用GM-CSF拮抗剂治疗癌症的制作方法

用gm-csf拮抗剂治疗癌症
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年6月3日提交的美国临时专利申请第62/856,638号的优先权，其出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。
3.序列表
4.本说明书参考序列表(在2020年6月3日以名为“kpl-035wo_sl.txt”的.txt文件形式以电子方式提交)。所述.txt文件产生于2020年6月3日且大小为4kb。序列表的整体内容以引用的方式并入本文。
技术领域

背景技术：

5.肿瘤细胞表达独特的抗原，所述抗原可能被宿主t细胞库识别，并且充当肿瘤免疫疗法的强效靶标。然而，肿瘤细胞逃避宿主免疫并表达抑制天然抗原呈递效应细胞群体的抑制性细胞因子。这种免疫抑制环境中的一个要素是在肿瘤床、引流淋巴结和恶性肿瘤患者的循环中发现的调节性t细胞的存在增加。进一步研究的一个领域是开发逆转肿瘤相关无反应性并且刺激效应细胞识别和消除恶性细胞的治疗剂。


技术实现要素：

6.本发明尤其提供了一种用于使用gm-csf拮抗剂基于对骨髓来源的抑制细胞的免疫抑制活性的抑制来治疗癌症的改进的方法。本发明部分基于以下出人意料的发现：gm-csf诱导pd-l1在具有免疫抑制活性的mdsc上的表达，并且这种表达可以通过拮抗gm-csf来抑制。本发明还提供了使用gm-csf拮抗剂与如本文进一步描述的其它癌症疗法组合来治疗癌症的方法。
7.在一些方面，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包含向需要治疗的患者施用gm-csf拮抗剂，其中所述gm-csf拮抗剂的施用导致抑制骨髓来源的抑制细胞(mdsc)的免疫抑制活性。
8.在一些方面，本发明提供了一种抑制罹患癌症的患者中的骨髓来源的抑制细胞(mdsc)的免疫抑制活性的方法，其包含向所述患者施用gm-csf拮抗剂。
9.在一些方面，本发明提供了一种增强癌症治疗的免疫反应的方法，其包含向接受癌症治疗的患者施用gm-csf拮抗剂，其中与对照相比，免疫反应增加。
10.在一些实施例中，免疫反应是t细胞增殖的百分比。在一些实施例中，t细胞为cd8阳性(cd8 )。在一些实施例中，t细胞为cd4阳性(cd4 )。在一些实施例中，t细胞对于cd8和cd4是双重阳性的(cd8 /cd4 )。
11.在一些实施例中，对照指示在施用gm-csf拮抗剂之前患者中的免疫反应水平。在一些实施例中，对照是在没有gm-csf拮抗剂的情况下接受癌症治疗的对照患者中的参考免疫反应水平或基于历史数据的参考免疫反应水平。
12.在一些实施例中，癌症疗法是免疫疗法。
13.在一些实施例中，施用gm-csf拮抗剂增加了免疫疗法的功效。
14.在一个方面，本发明尤其提供了一种与对照相比抑制癌症患者中的pd-l1的方法，其包含向需要治疗的患者施用gm-csf拮抗剂。
15.在一些实施例中，施用gm-csf拮抗剂降低癌症患者中的pd-l1水平。
16.在一些实施例中，对照指示在施用gm-csf拮抗剂之前患者中的pd-l1水平。
17.在一些实施例中，对照是在没有gm-csf拮抗剂的情况下接受癌症治疗的对照患者中的参考pd-l1水平或基于历史数据的参考pd-l1水平。
18.在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少10％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少15％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少20％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少30％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少40％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少45％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少50％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少60％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少70％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少75％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少80％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少85％。在一些实施例中，与对照相比，患者中的pd-l1水平降低至少90％。
19.在一些实施例中，pd-l1在mdsc上表达。在一些实施例中，pd-l1在循环的mdsc上表达。在一些实施例中，pd-l1在血浆来源的mdsc上表达。在一些实施例中，pd-l1在肿瘤细胞上表达。在一些实施例中，pd-l1在肿瘤浸润免疫细胞上表达。
20.在一些实施例中，患者具有循环骨髓来源的抑制细胞(mdsc)。
21.在一些实施例中，患者罹患浸润t细胞水平低的癌症。
22.在一些实施例中，患者罹患免疫检查点抑制剂(ici)难治性癌症。
23.在一些实施例中，患者罹患晚期或转移性癌症。
24.在一些实施例中，所述患者罹患选自以下的癌症：乳腺癌、结直肠癌(crc)、前列腺癌、黑色素瘤、膀胱癌、胰腺癌、胰腺导管腺癌、肝细胞癌、胃癌、非小细胞肺癌(nsclc)、小细胞肺癌(sclc)、头颈鳞状细胞癌、非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin lymphoma)、子宫颈癌、胃肠道癌、泌尿生殖系统癌、脑癌、间皮瘤、肾细胞癌、妇科癌症、卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、胃肠道癌、胰腺癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌、脑癌、间皮瘤、恶性黑色素瘤、梅克尔细胞癌(merkel cell carcinoma)、多发性骨髓瘤、急性髓源性白血病、慢性髓源性白血病、骨髓增生异常综合征或急性淋巴细胞性白血病。
25.在一些实施例中，患者罹患选自iv期乳腺癌、iv期结直肠癌(crc)、前列腺癌或黑色素瘤的癌症。
26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含向所述患者施用至少另一种癌症疗法。
27.在一些实施例中，至少另一种癌症疗法是化学疗法、mdsc靶向疗法、免疫疗法、放射疗法以及其组合。
28.在一些实施例中，gm-csf拮抗剂和另一种癌症疗法同时施用。
29.在一些实施例中，gm-csf拮抗剂和另一种癌症疗法序贯施用。
30.在一些实施例中，患者已在施用gm-csf拮抗剂之前接受了用另一种癌症疗法的治疗。
31.在一些实施例中，患者已在施用另一种癌症疗法之前接受用gm-csf拮抗剂的治疗。
32.在一些实施例中，另一种癌症疗法是ici。
33.在一些实施例中，ici拮抗pd-1、ctla-4、b7、btla、hvem、tim-3、gal-9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk1、chk2或a2ar的活性。
34.在一些实施例中，ici选自抗pd-1抗体(任选地派姆单抗(pembrolizumab)、纳武单抗(nivolumab)、西米普利单抗(cemiplimab))、抗pd-l1抗体(任选地阿特珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐鲁单抗(durvalumab))、抗ctla-4抗体(任选地伊匹木单抗(ipillimumab))、抗pd-l2抗体、抗b7-h3抗体、抗b7-h4抗体、抗btla抗体、抗hvem抗体、抗tim-3抗体、抗gal-9抗体、抗lag3抗体、抗vista抗体、抗kir抗体、抗2b4抗体、抗cd160抗体、抗cgen-15049抗体、抗chk1抗体、抗chk2抗体、抗a2ar抗体、抗b-7抗体，以及其组合。
35.在一些实施例中，ici是抗pd-l1抗体。在一些实施例中，ici是抗pd-l1抗体。
36.在一些实施例中，所述方法还包括向患者施用化学治疗剂。
