多孔葡甘露聚糖支架和生产该支架的方法
1.相关申请的交叉引用本技术要求2019年10月29日提交的美国临时申请号62/927,207的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
2.发明背景组织工程学需要功能细胞、适当的生化因子和生物材料支架以再生、改善、替换或修复受损、患病或缺失的组织和/或器官，以努力改善患者的临床结果。组织工程学也可用于开发生物构建体（construct）以研究和筛选毒素、药物、蛋白质和各种化合物。尽管细胞是用于生成组织和生物构建体的基本结构单元，但生物材料支架在体内或体外建立有益于构建组织的环境中起到关键作用。
3.支架可由天然来源材料（例如基于碳水化合物或蛋白质的生物材料）或合成材料（例如基于聚合物或陶瓷的材料）构建。支架材料应该是生物相容的和生物可降解的，并且其应该具有与相关组织/部位一致的机械性质。支架架构还应表现出足够的孔径和密度以允许细胞和营养物的扩散（o’brien materials today 2011 14:88-95）。
4.已用作组织工程学支架的碳水化合物基生物材料包括但不限于藻酸盐、壳聚糖、糖胺聚糖和杂化复合材料。葡甘露聚糖（gm）聚合物是超高交联的，以产生有益于生物应用的高度多孔、热稳定、生物相容和生物可降解的结构。
5.基于碳水化合物的支架也已用作骨诱导因子，如重组人bmp-2的载体媒介物（vehicle）。rhbmp-2已用于超适应症颈前路椎间盘切除融合术（acdf），但所用浓度远超过天然存在的bmp-2水平以补偿超出植入部位向邻近组织中的泄漏。这样的泄漏和高剂量与不良事件相关联。因此，有效地将bmp-2定位在植入部位并降低有效剂量的载体是合意的。
6.当前生产葡甘露聚糖支架的方法导致结构坍塌和不均匀孔隙率。这一观察结果尚未得到研究，并且迄今还没有采取任何努力以防止结构坍塌或不均匀孔隙率。相反，简单地选择支架构建体的具有适当结构和孔隙率的部分，并将其与其余部分切离以提供用于组织工程学的最佳结构。支架构建体的未选择的不合适的部分被丢弃，导致相当大的废料量和总生产成本的增加。此外，设备和实验室的不规则性导致结构坍塌和不均匀的孔隙率。设备变化（由于冷冻机的机龄、制造、型号或配置）、位置变化（由于凝胶在冷冻机内的高度或深度）、运行变化（由于功率波动或中断）和用户变化（由于打开/进入冷冻机）都导致甚至单个冷冻系统内的温度差异。
7.因此，改进支架特性的方法是必要的。美国专利号9,359,591中公开的制造多孔葡甘露聚糖支架的方法导致葡甘露聚糖支架的结构坍塌。本发明提供了获得葡甘露聚糖支架的结构特性的更好结果的改进方法。
8.发明概述已经发现，通过控制固化阶段的时间长度变量，可制造均匀多孔和互连的支架。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括在导致约10-2000分钟或在一些实施方案中50-1500分钟的固化阶段的条件下冷冻葡甘露聚糖凝胶。该方法可包括监测凝胶的温度。
9.在另一实施方案中，本发明提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括步骤：a) 将葡甘露聚糖凝胶从约25℃的温度冷却到约4℃的温度；b) 将葡甘露聚糖凝胶在固化阶段保持至少约10分钟；c) 将葡甘露聚糖凝胶解冻至约25℃的温度；d) 任选地重复步骤a)、b)和/或c)。在一些实施方案中，该制备方法包括至少1、2、3或4个冻融循环。
10.本发明还提供由本文所述的制造方法制成的支架。
11.在另一实施方案中，本发明提供一种支架，其具有至少约50%的孔隙率和/或至少约50%的互连度（interconnectivity）。在一个实施方案中，孔隙率和/或互连度均匀地呈现在整个支架中。在另一实施方案中，具有所述孔隙率和/或互连度特性的支架的体积是葡甘露聚糖凝胶的体积的至少10%。在一个实施方案中，所述支架具有约100-500 μm的均匀孔径。
12.在一个实施方案中，本发明的方法包括中和支架的ph的步骤。类似地，在一个实施方案中，本发明提供具有约7的ph的支架。
13.本发明的支架具有至少50% w/w碳水化合物混合物的骨架，和在一些实施方案中至少50%葡甘露聚糖的骨架。所述骨架可包含复合材料。在一些实施方案中，所述支架包括一种或多种骨成分（如钙和磷酸盐）和/或一种或多种形态发生蛋白（如bmp-2）。
14.在另一实施方案中，所述支架是射线可透的。
15.在另一实施方案中，所述支架可用于实验建模以及治疗应用。这样的实验和治疗用途包括但不限于新血管形成、矫形外科、心血管、神经元、伤口愈合、止血、药物筛选和药物递送、组织再生、类器官（organoid）、组织（包括软组织）和骨（再）生成、皮肤病学和牙科学。
16.附图简述图1a显示使用现有技术制成的葡甘露聚糖支架。其表现出结构的显著坍塌，导致不均匀的孔隙率。图1b显示使用所述的本方法制成的gm支架。
17.图2显示葡甘露聚糖（gm）体系的阶段图。gm体系的温度沿y轴表示，且时间沿x轴表示。gm凝胶首先经历温度变化，直至达到冷冻（冷却）温度，随后是恒温期，我们将其定义为固化阶段的时间长度（ltsp）。当凝胶达到低于冰点的温度时，可发生过冷。sp是其中凝胶中的所有液体冷冻形成冰晶的阶段。然后温度进一步冷却以达到该体系的最终温度。
18.图3显示具有互连孔隙的高度多孔葡甘露聚糖支架。图3显示将葡甘露聚糖支架浸没在有色染料中。图3b显示染料通过互连孔隙渗透支架。图3c显示完全被染料饱和的支架。
19.图4显示通过间接检测得出的rhbmp-2在hccp中保留的时间进程。将hccp支架在bmp-2溶液中培养5分钟（负载），然后洗涤30分钟、16、40和64小时。经由elisa测量溶液中残留rhbmp-2的浓度（黑条）。通过从基线（虚线）储液浓度减去rhbmp-2的累积残留浓度，计算支架对rhbmp-2的保留。误差条代表平均值的标准误差（n = 5次重复实验）。
20.图5显示hccp对rhbmp-2的保留的间接检测。将hccp支架置于rhbmp-2溶液中并培养30分钟。rhbmp-2残留（黑条）代表在用hccp培养后溶液中剩余rhbmp-2的浓度。基线对照是没有在hccp存在下培养的rhbmp-2储液；pbs用作阴性对照（误差条代表平均值的标准误差；n = 在elisa检测中的12次重复技术）。灰色条代表通过从平均“基线”浓度减去平均“残留”而计算出的支架中的bmp-2保留（n = 3次重复实验，标示为hccp 1、2、3）。
21.图6显示hccp对rhbmp-2的保留的直接检测。将hccp圆盘在rhbmp-2溶液（rhbmp-2；
1 μg/ml）、骨髓（bm）、骨髓 rhbmp-2（bm rhbmp-2）或pbs中培养过夜，然后漂洗，并用抗bmp-2抗体染色。二次dab染色表明作为深棕色存在rhbmp-2 (a)。对每种条件（i、ii、iii）进行三次重复实验。光密度分析显示rhbmp-2处理组中的dab信号明显高于所有其它组(b)。
22.图7显示在支架外植体中内源性bmp-2与hccp的结合。为了内源性bmp-2的比色可视化，将5 μm石蜡切片用抗bmp-2抗体和3,3'-二氨基联苯胺染色。该图显示在2周(a, b)和4周(d, e)时间间隔的阳性棕色沉淀物。兔igg对照用于(c) 2周和(f) 4周时间间隔切片。黑色三角形(a)标示hccp。黑色实心箭头(a, b, e)标示沿hccp的孔隙的阳性棕色染色。具有黑色边界的白色箭头(b, e)标示具有负性棕色染色的未填充的hccp孔隙。黑色点划线箭头(a)标示具有点状形态的成骨细胞。
23.发明详述i. 定义如本文所用的，术语“葡甘露聚糖”是指由约1:1.6比率的β-1,4-连接的d-葡萄糖与d-甘露糖组成的约每11个残基具有支链的天然来源寡糖（alonso-sande等人eur j pharm biopharm. 200972:453-462）及其衍生物。葡甘露聚糖具有约5-10%取代乙酰基的主链，所述乙酰基参与氢键合和疏水相互作用以赋予可溶性。示例性的葡甘露聚糖衍生物包括但不限于水溶性衍生物，如o-烷基衍生物和o-羧烷基衍生物、具有各种取代度的衍生物（非限制性地，例如大于或小于5-10%取代的乙酰基）、具有各种氧化度的衍生物、接枝共聚物（非限制性地例如丙烯酸酯和丙烯酰胺共聚物）及其盐（例如其季铵盐）。
24.如本文所用的，术语“葡甘露聚糖凝胶”是指交联碳水化合物的热稳定的均匀悬浮液)。葡甘露聚糖凝胶可以以各种方式形成，包括但不限于，通过在碱的存在下水解葡甘露聚糖的乙酰基。
25.如本文所用的，术语“葡甘露聚糖支架”是指通过升华葡甘露聚糖凝胶形成的三维多孔基质。葡甘露聚糖支架提供适于细胞培养和组织工程学（包括组织再生）的环境。
26.以下方法和组合物以葡甘露聚糖凝胶和葡甘露聚糖支架为例描述，但本发明可涵盖不完全包含葡甘露聚糖或与葡甘露聚糖组合的凝胶和支架。其它天然来源材料（例如基于碳水化合物或蛋白质的生物材料）或合成材料（例如基于聚合物和陶瓷的材料）可包括或组合在凝胶和/或支架中。在本发明的实施方案中，支架包含至少约50% (w/w)葡甘露聚糖，在一些实施方案中至少60%、70%、80%、90%、95%葡甘露聚糖(w/w)。
27.支架的“骨架”是指限定和维持多孔结构的结构组分。包含支架骨架的组分是葡甘露聚糖凝胶形成中的材料。在葡甘露聚糖支架形成后，可将附加组分嵌入骨架，使得它们嵌在骨架上，但不是骨架的组成部分。此外，这些组分可嵌在骨架中，以允许在体内随时间经过随着葡甘露聚糖支架的降解而缓慢和持续释放组分。
28.如本文所用的，术语“固化阶段”（sp）是指从液体到固体的相变。固化阶段在该体系（最初为凝胶）首次达到冰点温度时开始，并在(现为固体的)体系的温度降低到冰点温度以下时结束。“固化阶段的时间长度”（ltsp）是该体系在冷冻相变的过程中保持大致恒温的过程中的时间。如果该体系表现出过冷阶段，固化阶段包括过冷阶段。也就是说，固化阶段的时间长度开始于该体系首次达到冰点温度的时刻，并且仅在相变完成之后结束。对于本发明的葡甘露聚糖凝胶组合物，冰点在-0.01℃至-3.00℃的范围内（略低于0℃，水的冰点）。因此，对于由葡甘露聚糖作为骨架碳水化合物组成的凝胶，固化阶段将在约-0.8℃下
图形表示为稳定期（plateau），见图2。
29.如本文所用的，术语“冷冻条件”是指对葡甘露聚糖体系施以等于或低于0℃的温度以诱导和维持sp来实现均匀的孔隙率。冷冻条件包括在-80至-20℃、-20至-10℃、-10至-5℃、-5至0℃的范围内的温度，或使用受控速率冷冻程序的逐渐降温范围。在一个实施方案中，冷冻条件包括等于或低于-0.33℃的温度。
30.术语“解冻条件”是指对葡甘露聚糖体系施以高于0℃的温度。解冻条件包括0℃至5℃、0℃至10℃、0℃至20℃的温度、室温条件（20℃至25℃、或约23℃）、或高于25℃的温度。
31.如本文所用的，“受控速率”条件是指对该体系施以预选的温度变化速率（例如在实验室级的受控速率冷冻机中）以诱导和维持sp。相反，“恒温”条件是指对该体系施以恒定的预选温度。在这两种情况下，“受控速率”和“恒温”冷冻条件都是指设备（例如冷冻机）和/或环境（物理、化学）的温度设置，而非可单独监测和记录（即，为了测量固化阶段的时间长度）的葡甘露聚糖体系的温度。
32.如本文所用的，一个“冻融循环”是两部分步骤，其中在葡甘露聚糖冰点或低于其冰点的葡甘露聚糖体系（即冻结或部分冻结的葡甘露聚糖体系）随后a) 经受解冻条件，即高于葡甘露聚糖体系的冰点的温度，然后2) 再经受冷冻条件。在各冻融循环中，解冻条件和/或冷冻条件可与先前的解冻或冷冻条件相同或不同或其组合。各解冻步骤和各冷冻步骤可独立地选自受控速率和恒温条件。
33.如本文所用的，孔隙率是指如通过压汞孔隙率试验测得的葡甘露聚糖支架的孔隙体积与总体积的至少50%比率。在一些实施方案中，孔隙率可为至少50%、60%、70%或80%。此外，当支架在由凝胶制备之后呈现在各处一致（例如从外围到中心）的孔隙率时，实现“均匀”孔隙率。先前的制造多孔葡甘露聚糖支架的方法（美国专利号9,359,591）对葡甘露聚糖凝胶施以特定温度以促进冷冻。但是，这种方法在支架中产生结构坍塌和不均匀的孔隙率。相反，本发明公开了控制不同的和多个变量
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将产生更准确和一致的结果。更具体地，调整ltsp将产生改进的产物结果。
34.如本文所用的，“互连”孔隙是指可渗透并允许物质从一个孔隙流到另一个孔隙的孔隙网络（图3）。在一些实施方案中，互连度可为支架的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。互连度可通过如图3所述的染料渗透研究测量。此外，当支架在由凝胶制备后呈现在各处一致（例如从外围到中心）的互连度时，实现“均匀的”互连度。
35.互连孔隙对细胞渗透、营养物的引入和废物的清除以及细胞信号因子的流动是重要的。互连孔隙提供了在整个支架/组织构建体中新形成的组织内建立新脉管系统的难得机会。通常，在临床环境中，需要再生的组织缺损或损伤的大小可能超出通过扩散递送营养物或清除废物的能力。因此，新血管形成不仅在支架/组织构建体的外围是必要的，而且在整个新形成的组织中是必要的，以防止细胞凋亡和随后的坏死。因此，除高孔隙率外，支架内的互连度对成功的组织工程学和再生是至关重要的。此外，在血液凝固的情况下，参与凝固的血液成分的渗透不足可导致持续出血。含有互连孔隙的高度多孔支架可用作止血装置，其中纤维蛋白纤维（或血小板聚集）在整个支架的各处交联/形成。这可提供有助于止血的稳定血凝块。此外，这样的支架可用于拔牙槽而不需要放置缝线，由于在整个支架构建体中形成血凝块，这将防止支架从槽中脱出（“干槽症”）。这种方法可让牙医将支架方便地放置在拔牙槽中，而不需要将患者送至口腔外科。
