成功率，但是长期以来种植体周围骨缺隙一直限制着种植体在临床的广泛应用。传统的种植义齿从拔牙到义齿修复需要10个月时间，给患者咀嚼和营养吸收功能带来不利影响，并且在拔牙创口自然愈合过程中还伴随不同程度的牙槽骨萎缩和牙槽骨的变窄，特别是在拔牙后的3个月最为明显。患者等待镶牙的时间越长，牙槽骨的吸收越明显，给义齿修复带来困难。目前即便是新方法-即刻种植，也存在如何使牙床中的种植体保持稳定和促进种植体的早期骨结合等问题。如何有效地提高种植体周围骨高度及骨结合面积，促进种植体周围尽早形成骨结合，如何使用生物介质提高种植体周支持骨的质和量，对于增强种植体的稳定性及其适应复杂多变的口颌系统功能的能力，降低种植体周围炎的发生机率，提高种植牙的近远期成功率具有重要的意义。
5.目前已有较多的实验通过对种植体周围施加干预来增加种植体骨结合率从而提高种植成功率，并取得了一定成果，包括了增加种植体周骨粉、增加种植体周胰岛素水平、增加种植体周促骨形成细胞因子等等，但用干细胞干预来提高种植体成功率的研究报道较少。
6.研究证实干细胞尤其是骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells，bmscs) 具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。近年来国内外研究发现，骨髓内的间充质干细胞在骨组织受到创伤刺激和局部微环境因素的影响，能够进行增殖，并经骨原细胞、前成骨细胞最终分
7.化为成骨细胞，以参与组织更新、创伤修复及骨生成等。在bmscs向成骨细胞分化中，受到多种信号通路调控，其中转化生长因子β1(transforming growthfactorβ1，tgf-β1)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,bmps)、wnt、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,mapk)和刺猬蛋白信号通路(hedgehog)信号通路发挥了重要作用。tgf-β1在骨形成方面起重要作用，可促进骨髓间充质干细胞向成骨分化，抑制其向破骨细胞分化，它在骨重建过程中的作用逐渐成为人们研究的热点。房佰俊等发现tgf-β1促进bmscs 的增殖。尽管bmscs已被证实可以诱导骨形成，但是在种植牙周围骨结合方面的研究较少，在糖尿病患者种植牙的治疗方面尚未有研究报道。bmscs的募集依靠趋化因子受体、活性脂、补体系统、微泡等许多细胞通路参与调解。趋化因子如肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，hgf)、干细胞因子(stem cellfactor，scf)及基质细胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α，sdf-1α) 等对bmscs有显著的趋化效应，并且对血管的形成也具有促进作用，同时这些因子在一定程度上对bmscs可有促生长作用，其中sdf-1/cxcr4轴是最主要的。许多研究表明，基质细胞衍生因子1α(sdf-1α)是bmscs向损伤器官、炎症组织特异性归巢的关键分子，通过这些细胞表面表达的趋化因子受体4 (cxcr4)相关引导而起趋化归巢作用。sdf-1α能够与bmscs表面受体cxcr4 形成sdf-1/cxcr4信号通路对bmscs产生募集作用，并靶向bmscs趋化迁移，指引表达cxcr4的目的细胞在体内迁移。缺血、炎症或损伤部位局部产生的sdf-1α与bmscs表面表达的cxcr4在细胞迁移过程中起到关键作用。 sdf-1α能够促进内皮细胞分泌血管内皮生长因子，促进血管生成。sdf-1α对包
括造血干细胞、内皮祖细胞在内的多种干细胞和白细胞、肿瘤细胞等多种成体细胞有趋化作用,而且是多种干细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞的生长因子，这些优势在理论上均有利于种植牙周骨结合性的提高，提示我们sdf-1具有诱导 bmscs成骨趋势的潜力，可以作为种植牙周骨结合治疗的潜在策略。


技术实现要素：

8.为了解决上述缺陷，本发明提供了一种过表达sdf-1的人骨髓间充质干细胞bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用。
9.为了解决现有技术的问题，本发明提供了如下技术方案：本发明的一种过表达sdf-1的bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用。
10.进一步地，所述的过表达sdf-1基因的cds序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
11.进一步地，所述的过表达sdf-1基因的过表达载体序列为seq id no.2所示的核苷酸序列。
12.更进一步地，所述的过表达sdf-1的bmscs对糖尿病条件下能够提高种植体骨结合率。
13.进一步地，所述的bmscs和sdf-1-bmscs都可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的col1，ocn和runx2的蛋白表达量。
14.进一步地，所述的种植体为牙种植体。
15.本发明所述的过表达sdf-1的bmscs对糖尿病骨缺损成骨细胞的诱导分化作用。
16.有益效果：本发明首次在体外实验研究了过表达sdf-1的bmscs对糖尿病骨缺损成骨细胞的诱导分化作用。本发明首次通过体内实验，证实了过表达 sdf-1的人骨髓间充质干细胞bmscs对糖尿病条件下骨结合具有促进作用。
17.与现有技术相比，本发明具有如下优点：本发明构建稳定过表达sdf-1的 bmscs，了解其成骨性质。本发明拟利用慢病毒感染人骨髓间充质干细胞 bmscs构建稳定的过表达sdf-1的bmscs，在体外细胞实验验证其对成骨性诱导的优势作用，并且利用糖尿病sd大鼠骨缺损模型，证实过表达sdf-1的 bmscs对种植体周围骨结合的影响。
