生物标志物EPN3在制备诊断或评估肺癌的产品中的应用

生物标志物epn3在制备诊断或评估肺癌的产品中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及生物标志物epn3在制备诊断或评估肺癌的产品中的应用。


背景技术：

2.肺癌是全球发病人数第二多的肿瘤，全球发病人数在2020年超过220w人。根据病理的分型，肺癌可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌的病例远远多于小细胞肺癌。非小细胞肺癌中，又可以分为肺腺癌和肺鳞癌，其中肺腺癌是主要的病理类型。虽然目前肺癌的诊断和治疗手段在临床上取得了显著的进步，但是肺癌的死亡率仍是所有肿瘤中的第一位，早期肺癌的患者的治疗效果及预后明显要好于中晚期的患者，所以早期诊断患癌对于肺癌患者至关重要。
3.内吞作用在细胞内调节多种生理过程，并且在肿瘤的发生中起到关键作用。epsin是一种衔接子蛋白，参与细胞内吞过程。epsin家族包括epsin1(epn1)、epsin2(epn2)和epsin3(epn3)。epsin1和epsin2在肿瘤中的作用受到广泛研究，参与调节血管生成等生物学功能，但关于epn3在癌症中的研究很少。epn3在正常的组织中表达量很低，仅在损伤的上皮组织和胃壁细胞中高表达。目前的研究表，epn3在乳腺癌和神经胶质瘤等肿瘤中表达量异常升高，并且介导和参与肿瘤发生和发展中的多种生物学进程，通过epn3基因表达量的判断及其表达的干预，能对肿瘤的发现和发展提供新的诊断和治疗方案。目前尚无epn3在肺癌方面的研究。