36.在一个实施方案中，在经受任何冷冻条件之前，葡甘露聚糖凝胶的初始体积可在100-5000 ml、250-2500 ml、100-1000 ml或约450 ml的范围内。例如，在一个实施方案中，初始凝胶为圆柱形，其尺寸为1-5 cm的厚度和10-20 cm的直径。在其它形状、配置和尺寸中，初始凝胶体积可与示例性圆柱形体积和尺寸相同或不同。本发明人已经发现，通过监测ltsp，可以调整合适的冷冻条件适应于多样化的组织工程应用的各种凝胶形状和尺寸。例如，可将初始凝胶倒入任何结构中，或可将所得支架切割成各种形状，包括立方体、片材圆柱体、细管或圆环（环形）。在一个具体实施方案中，上述圆柱体直径范围，表面积/体积比（sa:v）在0.5至2.5、0.6至2.4、或0.75至1/cm的范围内。在一个具体实施方案中，sa:v比为0.8至0.9/cm。
37.作为初始葡甘露聚糖凝胶转化成具有至少50%的均匀孔隙率的葡甘露聚糖支架的体积百分比来测量产率。产率测量不包括未落在指定孔隙率范围内的固化葡甘露聚糖（其通过先前的方法，从支架产物上切除并作为制造废料丢弃）。在本发明中，该方法由初始凝胶材料产生至少10%、至少25%、至少35%或优选至少50%或更多的适当多孔支架。
38.ii. 固化阶段本发明提供了一种改进的葡甘露聚糖支架。本发明的葡甘露聚糖支架适合用作三维细胞培养和组织工程学或类器官。该葡甘露聚糖支架提供了适用于培养细胞的高度多孔结构和孔径。此外，该支架是均匀、热稳定、有弹性、生物相容和生物可降解的，并可通过例如模制或切割制成适用于3d组织培养和工程学、类器官的任何形状和尺寸。
39.根据美国专利号9,359,591中公开的制造技术，通过将葡甘露聚糖凝胶置于培养皿中、然后在气流冷冻机中在小于或等于-50℃下冷冻30分钟，来冷冻葡甘露聚糖凝胶。参见美国专利9,359,591。相反，改进的本方法的冷冻温度或冷冻速率提供特定的ltsp以产生具有均匀孔隙率的葡甘露聚糖支架。在一个实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在冷冻步骤开始时在低于50℃的温度下。在一些实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在高于0℃和低于：40℃、35℃、30℃、25℃、10℃或5℃的温度下。在一个实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在冷冻步骤开始时在约室温（20℃至25℃、或约23℃）下。在另一实施方案中，葡甘露聚糖在冷冻步骤开始时在约4℃下。
40.在一个实施方案中，该方法包括冷冻葡甘露聚糖凝胶，其中冷冻条件导致ltsp为约10-2000分钟。在一些实施方案中，ltsp为至少约10-30、60、100、200、270、280、300、350、360、375、400、425、440、450、460、470、475、480、490、500、525、550或600分钟。在一些实施方案中，ltsp为约10-60分钟、250-2000分钟、250-1500分钟、250-1000分钟、250-750分钟、500-1500分钟、500-1000分钟、250-750分钟、400-500分钟、或450-500分钟。
41.在一个实施方案中，sp包括过冷阶段。在这种情况下，ltsp开始于该体系首次达到冰点温度（例如约-0.8℃）的时刻，其包括低于冷冻温度的过冷峰值，在约冷冻温度下继续经过该稳定期，并仅在该体系开始其向最终冷冻温度或环境冷冻温度（例如冷冻机温度）的下降时结束。
42.在另一实施方案中，不存在过冷阶段。在这种情况下，ltsp开始于该体系首次达到冰点温度（例如约-0.8℃）的时刻；其在约冷冻温度下继续经过该稳定期，并在该体系开始其向最终冷冻温度或环境冷冻温度（例如冷冻机温度）的下降时结束。
43.在一些实施方案中，该方法包括在一个或多个冷冻步骤的过程中监测葡甘露聚糖
体系的温度。可通过插入温度探针（例如cooper atkins digital thermometer, lcd, immersion probe model dtt361-01）以测量葡甘聚糖体系的内部温度来监测温度。在一个实施方案中，实验室温度探针可远程报告和/或记录葡甘露聚糖体系在冷冻机内的温度变化。监测温度可有助于为预定的葡甘露聚糖凝胶体积和/或尺寸限定规定的冷冻条件。考虑设备和实验室的不规则性也可以是有用的。监测温度允许用户在考虑设备变化（由于冷冻机的机龄、制造、型号或配置）、位置变化（由于凝胶在冷冻机内的高度或深度）、运行变化（由于功率波动或中断）和用户变化（由于打开/进入冷冻机）的同时实现合意的ltsp。
44.可通过对葡甘露聚糖体系施以包括受控速率降温和/或恒温的冷冻条件来实现ltsp参数。在一些实施方案中，冷冻条件包括受控速率降温。通过使用实验室、食品、临床级受控速率冷冻机实现受控速率降温。受控速率冷冻步骤条件的结束温度可选自等于或低于0℃的温度，如约-78℃至-20℃、-20℃至-10℃、-10℃至-5℃、或-5℃至0℃的温度。
45.在一些实施方案中，受控速率为约-0.05℃/min至-l℃/min、-0.1至-10℃/min、-0.5℃/min至-0.005℃/min、-0.05℃/min至-0.005℃/min、或-0.06℃/min至-0.04℃/min。在一个实施方案中，受控速率为约-0.05℃/min。
46.在一些实施方案中，冷冻条件包括暴露于恒温。恒温冷冻条件包括等于或低于约0℃的任何温度。恒温冷冻条件包括约-78至-20℃、-20至-10℃、-10至-5℃、-5至-1℃的温度。暴露的持续时间可等于或大于约5 min、15 min、30 min、1 hr、2 hr、2.5 hr、3 hr、4 hr或5 hr。在一些实施方案中，在恒定冷冻温度下暴露的持续时间为约1-5小时。在其它实施方案中，暴露的持续时间可以为至少约5、8、10、12或24小时。
47.在另一实施方案中，冷冻条件包括受控速率期和恒温期二者。在一个实施方案中，冷冻条件包括受控速率期，随后是恒温期。
48.iii. 循环冻融在一些实施方案中，该方法包括一个或多个冻融循环。冻融循环是对在等于或低于约0℃的温度下用于诱导、调整和维持sp的葡甘露聚糖体系施以解冻条件，然后再施以冷冻条件（其可以与一个或多个先前的冷冻步骤相同或不同或其组合）的时间。该方法可包括0、1、2、3、4或更多个冻融循环。在一个实施方案中，该方法包括一个冻融循环。
[0049]“解冻条件”包括约0℃至5℃、0℃至10℃、0℃至20℃的温度、室温条件（约20℃至25℃、或约23℃）、或高于约25℃的温度。在一个实施方案中，解冻条件使葡甘露聚糖体系达到约室温的温度。
[0050]
当解冻步骤使葡甘露聚糖体系达到高于0℃的温度时，下一个循环可包括在后续冷冻步骤之前的中间冷却步骤。例如，在一些实施方案中，解冻步骤包括将葡甘露聚糖体系从低于约0℃的温度升温（例如允许在室温下升温）到高于约0℃、5℃、10℃、25℃、30℃或35℃的温度。然后对解冻的葡甘露聚糖体系施以冷却步骤，其中将该体系温度降低到低于解冻温度但高于约0℃的温度，例如约4℃。然后对葡甘露聚糖体系施以如前所述的冷冻步骤。类似于冷冻条件，可通过受控速率和/或恒温条件实现解冻和/或冷却条件。
[0051]
iv. 葡甘露聚糖凝胶制剂本发明的方法可包括各种附加步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括形成包括碳水化合物混合物（具有至少约50% (w/w)葡甘露聚糖）、碱性溶液和水的反应混合物；以及在约50℃至约130℃的温度下加热反应混合物以形成葡甘露聚糖凝胶和/或将葡甘露
聚糖凝胶的压力提高到比大气压高约0.1 psi至50 psi以形成葡甘露聚糖凝胶。
[0052]
本发明的方法中使用的葡甘露聚糖凝胶是碳水化合物混合物（具有至少约50% (w/w)葡甘露聚糖）和水溶液的混合物。葡甘露聚糖可作为葡甘露聚糖粉末提供。在一些实施方案中，将葡甘露聚糖粉末溶解在水中以提供在水中含有约1%至约5% w/v葡甘露聚糖的葡甘露聚糖溶液。葡甘露聚糖粉末可在任何适当的温度和压力条件下溶解在水溶液中。可被包括的碳水化合物的实例非限制性地为藻酸盐、壳聚糖、淀粉、基于植物或细菌的多糖。
[0053]
为了将葡甘露聚糖凝胶诱导到sp，该方法可包括冷却反应混合物（先前被加热以促进溶解），随后将gm凝胶施加到冷冻系统。在一些实施方案中，如本文所述，在将gm凝胶施加到冷冻系统以维持sp之前，将葡甘露聚糖凝胶的温度冷却到低于约80℃。在某些实施方案中，在将gm凝胶施加到冷冻系统之前，将葡甘露聚糖凝胶的温度冷却到低于约50℃。冷却步骤可以以受控速率或恒温方式进行。在一个实施方案中，冷却步骤通过将加热的葡甘露聚糖混合物恢复到室温进行。
[0054]
该水溶液可具有任何合适的组成。该水溶液可以是水或水和一种或多种不降解或消化中性的葡甘露聚糖体系的试剂的混合物。合适的水溶液的实例包括但不限于水、缓冲溶液和细胞培养基。
[0055]
在一个实施方案中，该水溶液是缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于pbs、taps、bis-tris丙烷、tris、hepes、tes、mops、pipes和mes。在一些实施方案中，缓冲溶液是pbs、hepes、mes、mops、tris或bis-tris丙烷。在优选实施方案中，缓冲溶液是pbs。
[0056]
在另一实施方案中，该水溶液是细胞培养基。合适的细胞培养基的实例包括但不限于roswell park memory institute培养基（rpmi）、dulbecco's改良伊格尔培养基（dmem）、最低基本培养基（mem）、dulbecco's改良伊格尔培养基：营养混合物f-12培养基（dmem/f12）、iscove's modified dulbecco's培养基（imdm）、national collection of type cultures培养基（nctc）和成骨诱导培养基（oim）。在一些实施方案中，细胞培养基是roswell park memory institute培养基（rpmi）、dulbecco's改良伊格尔培养基（dmem）、最低基本培养基（mem）、dulbecco's改良伊格尔培养基：营养混合物f-12培养基（dmem/f12）、iscove's modified dulbecco's培养基（imdm）或national collection of type cultures培养基（nctc）。
[0057]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖凝胶可包括酸性溶液。合适的酸性溶液的实例包括但不限于盐酸、乙酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸。
[0058]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖凝胶可包括碱性溶液。碱性溶液可以是任何含有碱金属盐或碱土金属盐的溶液。代表性的碱金属盐和碱土金属盐包括但不限于氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化镁、碳酸镁、氢氧化钙和碳酸钙。在一些实施方案中，碱性溶液包含氢氧化钙。
[0059]
v. 葡甘露聚糖支架制备和修饰本发明的葡甘露聚糖支架可以是碱性的（具有大于约8的ph），或其可根据美国专利9,359,591中描述的方法中和（具有约7的ph），该专利通过引用以其整体并入本文。
[0060]
本发明的葡甘露聚糖支架随后可通过高压灭菌法进行灭菌，以使其可用于植入和其它体内应用。
[0061]
在一些实施方案中，该方法进一步包含从葡甘露聚糖体系中除去水。可通过本领
域中已知的任何合适的方法除去水。在一些实施方案中，通过冷冻干燥、升华或热致相分离操作进行该除去步骤。在某些实施方案中，通过升华进行该除去步骤。
[0062]
在本发明的一个方面，葡甘露聚糖支架包括一种或多种骨成分。骨成分被定义为有助于骨生成或骨形成的任何物质。骨成分包括但不限于有机成分如细胞外基质和/或骨基质或碎骨粉（ground bone），和无机成分如钙、磷酸盐、钾、镁和羟磷灰石。在一个实施方案中，该支架包括钙和/或磷酸盐作为骨成分。在另一实施方案中，该支架包括钙。（一种或多种）骨成分整体结合到支架的骨架上。骨成分的总浓度相对于葡甘露聚糖体系在约0.1至95% (w/w)的范围内。例如，该支架可用1-20%、1-10%或约5% caoh: 葡甘露聚糖粉末(w/w)制造。
[0063]
该浓度是合意有利的，因为其使得支架是射线可透的。在更高浓度下，支架将是不透射线的，由此阻碍干细胞粘附和骨形成的可视化和监测。在更低浓度下，支架在发生新骨形成方面不太有效。在骨科市场可得的大多数产品是不透射线的，这意味着即使没有发生骨生成，这些产品也可表现出与发育中的骨或成熟骨类似的射线照相密度。因此，射线可透的产品将为外科医生、医生和患者提供随时间以射线照相来可视化和监测骨再生的能力。ct提供优异的小梁和皮质骨分辨率以及用于评估矿物密度的亨氏（hounsfield）单位（hu）的定量方法。hu是组织的标准线性衰减系数，容易提供关于骨量的信息。通常，骨的hu值在300至3,000的范围内。因此，用于骨应用的“射线可透性”被定义为hu低于300。与这一观察结果一致，本发明的支架测得的hu小于300并提供监测和量化骨修复和再生的独特的方式，其在基线处始于300以下的hu，且hu随着骨修复和再生过程发生随时间增加。
[0064]
