一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法
技术领域：
：1.本发明涉及癌症风险评估
技术领域：
：，具体涉及一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法。
背景技术：
：：2.nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)是非霍奇金淋巴瘤的一种亚型，世界范围内我国发病率最高。早期nktcl患者5年生存率可达80%，明显优于晚期患者，因此早期诊断和早期治疗可极大降低nktcl死亡率。nktcl个体异质性强，当前预后评价系统多基于临床及病理特征，临床分期相同的患者常表现出明显的预后差异。开发有效且使用简单的检测手段，对于改善患者预后、指导精准治疗以节约医疗资源、减轻患者负担并减少患者治疗副反应等至关重要。3.目前，有研究报道基于基因组测序、单核苷酸多态性的nktcl分子模型，但分别存在需要大量组织切片、价格昂贵、无法反映肿瘤细胞突变等诸多不足；且由于nktcl病变部位组织坏死明显，给nktcl的明确诊断带来一定难度。4.循环肿瘤dna（ctdna）·检测是通过无创/微创方式对非固体组织（主要是血液）肿瘤相关dna的采样及分析，具有无创、全面、动态和敏感的优势。对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定。因此，ctdna甲基化水平是更理想的肿瘤早诊指标。5.1、目前，基于基因组测序、单核苷酸多态性等的nktcl分子模型，分别存在需要大量组织切片、价格昂贵、无法反映肿瘤细胞突变等诸多不足。6.2、传统针对ctdna体细胞突变谱的检测，灵敏度和动态监控价值不足，无法检测单个靶基因的多个位点信息，且来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变异质性较大。7.3、nktcl病变部位组织坏死明显，无法排除取材质量、检取材部位及肿瘤异质性的偏差；4、目前尚无针对nktcl的无创性早期诊断方式；且预后判断主要使用pink、pink-e、ipi等基于临床及病理特征的预后评价系统，无法解释差异性预后的根本原因。技术实现要素：8.本发明提供一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法用于解决上述
背景技术：
：中所存在的至少一个技术问题。9.一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其包括以下步骤：步骤s1：筛选差异性ctdna甲基化位点；步骤s2：ctdna甲基化探针的筛选；步骤s3：nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证；步骤s4：nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证。10.作为优选方案，步骤s1中，所述筛选差异性ctdna甲基化位点的步骤包括：s11：收集250-350例nktcl患者和250-350例正常人的血浆标本；s12：使用cfdna提取试剂盒提取游离dna，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctdna甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；s13：通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；s14：根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。11.作为优选方案，在步骤s12中，所述使用cfdna提取试剂盒提取游离dna的步骤包括：s121：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液gs，震荡至彻底混匀；s122：加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，至溶液变清亮；s123：室温放置2-5min后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀。12.作为优选方案，所述步骤s12还包括：s124：将步骤s123所得溶液加入一个吸附柱cg2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s125：向吸附柱cg2中加入600μl缓冲液gdb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s126：向吸附柱cg2中加入500μl漂洗液pwb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2室温放置2min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s127：将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。13.作为优选方案，在步骤s2中，所述ctdna甲基化探针的筛选的步骤为：s21：收集100例治疗前nktcl肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织dna和血浆ctdna试剂盒提取肿瘤组织dna和血浆ctdna，提取步骤同s12；s22：以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna与相应匹配的血浆ctdna的候选甲基化位点的甲基化水平；s23：比对组织标本dna与血浆ctdna甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。14.作为优选方案，在步骤s22中，所述重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna甲基化水平的步骤为：s221：亚硫酸氢盐处理产物离心，移至1.5mlep管；s222：加入310μlbμfferbl，振荡混匀，如果dna含量低于100ng，加入carrierrna；加入250μl乙醇（浓度90-100%），震荡15s，离心；s223：将上一步所得溶液加入一个吸附柱minelμtednaspincolμmes中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s224：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s225：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbd，室温15min；12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s226：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；s227：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入250μl无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s228：继续12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱minelμtednaspincolμmes室温放置2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s229：将吸附柱minelμtednaspincolμmes转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液bμffereb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。