37.在一些实施例中，mdsc靶向疗法选自抗cfs-1r抗体、抗il-6抗体、全反式视黄酸、阿昔替尼(axitinib)、恩替司他(entinostat)、吉西他滨(gemcitabine)或苯乙福明(phenformin)以及其组合。
38.在一些实施例中，免疫疗法选自单克隆抗体、细胞因子、癌症疫苗、t细胞接合疗法以及其组合。
39.在一些实施例中，单克隆抗体选自抗cd3抗体、抗cd52抗体、抗pd1抗体、抗pd-l1抗体、抗ctla4抗体、抗cd20抗体、抗bcma抗体、双特异性抗体或双特异性t细胞接合子(bite)抗体，以及其组合。
40.在一些实施例中，细胞因子选自ifna、ifnp、ifny、ifn、il-2、il-7、il-15、il-21、il-11、il-12、il-18、hgm-csf、tnfa或其任何组合。
41.在一些实施例中，gm-csf拮抗剂是抗gm-csf抗体或其片段。
42.在一些实施例中，gm-csf拮抗剂是可溶性gm-csf受体。
43.在一些实施例中，gm-csf拮抗剂是抗gm-csf受体抗体或其片段。
44.在一些实施例中，抗gm-csf受体抗体或其片段是抗gm-csfrα抗体或其片段。
45.在一些实施例中，抗gm-csfrα抗体或其片段是人gm-csfrα特异性单克隆抗体。
46.在一些实施例中，抗gm-csfrα抗体是人或人源化igg4抗体。
47.在一些实施例中，抗gm-csfrα抗体是玛弗利木单抗(mavrilimumab)。
48.在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体其片段包含由seq id no:6定义的轻链互补决定区1(lcdr1)、由seq id no:7定义的轻链互补决定区2(lcdr2)和由seq id no:8定义的轻链互补决定区3(lcdr3)；以及由seq id no:3定义的重链互补决定区1(hcdr1)、由seq id no:4定义的重链互补决定区2(hcdr2)和由seq id no:5定义的重链互补决定区3(hcdr3)。
15049抗体、抗chk1抗体、抗chk2抗体、抗a2ar抗体、抗b-7抗体，以及其组合。
71.在一些方面，本发明提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包括包含gm-csf拮抗剂的药物组合物和包含至少另一种癌症疗法的药物组合物，所述另一种癌症疗法选自化学疗法、mdsc靶向疗法、免疫疗法、放射疗法以及其组合。
72.在一些实施例中，免疫疗法是选自以下的ici：抗pd-1抗体(任选地派姆单抗、纳武单抗、西米普利单抗)、抗pd-l1抗体(任选地阿特珠单抗、阿维鲁单抗、度伐鲁单抗)、抗ctla-4抗体(任选地伊匹木单抗)、抗pd-l2抗体、抗b7-h3抗体、抗b7-h4抗体、抗btla抗体、抗hvem抗体、抗tim-3抗体、抗gal-9抗体、抗lag3抗体、抗vista抗体、抗kir抗体、抗2b4抗体、抗cd160抗体、抗cgen-15049抗体、抗chk1抗体、抗chk2抗体、抗a2ar抗体、抗b-7抗体，以及其组合。
73.定义
74.为了使本发明更容易理解，下文首先定义了某些术语。说明书自始至终阐述了关于下述术语和其它术语的另外定义。本文提及的描述本发明背景并且提供有关其实践的另外细节的出版物及其它参考材料以引用的方式在此并入。
75.抗体：如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(ig)分子的免疫活性部分，即含有结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“结合”或“与之免疫反应”意指抗体与所需的一个或多个抗原决定子反应。抗体包括抗体片段。抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合dab(结构域抗体)、单链、fab、fab'、f(ab')2片段、scfv和fab表达文库。抗体可以是完整抗体，或免疫球蛋白，或抗体片段。
76.氨基酸：如本文使用的，术语“氨基酸”在最广泛的含义上指可以掺入多肽链内的任何化合物和/或物质。在一些实施例中，氨基酸具有一般结构h2n-c(h)(r)-cooh。在一些实施例中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施例中，氨基酸是合成氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施例中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”指天然存在的肽中通常发现的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”指除标准氨基酸外的任何氨基酸，无论它是合成制备的还是从天然来源获得的。如本文使用的，“合成氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，包括但不限于盐、氨基酸衍生物(例如酰胺)和/或取代。氨基酸，包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸，可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或由其它化学基团的取代进行修饰，所述修饰可以改变肽的循环半衰期，而不会不利影响其活性。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一种或翻译后修饰，例如与一种或多种化学实体(例如甲基、乙酸根基团、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸根基团、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)结合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。根据其中使用该术语的上下文，它指的是游离氨基酸还是肽的残基是显而易见的。
77.改善：如本文使用的，术语“改善”指状态的预防、减少或缓解，或者受试者状态的改善。改善包括但不要求疾病状况的完全恢复或完全预防。在一些实施例中，改善包括相关疾病组织中缺乏的相关蛋白质或其活性的水平增加。
78.大约或约：如本文使用的，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指类似于所述参考值的值。在某些实施例中，术语“大约”或“约”指在所述参考值的任一方向(大于或小于)上落入25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、
9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少内的一系列值，除非另有说明或从上下文另外显而易见(除非其中此类数目超过可能值的100％)。
79.递送：如本文使用的，术语“递送”涵盖局部递送和全身递送两者。
80.改善、增加、抑制或减少：如本文使用的，术语“改善”、“增加”、“抑制”或“减少”或语法等效物，指示相对于基线测量的值，例如开始在本文描述的治疗之前在同一个体中的测量，或在不存在本文描述的治疗的情况下在对照受试者(或多个对照受试者)中的测量，例如施用安慰剂的受试者。“对照受试者”是罹患与待治疗的受试者相同形式的疾病的受试者，其与待治疗的受试者约相同年龄。
[0081]“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”：如本文所用，“抑制”或“抑制”或语法等效物意指生物活性的减少、降低或抑制。中和：如本文所用，中和意指中和抗体与之结合的蛋白质的生物活性的减少或抑制，在这种情况下为gm-csfrα，例如减少或抑制gm-csf与gm-csfrα的结合，或gm-csfrα的信号传导，例如，如通过gm-csfrα介导的反应测量。生物活性的减少或抑制可以是部分或全部的。抗体中和gm-csfrα的程度被称为其中和效力。
[0082]
患者：术语“患者”是指所提供的组合物可以施用于其例如用于实验、诊断、预防、美容和/或治疗目的的任何生物。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，例如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物和/或人)。在一些实施例中，患者是人。人包括出生前和出生后形式。
[0083]