附图说明
18.图1为本发明目的基因与构建重组质粒的测序比对结果图。
19.图2为本发明sdf-1-phblv-cmv慢病毒感染293t细胞48小时情况图。
20.图3为本发明sdf-1-phblv-cmv慢病毒及其对照病毒感染bmsc细胞48 小时情况图。
21.图4为本发明sdf-1在各组中的表达情况图；数据以平均值 标准差(sd) 的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析， *:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
22.图5为本发明sdf-1-phblv-cmv慢病毒及其对照病毒对bmscs细胞形态的影响，200x图。
23.图6为本发明sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞增殖的影响图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析 (one-way anova)进行统计
分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
24.图7为本发明sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞凋亡的影响图。
25.图8为本发明sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中i型胶原蛋白表达的影响图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.
26.图9为本发明sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中各基因表达的影响图。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
27.图10为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中各蛋白表达的影响图。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.。
28.图11为本发明糖尿病(stz)大鼠成骨细胞的茜红素染色，100x图。
29.图12为本发明不同处理的bmscs对糖尿病大鼠成骨细胞形态的影响图， 100x。
30.图13为本发明各组成骨细胞的增殖活力图；数据以平均值 标准差(sd) 的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析， *:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
31.图14为本发明各组糖尿病大鼠成骨细胞分化检测图。
32.图15为本发明各组成骨细胞的alp含量图；数据以平均值 标准差(sd) 的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析， *:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
33.图16为本发明各组成骨细胞的collagen i和骨钙素含量图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova) 进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
34.图17为本发明各组成骨细胞的col1，ocn和runx2的mrna水平表达量图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
35.图18为本发明各组成骨细胞的col1，ocn和runx2的蛋白表达量图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.。
36.图19为本发明的g组:dm股骨缺损组的micro-ct三维重建图像图。
37.图20为本发明的h组:dm股骨缺损 bmscs组的micro-ct三维重建图像图。
38.图21为本发明的j组:dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组的micro-ct三维重建图像图。
39.图22为本发明的术后第2周g组:dm股骨缺损组的micro-ct he染色结果图。
40.图23为本发明的术后第2周h组:dm股骨缺损 bmscs组的he染色结果图。
41.图24为本发明的术后第2周j组:dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组的he染色结果图。
具体实施方式
42.为了更好的理解本发明，下面通过实施例对本发明进一步说明，实施例只用于解释本发明，不会对本发明构成任何限定。
43.实施例1
44.本发明的一种过表达sdf-1的人骨髓间充质干细胞bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合中的应用。
45.所述的过表达sdf-1的bmscs在促进糖尿病患者的种植体和骨组织结合的药物中的应用。
46.所述的过表达sdf-1基因的cds序列为seq id no.1所示的核苷酸序列。
47.所述的过表达sdf-1基因的过表达载体序列为seq id no.2所示的核苷酸序列。
48.所述的过表达sdf-1的bmscs对糖尿病条件下能够提高种植体骨结合。
49.所述的种植体为牙种植体。所述的bmscs和sdf-1-bmscs都可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的col1，ocn和runx2的蛋白表达量。