15.作为优选方案，在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤为：s31：在内部收集550-650例治疗前nktcl患者和550-650例正常人血浆标本，按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集，将上述差异甲基化位点作为队列研究的背景，进行靶向重亚硫酸盐测序；在外部收集约100-200例治疗前nktcl患者和100-200例正常人的血浆标本，作为外部验证集；s32：分别使用lasso（leastabsolμteshrinkageandselectionoperator）回归模型和随机森林（randomforest）回归模型方法，构建诊断模型，选择与疾病诊断最相关的甲基化位点作为二分类模型构建变量。16.作为优选方案，在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤还包括：s33：使用逻辑回归（logisticregression）模型，综合回归系数与位点的甲基化水平表达矩阵，计算得出甲基化标签诊断评分；s34：通过受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，roc）曲线、曲线下面积（areaμndercμrve,aμc）、混淆矩阵（confμsiontable）方式，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能。17.作为优选方案，在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤为：s41：将内部收集的550-650例nktcl患者按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集；将外部收集的100-200例治疗前nktcl患者血浆标本作为外部验证集；s42：以患者无进展生存期（progression-freesμrvival，pfs）为结局指标，先后使用单因素cox比例风险回归模型、lasso-cox方法、多因素cox回归模型，构建预后模型，筛选出与预后密切相关的甲基化位点作为nktcl患者预后模型的构建变量，计算得出甲基化标签预后评分。18.作为优选方案，在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤还包括：s43：基于甲基化标签预后评分，将患者分为高危组和低危组，通过roc曲线和aμc，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能，探索甲基化标签预后评分系统对p-gemox（培门冬酶、吉西他滨、奥沙利铂）方案化疗疗效的早期预测价值；s44：将我们构建的ctdna甲基化标签与ipi评分（internationalprognosticindex）、kpi评分（koreanprognosticindex）、pink评分（prognosticindexofnatμralkillercelllymphoma）预后模型进行敏感性和特异性的对比，以评估该甲基化标签预后评分的预后预测价值。19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明是基于甲基化芯片测序技术，利用lasso-cox、随机森林高维建模方法，筛选出nktcl患者与正常人的差异ctdna甲基化位点，实现nktcl的早期诊断；筛选出与nktcl患者预后生存相关的ctdna甲基化位点，构建预后标签，个体化评估患者进展风险，继而探索其疗效预测价值；（2）明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl早期诊断标志物的使用价值，实现高危人群的早期诊断，为nktcl的早期诊断提供科学证据，进一步提升nktcl患者的远期生存；（3）明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl患者生存预后的预测价值，实现nktcl患者的预后评估，以及作为潜在的免疫化疗疗效预测与早期复发检测的生物标记物，为nktcl的精准预后分层和个体化治疗方案选择提供依据，并为未来临床研究提供设计思路；（4）ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足；（5）对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定；本ctdna甲基化模型的建立对nktcl个体化精准治疗方案的制定和分层治疗依据的完善十分重要。附图说明20.图1为本发明的步骤原理图。21.图2为本发明的原理演示流程图。22.图3-图7分别为本发明quma软件不同结果主要展示形式图。具体实施方式23.现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。24.实施例1本实施例1提供一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其包括以下步骤：步骤s1：筛选差异性ctdna甲基化位点；步骤s2：ctdna甲基化探针的筛选；步骤s3：nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证；步骤s4：nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证。25.采用上述方案，ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足。26.实施例2本实施例2包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s1中，所述筛选差异性ctdna甲基化位点的步骤包括：s11：收集250-350例nktcl患者和250-350例正常人的血浆标本；s12：使用cfdna提取试剂盒提取游离dna，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctdna甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；s13：通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；s14：根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。27.