药学可接受的：如本文使用的，术语“药学可接受的”指这样的物质，其在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触，而无过度毒性、刺激性、过敏反应或者其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0084]
基本同一性：短语“基本同一性”在本文中用于指氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域普通技术人员将了解的，如果两个序列在相应位置中包含相同残基，则它们一般被视为“基本上相同的”。如本领域众所周知的，可以使用各种算法中的任一种来比较氨基酸或核酸序列，包括在商业计算机程序中可获得的那些算法，例如用于核苷酸序列的blas tn，以及用于氨基酸序列的blastp、gapped blast和psi-blast。示例性的此类程序在altschul等人，basic local alignment search tool,j mal.biol.,215(3):403-410,1990；altschul等人，methods in enzymology；altschul等人，nucleic acids res.25:3389-3402,1997；baxevanis等人，bioinformatics:a practical guide to the analysis of genes and proteins,wiley,1998；以及misener等人，(编辑)，bioinformatics methods and protocols(methods in molecular biology，第132卷，)humana press，1999中描述。除鉴定相同的序列之外，上述程序通常还提供了同一性程度的指示。在一些实施例中，如果两个序列的相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关的残基段上是相同的，则它们被视为基本上相同的。在一些实施例中，相关段是全序列。在一些实施例中，相关段为至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500个或更多残基。
[0085]
受试者：如本文使用的，术语“受试者”指人或任何非人动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。人包括出生前和出生后形式。在许多实施例中，受试者是人类。受试者可以是患者，其指呈现给医疗提供者用于疾病的诊断或治疗的人。术语“受试者”在本文中与“个体”或“患者”可互换使用。受试者可以罹患疾病或病症或者易受疾
病或病症的影响，但可以展示或不展示该疾病或病症的症状。
[0086]
基本上：如本文使用的，术语“基本上”指显示出目的特征或特性的全部或几乎全部范围或程度的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)完成和/或进行至完成或达到或避免绝对结果。术语“基本上”因此在本文中用于捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在的完全性缺失。
[0087]
全身分布或递送：如本文使用的，术语“全身分布”、“全身递送”或语法等效物指影响整个身体或整个生物的递送或分布机制或方法。通常，全身分布或递送经由身体的循环系统例如血液来完成。与“局部分布或递送”的定义相比。
[0088]
治疗有效量：如本文使用的，术语治疗剂的“治疗有效量”意指这样的量，当施用于罹患疾病、病症和/或状况或易受疾病、病症和/或状况的影响的受试者时，其足以治疗、诊断、预防和/或延迟疾病、病症和/或状况的发作。本领域普通技术人员将了解，通常经由包含至少一个单位剂量的给药方案来施用治疗有效量。
[0089]
治疗：如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”指用于部分或完全减轻、改善、缓解、抑制、预防以下，延迟以下的发作，减少以下的严重性和/或减少以下的发生率：特定疾病、病症和/或状况的一种或多种症状或特征。治疗可以施用于不显示出疾病体征和/或仅显示出疾病的早期体征的受试者，用于降低发展与疾病相关的病理状况的风险的目的。
附图说明
[0090]
附图仅用于说明性目的，而不是用于限制。
[0091]
图1是说明来自胰脏癌患者血液的cd14 细胞(mdsc)的t细胞增殖测定的示例性条形图。与仅在完全培养基中培养的那些t细胞相比，在健康供体同种异体t细胞和从胰腺癌患者血液中分选的cd14 细胞共培养之后，t细胞增殖受到抑制。在用抗gm-csfrα抗体和从胰腺癌患者的血液中分选的cd14 细胞培养后，挽救t细胞增殖。
[0092]
图2是说明不同癌细胞系中的gm-csf表达水平的示例性图。
[0093]
图3为一系列说明癌细胞条件培养基可将单核细胞极化为表型mdsc(cd14 细胞)的示范性条形图。为了产生肿瘤条件培养基(cm)，根据本领域中已知的方法接种并培养四种不同细胞系。然后在cm存在下将cd14 单核细胞培养6天并且分析基因和蛋白质表达。低水平的hla-dr生物标记物指示mdsc表型。与在正常培养基中生长的cd 14细胞(对照)相比，当cd14 单核细胞与来自表达gm-csf的癌细胞的条件培养基一起温育时，观察到表型mdsc的增加。
[0094]
图4是一系列说明用各种培养基培养的mdsc上的pd-l1表达的示例性条形图。数据显示，癌细胞条件培养基(cm)和补充有重组gm-csf的cm可以诱导在mdsc上表达pd-l1。另外，抗gm-csfrα抗体(ab)可降低mdsc上的pd-l1表达水平。
[0095]
图5a和图5b是一系列说明用各种培养基培养的mdsc上的pd-l1表达的示例性条形图。数据显示，癌细胞条件培养基(cm)和第1天补充有重组gm-csf的cm与在正常培养基(培养基)中生长的mdsc相比可诱导pd-l1在mdsc上的表达。另外，抗gm-csfrα抗体(ab)可降低在cm中生长的mdsc上的pd-l1水平。图5a中的数据显示当同时添加cm和抗gm-csfrα抗体(ab)时的pd-l1表达。在处理3天之后测量pd-l1表达。图5b中的数据显示当在用cm培养之后
72小时添加抗gm-csfrα抗体时的pd-l1表达。在用抗gm-csfrα抗体处理24小时之后测量pd-l1表达。
[0096]
图6是一系列说明t细胞增殖的示例性条形图，其中用来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基处理单核细胞，补充和没有补充人重组gm-csf和/或抗gm-csfrα抗体(ab)。将单核细胞在来自表达gm-csf的癌细胞系(cm)的条件培养基中培养三天。通过在imdm细胞培养基中用0.1μm cfse标记并用10ng/ml il-2和10ul可溶性cd3/cd28 t细胞活化剂(immunocult)刺激来制备t细胞(1
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105个细胞)。然后，在混合淋巴细胞反应(mlr)中将受刺激的t细胞与经cm处理的单核细胞(以2:1单核细胞:t细胞的比率)在有或没有重组gm-csf(10ng/ml)和/或抗-gm-csfrα抗体(100μg/ml)的情况下一起共培养。将imdm培养基中的受刺激的t细胞与健康单核细胞一起用作对照。将t细胞扩增5天，收集并针对cd4和cd8染色，所述cd4和cd8是辅助t和细胞毒性t细胞的标记物。通过流动式细胞测量术来测量细胞增殖，并且通过cfse稀释来评价。左图显示了以占增殖细胞的百分比表示的t细胞增殖测定结果，右图显示了通过流动式细胞测量术以占最大(mfi)的百分比(cd4 或cd8 细胞中cfse稀释的信号检测)表示的结果。
具体实施方式
[0097]
本发明尤其提供了使用gm-csf拮抗剂通过抑制需要治疗的患者的骨髓来源抑制细胞(mdsc)的免疫抑制活性来治疗癌症的方法。在一些实施例中，gm-csf拮抗剂与免疫检查点抑制剂组合使用。可以设想，本发明在治疗免疫检查点抑制(ici)难治性或抗性癌症或晚期或转移性癌症中特别有效。
[0098]
在下述节段中详细描述了本发明的各个方面。节段的使用并不意欲限制本发明。每个节段可以应用于本发明的任何方面。在本专利申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。
[0099]
骨髓来源的抑制细胞(mdsc)
[0100]
mdsc是一组来自骨髓谱系的异质免疫细胞。mdsc在病理情况下强烈扩张，例如慢性感染和癌症，并且与其他骨髓细胞类型区分开来，在这些类型中，mdsc具有强免疫抑制活性，而不是免疫刺激特性。将具有减少的hla-dr表达或无hla-dr表达的单核细胞，称为cd14