50.本发明所述的过表达sdf-1的bmscs对糖尿病骨缺损成骨细胞的诱导分化作用。
51.试验例1
52.(一)研究方法及研究指标
53.(1)体外细胞实验研究过表达sdf-1对bmscs的影响
54.构建过表达sdf-1慢病毒质粒，感染bmscs，并利用g418筛选，最终构建稳定过表达sdf-1的bmscs(sdf-1-bmscs)。并比较其与正常bmscs的迁移，增殖，存活情况。随后利用成骨诱导剂，处理不同细胞系，在不同时间点，比较诱导成骨的分化情况。同时检测诱导前以及诱导后不同时间bmscs中成骨相关的细胞因子成骨相关因子-i型胶原(col-i)、骨钙素(ocn)、runt相关转录因子2(runx-2)的基因、蛋白等的表达水平变化。
55.(2)体外细胞实验研究过表达sdf-1的bmscs(sdf-1-bmscs)对糖尿病患者成骨细胞的影响
56.观察bmscs对两组细胞的增殖，迁移，成骨分化，同时检测成骨相关蛋白的表达水平变化。
57.(3)糖尿病sd大鼠骨缺损模型中实验研究过表达sdf-1的bmscs (sdf-1-bmscs)对骨缺损骨结合的影响
58.构建糖尿病sd大鼠骨缺损模型，将sdf-1-bmscs和bmscs和 sdf-1-bmscs分别注射于骨缺损周围，he染色、x光和micro-ct对比观测糖尿病sd大鼠和正常sd大鼠骨缺损周围新骨形成，骨密度变化等。
59.(二)实验结果
60.(1)体外细胞实验研究过表达sdf-1对bmscs的影响
61.1大鼠sdf-1过表达慢病毒构建及包装
62.本实验成功构建了大鼠sdf-1过表达慢病毒载体
63.seq id no.1：rsdf-1基因cds序列信息如下：
64.atggacgccaaggtcgtcgccgtgctggccctggtgctggccgcgct ctgcatcagtgacggtaagccagtcagcctgagctacagatgcccctgcc gattctttgagagccatgtcgccagagccaacgtcaaacatctgaaaatcc tcaacactccaaactgtgcccttcagattgttgcaaggctgaaaagcaac aacagacaagtgtgcattgacccgaaattaaagtggatccaagagtacct ggacaaagccttaaacaagtaa
65.rsdf-1过表达载体测序结果:成功插入到目的载体的大鼠sdf-1基因的cds 序列。载体构建成功，无突变。seq id no.2：
66.tgacgtcaatgggtggagtattacggtaaactgcccacttggcagtac atcaagtgtatcatatgccaagtacgcccctattgacgtcaatgacggtaaa tggcccgcctggcattatgcccagtacatgactttatgggactttcctactt ggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttg gcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaag tctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacg ggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcg gtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctcgtttagtgaacc gtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagac accgactctactagaggatctatttccggtgaattcgccaccatggacgcc aaggtcgtcgccgtgctggccctggtgctggccgcgctctgcatcagtga cggtaagccagtcagcctgagctacagatgcccctgccgattctttgagag ccatgtcgccagagccaacgtcaaacatctgaaaatcctcaacactccaa actgtgcccttcagattgttgcaaggctgaaaagcaacaacagacaagtg tgcattgacccgaaattaaagtggatccaagagtacctggacaaagcctt aaacaagggatcctcggtaccaagcttaagtgactacaaggatgacgatg acaaggattacaaagacgacgatgataaggactataaggatgatgacgac aaataaagatccatcgatactagtaaggatctgcgatcgctccggtgcccg tcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttgggggga ggggtcggcaatgaacgggtgcctagagaaggtgccccgg
67.图1为本发明的目的基因与构建重组质粒的测序比对结果图。结果显示，大鼠sdf-1过表达慢病毒载体sdf-1-phblv-cmv构建成功。
68.2、病毒包装并浓缩后得到的滴度为：
69.滴度(tu/ml)＝细胞数
×
阳性克隆百分比
×
moi(1)
×
病毒稀释倍数
×ꢀ
10^3tu/ml。
70.在293t细胞中计算病毒滴度，加入10ul病毒加入到100ul培养基中；
71.如下图所示，计算出慢病毒的滴度(tu/ml)＝4
×
10^4
×
50％
×
病毒稀释倍数(10)
×
10^3＝2
×
10^8tu/ml
72.图2为本发明的sdf-1-phblv-cmv慢病毒感染293t细胞48小时情况图。
73.3、rsdf-1过表达慢病毒验证
