一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用

技术特征：
1.一种无外源氨基酸作用下高产l-甲硫氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌以e.coli w3110 m2/pam为出发菌株，在基因组上对lysa基因进行原位回补，并将lysa基因的启动子替换为pflia启动子，再在pam的质粒上过表达glta基因和maly基因获得的；所述出发菌株e.coli w3110 m2/pam基因型为e.coli w3110 δmetj δmeti δlysa trc-meth trc-metf trc-cyse trc-serb trc-serc/pa*ham，质粒pa*ham为用trc99a质粒的trc强启动子增强meta
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、yjeh、sera
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基因。2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述pflia启动子的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述lysa基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，glta基因的核苷酸序列如seq id no.3所示，maly基因的核苷酸序列如seq id no.4所示。3.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌按如下步骤构建：(1)以e.coli w3110 m2/pam为出发菌株，应用crispr-cas9基因编辑技术将该工程菌基因组中lysa基因进行原位回补，得到工程菌e.coli w3110 m2-lysa-atg/pam；(2)应用crispr-cas9基因编辑技术将工程菌e.coli w3110 m2-lysa-atg/pam基因组中lysa基因的启动子替换为pflia启动子，得到工程菌e.coli w3110 m2-pflia-lysa/pam；(3)以菌株e.coli w3110 m2-pflia-lysa/pam为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的glta基因，将质粒转化到e.coli w3110 m2-pflia-lysa中得到工程菌e.coli w3110 m2-pflia-lysa/pam glta；(4)以菌株e.coli w3110 m2-pflia-lysa/pam glta为底盘菌株，在质粒上过表达大肠杆菌的maly基因，将质粒转化到e.coli w3110 m2-pflia-lysa中得到重组大肠杆菌e.coli w3110 m2-pflia-lysa/pam glta maly。4.一种权利要求1所述重组大肠杆菌在无外源氨基酸作用下生产l-甲硫氨酸的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述的应用为：将所述重组大肠杆菌接种至发酵培养基，在25-35℃、100-200rpm条件下发酵培养，获得含l-甲硫氨酸的发酵液；所述发酵培养基组成如下：葡萄糖20g/l、(nh4)2so
4 16g/l、kh2po
4 1g/l、na2s2o
3 2g/l、酵母提取物2g/l，caco
3 10g/l、vb
12 0.2μg/l、1ml/l微量元素溶液，溶剂为去离子水，ph值自然，其中caco3和vb
12
在接种时加入；微量元素溶液组成为：mgso4·
7h2o 500g/l，feso4·
7h2o 5g/l，mnso4·
8h2o 5g/l，znso
4 5g/l，溶剂为去离子水。6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述重组大肠杆菌接种前先进行扩大培养，再将扩大培养的种子液以体积浓度1-5％的接种量接种到发酵培养基，所述扩大培养是将所述重组大肠杆菌接种到含50mg/l卡那霉素的lb培养基中，37℃培养8-12h，获得扩大培养液；所述lb培养基：蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，nacl 5g/l，溶剂为去离子水，ph值自然。

技术总结
本发明公开了一种无外源氨基酸作用下高产L-甲硫氨酸的重组大肠杆菌及其应用，所述重组大肠杆菌以赖氨酸途径敲除的L-甲硫氨酸高产菌株E.coliW3110M2/pAm为出发菌株，在基因组上对lysA基因进行原位回补，并将lysA基因的启动子替换为PfliA启动子，再在pAm的质粒上过表达gltA基因和malY基因获得的；本发明菌株在发酵过程中无需外源添加必需氨基酸也可以生长良好，降低了发酵成本，解决了发酵过程中必需氨基酸添加时机的不确定性，降低了发酵调控的操作难度，使摇瓶中L-甲硫氨酸产量从添加赖氨酸获得的2.44g/L提高至无外源氨基酸添加时的2.96g/L。的2.96g/L。


技术研发人员：牛坤 傅强 柳志强 周海岩 张博 汤晓玲 徐建妙 郑裕国
受保护的技术使用者：浙江工业大学
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2022/6/10