hla-dr
lo/neg
单核细胞分组到mdsc中，并且可以改变适应性免疫并产生免疫抑制。
[0101]
mdsc在外周血、淋巴器官、脾脏和肿瘤部位中累积，以致癌症、感染、慢性炎症、移植和自体免疫。肿瘤募集、扩增和活化mdsc的具体途径仍然未知，但存在关于白介素(il-1β、il-6、环氧合酶(cyclooxyhenase)2(cox2)生成的pge2、高浓度gm-csf、m-csf、血管内皮生长因子(vegf)、il-10、转化生长因子β(tgfβ)、吲哚胺2,3-二氧酶(dioxyhenase)(ido)、flt3配体以及干细胞因子的日益增加的证据。
[0102]
免疫感受态细胞与肿瘤细胞系的共培养，如所显示，可诱导致耐受性dc或mdsc。先前的研究还表明，肿瘤细胞释放gm-csf，从而诱导粒细胞ros产生以抑制t细胞功能。另外，在鼠肿瘤模型中，mdsc表面上程序性死亡配体1(pd-l1)的表达增加，尽管这在mdsc介导的抑制中的作用仍不清楚。
[0103]
程序性死亡配体1(pd-l1)
[0104]
程序性死亡配体1(pd-l1；也称为cd274)是与其受体pd-1结合的免疫检查点蛋白。
pd-l1在各种细胞类型上广泛表达，主要在肿瘤细胞、mdsc、单核细胞、巨噬细胞、天然杀伤(nk)细胞、树突状细胞(dc)和活化t细胞上，以及在免疫特权部位，如脑、角膜和视网膜上。在正常生理条件下，pd-1/pd-l1信号传导途径的活化与外周耐受性的诱导和维持、t细胞免疫稳态的维持、避免过度活化和防止免疫介导的组织损伤密切相关。在疾病状态下，pd-l1与其受体程序性死亡1(pd-1)相互作用，传递负信号以控制t细胞介导的细胞免疫反应的一系列过程，包括引发、生长、增殖和凋亡以及功能成熟，导致免疫逃脱。
[0105]
免疫检查点抑制剂(ici)改变了许多肿瘤的治疗格局，在一些情况下诱导持久反应，肿瘤突变负荷、cd8

t细胞密度和pd-l1表达各自被提出作为对pd-1/-l1拮抗剂的反应的独特生物标记物。免疫检查点阻断抗体的主要挑战之一在于t细胞反应有限的恶性肿瘤或免疫“冷”肿瘤。这些冷肿瘤含有极少的浸润性t细胞，不被识别并且不引发免疫系统的强反应，使得它们难以用当前免疫疗法治疗。本发明人出人意料地发现gm-csf上调pd-l1，有助于免疫抑制活性。将“冷”肿瘤转换为“热”肿瘤是癌症治疗中的里程碑之一。
[0106]
gm-csf拮抗剂
[0107]
gm-csf信号传导
[0108]
gm-csf是i型促炎性细胞因子，其增强广泛范围的造血细胞类型的存活和增殖。它为一种生长因子，首先被鉴定为骨髓细胞(例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞)的分化和增殖的诱导因子(wicks ip和roberts aw.《自然
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风湿病学综述(nat rev rheumatol)》.2016，12(1)：37-48)。使用不同方法的研究表明，gm-csf过表达几乎总是伴随着病理变化(hamilton ja等人，《生长因子(growth factors)》.2004，22(4)：225-31)。gm-csf通过血管的活化内皮增强骨髓细胞的运输，并且还可以在发炎期间促进单核细胞和巨噬细胞在血管中的累积。gm-csf还促进炎症组织中的单核细胞和巨噬细胞以及常驻组织巨噬细胞的活化、分化、存活和增殖。它通过促进浸润性单核细胞分化为m1巨噬细胞和单核细胞来源的树突状细胞(modc)来调节炎症组织中的抗原呈递细胞的表型。此外，通过巨噬细胞和modc产生的il-23结合其它细胞因子如il-6和il-1调节t细胞分化。
[0109]
与m-csf(巨噬细胞-集落刺激因子)一起，gm-csf调节巨噬细胞的数量和功能。由gm-csf活化的巨噬细胞获得一系列效应功能，所有这些效应功能都将其鉴定为炎性巨噬细胞。gm-csf活化的巨噬细胞产生促炎性细胞因子，包括tnf、il-1β、il-6、il-23和il-12以及趋化因子，例如ccl5、ccl22和ccl24，其将t细胞和其它发炎细胞募集到组织微环境中。
[0110]
gm-csf受体是造血素(haematopoietin)受体超家族的成员。其为异源二聚体，由α和β亚基组成。α亚基对gm-csf具有高度特异性，而β亚基与其它细胞因子受体，包括il-3和il-5共享。这反映在β受体亚基的更宽组织分布中。α亚基gm-csfr主要α在骨髓细胞和非造血细胞，例如嗜中性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、内皮细胞和呼吸道上皮细胞上表达。全长gm-csfrα是400个氨基酸的i型膜糖蛋白，其属于i型细胞因子受体家族，并且由22个氨基酸的信号肽(位置1-22)、298个氨基酸的细胞外结构域(位置23-320)、位置321-345的跨膜结构域和55个氨基酸的短细胞内结构域组成。裂解信号肽以提供成熟形式的gm-csfrα作为378个氨基酸的蛋白质。可以获得人和鼠gm-csfrα的互补dna(cdna)克隆，并且在蛋白质水平上，受体亚基具有36％同一性。gm-csf能够以相对较低的亲和力与单独的α亚基结合(kd 1-5nm)，但与单独的β亚基完全不结合。然而，α和β亚基两者的存在导致高亲和力配体受体复合物(kd～100pm)。gm-csf信号传导通过其最初与gm-csfrα链结合，然后
与较大亚基即共同β链交联以产生高亲和力相互作用而发生，所述高亲和力相互作用使jak-stat途径磷酸化。这种相互作用还能够通过酪氨酸磷酸化和map激酶途径的活化进行信号传导。
[0111]
在病理上，已显示gm-csf在加剧发炎性、呼吸道和自身免疫疾病中起作用。因此，中和gm-csf与gm-csfrα结合是一种治疗通过gm-csfr介导的疾病和病况的治疗方法。因此，本发明涉及结合人gm-csf或gm-csfrα,或抑制人gm-csf与gm-csfrα的结合，和/或抑制由gm-csf配体与受体的结合产生的信号传导的结合成员。在配体结合时，gm-csfr触发多个下游信号传导途径的刺激，包括jak2/stat5、mapk途径和pi3k途径；均与骨髓细胞的活化和分化相关。结合成员可以是通过gm-csfr的gm-csf信号传导的可逆抑制剂。
[0112]
gm-csf拮抗剂
[0113]
适合本发明的gm-csf拮抗剂包括能够减少、抑制或消除一种或多种gm-csf介导的信号传导，包括本文所述的那些信号传导的治疗剂。例如，根据本发明的合适的gm-csf拮抗剂包括但不限于抗gm-csf抗体或其片段、可溶性gm-csf受体和其变体，包括融合蛋白，例如gm-csf可溶性受体-fc融合蛋白、抗gm-csf受体抗体或其片段，仅举几例。
[0114]
在一些实施例中，合适的gm-csf拮抗剂是抗gm-csfrα抗体。示例性抗gm-csfrα单克隆抗体包括如下申请中描述的那些：2007年3月27日提交并以wo2007/110631公开的国际申请pct/gb2007/001108、2020年10月10日提交的欧洲专利申请120770487、2007年3月27日提交的美国申请11/692,008、2008年9月25日提交的美国申请12/294,616、2013年7月12日提交的美国申请13/941,409、2010年11月30日提交的美国申请14/753,792、2012年10月10日提交并以wo/2013/053767公开的国际申请pct/ep2012/070074、2015年5月18日提交并以wo2015/177097公开的国际申请pct/ep2015/060902、2017年5月23日提交的国际申请pct/ep2017/062479，所述申请中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一个实施例中，抗gm-csfrα单克隆抗体是玛弗利木单抗。wo2007/110631报告了抗gm-csfrα抗体玛弗利木单抗和其变体的分离和表征，其共享以高效力中和gm-csfrα的生物活性的能力。这些抗体的功能特性被认为至少部分地可归因于在人gm-csfr的位置226至230处结合tyr-leu-asp-phe-gln基序α，从而抑制gm-csfrα与其配体gm-csf之间的关联。玛弗利木单抗是一种人igg4单克隆抗体，其被设计成通过靶向gm-csfr来调节巨噬细胞活化、分化和存活α。其是gm-csfrα的生物活性的强效中和剂，并且显示通过结合gm-csfrα对ra患者的滑膜关节内的白细胞发挥治疗效果，导致细胞存活和活化减少。迄今为止，gm-csfr抗体玛弗利木单抗在α体内
[0115]