在步骤s12中，所述使用cfdna提取试剂盒提取游离dna的步骤包括：s121：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液gs，震荡至彻底混匀；s122：加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，至溶液变清亮；s123：室温放置2-5min后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀；s124：将步骤s123所得溶液加入一个吸附柱cg2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s125：向吸附柱cg2中加入600μl缓冲液gdb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s126：向吸附柱cg2中加入500μl漂洗液pwb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2室温放置2min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s127：将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。28.其中，使用试剂盒：基因组dna提取试剂盒（dp320）：血液（dp348)、土壤（dp336)、粪便（dp328)。29.其中，高通量全基因组甲基化测序如下：i.pcr扩增①50µl体系②反应程序③将扩增好的pcr产物全部加入琼脂糖凝胶孔中，然后进行电泳。30.ii.琼脂糖凝胶电泳①制备1%琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1×tae，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液；②胶板制备：将玻璃板，制胶槽洗净，晾干。将玻璃板放入制胶槽中，置于水平位置,并在固定位置放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶放入电泳槽中。加入1×tae电泳缓冲液至没过胶板为止；③加样：在点样板或一次性手套上混合dna样品和上样缓冲液，用10μl微量移液器将样品加入胶板的样品小槽内，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面；④电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，100v电泳10分钟，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；⑤电泳完毕后,取出凝胶，在紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。31.iii.pcr产物纯化①电泳结束后从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的凝胶，估计重量或精确称量重量。32.②每100mg琼脂糖凝胶加入100μlbindingsolμtion，于50～60℃水浴3～5min，期间每2～3min间断轻微颠倒混匀，直至胶块完全融化。33.注：为操作方便，可统一加入400μlbindingsolμtion。34.③将上述混合液转移至套有2ml收集管的吸附柱gc-2μ中，室温放置2min，6000rpm室温离心1min，取出吸附柱gc-2μ，并倒掉收集管中废液。35.④将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，加入500µlwasolμtion，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。36.⑤将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，加入500μlwashsolμtion，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。37.⑥重复步骤5一次。38.⑦将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，之后，打开吸附柱gc-2μ的盖子，室温放置5～10min或50℃放置3～5min，以彻底去除washsolμtion。39.⑧将吸附柱gc-2μ放入干净的1.5ml收集管中(试剂盒中自带)，对膜中央悬空加入20μlelμtionbμffer，盖好盖子，37℃放置2min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为包含目的dna片段的溶液。40.iv.克隆采用generay的ptg19-t作为载体，按照试剂盒中的品说明操作。41.连接反应：用纯化好的dna片段按照下表配制连接体系①混匀，离心，在22℃连接2小时；②转化：取5μl或全量连接产物加入100μl感受态细胞中；③冰浴30分钟；④42℃热激90秒钟后，再在冰中放置2分钟；⑤加入500μllb培养基，37℃振荡培养60分钟；⑥在含有x-gal、iptg、amp的l-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落；注：此步需要根据感受态细胞效率进行调整，使每个平板上长出100到1000个菌落，以便于以后的实验操作。42.⑦对于白色克隆，用酶切法进行鉴定插入片段。43.⑧取阳性质粒测序。44.v.测序①测序pcr反应条件：①测序pcr反应条件：②反应体系：pcrmixꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ15ul引物（5pm）ꢀꢀꢀꢀ各1ul模板ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ‑‑ul（50ng）h2oꢀꢀ至30ul③测序pcr反应产物纯化和测序：扩增后产物直接回收，最后20μl洗脱。取2μl纯化产物测序。45.④测序结果分析软件：测序仪器abi3730xl，测序试剂bigdyev3.1，测序分析软件seqμenceanalysisv5.02.测序结果也可以用seqscan，chromas等软件查看并导出序列。46.（2）通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究。47.（3）根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。48.实施例3本实施例3包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s2中，所述ctdna甲基化探针的筛选的步骤为：s21：收集100例治疗前nktcl肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织dna和血浆ctdna试剂盒提取肿瘤组织dna和血浆ctdna，提取步骤同s12；s22：以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna与相应匹配的血浆ctdna的候选甲基化位点的甲基化水平；s23：比对组织标本dna与血浆ctdna甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。49.