74.图3为本发明的sdf-1-phblv-cmv慢病毒及其对照病毒感染bmscs细胞 48小时情况图。
75.图4为本发明的sdf-1在各组中的表达情况图。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
76.图3和4显示，前面所包装的sdf-1过表达慢病毒具有较高的感染效率，且sdf-1基因的表达也显著增加，可以用于后续实验。
77.4.bmsc细胞形态
78.观察sdf-1对大鼠骨髓间充质干细胞形态的影响。
79.图5为本发明的sdf-1-phblv-cmv慢病毒及其对照病毒对bmscs细胞形态的影响，200x图。
80.5.细胞增殖结果
81.采用cck-8试剂盒对各组bmscs细胞增殖情况进行检测。结果显示：sdf-1 过表达可以显著增加bmsc细胞的活力。
82.图6为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞增殖的影响图。数据以
平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析 (one-wayanova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
83.6.细胞增殖结果
84.采用annexin-v/fitc-pi细胞凋亡试剂盒对各组bmscs细胞凋亡情况进行检测。结果显示：各组细胞间凋亡细胞百分数无显著差异。
85.图7为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞凋亡的影响图。
86.7.collagen i含量
87.采用collagen i elisa试剂盒检测细胞中collagen i的含量。结果显示：sdf-1 过表达显著增加了collagen i的含量。
88.图8为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中i型胶原蛋白表达的影响图。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.
89.8.实时荧光定量结果
90.利用2-δδct的方法来分析对照组与实验组之间各个不同基因的相对表达量差异倍数。
91.2-δδct方法即：表达水平差异＝2x倍，其中，δδct＝(实验组待测-实验组内参)-(对照组待测-对照组内参)，2-δδct得出的数值代表实验组x基因的表达水平是对照组的2-δδc倍。结果显示：sdf-1过表达可以显著促进bmscs 细胞中col1，ocn和runx2基因的表达。
92.图9为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中各基因表达的影响图。
93.数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析 (one-wayanova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
94.3.7 western blot检测结果
95.根据测定的蛋白含量作为参照，每个胶孔加入等量蛋白，再以-actin为参照验证蛋白含量，重复实验调整蛋白上样量使其一致，使用统一蛋白上样量进行sds-page，每个蛋白上样40ug进行sds-page，转膜，孵育一抗，再使用二抗，以bio-rad化学发光成像系统显色，结果使用image j 2x软件对 western-blot条带进行半定量，分析其读数，最后以(待测一抗/β-actin)作为该蛋白的相对表达量。结果显示：sdf-1过表达可以显著促进bmscs细胞中col1， ocn和runx2蛋白的表达。
96.图10为本发明的sdf-1/phblv-cmv过表达对大鼠bmscs细胞中各蛋白表达的影响图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.
97.试验例2
98.(2)体外细胞实验研究过表达sdf-1的bmscs(sdf-1-bmscs)对糖尿病患者成骨细胞的影响
99.1.成骨细胞鉴定
100.用茜红素s染色对成骨细胞进行鉴定，成骨细胞会出现不用红色的矿化结节。
101.图11为本发明的糖尿病(stz)大鼠成骨细胞的茜红素染色，100x图。
102.2.不同处理的bmscs对糖尿病大鼠成骨细胞形态的影响
103.糖尿病大鼠成骨细胞(ob)分别与大鼠bmscs和sdf-1-bmscs在transwell 中共培养，观察sdf-1-bmscs细胞上清液对糖尿病大鼠成骨细胞形态的变化。
104.图12为本发明的不同处理的bmscs对糖尿病大鼠成骨细胞形态的影响， 100x图。
105.3.细胞增殖结果
106.采用cck-8试剂盒对各组成骨细胞增殖情况进行检测。结果显示：bmscs 和sdf-1-bmscs都可以增加糖尿病大鼠成骨细胞的活力。
107.图13为本发明的各组成骨细胞的增殖活力
108.数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析 (one-wayanova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
109.4.成骨细胞分化检测
110.采用茜素红对各组成骨细胞分化情况进行检测。
111.图14为本发明的各组糖尿病大鼠成骨细胞分化检测图。
112.5.alp含量
113.采用alp含量试剂盒检测各组细胞中alp的含量。结果显示： sdf-1-bmscs可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的alp含量。图15.各组成骨细胞的alp含量。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.