在本发明的另一个方面，将葡甘露聚糖凝胶和/或葡甘露聚糖支架改性以促进细胞粘附和增殖。示例性的改性包括但不限于，并入细胞粘附促进剂、化学交联、表面涂层和引入官能团。本领域中已知的所有这样的分子和结构都包括在本发明的公开内。
[0065]
本发明的葡甘露聚糖支架可包括一种或多种细胞粘附促进剂。如本文所用的，术语“细胞粘附促进剂”是指例如通过修饰基质表面和/或通过改变表面电荷来增强细胞与培养基质的粘附或附着的天然或合成试剂。细胞粘附促进剂也可促进细胞生长和细胞分化。细胞粘附促进剂也可增强血清或细胞外基质蛋白对培养基质的吸附。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂可以是聚-l-赖氨酸（pll）、聚-d-赖氨酸（pdl）、rgd肽（rgd）、kqagdv、vapg、fgl、胺基团、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。细胞外基质蛋白可来自任何合适的来源，包括但不限于哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂是pll或rgd。在某些实施方案中，细胞粘附促进剂是pll。
[0066]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖支架包括合适的趋化分子。示例性的趋化分子包括但不限于血清、趋化因子、形态发生蛋白、生长因子、透明质酸。在一个实施方案中，葡甘露聚糖支架包括一种或多种骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白包括但不限于bmp-1、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8a、bmp-8b、bmp-9、bmp-10、bmp-11、bmp-12、bmp-13、bmp-14、bmp-15。在一个实施方案中，支架包括bmp-2。bmp可以是重组的或天然来源的。骨形态发生蛋白溶液在支架中的浓度比为约0.001至1.5 mg/ml。
[0067]
支架可包括其它骨诱导因子，如成纤维细胞生长因子-2（fgf-2）和/或血小板源性生长因子（pdgf）。在人体中，在断骨上清液中测量的bmp-2浓度为约23.2 pg/ml（glass等人proceedings of the national academy of sciences 2011 108:1585-1590）。但是，重组
人bmp-2（rhbmp-2）在临床上以1.5 mg/ml的剂量递送，显著高于损伤后的bmp-2天然浓度。rhbmp-2以高达2.5 mg /水平的浓度用于超适应症颈前路椎间盘切除融合术（acdf），该浓度是在试点研究中的用量的3.5倍（shields等人spine 200631:542-547）。这种较高的剂量与增加的并发症相关联，包括血肿、颈部肿胀、吞咽困难和过度水肿（shields等人spine 200631:542-547）。追溯到高剂量rhbmp-2的其它不良事件包括吞咽困难和异常脂肪组织形成（shields等人spine 2006 31:542-547）。尽管bmp-2的使用已经越来越受欢迎，但其在2003年至2007年间的用量的85%是超适应症（ong等人spine 201035:1794-1800）。这已导致bmp-2由于高临床剂量引起的并发症而受到大量关注（lykissas等人world journal of orthopedics 2017 8:531-555）。此外，重要的是将rhbmp-2定位于损伤部位，以使成骨前体增殖和分化成成熟骨细胞（sandhu等人spine 2003 28:64-73）而不泄漏到邻近组织中。但是，已经表明rhbmp-2在其作用扩展到靶区域外时在周围区域产生非预期的副作用，以致除上文列出的副作用外还导致异位骨形成（tannoury等人the spine journal 2014 14:552-559、shields等人spine 2006 31:542-547）。rhbmp-2的常用商业载体是可吸收胶原海绵（acs）。尽管acs已表明是rhbmp-2的有效载体，但可能由胶原降解引起的快速释放速率要求rhbmp-2以高浓度植入以递送有效剂量，这进一步增加并发症的风险（mariner等人journal of orthopaedic research 201231:401-406、winn等人clinical orthopaedics and related research 1999367:95-106）。因此，有效地将rhbmp-2定位在植入部位并降低有效剂量的载体是合意的。
[0068]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖支架包括合适的细胞信号分子。示例性的细胞信号分子包括但不限于细胞外基质蛋白、肽基序和生长因子以及本领域中已知的其它分子。
[0069]
vi. 使用方法本发明的支架可用于各种体外和体内方法。该支架可用于实验建模以及治疗应用。这样的实验和治疗用途包括但不限于新血管形成、矫形外科、心血管、神经元、伤口愈合、止血、药物筛选和药物递送、组织再生、类器官（organoid）、组织（包括软组织）和骨（再）生成、皮肤病学和牙科学。
[0070]
在一些实施方案中，该方法进一步包含在葡甘露聚糖支架上生长细胞。合适的细胞类型和培养条件是本领域已知的。
实施例
[0071]
实施例1: 冻/融循环将葡甘露聚糖粉末（1-5克）与0.15克氢氧化钙（sigma-aldrich, st. louis, mo, usa）一起在烧杯中溶解在100毫升水中，充分混合，并在室温下培养30分钟。用铝箔覆盖含有gm溶液的烧杯，并在保持在80℃以上温度的水浴中培养至少30分钟。在冷却到室温后，将所得gm凝胶切割成较小凝胶并在室温下在水中浸泡过夜。
[0072]
为了生产具有结构一致性和均匀孔隙率的多孔葡甘露聚糖支架，将葡甘露聚糖凝胶放置在变温室中的金属网上。以-0.05℃/min将室中的温度从室温降低到4℃。一旦温度达到4℃，将凝胶培养1-5小时。随后，以-0.05℃/分钟将温度再次降低到-20℃并在-20℃下保持5小时。对葡甘露聚糖凝胶施以这些特定的温度和时间以确保ltsp在用于产生结构一致性和均匀孔隙率的范围内。在5小时后，将葡甘露聚糖凝胶在水中以25℃/分钟解冻至室
温3-7小时或直至完全解冻。在下一个温度循环前挤出水。在这一实施例中，该温度循环进行四次。
[0073]
在最后一个循环后，在搁板温度达到120℃的情况下使水升华最多72小时，并将真空保持在100-300毫托（13至40 pa）。在干燥循环后，葡甘露聚糖支架通过在加压室中在磷酸盐缓冲盐水（ph 7.4）中煮沸30分钟来中和，随后在加压室中在蒸馏水中洗涤和煮沸两个循环，各持续30分钟。在最后一次洗涤之后，如上所述从葡甘露聚糖支架中升华水。将所得多孔gm产物切割成定制的形状和尺寸，包装在含有干燥剂的聚乙烯袋中，密封，并在室温下储存直至使用。
[0074]
实施例2: 固化阶段的时间长度使用与实施例1相同的方法制造葡甘露聚糖凝胶。在制成葡甘露聚糖凝胶后，将其放置在所选温度（例如-78℃、-20℃、-10℃、-5℃和-1℃）下的恒温冷冻机中。为了测定ltsp，测量凝胶的温度。为了获得凝胶的温度，将温度探针（cooper atkins digital thermometer, lcd, immersion probe）置于凝胶的中心。然后以所选间隔获取温度（例如30秒、1分钟、5分钟、10分钟）并作图。
[0075]
实施例3: 通过含钙的超高交联碳水化合物聚合物诱导骨生成我们研究了含钙的osteo-p
®ꢀ
bgs诱导骨生成的性质。与原位骨形成（即，邻近现有骨的骨生成）相比，对异位骨形成的研究探究了受试制品在缺乏适当的生物化学、生物机械和骨形成或内源性干细胞的情况下形成骨的能力。因此，其消除了与骨生成诱导相关的潜在外来的实验变量，以使研究人员能够研究受试制品诱导骨形成的能力。在这个正在进行的研究中，利用特征明确的大鼠模型研究在无血管环境中皮下植入时hccp加上骨成分钙是否能够诱导骨生成。
[0076]
材料和方法大鼠（wistar igs雄性大鼠，charles river，wilmington，ma）在距离切口部位至少1 cm的无血管位置（以避免与血液的可能混合）皮下植入含有整合到孔隙微结构中的钙的hccp（hccp-ca，n =6）或含钠的对照hccp构建体（hccp-na [“对照”]，n =6）。在基线处并每周拍摄ct图像，直至在植入后1个月收获植入物。收集各个植入物并进行组织学（苏木精和曙红染色）、免疫组织化学（ihc）和von kossa染色的处理。
[0077]
ct表现ct图像显示，与基线相比，在4周时植入部位的放射密度水平的增加。指示骨化的亨氏单位（hu）的量化评估用于在所有时间点比较hccp-ca与对照物。作为比较，在植入后4周观察到的hu的量等于在妊娠中期的发育中的胎儿骨的量。
[0078]
总体和组织学表现收获植入物，并进行总体成像。hccp-ca显示含有新鲜血液的新血管形成的证据。但是，使用对照构建体时观察到有限的新血管形成。与总体表现一致，组织学评价也揭示了新形成的血管浸润到hccp-ca中，并且对照构建体显示出有限量的血管。值得注意的是，观察到对照构建体具有更多的表现出成纤维细胞形态的细胞，而观察到hccp-ca具有表现出类似成骨细胞的形态的细胞。另外的切片显示对照构建体与hccp-ca之间的一些形态学差异。
[0079]
ihc和von kossa表现
通过ihc进一步评价植入物的骨唾液蛋白（bsp）的表达，bsp是矿化组织，如骨的重要组分。通过红色染色证实在hccp-ca中观察到大量表达bsp的细胞。所有其它条件（检测对照、对照构建体）显示背景染色，表现出特征不同的染色图。von kossa染色旨在用于钙沉积物的组织学可视化。与所有其它表现一致（ct、组织学、ihc），von kossa染色在对照构建体中表现出最小信号，而hccp-ca表现出钙沉积的证据。
[0080]
结论这些研究的结果表明，观察到hccp-ca具有：(1) 基于ct观察，与在妊娠中期发育中的胎儿的骨（最可能接近松质骨、肋骨）中观察到的骨密度相似的提高的放射密度水平；(2) 当植入无血管环境中时，新血管形成的证据；(3) 渗透到产物中的细胞的细胞质中的骨唾液蛋白的表达；和(4) 当皮下植入大鼠时，位于产物中的细胞中的von kossa染色。
[0081]
实施例4: 超高交联的碳水化合物聚合物与骨形态发生蛋白-2的结合亲和力超高交联的碳水化合物聚合物（hccp）已表明有效地桥接和修复临界大小的骨缺损。进行这一研究以探究hccp与重组和内源性骨形态发生蛋白-2（bmp-2）在体外和体内的相互作用。hccp在缓冲液和掺有重组人bmp-2（rhbmp-2）的骨髓中培养，充分洗涤，并使用定性和定量的免疫基检测来评估bmp-2结合亲和力。将hccp也植入新西兰白兔（new zealand white rabbits）的股骨髁的临界大小的缺损中，以将体外和体内表现相关联。结果表明rhbmp-2可结合到hccp并保留在hccp中，这通过抗体染色和elisa表现证实。植入临界大小的骨缺损中的hccp揭示了内源性bmp-2定位于被表达bmp-2的细胞包围的hccp结构体的表面。这些表现表明，hccp与bmp-2的结合亲和力可在临界大小的骨缺损的修复和桥接中起到重要作用，并支持hccp作为rhbmp-2的新载体。这一研究支持了超高交联碳水化合物聚合物（hccp）与bmp-2的结合亲和力在临界大小的骨缺损中的早期骨生成中起到关键作用的假说。这一研究还提出hccp可以是acs的合适替代物的证据。当作为用于修复兔股骨髁中的临界大小的缺损的骨移植替代物进行探究时，与acs的2-4周相比，hccp表现出平均16周的降解分布，这导致显著的骨再生。因此，hccp与rhbmp-2和内源性bmp-2的结合亲和力可提供在植入部位建立早期骨生成的有价值手段，并为其作为新载体的临床应用提供了证据。
[0082]
材料和方法hccp的表征和制备：hccp由合成交联的碳水化合物链组成。hccp在体内和体外研究中已证实是生物相容的，没有致热原性、免疫原性、细胞毒性或致癌性。hccp的微结构使用压汞技术表征（micromeritics instrument corporation, norcross, ga, usa），并表现出50-500 μm孔径的平均孔隙范围。如前所述制备hccp圆盘（7 mm x 5 mm）、颗粒（2 mm x 5 mm）和立方体（1 cm3）。对于体内应用，hccp在使用前通过高压灭菌法进行灭菌。
[0083]
定量的rhbmp-2结合亲和力测定：将hccp立方体（1 cm3，n = 5）在含有1 μg/ml rhbmp-2（r & d systems，minneapolis，mn，usa）的pbs中培养。在5分钟时收集溶液包围的hccp立方体样品（“负载”样品）。将hccp转移并浸没在新鲜的磷酸盐缓冲盐水（pbs, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）中，并在30分钟后收集pbs包围的hccp样品。同样地，对于连续的时间点（30分钟、16小时、40小时和64小时），将hccp转移并浸没在新的pbs中，并在每个时间点收集样品。
[0084]
将样品在pbs中稀释50倍，并通过elisa分析每次洗涤中滤出的残留rhbmp-2。pbs和1 μg/ml rhbmp-2溶液（未用hccp培养）用作对照。进行两个独立的elisa检测以评估hccp