在步骤s22中，所述重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna甲基化水平的步骤为：s221：亚硫酸氢盐处理产物离心，移至1.5mlep管；s222：加入310μlbμfferbl，振荡混匀，如果dna含量低于100ng，加入carrierrna；加入250μl乙醇（浓度90-100%），震荡15s，离心；s223：将上一步所得溶液加入一个吸附柱minelμtednaspincolμmes中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s224：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s225：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbd，室温15min；12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s226：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；s227：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入250μl无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s228：继续12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱minelμtednaspincolμmes室温放置2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s229：将吸附柱minelμtednaspincolμmes转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液bμffereb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。50.其中，重亚硫酸盐测序肿瘤组织dna甲基化水平：反应体系：dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20ulbisulfitesolutionꢀꢀꢀꢀꢀꢀ85uldnaprotectbufferꢀꢀꢀꢀ35ul反应程序：95℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5min60℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20min95℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5min60℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20min20℃实施例4本实施例4包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤为：s31：在内部收集550-650例治疗前nktcl患者和550-650例正常人血浆标本，按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集，将上述差异甲基化位点作为队列研究的背景，进行靶向重亚硫酸盐测序；在外部收集约100-200例治疗前nktcl患者和100-200例正常人的血浆标本，作为外部验证集；s32：分别使用lasso（leastabsolμteshrinkageandselectionoperator）回归模型和随机森林（randomforest）回归模型方法，构建诊断模型，选择与疾病诊断最相关的甲基化位点作为二分类模型构建变量。51.s33：使用逻辑回归（logisticregression）模型，综合回归系数与位点的甲基化水平表达矩阵，计算得出甲基化标签诊断评分；s34：通过受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，roc）曲线、曲线下面积（areaμndercμrve,aμc）、混淆矩阵（confμsiontable）方式，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能。52.实施例5本实施例5包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤为：s41：将内部收集的550-650例nktcl患者按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集；将外部收集的100-200例治疗前nktcl患者血浆标本作为外部验证集；s42：以患者无进展生存期（progression-freesμrvival，pfs）为结局指标，先后使用单因素cox比例风险回归模型、lasso-cox方法、多因素cox回归模型，构建预后模型，筛选出与预后密切相关的甲基化位点作为nktcl患者预后模型的构建变量，计算得出甲基化标签预后评分。53.s43：基于甲基化标签预后评分，将患者分为高危组和低危组，通过roc曲线和aμc，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能，探索甲基化标签预后评分系统对p-gemox（培门冬酶、吉西他滨、奥沙利铂）方案化疗疗效的早期预测价值；s44：将我们构建的ctdna甲基化标签与ipi评分（internationalprognosticindex）、kpi评分（koreanprognosticindex）、pink评分（prognosticindexofnatμralkillercelllymphoma）预后模型进行敏感性和特异性的对比，以评估该甲基化标签预后评分的预后预测价值。54.本发明能够明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl早期诊断标志物的使用价值，实现高危人群的早期诊断，为nktcl的早期诊断提供科学证据，进一步提升nktcl患者的远期生存。55.本发明能够明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl患者生存预后的预测价值，实现nktcl患者的预后评估，以及作为潜在的免疫化疗疗效预测与早期复发检测的生物标记物，为nktcl的精准预后分层和个体化治疗方案选择提供依据，并为未来临床研究提供设计思路。56.本发明的ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足。57.对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定；本ctdna甲基化模型的建立对nktcl个体化精准治疗方案的制定和分层治疗依据的完善十分重要。58.上述引物序列如下：在本说明书的描述中，参考术语“一个实施方式”、“某些实施方式”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合所述实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。59.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。60.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明涉及癌症风险评估