114.6.collagen i和骨钙素的含量
115.采用elisa的方法检测各组细胞中collagen i和骨钙素的含量。结果显示： bmscs和sdf-1-bmscs都可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的collagen i和骨钙素含量。
116.图16为本发明的各组成骨细胞的collagen i和骨钙素含量图；数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova) 进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
117.7.荧光定量检测结果
118.实时荧光定量pcr检测各组细胞中col1，ocn和runx2基因的表达变化。结果先msc和sdf-1-bmscs都可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的col1， ocn和runx2的表达量。
119.图17为本发明的各组成骨细胞的col1，ocn和runx2的mrna水平表达量数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析 (one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***:p《0.001.
120.8.western blot结果
121.western blot检测各组细胞中col1，ocn和runx2蛋白的表达变化。结果先bmscs和sdf-1-bmscs都可以显著增加糖尿病大鼠成骨细胞的col1， ocn和runx2的蛋白表达量。图18.各组成骨细胞的col1，ocn和runx2 的蛋白表达量。数据以平均值 标准差(sd)的形式呈现，数据差异采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计分析，*:p《0.05；**:p《0.01；***: p《0.001.
122.(3)糖尿病sd大鼠骨缺损模型中研究过表达sdf-1的bmscs (sdf-1-bmscs)对骨缺损的早期愈合和骨结合影响
123.1.ct检测各组大鼠股骨缺损情况
124.随机选用45健康8周龄雄性sd大鼠，适应性饲养1w后，构建sd大鼠糖尿病模型(dm)；采用链脲佐菌素(stz)一次性腹腔内注射的方法，制备大鼠糖尿病模型：健康sd大鼠禁食10h，按60mg/kg剂量腹腔注射stz，stz浓度为2.5mg/ml，注药后48h采用尾静脉采血检测每只老鼠血糖，若血糖浓度高于16.7mmol/l则糖尿病模型造模成功，dm造模后正常饲养1w，然后进行股骨缺损模型造模，并在缺损股骨周围注射大鼠bmscs/sdf-1-bmscs细胞；实验共分为以下几组：
125.g组:dm股骨缺损组
126.h组:dm股骨缺损 bmscs组
127.j组:dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组
128.根据以上分组构建大鼠模型后，正常饮食饲养1周后取材，以g组为例样本记为g-1w；饲养2周后取材，样本记为g-2w。然后进行ct检测。
129.(1)micro-ct检测结果
130.局部micro-ct三维重建图像可见，dm股骨缺损组、dm股骨缺损 bmscs 组、dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组三组术后1周均已形成骨结合。术后2周同组的骨结合量均大于术后1周。但dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组新生骨量大于dm股骨缺损 bmscs组，而且dm股骨缺损 bmscs组新生骨量大于dm 股骨缺损组。术后2周时，dm股骨缺 sdf-1-bmscs组相比较另外两组形成的骨组织最厚，排列最规则。
131.2.he染色结果
132.术后第1周，dm股骨缺损组、dm股骨缺损 bmscs组、dm股骨缺损 sdf-1-bmscs组三组骨损伤修复纤维性组织增多，骨修复组织中主要可见大量炎性细胞及纤维组织，细胞增殖最为活跃，细胞核染色较深，其修复区边缘见到前成骨样细胞；术后2周时可见术区的细胞成分较1周时减少，基质密度更加均匀，细胞核大、染色深，修复区边缘仍可见到前成骨样细胞。术后2周时，dm股骨缺 sdf-1-bmscs组相比较另外两组形成的骨基质最厚，排列最规则。
133.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。