技术实现要素：

4.本发明的发明人通过生物信息学的方法，发现epn3在肺癌患者的肿瘤组织中的表达量明显升高，并且具有预后和诊断的意义。通过生物信息学和实验验证，表明epn3对于诊断肺癌患者有着较好的敏感性。基于此，本发明保护如下技术方案：
5.本发明一方面保护检测样本中生物标志物的试剂在制备诊断或评估肺癌的产品中的应用，所述生物标志物为epn3。
6.所述epn3在ncbi的gene id:55040。
7.所述肺癌为非小细胞肺癌。
8.进一步地，所述肺癌为肺腺癌或大细胞肺癌。
9.在上述应用中，与正常对照相比，epn3在肺癌患者中的表达水平上调；一般认为log2fc绝对值大于1即表达相差两倍以上有意义。
10.在上述应用中，所述试剂包括：特异性识别epn3基因的探针；特异性扩增epn3基因的引物；或特异性结合epn3基因编码的蛋白的结合剂。
11.所述特异性扩增epn3基因的正、反向引物的序列如seq id no.1、2所示。
12.所述试剂包括在mrna水平或蛋白水平上检测生物标志物epn3表达水平的试剂。
13.在上述应用中，所述样本选自肺组织。
14.本发明的另一方面还保护生物标志物在构建预测或评估肺癌的计算模型中的应用，所述生物标志物为epn3。
15.本发明的有益效果是：通过生物信息学数据分析及pcr及wb验证，在肺癌的患者中，epn3基因的表达水平显著高于正常情况，随后通过生物信息学数据对正常肺组织及肺癌组织epn3的表达量对比，通过roc验证epn3的表达能很好的分辨正常组织和肿瘤组织，并通过epn3的表达量及患者的预后信息，表明，epn3的表达量高低能一定程度上预测患者的预后情况。
附图说明
16.图1是通过gpeia数据分析工具确定epn3在肺腺癌患者组织中的表达差异结果。
17.图2是pcr检测结果。
18.图3是westernblot检测结果。
具体实施方式
19.下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
20.下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；所用化学、生物试剂，如无特别说明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。
21.实施例1
22.1.实验材料及试剂：
23.1.1生物信息学数据来源
24.gepia公开数据库获取tcga数据库中的luad(肺腺癌)患者的基因表达数据及相应的临床数据，得出其表达差异和预后。
25.1.2实验细胞及培养基
26.人正常肺上皮细胞beas-2b，肺腺癌细胞a549，大细胞肺癌细胞h460，肺腺癌细胞系h1299。培养基：gibicodmem高糖，f-12k，1640。血清：pan南美胎牛血清。
27.1.3实验用的抗体
28.epn3抗体(cohesion bio，货号：cpa4402)，gapdh抗体(武汉塞维尔，货号：gb15004)。
29.1.4 pcr引物
30.epn3的ncbi的gene id：55040，转录本号nm_017957.3-n p_060427.2(此为mrna上转录本的范围)。
31.根据epn3基因序列，设计epn3扩增引物，引物序列如下(上海生工合成)：
32.33.2.实验过程
34.2.1生物信息学分析
35.通过gpeia数据分析工具，确定epn3在肺腺癌患者组织中的表达差异，并且分析其在肺腺癌患者中的预后及诊断意义。
36.在gpeia网站中(http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html)使用tcga联合gtex数据分析epn3在肺癌组织与正常肺组织中的表达差异，差异分析使用483例肺癌组织样本与347例正常肺组织的经log2转化的tpm格式表达谱数据做对比，使用单因素方差分析的方法对数据进行统计学分析，结果表明在肺癌的组织中相比于正常组织，log2fc绝对值大于1即epn3表达量在肺腺癌中的表达量超过正常组织两倍(一般认为log2fc绝对值大于1即表达相差两倍以上有意义)，且p＜0.05具有统计学差异；通过r软件(3.63)，proc包用作roc分析，并用ggplot2包用作roc曲线的制图。
37.统计结果描述
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分组数目最小值最大值中位数(median)四分位距(iqr)均值(mean)标准差(sd)标准误(se)normal34703.5070.5750.8080.7640.670.036tumor51506.1073.4841.4783.3991.1130.049
38.从上面的统计描述表中可以看到：在epn3组中，normal组的平均水平为0.764
±
0.67，tumor组的平均水平为3.399
±
1.113，表明epn3的表达，在normal组中表达水平低于tumor组。
39.从auc结果表分析(见下表)来看，在预测normal和tumor结局上，变量epn3的预测能力有较高准确性(auc＝0.965，ci＝0.954-0.977)。
40.auc结果表
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预测变量预测结局曲线下面积(auc)置信区间(ci)epn3tumor vs normal0.9650.954-0.977
41.匹配肺腺患者表达谱及临床预后的数据，通过km曲线分析epn3的表达对于患者预后的影响。cox回归结果(见下表)提示，group分组的生存时间分布的差异具有统计学意义，p＝0.017。epn3高表达组预后更差。
42.km曲线统计学差异
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方法hrcip值cox回归1.461.07-2.000.017
43.图1显示了epn3在肺腺癌患者组织中的表达差异结果，图1a显示在tcga联合gtxe正常肺组织的数据中，epn3在肺癌组织中的表达量明显上升，且具有统计学意义；图1b表明epn3在肿瘤中表达量越高，患者可能的生存期就越短，且具有统计学意义；图1c表明诊断roc，说明epn3判断肺癌的能力较强。
44.2.2细胞培养
45.通过pcr检测在细胞系中epn3的表达水平。