技术领域：
：，具体涉及一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法。
背景技术：
：：2.nk/t细胞淋巴瘤(nktcl)是非霍奇金淋巴瘤的一种亚型，世界范围内我国发病率最高。早期nktcl患者5年生存率可达80%，明显优于晚期患者，因此早期诊断和早期治疗可极大降低nktcl死亡率。nktcl个体异质性强，当前预后评价系统多基于临床及病理特征，临床分期相同的患者常表现出明显的预后差异。开发有效且使用简单的检测手段，对于改善患者预后、指导精准治疗以节约医疗资源、减轻患者负担并减少患者治疗副反应等至关重要。3.目前，有研究报道基于基因组测序、单核苷酸多态性的nktcl分子模型，但分别存在需要大量组织切片、价格昂贵、无法反映肿瘤细胞突变等诸多不足；且由于nktcl病变部位组织坏死明显，给nktcl的明确诊断带来一定难度。4.循环肿瘤dna（ctdna）·检测是通过无创/微创方式对非固体组织（主要是血液）肿瘤相关dna的采样及分析，具有无创、全面、动态和敏感的优势。对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定。因此，ctdna甲基化水平是更理想的肿瘤早诊指标。5.1、目前，基于基因组测序、单核苷酸多态性等的nktcl分子模型，分别存在需要大量组织切片、价格昂贵、无法反映肿瘤细胞突变等诸多不足。6.2、传统针对ctdna体细胞突变谱的检测，灵敏度和动态监控价值不足，无法检测单个靶基因的多个位点信息，且来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变异质性较大。7.3、nktcl病变部位组织坏死明显，无法排除取材质量、检取材部位及肿瘤异质性的偏差；4、目前尚无针对nktcl的无创性早期诊断方式；且预后判断主要使用pink、pink-e、ipi等基于临床及病理特征的预后评价系统，无法解释差异性预后的根本原因。技术实现要素：8.本发明提供一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法用于解决上述
背景技术：
：中所存在的至少一个技术问题。9.一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其包括以下步骤：步骤s1：筛选差异性ctdna甲基化位点；步骤s2：ctdna甲基化探针的筛选；步骤s3：nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证；步骤s4：nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证。10.作为优选方案，步骤s1中，所述筛选差异性ctdna甲基化位点的步骤包括：s11：收集250-350例nktcl患者和250-350例正常人的血浆标本；s12：使用cfdna提取试剂盒提取游离dna，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctdna甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；s13：通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；s14：根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。11.作为优选方案，在步骤s12中，所述使用cfdna提取试剂盒提取游离dna的步骤包括：s121：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液gs，震荡至彻底混匀；s122：加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，至溶液变清亮；s123：室温放置2-5min后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀。12.作为优选方案，所述步骤s12还包括：s124：将步骤s123所得溶液加入一个吸附柱cg2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s125：向吸附柱cg2中加入600μl缓冲液gdb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s126：向吸附柱cg2中加入500μl漂洗液pwb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2室温放置2min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s127：将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。13.作为优选方案，在步骤s2中，所述ctdna甲基化探针的筛选的步骤为：s21：收集100例治疗前nktcl肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织dna和血浆ctdna试剂盒提取肿瘤组织dna和血浆ctdna，提取步骤同s12；s22：以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna与相应匹配的血浆ctdna的候选甲基化位点的甲基化水平；s23：比对组织标本dna与血浆ctdna甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。14.作为优选方案，在步骤s22中，所述重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna甲基化水平的步骤为：s221：亚硫酸氢盐处理产物离心，移至1.5mlep管；s222：加入310μlbμfferbl，振荡混匀，如果dna含量低于100ng，加入carrierrna；加入250μl乙醇（浓度90-100%），震荡15s，离心；s223：将上一步所得溶液加入一个吸附柱minelμtednaspincolμmes中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s224：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s225：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbd，室温15min；12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s226：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；s227：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入250μl无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s228：继续12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱minelμtednaspincolμmes室温放置2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s229：将吸附柱minelμtednaspincolμmes转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液bμffereb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。