使用的安全性概况已经在类风湿性关节炎(ra)ii期临床试验中确立。
[0116]
在某些实施例中，抗体由两条轻链和两条重链构成。重链可变结构域(vh)包含seq id no：1中鉴定的氨基酸序列。轻链可变结构域(vl)包含seq id no：2中鉴定的氨基酸序列。重链和轻链各自包含以下布置中的互补决定区(cdr)和构架区：
[0117]
fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4
[0118]
玛弗利木单抗抗体重链包含cdr：hcdr1、hcdr2、hcdr3，如分别由seq id no：3、4和5中的氨基酸序列鉴定。轻链包含cdr：lcdr1、lcdr2、lcdr3，如分别由seq id no：6、7和8中的氨基酸序列鉴定。
[0119]
抗gm-csfrα重链可变结构域氨基酸序列
[0120]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckvsgytltelsihwvrqapgkglewm
[0121]
ggfdpeeneivyaqrfqgrvtmtedtstdtaymelsslrsedtavyycaivgsfspltlglwgqgtmvtvss(seq id no:1)
[0122]
抗gm-csfrα轻链可变结构域氨基酸序列
[0123]
qsvltqppsvsgapgqrvtisctgsgsnigapydvswyqqlpgtapklliyhnnkrpsgvpdrfsgsksgtsaslaitglqaedeadyycatveaglsgsvfgggtkltvl(seq id no:2)
[0124]
抗gm-csfra重链可变结构域cdr1(hcdr1)氨基酸序列
[0125]
elsih(seq id no:3)
[0126]
抗gm-csfrα重链可变结构域cdr2(hcdr2)氨基酸序列
[0127]
gfdpeeneivyaqrfqg(seq id no:4)
[0128]
抗gm-csfrα重链可变结构域cdr3(hcdr3)氨基酸序列
[0129]
vgsfspltlgl(seq id no:5)
[0130]
抗gm-csfrα轻链可变结构域cdr 1(lcdr1)氨基酸序列
[0131]
tgsgsnigapydvs(seq id no:6)
[0132]
抗gm-csfrα轻链可变结构域cdr 2(lcdr2)氨基酸序列
[0133]
hnnkrps(seq id no:7)
[0134]
抗gm-csfra轻链可变结构域cdr3(lcdr3)氨基酸序列
[0135]
atveaglsgsv(seq id no:8)
[0136]
在一些实施例中，用于癌症治疗的抗gm-csfrα抗体是玛弗利木单抗的变体，其选自申请wo2007/11063和wo2013053767中所公开的gm-csfα结合成员，所述申请以全文引用的方式併入。
[0137]
在一些实施例中，用于癌症治疗的抗gm-csfrα抗体包含与seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7和seq id no:8中的一或多者具有至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大同一性的cdr氨基酸序列。
[0138]
在一些实施例中，抗gm-csfrα抗体包含具有与seq id no:2至少90％相同的氨基酸序列的轻链可变结构域和具有与seq id no:1至少90％相同的氨基酸序列的重链可变结构域。在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体具有与seq id no:2具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的轻链可变结构域氨基酸序列，和与seq id no:1具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的重链可变结构域氨基酸序列。在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体包含具有seq id no:2中所示的氨基酸序列的轻链可变结构域，和具有seq id no:1中所示的氨基酸序列的重链可变结构域。在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体的重链恒定区包含源自igg4抗体的ch1、铰链和ch2结构域，所述结构域与源自igg1抗体的ch3结构域融合。在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体的重链恒定区是或源自igg1、igg2或igg4重链恒定区。在本发明的一些实施例中，抗gm-csfrα抗体的轻链恒定区是或源自λ或κ轻链恒定区。
[0139]
在一些实施例中，抗gm-csfrα抑制剂是玛弗利木单抗抗体的片段。在一些实施例
中，抑制剂包含单链可变片段(scfv)，其包含seq id no：3、4、5、6、7或8的cdr序列中的至少任一者。在一些实施例中，抑制剂是包含seq id no：3、4、5、6、7或8的cdr序列中的至少任一者的融合分子。在一些实施例中，抗gm-csfrα抑制剂序列是包含seq id no：3、4、5、6、7或8的cdr序列中的至少一者的双特异性抗体。
[0140]
在其他实施例中，合适的gm-csf拮抗剂是抗gm-csf抗体。示例性抗gm-csf单克隆抗体包括在以下申请中描述的那些：2006年5月17日提交并以wo2006/122797公开的国际申请pct/ep2006/004696，在2016年10月31日提交并以wo2017/076804公开的国际申请pct/ep2016/076225，和在2018年10月2日提交并以wo/2019/070680公开的国际申请pct/us2018/053933，所述申请以全文引用的方式并入本文中。在一个实施例中，抗gm-csf单克隆抗体是替利马布单抗(otilimab)。
[0141]
本公开的抗gm-csfrα或抗gm-csf抗体可以是多特异性的，例如双特异性的。抗体可以是哺乳动物(例如，人或小鼠)、人源化的、嵌合的、重组的、合成产生的或天然分离的。本公开的示例性抗体包括但不限于igg(例如igg1、igg2、igg3和igg4)、igm、iga(例如iga1、iga2和igasec)、igd、ige、fab、fab
′
、fab
′
2、f(ab
′
)2、fd、fv、feb、scfv、scfv-fc和smip结合部分。在某些实施例中，抗体是scfv。scfv可包括例如允许scfv在不同方向上定向以实现抗原结合的柔性接头。在各种实施例中，抗体可以是在细胞内部还原环境中保留其结构和功能的细胞溶质稳定的scfv或胞内抗体(参见例如fisher和delisa，《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》385(1)：299-311，2009；以引用的方式并入本文)。在特定实施例中，根据本领域已知的方法将scfv转化为igg或嵌合抗原受体。在实施例中，抗体结合变性蛋白质靶与天然蛋白质靶两者。在实施例中，抗体结合变性或天然蛋白质。
[0142]
在包括人在内的大多数哺乳动物中，完整抗体具有至少两条重链(h)和通过二硫键连接的两条轻链(l)。每条重链由重链可变区(vh)和重链恒定区(ch)组成。重链恒定区由三个结构域(ch1、ch2和ch3)和ch1与ch2之间的铰链区组成。每条轻链由轻链可变区(vl)和轻链恒定区(cl)组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其散布有更为保守的区，称为构架区(fr)。每个vh和vl由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
[0143]
抗体包括所有已知形式的抗体和具有抗体样特性的其它蛋白质支架。例如，抗gm-csfrα抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、一价抗体、嵌合抗体，或具有抗体样特性的蛋白质支架，例如纤连蛋白或锚蛋白重复。抗体可具有以下同种型中的任一种：igg(例如igg1、igg2、igg3和igg4)、igm、iga(例如iga1、iga2和igasec)、igd或ige。
[0144]
抗体片段可以包括源自抗体的一个或多个区段。源自抗体的区段可以保留特异性结合特定抗原的能力。抗体片段可以是例如fab、fab
′
、fab
′
2、f(ab
′