保留rhbmp-2的能力。第一个检测利用夹心(2,2'-连氮基-双)abts elisa试剂盒（peprotech, rocky hill, nj, usa）进行吸光度读数。elisa板根据试剂盒制造商的程序用捕获抗体预备整夜。第二天，将板在pbs中的0.05% tween-20（洗涤缓冲液）中洗涤4次，并用pbs中的1%牛血清白蛋白（bsa, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）封闭1小时以防止非特异性结合。然后使用洗涤缓冲液将板洗涤4次。
[0085]
第二次elisa检测30分钟后的hccp上的rhbmp-2保留。hccp立方体（1 cm3，n =3）在含有1 μg/ml rhbmp-2的1毫升pbs中培养。在30分钟后，从rhbmp-2溶液中取出hccp立方体，拧干过量溶液，并将rhbmp-2溶液的残留浓度稀释500倍，并根据制造商的说明书（thermofisher, waltham, ma, usa）使用elisa量化。pbs和1 μg/ml rhbmp-2溶液（未用hccp培养）用作对照。
[0086]
rhbmp-2保留的可视化：在镇静和无菌条件下从雄性新西兰白兔（4.0 kg，》6月龄）收集骨髓抽取液（bma）。所有外科和动物护理程序都得到institutional animal care and use committee（protocol# mm-007102）的批准。用0.5 m乙二胺四乙酸（edta, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）的10%无菌溶液预备的22 g脊椎穿刺针用于从股骨抽取最多3 ml骨髓。将bma收集在含有edta三钾的无菌5 ml管中。hccp圆盘（7 mm x 5 mm, n=3）在含有pbs和1 μg/ml rhbmp-2的24孔板中培养过夜。hccp圆盘也在掺有1 μg/ml rhbmp-2的骨髓中培养。不含rhbmp-2的pbs和骨髓用作对照。然后从孔中取出hccp圆盘，用1 ml pbs冲洗三次，并用原代小鼠抗人bmp-2抗体（1 μg/ml）（abeam, cambridge, ma, usa）培养。在1小时后，hccp圆盘在pbs中充分洗涤并使用3,3-二氨基联苯胺（dab）试剂盒（r&d systems, minneapolis, mn, usa）染色。将染色的hccp圆盘的图像上传到imagej（national institute of health, bethesda, md, usa），并通过测量像素强度来测定rhbmp-2的信号。在白色背景下拍摄染色hccp圆盘的rgb图像。将图像在imagej中转换成32位灰度并倒转。对于每个图像，在排除了周边阴影的圆盘周围绘制感兴趣区域（roi）。对每个选择测量平均像素强度值。为了考虑到图像之间的照明差异，从hccp圆盘的平均强度减去背景的平均像素强度值。
[0087]
内源性bmp-2与hccp的结合亲和力：使用新西兰白兔（nzw）中已确立的临界大小的骨缺损模型来探究内源性bmp-2是否在体内表现出对hccp的结合亲和力。所有外科和动物护理程序都得到institutional animal care and use committee（protocol# mm-003828）的批准。使用氯胺酮-咪达唑仑混合物（20 mg/kg；2 mg/kg）使雄性nzw兔（n =6，4.0 kg (
±
0.5)，13月龄）镇静，并使用异氟烷（》5%）麻醉。夹住左右股骨，并用聚维酮碘和70%乙醇溶液消毒。通过切开并解剖皮肤、浅筋膜和深筋膜而进入外侧股骨髁。使用2 mm高速磨钻（medtronic, minneapolis, mn, usa）在两侧制作7 mm直径
×
10 mm深度的圆柱形缺损，并将约1 cc的hccp颗粒（2 mm x 5 mm颗粒）植入各缺损中。植入部位用骨蜡密封，用4-0可吸收pds-ii缝合线（ethicon, somerville, nj, usa）缝合，并用外科钉修补。在手术后用抗生素和镇痛药治疗兔子三天，并在研究期间每天进行临床观察。在安乐死后2周(n = 3)和4周(n = 3)用戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液从动物中收获hccp。
[0088]
免疫染色：将hccp外植体在10%福尔马林中固定至少24小时，然后转移到70%乙醇中以便包埋在石蜡中（vdx veterinary diagnostics, davis, ca usa）。切片（5 μm）在制剂83（cbg biotech, solon, oh, usa）中脱蜡并在浓度递减的无水乙醇中再水化，用pbs整
理。载玻片用dab染色试剂盒（r&d systems, minneapolis, mn, usa）提供的血清封闭剂培养，用1 μg/ml的原代小鼠bmp-2抗体（abeam, cambridge, ma, usa）培养1小时，在pbs中洗涤，然后使用相同的dab染色试剂盒染色以确定是否存在内源性bmp-2，并最后用mm83封固剂（cbg biotech, solon, oh, usa）封固。
[0089]
统计分析：结果报告为平均值
±
平均值的标准误差，并使用microsoft excel（microsoft, redmond, wa, usa）计算。通过方差分析或双侧学生t检验分析测定统计学意义。关于图像光密度数据的统计学使用welch t检验，在excel中进行。
[0090]
结果hccp对rhbmp-2的保留：为了间接分析负载rhbmp-2的hccp的保留状况，在两个独立检测中进行elisa。第一elisa检测分析了hccp经过64小时的持续时间保留的rhbmp-2（图4）。第二elisa检测具有3个独立的负载rhbmp-2的hccp立方体；在30分钟后测定保留（图5）。这两个elisa分析都表明与hccp一起培养后rhbmp-2溶液中可检出的rhbmp-2量的减少。发现hccp保留了286 ng rhbmp-2/g hccp，具有90%置信区间[159, 418]和95%置信区间[129, 449]。
[0091]
图4表明，发现在bmp-2溶液中培养支架后，hccp支架具有平均44.91 ng/ml rhbmp-2保留率。在负载有rhbmp-2的hccp支架经过pbs洗涤30分钟后，发现保留平均34.22 ng/ml rhbmp-2。在pbs洗涤16小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为32.11 ng/ml。在pbs洗涤40小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为31.65 ng/ml。在pbs洗涤60小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为31.61 ng/ml。这一数据提供了hccp支架确实保留rhbmp-2的证据。
[0092]
此外，图5表明，在hccp培养后，基线对照有1.08 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，没有rhbmp-2保留在支架中。用作阴性对照的pbs溶液既没有rhbmp-2在溶液中也没有rhbmp-2在支架中。hccp 1在hccp培养后有0.17 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.91 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。hccp 2在hccp培养后有0.31 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.77 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。hccp 3在hccp培养后有0.21 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.87 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。
[0093]
hccp对rhbmp-2保留的直接检测：为了提供hccp结合和保留rhbmp-2的能力的直接证据，向hccp圆盘加载rhbmp-2，然后在pbs中洗涤3次，并用抗bmp-2抗体进行免疫染色。用dab secondary比色检测rhbmp-2的存在。浸泡在rhbmp-2中的hccp显示高dab信号，而对照圆盘显示最小检测（图6）。在rhbmp-2溶液中培养过夜的hccp圆盘具有42.73像素强度的调整强度。在骨髓和rhbmp-2中培养过夜的hccp圆盘具有24.93像素强度的调整强度；在单独骨髓中的hccp具有16.02像素强度；在pbs中的hccp具有17.67像素强度。这一数据提供pbs对照 vs. rhbmp-2负载的hccp的图像强度的统计学意义差异的直接证据（17.7
ꢀ±ꢀ
5.37 vs. 42.7
ꢀ±ꢀ
2.74平均像素强度，p值0.003）。
[0094]
hccp中的内源性bmp-2的检测：接下来，通过将hccp植入兔股骨髁中来评估hccp结合内源性bmp-2的能力。在2周和4周移出支架，加工并染色以检测内源性bmp-2（图7）。取自整个组织块样品中的多个位置的连续5 μm切片显示沿孔隙壁存在内源性bmp-2沉积。在hccp孔隙各处观察到许多表达bmp-2的细胞。兔igg同型对照显示最小至无bmp-2信号。图7中的阳性棕色染色显示在支架外植体中除形成成骨细胞外还有结合到hccp的内源性bmp-2
的证据。
[0095]
讨论hccp的安全性状况及其作为骨引导型骨移植替代物的多样化应用提供了在各种临床环境中递送rhbmp-2以便骨再生和修复的有前途的媒介物。bmp-2在植入装置上的定位对促进内源性成骨干细胞和祖细胞在植入部位的募集、增殖和分化可以是重要的。在我们先前的研究中，hccp在兔中早在10周就显示桥接股骨髁中的临界缺损（koleva等人bioresearch open access 2019 8:111-120）。进行本研究以探究hccp和bmp-2之间的相互作用并提出潜在作用机制。结果表明rhbmp-2在hccp中的体外稳定保留和内源性bmp-2在体内沉积在三维多孔hccp结构体的表面上。此外，我们已经在bmp-2定位到的hccp孔隙内观察到大量表达bmp-2的细胞，这表明hccp可在植入后通过内源性bmp-2与hccp的微结构表面的结合获得骨诱导特性。
[0096]
在机械创伤或通过自分泌和旁分泌调节机制刺激后的软骨内愈合、板层骨形成或膜内愈合期间，bmp-2的表达特别在成骨细胞和血管细胞中上调。但是，其也显示导致许多严重的副作用，包括异位骨形成和周围组织的炎症（robin等人spine 2010 35:1350-1354, wong等人the spine journal 2008 8:1011-1018），这表明rhbmp-2从植入部位泄漏。有趣的是，wyeth发表的早期研究表明，使用胶原海绵递送的显著量的125i-rhbmp-2离开植入部位（植入后24小时为~50%，7天为68%，2周为》90%）（geiger等人advanced drug delivery reviews 2003 55:1613-1629），表明125i-rhbmp-2在胶原中的保留差和/或胶原载体的快速降解。有趣的是，在最近的研究中（gunnella等人the spine journal 2017 17: 1699-1711），当rhbmp-2与聚(l-丙交酯-共-乙交酯)酸（plga）纤维增强的透钙磷石形成水泥（cpc）一起递送时，低于100 μg（当前临床剂量的~1/100倍）的剂量已显示显著增强骨形成。这种观察结果可以是由于rhbmp-2在植入部位的更好保留和/或载体的更慢降解。
[0097]
由于它们的化学和机械性质以及易于制造和灭菌，其它合成聚合物也已作为rhbmp-2的载体进行研究（wang等人journal of biomedical nanotechnology 2017 13:1446-1456）。合成聚合物的实例包括聚l-乳酸（pla）、聚乙醇酸（pga）和两者的组合作为plga。但是，这些聚合物已知在临床环境中使用时潜在地引起炎症反应（anderson等人advanced drug delivery reviews 199728:5-24, ceonzo等人tissue engineering 2007 12:301-308）。使用合成聚合物的其它缺点包括由于副产物的累积导致的局部ph降低和有限的生物功能（ceonzo等人tissue engineering 2007 12:301-308）。用于避开其它合成物的限制的一种替代材料可以是多糖聚合物，由于其生物相容性、可持续性和可再生特性，其已受到欢迎（wahab等人composites from renewable and sustainable materials 2016）。多糖由碳水化合物链组成，这简化了hccp的组成。我们对hccp的研究证实了其作为rhbmp-2的新型多糖递送体系的有前途的潜力，如通过其将内源性bmp-2定位在其整个结构中的能力所证实的。此外，hccp已显示比plga更高效地显著桥接临界骨缺损（koleva等人bioresearch open access 2019 8:111-120），同时保持射线可透性（在骨形成的情况下为不透射线的），这不同于矿化/水泥基载体。
[0098]
总之，bmp-2定位于hccp可部分有助于临界大小的骨缺损的修复和再生。可能的是hccp的其它机械和化学性质可对植入部位的骨生成提供额外的贡献。bmp-2与hccp的结合亲和力为开发可吸收胶原海绵的更有效和更安全的替代品提供了额外的机会。
[0099]