15.作为优选方案，在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤为：s31：在内部收集550-650例治疗前nktcl患者和550-650例正常人血浆标本，按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集，将上述差异甲基化位点作为队列研究的背景，进行靶向重亚硫酸盐测序；在外部收集约100-200例治疗前nktcl患者和100-200例正常人的血浆标本，作为外部验证集；s32：分别使用lasso（leastabsolμteshrinkageandselectionoperator）回归模型和随机森林（randomforest）回归模型方法，构建诊断模型，选择与疾病诊断最相关的甲基化位点作为二分类模型构建变量。16.作为优选方案，在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤还包括：s33：使用逻辑回归（logisticregression）模型，综合回归系数与位点的甲基化水平表达矩阵，计算得出甲基化标签诊断评分；s34：通过受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，roc）曲线、曲线下面积（areaμndercμrve,aμc）、混淆矩阵（confμsiontable）方式，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能。17.作为优选方案，在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤为：s41：将内部收集的550-650例nktcl患者按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集；将外部收集的100-200例治疗前nktcl患者血浆标本作为外部验证集；s42：以患者无进展生存期（progression-freesμrvival，pfs）为结局指标，先后使用单因素cox比例风险回归模型、lasso-cox方法、多因素cox回归模型，构建预后模型，筛选出与预后密切相关的甲基化位点作为nktcl患者预后模型的构建变量，计算得出甲基化标签预后评分。18.作为优选方案，在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤还包括：s43：基于甲基化标签预后评分，将患者分为高危组和低危组，通过roc曲线和aμc，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能，探索甲基化标签预后评分系统对p-gemox（培门冬酶、吉西他滨、奥沙利铂）方案化疗疗效的早期预测价值；s44：将我们构建的ctdna甲基化标签与ipi评分（internationalprognosticindex）、kpi评分（koreanprognosticindex）、pink评分（prognosticindexofnatμralkillercelllymphoma）预后模型进行敏感性和特异性的对比，以评估该甲基化标签预后评分的预后预测价值。19.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）本发明是基于甲基化芯片测序技术，利用lasso-cox、随机森林高维建模方法，筛选出nktcl患者与正常人的差异ctdna甲基化位点，实现nktcl的早期诊断；筛选出与nktcl患者预后生存相关的ctdna甲基化位点，构建预后标签，个体化评估患者进展风险，继而探索其疗效预测价值；（2）明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl早期诊断标志物的使用价值，实现高危人群的早期诊断，为nktcl的早期诊断提供科学证据，进一步提升nktcl患者的远期生存；（3）明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl患者生存预后的预测价值，实现nktcl患者的预后评估，以及作为潜在的免疫化疗疗效预测与早期复发检测的生物标记物，为nktcl的精准预后分层和个体化治疗方案选择提供依据，并为未来临床研究提供设计思路；（4）ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足；（5）对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定；本ctdna甲基化模型的建立对nktcl个体化精准治疗方案的制定和分层治疗依据的完善十分重要。附图说明20.图1为本发明的步骤原理图。21.图2为本发明的原理演示流程图。22.图3-图7分别为本发明quma软件不同结果主要展示形式图。具体实施方式23.现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成。24.实施例1本实施例1提供一种nk/t细胞淋巴瘤早期诊断和预后预测模型构建方法，其包括以下步骤：步骤s1：筛选差异性ctdna甲基化位点；步骤s2：ctdna甲基化探针的筛选；步骤s3：nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证；步骤s4：nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证。25.采用上述方案，ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足。26.实施例2本实施例2包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s1中，所述筛选差异性ctdna甲基化位点的步骤包括：s11：收集250-350例nktcl患者和250-350例正常人的血浆标本；s12：使用cfdna提取试剂盒提取游离dna，通过高通量全基因组甲基化测序进行全基因组ctdna甲基化水平检测，建立约300万位点的甲基化文库；s13：通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究；s14：根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。27.