)2、fd、fv、feb、scfv或smip。抗体片段可以是例如双功能抗体、三功能抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体、结构域抗体、线性抗体、单链抗体，或多种由抗体片段形成的多特异性抗体中的任一种。
[0145]
抗体片段的实例包括(i)fab片段，一种由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，一种包含两个由铰链区二硫桥键连接的fab片段的二价片段；(iii)fd片段，一种由vh和ch1结构域组成的片段；(iv)fv片段，一种由抗体单臂的vl和vh结构域组成
3、gal-9、lag3、vista、kir、2b4、cd160、cgen-15049、chk 1、chk2、a2ar、b-7家族配体或其组合。
[0155]
在一些实施例中，ici是抗ctla-4抗体。在一些实施例中，ici是抗pd-l1抗体。在一些实施例中，ici是抗pd-l2抗体。在一些实施例中，ici是抗pd-1抗体。在一些实施例中，ici是抗b7-h3抗体。在一些实施例中，ici是抗b7-h4抗体。在一些实施例中，ici是抗btla抗体。在一些实施例中，ici是抗hvem抗体。在一些实施例中，ici是抗tim-3抗体。在一些实施例中，ici是抗gal-9抗体。在一些实施例中，ici是抗lag-3抗体。在一些实施例中，ici是抗vista抗体。在一些实施例中，ici是抗kir抗体。在一些实施例中，ici是抗2b4抗体。在一些实施例中，ici是抗cd160抗体。在一些实施例中，ici是抗cgen-15049抗体。在一些实施例中，ici是抗chk1抗体。在一些实施例中，ici是抗chk2抗体。在一些实施例中，ici是抗a2ar抗体。在一些实施例中，检查点抑制剂是抗b-7抗体。
[0156]
在一些实施例中，pd-1抗体是派姆单抗。在一些实施例中，pd-1抗体是纳武单抗。在一些实施例中，pd-1抗体是西米普利单抗。在一些实施例中，pd-l1抗体是阿特珠单抗。在一些实施例中，pd-l1抗体是阿维鲁单抗。在一些实施例中，pd-l1抗体是度伐鲁单抗。在一些实施例中，ctla-4抗体是伊匹木单抗。
[0157]
另外的治疗剂
[0158]
在一些实施例中，根据本发明的治疗癌症的方法包括向有需要的受试者施用gm-csf拮抗剂与另外的治疗剂组合。在某些实施例中，另外的药剂是包含化学疗法和/或放射疗法的癌症疗法。在某些实施例中，另外的治疗剂包含重组蛋白或单克隆抗体。在某些实施方案中，重组蛋白或单克隆抗体包含依他珠单抗(etaracizumab)(abegrin)、他卡妥珠单抗泰坦(tacatuzumab tetraxetan)、贝伐珠单抗(bevacizumab)(avastin)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)(erbitux)、奥比妥珠单抗(obinutuzumab)(gazyva)、曲妥珠单抗(trastuzumab)(herceptin)、克利瓦妥珠单抗(clivatuzumab)、曲妥珠单抗美坦(trastuzumab emtansine)(kadcyla)、雷马妥珠单抗(ramucirumab)、利妥昔单抗(rituximab)(mabthera、rituxan)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)(mylotarg)、帕妥珠单抗(pertuzumab)(omnitarg)、吉伦妥昔单抗(girentuximab)(rencarex)或尼妥珠单抗(nimotuzumab)(theracim、theraloc)。
[0159]
在某些实施例中，gm-csf拮抗剂包含靶向检查点抑制剂的免疫调节剂，如上文检查点抑制剂一节所述。在某些实施例中，免疫调节剂包含纳武单抗、伊匹木单抗、阿特珠单抗或派姆单抗。在某些实施例中，另外的治疗剂是化学治疗剂。在某些实施例中，所述化学治疗剂是烷基化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺(ifosfamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、美法仑(melphalan)、氮芥(mechlorethamine)、乌拉莫司汀(uramustine)、噻替派(thiotepa)、亚硝基脲类或替莫唑胺(temozolomide))、蒽环类(例如，多柔比星(doxorubicin)、阿霉素(adriamycin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)或米托蒽醌(mitoxantrone))、细胞骨架干扰物(例如，紫杉醇或多西他赛(docetaxel))、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂(例如，伏立诺他(vorinostat)或罗米地辛(romidepsin))、拓扑异构酶的抑制剂(例如，伊立替康(irinoteca)、拓扑替康(topotecan)、安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)或替尼泊尔(teniposide))、激酶抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib)、埃罗替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitini)、伊马
替尼(imatinib)、维莫非尼(vemurafenib)或维莫德吉(vismodegib))、核苷类似物或前体类似物(例如，阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨(capecitabine)、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯基嘌呤、甲氨蝶呤或硫鸟嘌呤)、肽抗生素(例如，放线菌素或博来霉素)、基于铂的试剂(例如，顺铂、奥洛铂(oxaloplatin)或卡铂)或植物生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛(vindesine)、鬼臼霉素(podophyllotoxin)、紫杉醇或多西他赛(docetaxel))。在一些实施例中，化学治疗剂是核苷类似物。在一些实施例中，化学治疗剂是吉西他滨。在某些实施例中，另外的治疗剂是放射疗法。
[0160]
癌症的治疗
[0161]
本发明可用于治疗各种癌症，特别是那些免疫检查点抑制(ici)难治性或抗性癌症，或晚期或转移性癌症。
[0162]
在一些实施例中，癌症是任何实体瘤或液体癌，包括泌尿生殖系统癌(例如前列腺癌、肾细胞癌、膀胱癌)，妇科癌症(例如卵巢癌、子宫颈癌、子宫内膜癌)，肺癌，胃肠道癌(例如非转移性或转移性结直肠癌、胰腺癌、胃癌、食道癌、肝细胞癌、胆管细胞癌)，头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)，脑癌，包括恶性胶质瘤和脑转移，恶性间皮瘤，非转移性或转移性乳腺癌(例如，激素难治性转移性乳腺癌)，恶性黑色素瘤，梅克尔细胞癌或骨和软组织肉瘤，和血液肿瘤，例如多发性骨髓瘤、急性髓源性白血病、慢性髓源性白血病、骨髓发育异常综合征和急性淋巴细胞性白血病。在一些实施例中，所述疾病是非小细胞肺癌(nsclc)、乳腺癌(例如，iv期乳腺癌、激素难治性转移性乳腺癌)、头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)、转移性结直肠癌、激素敏感性或激素难治性前列腺癌、结直肠癌(例如iv期结直肠癌)、卵巢癌、肝细胞癌、肾细胞癌、软组织肉瘤或小细胞肺癌。
[0163]
如本文所用，术语“癌症”是指特征在于体外(例如转化的细胞)或体内的高增生性细胞生长的广泛类别的病症。可以通过本发明的组合物和方法治疗或预防的病况包括例如多种肿瘤，包括良性或恶性肿瘤、多种增生等。本发明的化合物和方法可以抑制和/或逆转此类病况中所涉及的不期望的高增生性细胞生长。
[0164]