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但本领域技术人员将认识到，可在所附权利要求的范围内实践某些变动和修改。尽管本文可能就某些实施方案描述了特定特征，但这些特征可应用于本发明的任何实施方案。此外，本文提供的各参考文献通过引用以其整体并入本文，就像各个参考文献独自通过引用并入本文那样。
1.相关申请的交叉引用本技术要求2019年10月29日提交的美国临时申请号62/927,207的优先权，其通过引用以其整体并入本文。
2.发明背景组织工程学需要功能细胞、适当的生化因子和生物材料支架以再生、改善、替换或修复受损、患病或缺失的组织和/或器官，以努力改善患者的临床结果。组织工程学也可用于开发生物构建体（construct）以研究和筛选毒素、药物、蛋白质和各种化合物。尽管细胞是用于生成组织和生物构建体的基本结构单元，但生物材料支架在体内或体外建立有益于构建组织的环境中起到关键作用。
3.支架可由天然来源材料（例如基于碳水化合物或蛋白质的生物材料）或合成材料（例如基于聚合物或陶瓷的材料）构建。支架材料应该是生物相容的和生物可降解的，并且其应该具有与相关组织/部位一致的机械性质。支架架构还应表现出足够的孔径和密度以允许细胞和营养物的扩散（o’brien materials today 2011 14:88-95）。
4.已用作组织工程学支架的碳水化合物基生物材料包括但不限于藻酸盐、壳聚糖、糖胺聚糖和杂化复合材料。葡甘露聚糖（gm）聚合物是超高交联的，以产生有益于生物应用的高度多孔、热稳定、生物相容和生物可降解的结构。
5.基于碳水化合物的支架也已用作骨诱导因子，如重组人bmp-2的载体媒介物（vehicle）。rhbmp-2已用于超适应症颈前路椎间盘切除融合术（acdf），但所用浓度远超过天然存在的bmp-2水平以补偿超出植入部位向邻近组织中的泄漏。这样的泄漏和高剂量与不良事件相关联。因此，有效地将bmp-2定位在植入部位并降低有效剂量的载体是合意的。
6.当前生产葡甘露聚糖支架的方法导致结构坍塌和不均匀孔隙率。这一观察结果尚未得到研究，并且迄今还没有采取任何努力以防止结构坍塌或不均匀孔隙率。相反，简单地选择支架构建体的具有适当结构和孔隙率的部分，并将其与其余部分切离以提供用于组织工程学的最佳结构。支架构建体的未选择的不合适的部分被丢弃，导致相当大的废料量和总生产成本的增加。此外，设备和实验室的不规则性导致结构坍塌和不均匀的孔隙率。设备变化（由于冷冻机的机龄、制造、型号或配置）、位置变化（由于凝胶在冷冻机内的高度或深度）、运行变化（由于功率波动或中断）和用户变化（由于打开/进入冷冻机）都导致甚至单个冷冻系统内的温度差异。
7.因此，改进支架特性的方法是必要的。美国专利号9,359,591中公开的制造多孔葡甘露聚糖支架的方法导致葡甘露聚糖支架的结构坍塌。本发明提供了获得葡甘露聚糖支架的结构特性的更好结果的改进方法。
8.发明概述已经发现，通过控制固化阶段的时间长度变量，可制造均匀多孔和互连的支架。在一个实施方案中，本发明提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括在导致约10-2000分钟或在一些实施方案中50-1500分钟的固化阶段的条件下冷冻葡甘露聚糖凝胶。该方法可包括监测凝胶的温度。
9.在另一实施方案中，本发明提供了一种制备葡甘露聚糖支架的方法，其包括步骤：a) 将葡甘露聚糖凝胶从约25℃的温度冷却到约4℃的温度；b) 将葡甘露聚糖凝胶在固化阶段保持至少约10分钟；c) 将葡甘露聚糖凝胶解冻至约25℃的温度；d) 任选地重复步骤a)、b)和/或c)。在一些实施方案中，该制备方法包括至少1、2、3或4个冻融循环。
10.本发明还提供由本文所述的制造方法制成的支架。
11.在另一实施方案中，本发明提供一种支架，其具有至少约50%的孔隙率和/或至少约50%的互连度（interconnectivity）。在一个实施方案中，孔隙率和/或互连度均匀地呈现在整个支架中。在另一实施方案中，具有所述孔隙率和/或互连度特性的支架的体积是葡甘露聚糖凝胶的体积的至少10%。在一个实施方案中，所述支架具有约100-500 μm的均匀孔径。
12.在一个实施方案中，本发明的方法包括中和支架的ph的步骤。类似地，在一个实施方案中，本发明提供具有约7的ph的支架。
13.本发明的支架具有至少50% w/w碳水化合物混合物的骨架，和在一些实施方案中至少50%葡甘露聚糖的骨架。所述骨架可包含复合材料。在一些实施方案中，所述支架包括一种或多种骨成分（如钙和磷酸盐）和/或一种或多种形态发生蛋白（如bmp-2）。
14.在另一实施方案中，所述支架是射线可透的。
15.在另一实施方案中，所述支架可用于实验建模以及治疗应用。这样的实验和治疗用途包括但不限于新血管形成、矫形外科、心血管、神经元、伤口愈合、止血、药物筛选和药物递送、组织再生、类器官（organoid）、组织（包括软组织）和骨（再）生成、皮肤病学和牙科学。
16.附图简述图1a显示使用现有技术制成的葡甘露聚糖支架。其表现出结构的显著坍塌，导致不均匀的孔隙率。图1b显示使用所述的本方法制成的gm支架。
17.图2显示葡甘露聚糖（gm）体系的阶段图。gm体系的温度沿y轴表示，且时间沿x轴表示。gm凝胶首先经历温度变化，直至达到冷冻（冷却）温度，随后是恒温期，我们将其定义为固化阶段的时间长度（ltsp）。当凝胶达到低于冰点的温度时，可发生过冷。sp是其中凝胶中的所有液体冷冻形成冰晶的阶段。然后温度进一步冷却以达到该体系的最终温度。
18.图3显示具有互连孔隙的高度多孔葡甘露聚糖支架。图3显示将葡甘露聚糖支架浸没在有色染料中。图3b显示染料通过互连孔隙渗透支架。图3c显示完全被染料饱和的支架。
19.图4显示通过间接检测得出的rhbmp-2在hccp中保留的时间进程。将hccp支架在bmp-2溶液中培养5分钟（负载），然后洗涤30分钟、16、40和64小时。经由elisa测量溶液中残留rhbmp-2的浓度（黑条）。通过从基线（虚线）储液浓度减去rhbmp-2的累积残留浓度，计算支架对rhbmp-2的保留。误差条代表平均值的标准误差（n = 5次重复实验）。
20.图5显示hccp对rhbmp-2的保留的间接检测。将hccp支架置于rhbmp-2溶液中并培养30分钟。rhbmp-2残留（黑条）代表在用hccp培养后溶液中剩余rhbmp-2的浓度。基线对照是没有在hccp存在下培养的rhbmp-2储液；pbs用作阴性对照（误差条代表平均值的标准误差；n = 在elisa检测中的12次重复技术）。灰色条代表通过从平均“基线”浓度减去平均“残留”而计算出的支架中的bmp-2保留（n = 3次重复实验，标示为hccp 1、2、3）。
21.图6显示hccp对rhbmp-2的保留的直接检测。将hccp圆盘在rhbmp-2溶液（rhbmp-2；
1 μg/ml）、骨髓（bm）、骨髓 rhbmp-2（bm rhbmp-2）或pbs中培养过夜，然后漂洗，并用抗bmp-2抗体染色。二次dab染色表明作为深棕色存在rhbmp-2 (a)。对每种条件（i、ii、iii）进行三次重复实验。光密度分析显示rhbmp-2处理组中的dab信号明显高于所有其它组(b)。
22.图7显示在支架外植体中内源性bmp-2与hccp的结合。为了内源性bmp-2的比色可视化，将5 μm石蜡切片用抗bmp-2抗体和3,3'-二氨基联苯胺染色。该图显示在2周(a, b)和4周(d, e)时间间隔的阳性棕色沉淀物。兔igg对照用于(c) 2周和(f) 4周时间间隔切片。黑色三角形(a)标示hccp。黑色实心箭头(a, b, e)标示沿hccp的孔隙的阳性棕色染色。具有黑色边界的白色箭头(b, e)标示具有负性棕色染色的未填充的hccp孔隙。黑色点划线箭头(a)标示具有点状形态的成骨细胞。
23.发明详述i. 定义如本文所用的，术语“葡甘露聚糖”是指由约1:1.6比率的β-1,4-连接的d-葡萄糖与d-甘露糖组成的约每11个残基具有支链的天然来源寡糖（alonso-sande等人eur j pharm biopharm. 200972:453-462）及其衍生物。葡甘露聚糖具有约5-10%取代乙酰基的主链，所述乙酰基参与氢键合和疏水相互作用以赋予可溶性。示例性的葡甘露聚糖衍生物包括但不限于水溶性衍生物，如o-烷基衍生物和o-羧烷基衍生物、具有各种取代度的衍生物（非限制性地，例如大于或小于5-10%取代的乙酰基）、具有各种氧化度的衍生物、接枝共聚物（非限制性地例如丙烯酸酯和丙烯酰胺共聚物）及其盐（例如其季铵盐）。
24.如本文所用的，术语“葡甘露聚糖凝胶”是指交联碳水化合物的热稳定的均匀悬浮液)。葡甘露聚糖凝胶可以以各种方式形成，包括但不限于，通过在碱的存在下水解葡甘露聚糖的乙酰基。
25.如本文所用的，术语“葡甘露聚糖支架”是指通过升华葡甘露聚糖凝胶形成的三维多孔基质。葡甘露聚糖支架提供适于细胞培养和组织工程学（包括组织再生）的环境。
26.以下方法和组合物以葡甘露聚糖凝胶和葡甘露聚糖支架为例描述，但本发明可涵盖不完全包含葡甘露聚糖或与葡甘露聚糖组合的凝胶和支架。其它天然来源材料（例如基于碳水化合物或蛋白质的生物材料）或合成材料（例如基于聚合物和陶瓷的材料）可包括或组合在凝胶和/或支架中。在本发明的实施方案中，支架包含至少约50% (w/w)葡甘露聚糖，在一些实施方案中至少60%、70%、80%、90%、95%葡甘露聚糖(w/w)。
27.支架的“骨架”是指限定和维持多孔结构的结构组分。包含支架骨架的组分是葡甘露聚糖凝胶形成中的材料。在葡甘露聚糖支架形成后，可将附加组分嵌入骨架，使得它们嵌在骨架上，但不是骨架的组成部分。此外，这些组分可嵌在骨架中，以允许在体内随时间经过随着葡甘露聚糖支架的降解而缓慢和持续释放组分。
28.如本文所用的，术语“固化阶段”（sp）是指从液体到固体的相变。固化阶段在该体系（最初为凝胶）首次达到冰点温度时开始，并在(现为固体的)体系的温度降低到冰点温度以下时结束。“固化阶段的时间长度”（ltsp）是该体系在冷冻相变的过程中保持大致恒温的过程中的时间。如果该体系表现出过冷阶段，固化阶段包括过冷阶段。也就是说，固化阶段的时间长度开始于该体系首次达到冰点温度的时刻，并且仅在相变完成之后结束。对于本发明的葡甘露聚糖凝胶组合物，冰点在-0.01℃至-3.00℃的范围内（略低于0℃，水的冰点）。因此，对于由葡甘露聚糖作为骨架碳水化合物组成的凝胶，固化阶段将在约-0.8℃下
图形表示为稳定期（plateau），见图2。
29.如本文所用的，术语“冷冻条件”是指对葡甘露聚糖体系施以等于或低于0℃的温度以诱导和维持sp来实现均匀的孔隙率。冷冻条件包括在-80至-20℃、-20至-10℃、-10至-5℃、-5至0℃的范围内的温度，或使用受控速率冷冻程序的逐渐降温范围。在一个实施方案中，冷冻条件包括等于或低于-0.33℃的温度。
30.术语“解冻条件”是指对葡甘露聚糖体系施以高于0℃的温度。解冻条件包括0℃至5℃、0℃至10℃、0℃至20℃的温度、室温条件（20℃至25℃、或约23℃）、或高于25℃的温度。
31.如本文所用的，“受控速率”条件是指对该体系施以预选的温度变化速率（例如在实验室级的受控速率冷冻机中）以诱导和维持sp。相反，“恒温”条件是指对该体系施以恒定的预选温度。在这两种情况下，“受控速率”和“恒温”冷冻条件都是指设备（例如冷冻机）和/或环境（物理、化学）的温度设置，而非可单独监测和记录（即，为了测量固化阶段的时间长度）的葡甘露聚糖体系的温度。
32.如本文所用的，一个“冻融循环”是两部分步骤，其中在葡甘露聚糖冰点或低于其冰点的葡甘露聚糖体系（即冻结或部分冻结的葡甘露聚糖体系）随后a) 经受解冻条件，即高于葡甘露聚糖体系的冰点的温度，然后2) 再经受冷冻条件。在各冻融循环中，解冻条件和/或冷冻条件可与先前的解冻或冷冻条件相同或不同或其组合。各解冻步骤和各冷冻步骤可独立地选自受控速率和恒温条件。
33.如本文所用的，孔隙率是指如通过压汞孔隙率试验测得的葡甘露聚糖支架的孔隙体积与总体积的至少50%比率。在一些实施方案中，孔隙率可为至少50%、60%、70%或80%。此外，当支架在由凝胶制备之后呈现在各处一致（例如从外围到中心）的孔隙率时，实现“均匀”孔隙率。先前的制造多孔葡甘露聚糖支架的方法（美国专利号9,359,591）对葡甘露聚糖凝胶施以特定温度以促进冷冻。但是，这种方法在支架中产生结构坍塌和不均匀的孔隙率。相反，本发明公开了控制不同的和多个变量
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sp
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将产生更准确和一致的结果。更具体地，调整ltsp将产生改进的产物结果。
34.如本文所用的，“互连”孔隙是指可渗透并允许物质从一个孔隙流到另一个孔隙的孔隙网络（图3）。在一些实施方案中，互连度可为支架的至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。互连度可通过如图3所述的染料渗透研究测量。此外，当支架在由凝胶制备后呈现在各处一致（例如从外围到中心）的互连度时，实现“均匀的”互连度。
35.互连孔隙对细胞渗透、营养物的引入和废物的清除以及细胞信号因子的流动是重要的。互连孔隙提供了在整个支架/组织构建体中新形成的组织内建立新脉管系统的难得机会。通常，在临床环境中，需要再生的组织缺损或损伤的大小可能超出通过扩散递送营养物或清除废物的能力。因此，新血管形成不仅在支架/组织构建体的外围是必要的，而且在整个新形成的组织中是必要的，以防止细胞凋亡和随后的坏死。因此，除高孔隙率外，支架内的互连度对成功的组织工程学和再生是至关重要的。此外，在血液凝固的情况下，参与凝固的血液成分的渗透不足可导致持续出血。含有互连孔隙的高度多孔支架可用作止血装置，其中纤维蛋白纤维（或血小板聚集）在整个支架的各处交联/形成。这可提供有助于止血的稳定血凝块。此外，这样的支架可用于拔牙槽而不需要放置缝线，由于在整个支架构建体中形成血凝块，这将防止支架从槽中脱出（“干槽症”）。这种方法可让牙医将支架方便地放置在拔牙槽中，而不需要将患者送至口腔外科。