46.日常细胞培养的步骤为：从37℃恒温孵箱中取出前述细胞系，置于已经经过至少20分钟紫外消毒的超净台中，用1ml移液枪吸出6cm培养皿中残存的培养基，并用无菌pbs 1ml清晰两到三次随后弃去pbs，用5ml移液枪加入4-5ml新的含10％血清的对应培养基，具体为beas-2b加入dmem高糖培养基，a549加入f-12k培养基，h460加入1640培养基，h1299加
入1640培养基，然后放入37℃恒温孵箱继续培养。
47.2.3提取pcr所需mrna
48.采用takara的trizo提取mrna：取步骤2.2孵箱培养后的长满细胞的培养皿，用pbs洗去残余培养基，用1ml无酶移液枪吸取1ml trizo加入已洗去培养基的6cm培养皿中，并用枪头反复吹打，随后吸入1ml无酶ep管中，并向其中加入三氯甲烷200ml并摇晃至液体奶昔样后，放入4℃离心机，按照12000rpm/min离心10分钟后，取出，吸取上清液500ml，注意不要接触到trizo。然后向上清液中加入500ml异丙醇摇晃均匀后静止5分钟，然后4摄氏度离心机离心15分钟，虽然弃去上清液保留底部沉淀，并向沉淀中加入无水乙醇500ul并在4℃离心机中以7500rpm/min离心5分钟，之后弃去上放在室温下放干，放干后加入20ul无酶水溶解，并测量mrna浓度。
49.2.4逆转录合成cdna
50.使用takara的prime script
tm
rt reagent kit withg dna eraser(perfect real time)试剂盒将提取得到的mrna逆转录合成cdna。
51.2.4.1去除基因组dna反应
52.按如下成分于冰上配制反应混合液，为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数 2的量配制mastermix，然后再分装到每个反应管中，最后加入rna样品。
53.试剂使用量5
×
gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μltotalrna*1rnasefreedh2oupto10μl
54.去除dna体系于pcr仪按以下条件反应：42℃2min(或者室温5min*2)
→
4℃保存。
55.2.4.2逆转录反应
56.反应液配制在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先按反应数 2的量配制mastermix，然后再分装10μl到每个反应管中*3。轻柔混匀后立即进行逆转录反应。
57.《tb greenq pcr法》
58.试剂使用量步骤2.4.1的反应液10.0μlprimescript rt enzyme mix i1.0μlrt primer mix*41.0μl5
×
prim escript buffer 2(for real time)4.0μlrnase free dh2o4.0μltotal20μl*5
59.逆转录反应体系放于pcr仪按以下条件反应：37℃15min，85℃5sec，4℃保存。
60.2.5 pcr反应
61.上机：使用takara tb green premix ex taq
tm
ii(tlirnasehplus)试剂盒
62.应用cfx96 real-time pcr detection system的操作方法
63.按下列组份配制pcr反应液(反应液配制在冰上进行)。考虑到吸取误差，配置的预混液体积要至少多于所有反应用总体积的10％。
[0064][0065][0066]
进行real time pcr反应，反应程序：
①
95℃30秒；
②
95℃5秒，60℃30秒，此步骤进行40个循环；
③
95℃5秒，65℃30秒。
[0067]
pcr结果如图2所示，结果表明，相对于正常的肺上皮细胞系beas-2b，肺肿瘤细胞系中epn3的转录水平明显较高。
[0068]
2.6 westernblot
[0069]
(1)提取蛋白：首先，从37℃孵育箱中取出待提取蛋白的beas-2b、a549及h460细胞，之后将待提蛋白的培养皿置于冰上，用移液枪吸出培养皿内剩余的培养基，并用提前低温处理过的pbs冲洗，随后每个6cm的培养皿加入100ul配置好的细胞裂解液(细胞裂解液 1％蛋白酶抑制剂 1％edta抑制剂)。置于冰上，用细胞刮研磨使细胞在冰上充分裂解，持续30分钟，裂解后，用超声震荡2-3次，每次5到10s，使得细胞能充分的裂解，随后放入4℃离心机中以12000rpm/min离心15min，离心完成后，分别从每种细胞的ep管中取100ul的蛋白上清液加入到做好标记的对应的新的ep管中，并加入25ul蛋白上样buffer5x(碧云天，货号：p0015)，将蛋白放于100℃烤锅中，加热10分钟，制备蛋白样本完成。
[0070]
(2)电泳：提前配置电泳液：1l电泳液＝14.4g甘氨酸 3.03g tris 1g sds 双蒸水配好，随后将电泳液倒入提前准备好的sds-page凝胶电泳槽中，并完成加样，开始电泳。
[0071]
(3)电转：配置电转液甘氨酸14.4g tris 3.03g 200ml甲醇配置1l电转液，取出电泳完成的sds-page凝胶，按照marker的分子量切取实验所需目标蛋白及内参的蛋白凝胶条带，放入电转用三明治夹中，并用pvdf膜覆盖，完成后放置好三明治夹开始电转，按照一个分子量1分钟电转。
[0072]
(4)封闭，电转完成后，取出带有marker印记的pvdf膜条带，放入快速封闭液中封闭30min。
[0073]
(5)孵育一抗(epn3抗体及gapdh抗体，epn3是目标蛋白，gapdh是内参蛋白)过夜。
[0074]
(6)一抗孵育过夜后，用滤纸擦干条带，并放入tbst溶液中清洗次，每次10min，随后孵育二抗(武汉三鹰抗兔二抗)1h。二抗孵育完毕后，取出条带擦干，继续用tbst清洗3次，每次10min，完成后曝光。通过bio-redchemidoc成像系统观察对应条带的灰度值，判断蛋白的表达量。
[0075]
结果如图3所示，结果表明在正常肺上皮细胞系和肺癌细胞系中，肺癌细胞系的epn3基因表达量明显高于正常的肺上皮细胞，表明正常肺上皮细胞epn3的表达量低，而在细胞发生肿瘤变化后，表达量明显上升。
[0076]
本发明通过生物信息学数据分析及pcr及wb验证，在肺癌的患者中，epn3基因的表达水平显著高于正常情况，随后通过生物信息学数据对正常肺组织及肺腺癌组织epn3的表达量对比，通过roc验证epn3的表达能很好的分辨正常组织和肿瘤组织，并通过epn3的表达量及患者的预后信息，表明，epn3的表达量高低能一定程度上预测患者的预后情况。