癌症的实例包括急性淋巴细胞性白血病，成人；急性淋巴细胞性白血病，儿童期；急性骨髓性白血病，成人；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童期；与艾滋病(aids)相关的淋巴瘤；与艾滋病相关的恶性肿瘤；肛门癌；星形细胞瘤，儿童小脑；星形细胞瘤，儿童大脑；胆道癌，肝外；膀胱癌；膀胱癌，儿童期；骨癌，骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤；脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，成人；脑肿瘤，脑干胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，小脑星形细胞瘤，儿童期；脑肿瘤，大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，室管膜瘤，儿童期；脑肿瘤，髓母细胞瘤，儿童期；脑肿瘤，幕上原始神经外胚层瘤，儿童期；脑肿瘤，视觉通路和下丘脑胶质瘤，儿童期；脑肿瘤，儿童期(其他)；乳腺癌；乳腺癌和妊娠；乳腺癌，儿童期；乳腺癌，男性；支气管腺瘤/类癌，儿童期：癌状肿瘤，儿童期；癌状肿瘤，胃肠道；癌，肾上腺皮质；癌，胰岛细胞；未知原发性癌；中枢神经系统淋巴瘤，初级；小脑星形细胞瘤，儿童期；大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤，儿童期；宫颈癌；儿童期癌症；慢性淋巴细胞性白血病；慢性髓源性白血病；慢性骨髓增生性病症；腱鞘透明细胞肉瘤；结肠癌；结直肠癌，儿童期；皮肤t细胞淋巴瘤；子宫内膜癌；室管膜瘤，儿童期；上皮癌，卵巢；食道癌；食道癌，儿童期；尤因氏肿瘤家族(ewing's family of tumors)；颅外生殖细胞肿瘤，儿童期；性腺外生殖细胞肿瘤；肝外胆道癌；眼部癌，眼内黑色素瘤；眼部癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌，儿童期；胃
肠道类癌瘤；生殖细胞肿瘤，颅外，儿童期；生殖细胞肿瘤，性腺外；生殖细胞肿瘤，卵巢；妊娠滋养细胞肿瘤；胶质瘤，儿童脑干；胶质瘤，儿童视觉通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌，成人(原发性)；肝细胞(肝)癌，儿童期(原发性)；霍奇金氏淋巴瘤(hodgkin's lymphoma)，成人；霍奇金氏淋巴瘤，儿童期；妊娠期间霍奇金氏淋巴瘤；咽下癌；下丘脑和视觉通路胶质瘤，儿童期；眼内黑色素瘤；胰岛细胞癌(内分泌胰腺)；卡波西氏肉瘤(kapei's sarcoma)；肾癌；喉癌；喉癌，儿童期；白血病，急性成淋巴细胞，成人；白血病，急性成淋巴细胞，儿童期；白血病，急性骨髓性，成人；白血病，急性骨髓性，儿童期；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性粒细胞；白血病，毛细胞；唇癌和口腔癌；肝癌，成人(原发性)；肝癌，儿童期(原发性)；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴细胞性白血病，成人急性；淋巴细胞性白血病，急性儿童期；淋巴细胞性白血病，慢性；淋巴瘤，与艾滋病相关；淋巴瘤，中枢神经系统(原发性)；淋巴瘤，皮肤t细胞；淋巴瘤，霍奇金氏(hodgkin's)，成人；淋巴瘤，霍奇金氏，儿童期；淋巴瘤，妊娠期间霍奇金氏；淋巴瘤，非霍奇金氏，成人；淋巴瘤，非霍奇金氏，儿童期；淋巴瘤，妊娠期间非霍奇金氏；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦氏(waldenstrom's)；男性乳腺癌；恶性间皮瘤，成人；恶性间皮瘤，儿童期；恶性胸腺瘤；髓母细胞瘤，儿童期；黑色素瘤；黑色素瘤，眼内；梅克尔细胞癌；间皮瘤，恶性；具有隐匿性原发性的转移性鳞状颈癌；多发性内分泌肿瘤综合征，儿童期；多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤；蕈样肉芽肿；骨髓增生异常综合征；髓源性白血病，慢性；骨髓性白血病，儿童期急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性病症，慢性；鼻腔和鼻旁窦癌；鼻咽癌；鼻咽癌，儿童期；神经母细胞瘤；神经纤维瘤；非霍奇金氏淋巴瘤，成人；非霍奇金氏淋巴瘤，儿童期；妊娠期间非霍奇金氏淋巴瘤；非小细胞肺癌；口腔癌，儿童期；口腔癌和唇癌；口咽癌；骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌，儿童期；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低恶性潜能肿瘤；胰腺癌；胰腺癌，儿童期，胰腺癌，胰岛细胞；鼻旁窦和鼻腔癌；甲状旁腺癌；阴茎癌；嗜铬细胞瘤；松果体和幕上原始神经外胚层瘤，儿童期；垂体瘤；浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤；胸膜肺母细胞瘤；妊娠和乳腺癌；妊娠和霍奇金氏淋巴瘤；妊娠和非霍奇金氏淋巴瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；原发性肝癌，成人；原发性肝癌，儿童期；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾细胞癌，儿童期；肾盂和输尿管，移行细胞癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤，儿童期；唾液腺癌；唾液腺癌，儿童期；肉瘤，尤因氏肿瘤家族；肉瘤，卡波西氏；肉瘤(骨肉瘤)/骨恶性纤维组织细胞瘤；肉瘤，横纹肌肉瘤，儿童期；肉瘤，软组织，成人；肉瘤，软组织，儿童期；sezary综合征；皮肤癌；皮肤癌，儿童期；皮肤癌(黑色素瘤)；皮肤癌，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤，成人；软组织肉瘤，儿童期；具有隐匿性原发性转移性的鳞状颈癌；胃(胃部)癌；胃(胃部)癌症，儿童期；幕上原始神经外胚层瘤，儿童期；t细胞淋巴瘤，皮肤；睾丸癌；胸腺瘤，儿童期；胸腺瘤，恶性；甲状腺癌；甲状腺癌，儿童期；肾盂和输尿管的移行性细胞癌；滋养细胞肿瘤，妊娠；未知的原发部位，癌症，儿童期；不寻常的儿童癌症；输尿管和肾盂，移行细胞癌；尿道癌；子宫肉瘤；阴道癌；视觉通路和下丘脑胶质瘤，儿童期；外阴癌；瓦氏巨球蛋白血症；和威尔姆斯肿瘤(wilms'tumor)。
[0165]
药物组合物和施用
[0166]
本发明的抗体或药剂(在本文中也称为“活性化合物”)及其衍生物、片段、类似物和同源物可并入到适于施用的药物组合物中。此类组合物通常包含抗体或药剂和药学上可接受的载剂。如本文所使用，术语“药学上可接受的载剂”意图包括与药学施用相容的任何
和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。适合的载剂描述于最新版本的雷明顿氏医药科学(remington's pharmaceutical sciences)，本领域中的标准参考教科书中，其以引用的方式并入本文中。此类载剂或稀释剂的优选实例包括(但不限于)水、盐水、林格氏溶液(ringer's solution)、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。也可以使用脂质体和如固定油等非水性媒剂。将此类介质和药剂用于药物活性物质是本领域中熟知的。除了任何常规介质或药剂与活性化合物不相容的情况之外，设想介质或药剂在组合物中的使用。补充的活性化合物也可以并入所述组合物中。
[0167]
本发明的医药组合物经配制可与其预定施用途径相容。施用途径的实例包括肠胃外，例如静脉内、皮内、皮下、口服(例如吸入)、经皮(即局部)、经粘膜和直肠施用。用于肠胃外、皮内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸(edta)；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，如氯化钠或右旋糖。ph可以用酸或碱调节，如盐酸或氢氧化钠。可以将肠胃外制剂密封在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0168]
适用于可注射使用的药物组合物包括无菌水溶液(其中可溶于水)或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载剂包括生理盐水、抑菌水、cremophor el
㈤
(新泽西州派西派尼的巴斯夫公司(basf,parsippany,n.j.))或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。载剂可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。恰当的流动性可以例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散液的情况下通过维持所需的粒度、以及通过使用表面活性剂来维持。防止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，优选的是在组合物中包含等张剂，例如糖、多元醇(如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