在步骤s12中，所述使用cfdna提取试剂盒提取游离dna的步骤包括：s121：取200μl血液至1.5ml离心管中，加入400μl细胞裂解液cl，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，向细胞核沉淀中加入200μl缓冲液gs，震荡至彻底混匀；s122：加入200μl缓冲液gb和20μlproteinasek的预混溶液，充分颠倒混匀，56℃放置10min，至溶液变清亮；s123：室温放置2-5min后加入350μl缓冲液bd，充分颠倒混匀；s124：将步骤s123所得溶液加入一个吸附柱cg2中，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s125：向吸附柱cg2中加入600μl缓冲液gdb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s126：向吸附柱cg2中加入500μl漂洗液pwb，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cg2室温放置2min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s127：将吸附柱cg2转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液tb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。28.其中，使用试剂盒：基因组dna提取试剂盒（dp320）：血液（dp348)、土壤（dp336)、粪便（dp328)。29.其中，高通量全基因组甲基化测序如下：i.pcr扩增①50µl体系②反应程序③将扩增好的pcr产物全部加入琼脂糖凝胶孔中，然后进行电泳。30.ii.琼脂糖凝胶电泳①制备1%琼脂糖凝胶：称取0.5g琼脂糖置于锥形瓶中，加入50ml1×tae，微波炉加热煮沸至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0%琼脂糖凝胶液；②胶板制备：将玻璃板，制胶槽洗净，晾干。将玻璃板放入制胶槽中，置于水平位置,并在固定位置放好梳子。将冷却至65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶放入电泳槽中。加入1×tae电泳缓冲液至没过胶板为止；③加样：在点样板或一次性手套上混合dna样品和上样缓冲液，用10μl微量移液器将样品加入胶板的样品小槽内，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面；④电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，100v电泳10分钟，当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时，停止电泳；⑤电泳完毕后,取出凝胶，在紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。31.iii.pcr产物纯化①电泳结束后从琼脂糖凝胶中切下含有目的片段的凝胶，估计重量或精确称量重量。32.②每100mg琼脂糖凝胶加入100μlbindingsolμtion，于50～60℃水浴3～5min，期间每2～3min间断轻微颠倒混匀，直至胶块完全融化。33.注：为操作方便，可统一加入400μlbindingsolμtion。34.③将上述混合液转移至套有2ml收集管的吸附柱gc-2μ中，室温放置2min，6000rpm室温离心1min，取出吸附柱gc-2μ，并倒掉收集管中废液。35.④将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，加入500µlwasolμtion，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。36.⑤将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，加入500μlwashsolμtion，于12000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中废液。37.⑥重复步骤5一次。38.⑦将吸附柱gc-2μ重新放回收集管中，12000rpm，室温离心1min，之后，打开吸附柱gc-2μ的盖子，室温放置5～10min或50℃放置3～5min，以彻底去除washsolμtion。39.⑧将吸附柱gc-2μ放入干净的1.5ml收集管中(试剂盒中自带)，对膜中央悬空加入20μlelμtionbμffer，盖好盖子，37℃放置2min，12000rpm离心1min，离心管中的液体即为包含目的dna片段的溶液。40.iv.克隆采用generay的ptg19-t作为载体，按照试剂盒中的品说明操作。41.连接反应：用纯化好的dna片段按照下表配制连接体系①混匀，离心，在22℃连接2小时；②转化：取5μl或全量连接产物加入100μl感受态细胞中；③冰浴30分钟；④42℃热激90秒钟后，再在冰中放置2分钟；⑤加入500μllb培养基，37℃振荡培养60分钟；⑥在含有x-gal、iptg、amp的l-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落；注：此步需要根据感受态细胞效率进行调整，使每个平板上长出100到1000个菌落，以便于以后的实验操作。42.⑦对于白色克隆，用酶切法进行鉴定插入片段。43.⑧取阳性质粒测序。44.v.测序①测序pcr反应条件：①测序pcr反应条件：②反应体系：pcrmixꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ15ul引物（5pm）ꢀꢀꢀꢀ各1ul模板ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ‑‑ul（50ng）h2oꢀꢀ至30ul③测序pcr反应产物纯化和测序：扩增后产物直接回收，最后20μl洗脱。取2μl纯化产物测序。45.④测序结果分析软件：测序仪器abi3730xl，测序试剂bigdyev3.1，测序分析软件seqμenceanalysisv5.02.测序结果也可以用seqscan，chromas等软件查看并导出序列。46.（2）通过甲基化水平差异分析，筛选得到p《0.05、甲基化水平差异倍数前2000的甲基化位点用于后续队列研究。47.（3）根据该2000个差异甲基化位点设计相应的甲基化探针，通过pcr验证筛选可产生阳性且特异性的pcr扩增信号的甲基化位点。48.实施例3本实施例3包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s2中，所述ctdna甲基化探针的筛选的步骤为：s21：收集100例治疗前nktcl肿瘤组织标本和相应的血浆标本，使用组织dna和血浆ctdna试剂盒提取肿瘤组织dna和血浆ctdna，提取步骤同s12；s22：以候选甲基化位点为差异位点，使用靶向重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna与相应匹配的血浆ctdna的候选甲基化位点的甲基化水平；s23：比对组织标本dna与血浆ctdna甲基化水平的一致性，选择一致性较好、检测丰度较高的候选甲基化位点用于后续建模。49.