36.在一个实施方案中，在经受任何冷冻条件之前，葡甘露聚糖凝胶的初始体积可在100-5000 ml、250-2500 ml、100-1000 ml或约450 ml的范围内。例如，在一个实施方案中，初始凝胶为圆柱形，其尺寸为1-5 cm的厚度和10-20 cm的直径。在其它形状、配置和尺寸中，初始凝胶体积可与示例性圆柱形体积和尺寸相同或不同。本发明人已经发现，通过监测ltsp，可以调整合适的冷冻条件适应于多样化的组织工程应用的各种凝胶形状和尺寸。例如，可将初始凝胶倒入任何结构中，或可将所得支架切割成各种形状，包括立方体、片材圆柱体、细管或圆环（环形）。在一个具体实施方案中，上述圆柱体直径范围，表面积/体积比（sa:v）在0.5至2.5、0.6至2.4、或0.75至1/cm的范围内。在一个具体实施方案中，sa:v比为0.8至0.9/cm。
37.作为初始葡甘露聚糖凝胶转化成具有至少50%的均匀孔隙率的葡甘露聚糖支架的体积百分比来测量产率。产率测量不包括未落在指定孔隙率范围内的固化葡甘露聚糖（其通过先前的方法，从支架产物上切除并作为制造废料丢弃）。在本发明中，该方法由初始凝胶材料产生至少10%、至少25%、至少35%或优选至少50%或更多的适当多孔支架。
38.ii. 固化阶段本发明提供了一种改进的葡甘露聚糖支架。本发明的葡甘露聚糖支架适合用作三维细胞培养和组织工程学或类器官。该葡甘露聚糖支架提供了适用于培养细胞的高度多孔结构和孔径。此外，该支架是均匀、热稳定、有弹性、生物相容和生物可降解的，并可通过例如模制或切割制成适用于3d组织培养和工程学、类器官的任何形状和尺寸。
39.根据美国专利号9,359,591中公开的制造技术，通过将葡甘露聚糖凝胶置于培养皿中、然后在气流冷冻机中在小于或等于-50℃下冷冻30分钟，来冷冻葡甘露聚糖凝胶。参见美国专利9,359,591。相反，改进的本方法的冷冻温度或冷冻速率提供特定的ltsp以产生具有均匀孔隙率的葡甘露聚糖支架。在一个实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在冷冻步骤开始时在低于50℃的温度下。在一些实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在高于0℃和低于：40℃、35℃、30℃、25℃、10℃或5℃的温度下。在一个实施方案中，葡甘露聚糖凝胶在冷冻步骤开始时在约室温（20℃至25℃、或约23℃）下。在另一实施方案中，葡甘露聚糖在冷冻步骤开始时在约4℃下。
40.在一个实施方案中，该方法包括冷冻葡甘露聚糖凝胶，其中冷冻条件导致ltsp为约10-2000分钟。在一些实施方案中，ltsp为至少约10-30、60、100、200、270、280、300、350、360、375、400、425、440、450、460、470、475、480、490、500、525、550或600分钟。在一些实施方案中，ltsp为约10-60分钟、250-2000分钟、250-1500分钟、250-1000分钟、250-750分钟、500-1500分钟、500-1000分钟、250-750分钟、400-500分钟、或450-500分钟。
41.在一个实施方案中，sp包括过冷阶段。在这种情况下，ltsp开始于该体系首次达到冰点温度（例如约-0.8℃）的时刻，其包括低于冷冻温度的过冷峰值，在约冷冻温度下继续经过该稳定期，并仅在该体系开始其向最终冷冻温度或环境冷冻温度（例如冷冻机温度）的下降时结束。
42.在另一实施方案中，不存在过冷阶段。在这种情况下，ltsp开始于该体系首次达到冰点温度（例如约-0.8℃）的时刻；其在约冷冻温度下继续经过该稳定期，并在该体系开始其向最终冷冻温度或环境冷冻温度（例如冷冻机温度）的下降时结束。
43.在一些实施方案中，该方法包括在一个或多个冷冻步骤的过程中监测葡甘露聚糖
体系的温度。可通过插入温度探针（例如cooper atkins digital thermometer, lcd, immersion probe model dtt361-01）以测量葡甘聚糖体系的内部温度来监测温度。在一个实施方案中，实验室温度探针可远程报告和/或记录葡甘露聚糖体系在冷冻机内的温度变化。监测温度可有助于为预定的葡甘露聚糖凝胶体积和/或尺寸限定规定的冷冻条件。考虑设备和实验室的不规则性也可以是有用的。监测温度允许用户在考虑设备变化（由于冷冻机的机龄、制造、型号或配置）、位置变化（由于凝胶在冷冻机内的高度或深度）、运行变化（由于功率波动或中断）和用户变化（由于打开/进入冷冻机）的同时实现合意的ltsp。
44.可通过对葡甘露聚糖体系施以包括受控速率降温和/或恒温的冷冻条件来实现ltsp参数。在一些实施方案中，冷冻条件包括受控速率降温。通过使用实验室、食品、临床级受控速率冷冻机实现受控速率降温。受控速率冷冻步骤条件的结束温度可选自等于或低于0℃的温度，如约-78℃至-20℃、-20℃至-10℃、-10℃至-5℃、或-5℃至0℃的温度。
45.在一些实施方案中，受控速率为约-0.05℃/min至-l℃/min、-0.1至-10℃/min、-0.5℃/min至-0.005℃/min、-0.05℃/min至-0.005℃/min、或-0.06℃/min至-0.04℃/min。在一个实施方案中，受控速率为约-0.05℃/min。
46.在一些实施方案中，冷冻条件包括暴露于恒温。恒温冷冻条件包括等于或低于约0℃的任何温度。恒温冷冻条件包括约-78至-20℃、-20至-10℃、-10至-5℃、-5至-1℃的温度。暴露的持续时间可等于或大于约5 min、15 min、30 min、1 hr、2 hr、2.5 hr、3 hr、4 hr或5 hr。在一些实施方案中，在恒定冷冻温度下暴露的持续时间为约1-5小时。在其它实施方案中，暴露的持续时间可以为至少约5、8、10、12或24小时。
47.在另一实施方案中，冷冻条件包括受控速率期和恒温期二者。在一个实施方案中，冷冻条件包括受控速率期，随后是恒温期。
48.iii. 循环冻融在一些实施方案中，该方法包括一个或多个冻融循环。冻融循环是对在等于或低于约0℃的温度下用于诱导、调整和维持sp的葡甘露聚糖体系施以解冻条件，然后再施以冷冻条件（其可以与一个或多个先前的冷冻步骤相同或不同或其组合）的时间。该方法可包括0、1、2、3、4或更多个冻融循环。在一个实施方案中，该方法包括一个冻融循环。
[0049]“解冻条件”包括约0℃至5℃、0℃至10℃、0℃至20℃的温度、室温条件（约20℃至25℃、或约23℃）、或高于约25℃的温度。在一个实施方案中，解冻条件使葡甘露聚糖体系达到约室温的温度。
[0050]
当解冻步骤使葡甘露聚糖体系达到高于0℃的温度时，下一个循环可包括在后续冷冻步骤之前的中间冷却步骤。例如，在一些实施方案中，解冻步骤包括将葡甘露聚糖体系从低于约0℃的温度升温（例如允许在室温下升温）到高于约0℃、5℃、10℃、25℃、30℃或35℃的温度。然后对解冻的葡甘露聚糖体系施以冷却步骤，其中将该体系温度降低到低于解冻温度但高于约0℃的温度，例如约4℃。然后对葡甘露聚糖体系施以如前所述的冷冻步骤。类似于冷冻条件，可通过受控速率和/或恒温条件实现解冻和/或冷却条件。
[0051]
iv. 葡甘露聚糖凝胶制剂本发明的方法可包括各种附加步骤。在一些实施方案中，该方法进一步包括形成包括碳水化合物混合物（具有至少约50% (w/w)葡甘露聚糖）、碱性溶液和水的反应混合物；以及在约50℃至约130℃的温度下加热反应混合物以形成葡甘露聚糖凝胶和/或将葡甘露
聚糖凝胶的压力提高到比大气压高约0.1 psi至50 psi以形成葡甘露聚糖凝胶。
[0052]
本发明的方法中使用的葡甘露聚糖凝胶是碳水化合物混合物（具有至少约50% (w/w)葡甘露聚糖）和水溶液的混合物。葡甘露聚糖可作为葡甘露聚糖粉末提供。在一些实施方案中，将葡甘露聚糖粉末溶解在水中以提供在水中含有约1%至约5% w/v葡甘露聚糖的葡甘露聚糖溶液。葡甘露聚糖粉末可在任何适当的温度和压力条件下溶解在水溶液中。可被包括的碳水化合物的实例非限制性地为藻酸盐、壳聚糖、淀粉、基于植物或细菌的多糖。
[0053]
为了将葡甘露聚糖凝胶诱导到sp，该方法可包括冷却反应混合物（先前被加热以促进溶解），随后将gm凝胶施加到冷冻系统。在一些实施方案中，如本文所述，在将gm凝胶施加到冷冻系统以维持sp之前，将葡甘露聚糖凝胶的温度冷却到低于约80℃。在某些实施方案中，在将gm凝胶施加到冷冻系统之前，将葡甘露聚糖凝胶的温度冷却到低于约50℃。冷却步骤可以以受控速率或恒温方式进行。在一个实施方案中，冷却步骤通过将加热的葡甘露聚糖混合物恢复到室温进行。
[0054]
该水溶液可具有任何合适的组成。该水溶液可以是水或水和一种或多种不降解或消化中性的葡甘露聚糖体系的试剂的混合物。合适的水溶液的实例包括但不限于水、缓冲溶液和细胞培养基。
[0055]
在一个实施方案中，该水溶液是缓冲溶液。合适的缓冲溶液的实例包括但不限于pbs、taps、bis-tris丙烷、tris、hepes、tes、mops、pipes和mes。在一些实施方案中，缓冲溶液是pbs、hepes、mes、mops、tris或bis-tris丙烷。在优选实施方案中，缓冲溶液是pbs。
[0056]
在另一实施方案中，该水溶液是细胞培养基。合适的细胞培养基的实例包括但不限于roswell park memory institute培养基（rpmi）、dulbecco's改良伊格尔培养基（dmem）、最低基本培养基（mem）、dulbecco's改良伊格尔培养基：营养混合物f-12培养基（dmem/f12）、iscove's modified dulbecco's培养基（imdm）、national collection of type cultures培养基（nctc）和成骨诱导培养基（oim）。在一些实施方案中，细胞培养基是roswell park memory institute培养基（rpmi）、dulbecco's改良伊格尔培养基（dmem）、最低基本培养基（mem）、dulbecco's改良伊格尔培养基：营养混合物f-12培养基（dmem/f12）、iscove's modified dulbecco's培养基（imdm）或national collection of type cultures培养基（nctc）。
[0057]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖凝胶可包括酸性溶液。合适的酸性溶液的实例包括但不限于盐酸、乙酸、酒石酸、苹果酸和柠檬酸。
[0058]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖凝胶可包括碱性溶液。碱性溶液可以是任何含有碱金属盐或碱土金属盐的溶液。代表性的碱金属盐和碱土金属盐包括但不限于氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氢氧化镁、碳酸镁、氢氧化钙和碳酸钙。在一些实施方案中，碱性溶液包含氢氧化钙。
[0059]
v. 葡甘露聚糖支架制备和修饰本发明的葡甘露聚糖支架可以是碱性的（具有大于约8的ph），或其可根据美国专利9,359,591中描述的方法中和（具有约7的ph），该专利通过引用以其整体并入本文。
[0060]
本发明的葡甘露聚糖支架随后可通过高压灭菌法进行灭菌，以使其可用于植入和其它体内应用。
[0061]
在一些实施方案中，该方法进一步包含从葡甘露聚糖体系中除去水。可通过本领
域中已知的任何合适的方法除去水。在一些实施方案中，通过冷冻干燥、升华或热致相分离操作进行该除去步骤。在某些实施方案中，通过升华进行该除去步骤。
[0062]
在本发明的一个方面，葡甘露聚糖支架包括一种或多种骨成分。骨成分被定义为有助于骨生成或骨形成的任何物质。骨成分包括但不限于有机成分如细胞外基质和/或骨基质或碎骨粉（ground bone），和无机成分如钙、磷酸盐、钾、镁和羟磷灰石。在一个实施方案中，该支架包括钙和/或磷酸盐作为骨成分。在另一实施方案中，该支架包括钙。（一种或多种）骨成分整体结合到支架的骨架上。骨成分的总浓度相对于葡甘露聚糖体系在约0.1至95% (w/w)的范围内。例如，该支架可用1-20%、1-10%或约5% caoh: 葡甘露聚糖粉末(w/w)制造。
[0063]
该浓度是合意有利的，因为其使得支架是射线可透的。在更高浓度下，支架将是不透射线的，由此阻碍干细胞粘附和骨形成的可视化和监测。在更低浓度下，支架在发生新骨形成方面不太有效。在骨科市场可得的大多数产品是不透射线的，这意味着即使没有发生骨生成，这些产品也可表现出与发育中的骨或成熟骨类似的射线照相密度。因此，射线可透的产品将为外科医生、医生和患者提供随时间以射线照相来可视化和监测骨再生的能力。ct提供优异的小梁和皮质骨分辨率以及用于评估矿物密度的亨氏（hounsfield）单位（hu）的定量方法。hu是组织的标准线性衰减系数，容易提供关于骨量的信息。通常，骨的hu值在300至3,000的范围内。因此，用于骨应用的“射线可透性”被定义为hu低于300。与这一观察结果一致，本发明的支架测得的hu小于300并提供监测和量化骨修复和再生的独特的方式，其在基线处始于300以下的hu，且hu随着骨修复和再生过程发生随时间增加。
[0064]
在本发明的另一个方面，将葡甘露聚糖凝胶和/或葡甘露聚糖支架改性以促进细胞粘附和增殖。示例性的改性包括但不限于，并入细胞粘附促进剂、化学交联、表面涂层和引入官能团。本领域中已知的所有这样的分子和结构都包括在本发明的公开内。
[0065]
本发明的葡甘露聚糖支架可包括一种或多种细胞粘附促进剂。如本文所用的，术语“细胞粘附促进剂”是指例如通过修饰基质表面和/或通过改变表面电荷来增强细胞与培养基质的粘附或附着的天然或合成试剂。细胞粘附促进剂也可促进细胞生长和细胞分化。细胞粘附促进剂也可增强血清或细胞外基质蛋白对培养基质的吸附。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂可以是聚-l-赖氨酸（pll）、聚-d-赖氨酸（pdl）、rgd肽（rgd）、kqagdv、vapg、fgl、胺基团、纤连蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白或层粘连蛋白。细胞外基质蛋白可来自任何合适的来源，包括但不限于哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞粘附促进剂是pll或rgd。在某些实施方案中，细胞粘附促进剂是pll。
[0066]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖支架包括合适的趋化分子。示例性的趋化分子包括但不限于血清、趋化因子、形态发生蛋白、生长因子、透明质酸。在一个实施方案中，葡甘露聚糖支架包括一种或多种骨形态发生蛋白。骨形态发生蛋白包括但不限于bmp-1、bmp-2、bmp-3、bmp-4、bmp-5、bmp-6、bmp-7、bmp-8a、bmp-8b、bmp-9、bmp-10、bmp-11、bmp-12、bmp-13、bmp-14、bmp-15。在一个实施方案中，支架包括bmp-2。bmp可以是重组的或天然来源的。骨形态发生蛋白溶液在支架中的浓度比为约0.001至1.5 mg/ml。
[0067]
支架可包括其它骨诱导因子，如成纤维细胞生长因子-2（fgf-2）和/或血小板源性生长因子（pdgf）。在人体中，在断骨上清液中测量的bmp-2浓度为约23.2 pg/ml（glass等人proceedings of the national academy of sciences 2011 108:1585-1590）。但是，重组
人bmp-2（rhbmp-2）在临床上以1.5 mg/ml的剂量递送，显著高于损伤后的bmp-2天然浓度。rhbmp-2以高达2.5 mg /水平的浓度用于超适应症颈前路椎间盘切除融合术（acdf），该浓度是在试点研究中的用量的3.5倍（shields等人spine 200631:542-547）。这种较高的剂量与增加的并发症相关联，包括血肿、颈部肿胀、吞咽困难和过度水肿（shields等人spine 200631:542-547）。追溯到高剂量rhbmp-2的其它不良事件包括吞咽困难和异常脂肪组织形成（shields等人spine 2006 31:542-547）。尽管bmp-2的使用已经越来越受欢迎，但其在2003年至2007年间的用量的85%是超适应症（ong等人spine 201035:1794-1800）。这已导致bmp-2由于高临床剂量引起的并发症而受到大量关注（lykissas等人world journal of orthopedics 2017 8:531-555）。此外，重要的是将rhbmp-2定位于损伤部位，以使成骨前体增殖和分化成成熟骨细胞（sandhu等人spine 2003 28:64-73）而不泄漏到邻近组织中。但是，已经表明rhbmp-2在其作用扩展到靶区域外时在周围区域产生非预期的副作用，以致除上文列出的副作用外还导致异位骨形成（tannoury等人the spine journal 2014 14:552-559、shields等人spine 2006 31:542-547）。rhbmp-2的常用商业载体是可吸收胶原海绵（acs）。尽管acs已表明是rhbmp-2的有效载体，但可能由胶原降解引起的快速释放速率要求rhbmp-2以高浓度植入以递送有效剂量，这进一步增加并发症的风险（mariner等人journal of orthopaedic research 201231:401-406、winn等人clinical orthopaedics and related research 1999367:95-106）。因此，有效地将rhbmp-2定位在植入部位并降低有效剂量的载体是合意的。
[0068]
在另一实施方案中，葡甘露聚糖支架包括合适的细胞信号分子。示例性的细胞信号分子包括但不限于细胞外基质蛋白、肽基序和生长因子以及本领域中已知的其它分子。
[0069]
vi. 使用方法本发明的支架可用于各种体外和体内方法。该支架可用于实验建模以及治疗应用。这样的实验和治疗用途包括但不限于新血管形成、矫形外科、心血管、神经元、伤口愈合、止血、药物筛选和药物递送、组织再生、类器官（organoid）、组织（包括软组织）和骨（再）生成、皮肤病学和牙科学。
[0070]
在一些实施方案中，该方法进一步包含在葡甘露聚糖支架上生长细胞。合适的细胞类型和培养条件是本领域已知的。
实施例
[0071]
实施例1: 冻/融循环将葡甘露聚糖粉末（1-5克）与0.15克氢氧化钙（sigma-aldrich, st. louis, mo, usa）一起在烧杯中溶解在100毫升水中，充分混合，并在室温下培养30分钟。用铝箔覆盖含有gm溶液的烧杯，并在保持在80℃以上温度的水浴中培养至少30分钟。在冷却到室温后，将所得gm凝胶切割成较小凝胶并在室温下在水中浸泡过夜。
[0072]
为了生产具有结构一致性和均匀孔隙率的多孔葡甘露聚糖支架，将葡甘露聚糖凝胶放置在变温室中的金属网上。以-0.05℃/min将室中的温度从室温降低到4℃。一旦温度达到4℃，将凝胶培养1-5小时。随后，以-0.05℃/分钟将温度再次降低到-20℃并在-20℃下保持5小时。对葡甘露聚糖凝胶施以这些特定的温度和时间以确保ltsp在用于产生结构一致性和均匀孔隙率的范围内。在5小时后，将葡甘露聚糖凝胶在水中以25℃/分钟解冻至室
温3-7小时或直至完全解冻。在下一个温度循环前挤出水。在这一实施例中，该温度循环进行四次。
[0073]
在最后一个循环后，在搁板温度达到120℃的情况下使水升华最多72小时，并将真空保持在100-300毫托（13至40 pa）。在干燥循环后，葡甘露聚糖支架通过在加压室中在磷酸盐缓冲盐水（ph 7.4）中煮沸30分钟来中和，随后在加压室中在蒸馏水中洗涤和煮沸两个循环，各持续30分钟。在最后一次洗涤之后，如上所述从葡甘露聚糖支架中升华水。将所得多孔gm产物切割成定制的形状和尺寸，包装在含有干燥剂的聚乙烯袋中，密封，并在室温下储存直至使用。
[0074]
实施例2: 固化阶段的时间长度使用与实施例1相同的方法制造葡甘露聚糖凝胶。在制成葡甘露聚糖凝胶后，将其放置在所选温度（例如-78℃、-20℃、-10℃、-5℃和-1℃）下的恒温冷冻机中。为了测定ltsp，测量凝胶的温度。为了获得凝胶的温度，将温度探针（cooper atkins digital thermometer, lcd, immersion probe）置于凝胶的中心。然后以所选间隔获取温度（例如30秒、1分钟、5分钟、10分钟）并作图。
[0075]
实施例3: 通过含钙的超高交联碳水化合物聚合物诱导骨生成我们研究了含钙的osteo-p
®ꢀ
bgs诱导骨生成的性质。与原位骨形成（即，邻近现有骨的骨生成）相比，对异位骨形成的研究探究了受试制品在缺乏适当的生物化学、生物机械和骨形成或内源性干细胞的情况下形成骨的能力。因此，其消除了与骨生成诱导相关的潜在外来的实验变量，以使研究人员能够研究受试制品诱导骨形成的能力。在这个正在进行的研究中，利用特征明确的大鼠模型研究在无血管环境中皮下植入时hccp加上骨成分钙是否能够诱导骨生成。
[0076]
材料和方法大鼠（wistar igs雄性大鼠，charles river，wilmington，ma）在距离切口部位至少1 cm的无血管位置（以避免与血液的可能混合）皮下植入含有整合到孔隙微结构中的钙的hccp（hccp-ca，n =6）或含钠的对照hccp构建体（hccp-na [“对照”]，n =6）。在基线处并每周拍摄ct图像，直至在植入后1个月收获植入物。收集各个植入物并进行组织学（苏木精和曙红染色）、免疫组织化学（ihc）和von kossa染色的处理。
[0077]
ct表现ct图像显示，与基线相比，在4周时植入部位的放射密度水平的增加。指示骨化的亨氏单位（hu）的量化评估用于在所有时间点比较hccp-ca与对照物。作为比较，在植入后4周观察到的hu的量等于在妊娠中期的发育中的胎儿骨的量。
[0078]
总体和组织学表现收获植入物，并进行总体成像。hccp-ca显示含有新鲜血液的新血管形成的证据。但是，使用对照构建体时观察到有限的新血管形成。与总体表现一致，组织学评价也揭示了新形成的血管浸润到hccp-ca中，并且对照构建体显示出有限量的血管。值得注意的是，观察到对照构建体具有更多的表现出成纤维细胞形态的细胞，而观察到hccp-ca具有表现出类似成骨细胞的形态的细胞。另外的切片显示对照构建体与hccp-ca之间的一些形态学差异。
[0079]
ihc和von kossa表现
通过ihc进一步评价植入物的骨唾液蛋白（bsp）的表达，bsp是矿化组织，如骨的重要组分。通过红色染色证实在hccp-ca中观察到大量表达bsp的细胞。所有其它条件（检测对照、对照构建体）显示背景染色，表现出特征不同的染色图。von kossa染色旨在用于钙沉积物的组织学可视化。与所有其它表现一致（ct、组织学、ihc），von kossa染色在对照构建体中表现出最小信号，而hccp-ca表现出钙沉积的证据。
[0080]
结论这些研究的结果表明，观察到hccp-ca具有：(1) 基于ct观察，与在妊娠中期发育中的胎儿的骨（最可能接近松质骨、肋骨）中观察到的骨密度相似的提高的放射密度水平；(2) 当植入无血管环境中时，新血管形成的证据；(3) 渗透到产物中的细胞的细胞质中的骨唾液蛋白的表达；和(4) 当皮下植入大鼠时，位于产物中的细胞中的von kossa染色。
[0081]
实施例4: 超高交联的碳水化合物聚合物与骨形态发生蛋白-2的结合亲和力超高交联的碳水化合物聚合物（hccp）已表明有效地桥接和修复临界大小的骨缺损。进行这一研究以探究hccp与重组和内源性骨形态发生蛋白-2（bmp-2）在体外和体内的相互作用。hccp在缓冲液和掺有重组人bmp-2（rhbmp-2）的骨髓中培养，充分洗涤，并使用定性和定量的免疫基检测来评估bmp-2结合亲和力。将hccp也植入新西兰白兔（new zealand white rabbits）的股骨髁的临界大小的缺损中，以将体外和体内表现相关联。结果表明rhbmp-2可结合到hccp并保留在hccp中，这通过抗体染色和elisa表现证实。植入临界大小的骨缺损中的hccp揭示了内源性bmp-2定位于被表达bmp-2的细胞包围的hccp结构体的表面。这些表现表明，hccp与bmp-2的结合亲和力可在临界大小的骨缺损的修复和桥接中起到重要作用，并支持hccp作为rhbmp-2的新载体。这一研究支持了超高交联碳水化合物聚合物（hccp）与bmp-2的结合亲和力在临界大小的骨缺损中的早期骨生成中起到关键作用的假说。这一研究还提出hccp可以是acs的合适替代物的证据。当作为用于修复兔股骨髁中的临界大小的缺损的骨移植替代物进行探究时，与acs的2-4周相比，hccp表现出平均16周的降解分布，这导致显著的骨再生。因此，hccp与rhbmp-2和内源性bmp-2的结合亲和力可提供在植入部位建立早期骨生成的有价值手段，并为其作为新载体的临床应用提供了证据。
[0082]
材料和方法hccp的表征和制备：hccp由合成交联的碳水化合物链组成。hccp在体内和体外研究中已证实是生物相容的，没有致热原性、免疫原性、细胞毒性或致癌性。hccp的微结构使用压汞技术表征（micromeritics instrument corporation, norcross, ga, usa），并表现出50-500 μm孔径的平均孔隙范围。如前所述制备hccp圆盘（7 mm x 5 mm）、颗粒（2 mm x 5 mm）和立方体（1 cm3）。对于体内应用，hccp在使用前通过高压灭菌法进行灭菌。
[0083]
定量的rhbmp-2结合亲和力测定：将hccp立方体（1 cm3，n = 5）在含有1 μg/ml rhbmp-2（r & d systems，minneapolis，mn，usa）的pbs中培养。在5分钟时收集溶液包围的hccp立方体样品（“负载”样品）。将hccp转移并浸没在新鲜的磷酸盐缓冲盐水（pbs, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）中，并在30分钟后收集pbs包围的hccp样品。同样地，对于连续的时间点（30分钟、16小时、40小时和64小时），将hccp转移并浸没在新的pbs中，并在每个时间点收集样品。
[0084]
将样品在pbs中稀释50倍，并通过elisa分析每次洗涤中滤出的残留rhbmp-2。pbs和1 μg/ml rhbmp-2溶液（未用hccp培养）用作对照。进行两个独立的elisa检测以评估hccp
保留rhbmp-2的能力。第一个检测利用夹心(2,2'-连氮基-双)abts elisa试剂盒（peprotech, rocky hill, nj, usa）进行吸光度读数。elisa板根据试剂盒制造商的程序用捕获抗体预备整夜。第二天，将板在pbs中的0.05% tween-20（洗涤缓冲液）中洗涤4次，并用pbs中的1%牛血清白蛋白（bsa, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）封闭1小时以防止非特异性结合。然后使用洗涤缓冲液将板洗涤4次。