在步骤s22中，所述重亚硫酸盐测序检测肿瘤组织dna甲基化水平的步骤为：s221：亚硫酸氢盐处理产物离心，移至1.5mlep管；s222：加入310μlbμfferbl，振荡混匀，如果dna含量低于100ng，加入carrierrna；加入250μl乙醇（浓度90-100%），震荡15s，离心；s223：将上一步所得溶液加入一个吸附柱minelμtednaspincolμmes中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s224：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液；s225：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbd，室温15min；12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s226：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入500μlbμfferbw，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，重复该步骤；s227：向吸附柱minelμtednaspincolμmes中加入250μl无水乙醇，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液；s228：继续12000rpm离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱minelμtednaspincolμmes室温放置2-5min，彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；s229：将吸附柱minelμtednaspincolμmes转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入80μl洗脱缓冲液bμffereb，室温放置2min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中，-20℃保存备用。50.其中，重亚硫酸盐测序肿瘤组织dna甲基化水平：反应体系：dnaꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20ulbisulfitesolutionꢀꢀꢀꢀꢀꢀ85uldnaprotectbufferꢀꢀꢀꢀ35ul反应程序：95℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5min60℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20min95℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ5min60℃ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ20min20℃实施例4本实施例4包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s3中，所述nktcl的ctdna甲基化诊断模型的构建与验证的步骤为：s31：在内部收集550-650例治疗前nktcl患者和550-650例正常人血浆标本，按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集，将上述差异甲基化位点作为队列研究的背景，进行靶向重亚硫酸盐测序；在外部收集约100-200例治疗前nktcl患者和100-200例正常人的血浆标本，作为外部验证集；s32：分别使用lasso（leastabsolμteshrinkageandselectionoperator）回归模型和随机森林（randomforest）回归模型方法，构建诊断模型，选择与疾病诊断最相关的甲基化位点作为二分类模型构建变量。51.s33：使用逻辑回归（logisticregression）模型，综合回归系数与位点的甲基化水平表达矩阵，计算得出甲基化标签诊断评分；s34：通过受试者工作特征（receiveroperatingcharacteristic，roc）曲线、曲线下面积（areaμndercμrve,aμc）、混淆矩阵（confμsiontable）方式，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能。52.实施例5本实施例5包含实施例1的全部技术特征，区别在于：在步骤s4中，所述nktcl的ctdna甲基化预后模型的构建与验证的步骤为：s41：将内部收集的550-650例nktcl患者按7:3的比例随机分配至训练集和内部验证集；将外部收集的100-200例治疗前nktcl患者血浆标本作为外部验证集；s42：以患者无进展生存期（progression-freesμrvival，pfs）为结局指标，先后使用单因素cox比例风险回归模型、lasso-cox方法、多因素cox回归模型，构建预后模型，筛选出与预后密切相关的甲基化位点作为nktcl患者预后模型的构建变量，计算得出甲基化标签预后评分。53.s43：基于甲基化标签预后评分，将患者分为高危组和低危组，通过roc曲线和aμc，在训练集、内部验证集和外部验证集中评估模型的预测效能，探索甲基化标签预后评分系统对p-gemox（培门冬酶、吉西他滨、奥沙利铂）方案化疗疗效的早期预测价值；s44：将我们构建的ctdna甲基化标签与ipi评分（internationalprognosticindex）、kpi评分（koreanprognosticindex）、pink评分（prognosticindexofnatμralkillercelllymphoma）预后模型进行敏感性和特异性的对比，以评估该甲基化标签预后评分的预后预测价值。54.本发明能够明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl早期诊断标志物的使用价值，实现高危人群的早期诊断，为nktcl的早期诊断提供科学证据，进一步提升nktcl患者的远期生存。55.本发明能够明确血浆ctdna甲基化标签作为nktcl患者生存预后的预测价值，实现nktcl患者的预后评估，以及作为潜在的免疫化疗疗效预测与早期复发检测的生物标记物，为nktcl的精准预后分层和个体化治疗方案选择提供依据，并为未来临床研究提供设计思路。56.本发明的ctdna甲基化检测具有无创、全面、动态和敏感的优势，只需要收集受试者的血标本进行检测，可解决目前基于基因组测序、单核苷酸多态性等分子模型需要大量组织切片、价格昂贵、临床应用行差等诸多不足，且可解决组织活检受取材类型和取材部位影响的不足。57.对比传统的ctdna体细胞突变谱检测，ctdna的甲基化水平检测具有以下优势：甲基化检测灵敏度和动态监控价值更高；可检测每个靶基因区域多个cpg甲基化位点；来源于同一类型肿瘤细胞ctdna甲基化改变相对稳定；本ctdna甲基化模型的建立对nktcl个体化精准治疗方案的制定和分层治疗依据的完善十分重要。58.上述引物序列如下：在本说明书的描述中，参考术语“一个实施方式”、“某些实施方式”、“示意性实施方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合所述实施方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施方式或示例中以合适的方式结合。59.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。60.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。当前第1页12当前第1页12
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