[0085]
第二次elisa检测30分钟后的hccp上的rhbmp-2保留。hccp立方体（1 cm3，n =3）在含有1 μg/ml rhbmp-2的1毫升pbs中培养。在30分钟后，从rhbmp-2溶液中取出hccp立方体，拧干过量溶液，并将rhbmp-2溶液的残留浓度稀释500倍，并根据制造商的说明书（thermofisher, waltham, ma, usa）使用elisa量化。pbs和1 μg/ml rhbmp-2溶液（未用hccp培养）用作对照。
[0086]
rhbmp-2保留的可视化：在镇静和无菌条件下从雄性新西兰白兔（4.0 kg，》6月龄）收集骨髓抽取液（bma）。所有外科和动物护理程序都得到institutional animal care and use committee（protocol# mm-007102）的批准。用0.5 m乙二胺四乙酸（edta, gibco, life technologies, carlsbad, ca, usa）的10%无菌溶液预备的22 g脊椎穿刺针用于从股骨抽取最多3 ml骨髓。将bma收集在含有edta三钾的无菌5 ml管中。hccp圆盘（7 mm x 5 mm, n=3）在含有pbs和1 μg/ml rhbmp-2的24孔板中培养过夜。hccp圆盘也在掺有1 μg/ml rhbmp-2的骨髓中培养。不含rhbmp-2的pbs和骨髓用作对照。然后从孔中取出hccp圆盘，用1 ml pbs冲洗三次，并用原代小鼠抗人bmp-2抗体（1 μg/ml）（abeam, cambridge, ma, usa）培养。在1小时后，hccp圆盘在pbs中充分洗涤并使用3,3-二氨基联苯胺（dab）试剂盒（r&d systems, minneapolis, mn, usa）染色。将染色的hccp圆盘的图像上传到imagej（national institute of health, bethesda, md, usa），并通过测量像素强度来测定rhbmp-2的信号。在白色背景下拍摄染色hccp圆盘的rgb图像。将图像在imagej中转换成32位灰度并倒转。对于每个图像，在排除了周边阴影的圆盘周围绘制感兴趣区域（roi）。对每个选择测量平均像素强度值。为了考虑到图像之间的照明差异，从hccp圆盘的平均强度减去背景的平均像素强度值。
[0087]
内源性bmp-2与hccp的结合亲和力：使用新西兰白兔（nzw）中已确立的临界大小的骨缺损模型来探究内源性bmp-2是否在体内表现出对hccp的结合亲和力。所有外科和动物护理程序都得到institutional animal care and use committee（protocol# mm-003828）的批准。使用氯胺酮-咪达唑仑混合物（20 mg/kg；2 mg/kg）使雄性nzw兔（n =6，4.0 kg (
±
0.5)，13月龄）镇静，并使用异氟烷（》5%）麻醉。夹住左右股骨，并用聚维酮碘和70%乙醇溶液消毒。通过切开并解剖皮肤、浅筋膜和深筋膜而进入外侧股骨髁。使用2 mm高速磨钻（medtronic, minneapolis, mn, usa）在两侧制作7 mm直径
×
10 mm深度的圆柱形缺损，并将约1 cc的hccp颗粒（2 mm x 5 mm颗粒）植入各缺损中。植入部位用骨蜡密封，用4-0可吸收pds-ii缝合线（ethicon, somerville, nj, usa）缝合，并用外科钉修补。在手术后用抗生素和镇痛药治疗兔子三天，并在研究期间每天进行临床观察。在安乐死后2周(n = 3)和4周(n = 3)用戊巴比妥钠和苯妥英钠溶液从动物中收获hccp。
[0088]
免疫染色：将hccp外植体在10%福尔马林中固定至少24小时，然后转移到70%乙醇中以便包埋在石蜡中（vdx veterinary diagnostics, davis, ca usa）。切片（5 μm）在制剂83（cbg biotech, solon, oh, usa）中脱蜡并在浓度递减的无水乙醇中再水化，用pbs整
理。载玻片用dab染色试剂盒（r&d systems, minneapolis, mn, usa）提供的血清封闭剂培养，用1 μg/ml的原代小鼠bmp-2抗体（abeam, cambridge, ma, usa）培养1小时，在pbs中洗涤，然后使用相同的dab染色试剂盒染色以确定是否存在内源性bmp-2，并最后用mm83封固剂（cbg biotech, solon, oh, usa）封固。
[0089]
统计分析：结果报告为平均值
±
平均值的标准误差，并使用microsoft excel（microsoft, redmond, wa, usa）计算。通过方差分析或双侧学生t检验分析测定统计学意义。关于图像光密度数据的统计学使用welch t检验，在excel中进行。
[0090]
结果hccp对rhbmp-2的保留：为了间接分析负载rhbmp-2的hccp的保留状况，在两个独立检测中进行elisa。第一elisa检测分析了hccp经过64小时的持续时间保留的rhbmp-2（图4）。第二elisa检测具有3个独立的负载rhbmp-2的hccp立方体；在30分钟后测定保留（图5）。这两个elisa分析都表明与hccp一起培养后rhbmp-2溶液中可检出的rhbmp-2量的减少。发现hccp保留了286 ng rhbmp-2/g hccp，具有90%置信区间[159, 418]和95%置信区间[129, 449]。
[0091]
图4表明，发现在bmp-2溶液中培养支架后，hccp支架具有平均44.91 ng/ml rhbmp-2保留率。在负载有rhbmp-2的hccp支架经过pbs洗涤30分钟后，发现保留平均34.22 ng/ml rhbmp-2。在pbs洗涤16小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为32.11 ng/ml。在pbs洗涤40小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为31.65 ng/ml。在pbs洗涤60小时后，保留在支架中的rhbmp-2的平均量为31.61 ng/ml。这一数据提供了hccp支架确实保留rhbmp-2的证据。
[0092]
此外，图5表明，在hccp培养后，基线对照有1.08 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，没有rhbmp-2保留在支架中。用作阴性对照的pbs溶液既没有rhbmp-2在溶液中也没有rhbmp-2在支架中。hccp 1在hccp培养后有0.17 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.91 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。hccp 2在hccp培养后有0.31 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.77 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。hccp 3在hccp培养后有0.21 μg/ml rhbmp-2剩余在溶液中，0.87 μg/ml rhbmp-2保留在支架中。
[0093]
hccp对rhbmp-2保留的直接检测：为了提供hccp结合和保留rhbmp-2的能力的直接证据，向hccp圆盘加载rhbmp-2，然后在pbs中洗涤3次，并用抗bmp-2抗体进行免疫染色。用dab secondary比色检测rhbmp-2的存在。浸泡在rhbmp-2中的hccp显示高dab信号，而对照圆盘显示最小检测（图6）。在rhbmp-2溶液中培养过夜的hccp圆盘具有42.73像素强度的调整强度。在骨髓和rhbmp-2中培养过夜的hccp圆盘具有24.93像素强度的调整强度；在单独骨髓中的hccp具有16.02像素强度；在pbs中的hccp具有17.67像素强度。这一数据提供pbs对照 vs. rhbmp-2负载的hccp的图像强度的统计学意义差异的直接证据（17.7
ꢀ±ꢀ
5.37 vs. 42.7
ꢀ±ꢀ
2.74平均像素强度，p值0.003）。
[0094]
hccp中的内源性bmp-2的检测：接下来，通过将hccp植入兔股骨髁中来评估hccp结合内源性bmp-2的能力。在2周和4周移出支架，加工并染色以检测内源性bmp-2（图7）。取自整个组织块样品中的多个位置的连续5 μm切片显示沿孔隙壁存在内源性bmp-2沉积。在hccp孔隙各处观察到许多表达bmp-2的细胞。兔igg同型对照显示最小至无bmp-2信号。图7中的阳性棕色染色显示在支架外植体中除形成成骨细胞外还有结合到hccp的内源性bmp-2
的证据。
[0095]
讨论hccp的安全性状况及其作为骨引导型骨移植替代物的多样化应用提供了在各种临床环境中递送rhbmp-2以便骨再生和修复的有前途的媒介物。bmp-2在植入装置上的定位对促进内源性成骨干细胞和祖细胞在植入部位的募集、增殖和分化可以是重要的。在我们先前的研究中，hccp在兔中早在10周就显示桥接股骨髁中的临界缺损（koleva等人bioresearch open access 2019 8:111-120）。进行本研究以探究hccp和bmp-2之间的相互作用并提出潜在作用机制。结果表明rhbmp-2在hccp中的体外稳定保留和内源性bmp-2在体内沉积在三维多孔hccp结构体的表面上。此外，我们已经在bmp-2定位到的hccp孔隙内观察到大量表达bmp-2的细胞，这表明hccp可在植入后通过内源性bmp-2与hccp的微结构表面的结合获得骨诱导特性。
[0096]
在机械创伤或通过自分泌和旁分泌调节机制刺激后的软骨内愈合、板层骨形成或膜内愈合期间，bmp-2的表达特别在成骨细胞和血管细胞中上调。但是，其也显示导致许多严重的副作用，包括异位骨形成和周围组织的炎症（robin等人spine 2010 35:1350-1354, wong等人the spine journal 2008 8:1011-1018），这表明rhbmp-2从植入部位泄漏。有趣的是，wyeth发表的早期研究表明，使用胶原海绵递送的显著量的125i-rhbmp-2离开植入部位（植入后24小时为~50%，7天为68%，2周为》90%）（geiger等人advanced drug delivery reviews 2003 55:1613-1629），表明125i-rhbmp-2在胶原中的保留差和/或胶原载体的快速降解。有趣的是，在最近的研究中（gunnella等人the spine journal 2017 17: 1699-1711），当rhbmp-2与聚(l-丙交酯-共-乙交酯)酸（plga）纤维增强的透钙磷石形成水泥（cpc）一起递送时，低于100 μg（当前临床剂量的~1/100倍）的剂量已显示显著增强骨形成。这种观察结果可以是由于rhbmp-2在植入部位的更好保留和/或载体的更慢降解。
[0097]
由于它们的化学和机械性质以及易于制造和灭菌，其它合成聚合物也已作为rhbmp-2的载体进行研究（wang等人journal of biomedical nanotechnology 2017 13:1446-1456）。合成聚合物的实例包括聚l-乳酸（pla）、聚乙醇酸（pga）和两者的组合作为plga。但是，这些聚合物已知在临床环境中使用时潜在地引起炎症反应（anderson等人advanced drug delivery reviews 199728:5-24, ceonzo等人tissue engineering 2007 12:301-308）。使用合成聚合物的其它缺点包括由于副产物的累积导致的局部ph降低和有限的生物功能（ceonzo等人tissue engineering 2007 12:301-308）。用于避开其它合成物的限制的一种替代材料可以是多糖聚合物，由于其生物相容性、可持续性和可再生特性，其已受到欢迎（wahab等人composites from renewable and sustainable materials 2016）。多糖由碳水化合物链组成，这简化了hccp的组成。我们对hccp的研究证实了其作为rhbmp-2的新型多糖递送体系的有前途的潜力，如通过其将内源性bmp-2定位在其整个结构中的能力所证实的。此外，hccp已显示比plga更高效地显著桥接临界骨缺损（koleva等人bioresearch open access 2019 8:111-120），同时保持射线可透性（在骨形成的情况下为不透射线的），这不同于矿化/水泥基载体。
[0098]
总之，bmp-2定位于hccp可部分有助于临界大小的骨缺损的修复和再生。可能的是hccp的其它机械和化学性质可对植入部位的骨生成提供额外的贡献。bmp-2与hccp的结合亲和力为开发可吸收胶原海绵的更有效和更安全的替代品提供了额外的机会。
[0099]
尽管为了清楚理解的目的，已经通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但本领域技术人员将认识到，可在所附权利要求的范围内实践某些变动和修改。尽管本文可能就某些实施方案描述了特定特征，但这些特征可应用于本发明的任何实施方案。此外，本文提供的各参考文献通过引用以其整体并入本文，就像各个参考文献独自通过引用并入本文那样。
再多了解一些
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