[0169]
无菌可注射溶液可以通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一种或其组合一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌处理来制备。通常，通过将活性化合物并入到含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其它成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法为真空干燥和冷冻干燥，这从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分加上任何另外的期望成分的粉末。
[0170]
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。它们可以被密封在明胶胶囊中或被压缩成片剂。为了口服治疗性施用，活性化合物可以与赋形剂一起并入并且以片剂、糖衣片或胶囊形式使用。口服组合物还可以使用适用作漱口水的流体载剂制备，其中流体载剂中的化合物口服施用并且漱口并吐掉或吞咽。可以包含药学上相容的结合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖衣片等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素，黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、淀粉羟基乙酸钠(primogel)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或斯特罗特斯(sterotes)；助流剂，如胶态二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
[0171]
对于吸入投与，所述化合物以气溶胶喷雾形式从含有适合推进剂(例如气体，如二氧化碳)的加压容器或分配器或喷雾器递送。
[0172]
全身施用还可通过经粘膜或经皮方式进行。对于经粘膜或经皮施用，可以在配制物中使用适合于待渗透屏障的渗透剂。所述渗透剂是所属领域中一般已知的，并且例如对于经粘膜施用，包括清洁剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾或栓剂实现。如所属领域中通常已知，对于经皮施用来说，活性化合物配制成软膏、药膏、凝胶或乳膏。
[0173]
活性化合物还可以制备成栓剂(例如使用常规的栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂形式用于经直肠递送。
[0174]
在一个实施例中，活性化合物与将保护化合物免于从体内快速消除的载剂一起制备，如控制释放配制物，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备此类配制物的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。所述材料还可以从阿尔扎公司(alza corporation)和诺华制药公司(nova pharmaceuticals,inc)商购获得。脂质体悬浮液(包含靶向受感染细胞的具有针对病毒抗原的单克隆抗体的脂质体)也可以用作药学上可接受的载剂。可以根据本领域的技术人员已知的例如美国专利第4,522,811号中所述的方法来制备这些配制物。
[0175]
为了易于施用以及剂量的均一性，以剂量单位形式配制口服或肠胃外组合物是特别有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合于作为待治疗的受试者的单位剂量的物理离散单元；每个单元含有经计算与所需的药物载剂结合产生所需治疗效果的预定量的活性化合物。针对本发明的剂量单位形式的规格受制于并直接取决于：活性化合物的独特特性和待实现的特定治疗效果，和所属领域中混配此类活性化合物以用于治疗个体的固有限制。
[0176]
药物组合物可以连同施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
[0177]
实例
[0178]
通过伴随本说明书的幻灯片进一步说明本发明，但不限于此。虽然已根据某些实施例特异性地描述了本发明的某些化合物、组合物和方法，但以下实例仅用于说明本发明，且不打算对其进行限制。
[0179]
实例1.抗gm-csfrα抗体挽救t细胞增殖
[0180]
本实例中的研究说明，gm-csf拮抗剂可挽救骨髓细胞群对t细胞增殖的抑制潜力。
[0181]
进行cdcd14 细胞的t细胞增殖测定，其中有或没有抗gm-csfrα抗体的处理。简言之，根据本领域已知的方法，从获自胰腺癌患者的血样(pbmc)中分离cd14 (mdsc)细胞。用抗gm-csfrα抗体处理分离的cd14 细胞48小时。接下来，用羧基-荧光素二乙酸二琥珀酰亚氨基酯(cse)标记的cd3 t细胞与抗gm-csfrα经抗体处理或未经处理的cd14 细胞共培养96小时，并且通过cfse稀释(分割细胞)来确定增殖。将不含共培养的t细胞用作阴性对照。
[0182]
如图1中所示，在用未处理的cd14 细胞培养之后，t细胞增殖被显著抑制。另一方面，抗gm-csfrα抗体处理的cd14 细胞显示出增加的t细胞增殖，提示抗gm-csfrα抗体的添加挽救了t细胞增殖并防止了mdsc的抑制潜力。
[0183]
实例2.癌细胞条件培养基将单核细胞极化为表型mdsc
[0184]
在本研究中，当cd 14单核细胞与来自表达gm-csf的癌细胞的条件培养基一起温育时，将各种癌细胞系用于说明表型mdsc(hla-dr
低
)的增加。
[0185]
分析癌细胞系的gm-csf的表达。在这一特定研究中，测量了两种结直肠癌(hct116和sw-480)、两种胰腺癌(panc-1和capan-1)、宫颈腺癌(hela)和恶性黑色素瘤(a375)细胞系的gm-csf表达。如图2中所示，癌细胞系以不同水平表达gm-csf。特别地，sw480和capan-1具有相对高的gm-csf表达，而hela细胞具有相对低的gm-csf表达。
[0186]
为了产生肿瘤条件培养基(cm)，根据本领域中已知的方法接种并培养细胞系。然后在cm存在下将cd14 细胞培养6天并且分析基因和蛋白质表达。低水平的hla-dr生物标记物指示mdsc表型。图3显示了与在正常培养基中生长的cd 14细胞相比，当cd14 单核细胞与来自表达gm-csf的癌细胞的条件培养基一起温育时，表型mdsc的增加。结果显示，来自具有高gm-csf表达的癌细胞系的cm对mdsc具有高诱导，表明gm-csf有助于单核细胞极化为表型mdsc。
[0187]
实例3.抗gm-csfrα抗体阻断mdsc中的pd-l1上调
[0188]
本实例中的研究展示了本发明人出人意料的发现，即gm-csf诱导pd-l1在表型mdsc上的表达。值得注意的是，用gm-csf拮抗剂处理足以抑制pd-l1在用来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基(cm)处理的单核细胞上的表达。
[0189]
免疫检查点阻断抗体的主要挑战之一在于t细胞反应有限的恶性肿瘤或免疫“冷”肿瘤。这些冷肿瘤含有极少的浸润性t细胞，不被识别并且不引发免疫系统的强反应，使得它们难以用当前免疫疗法治疗。本发明人出人意料地发现gm-csf上调pd-l1，mdsc表面上有助于免疫抑制活性的检查点蛋白。本实例中的研究表明，抗gm-csfrα抗体可用于将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤，可能增加免疫疗法的有效性和敏感性。
[0190]
在本研究中，当cd14 单核细胞与来自表达gm-csf的癌细胞的条件培养基一起温育时，将各种癌细胞系用于评价mdsc上pd-l1表达水平的变化。如图4中所示，将来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基添加到cd14 单核细胞中，与基线(仅培养基)相比增加了pd-l1表达水平。显示出低gm-csf表达水平的hela细胞系(参见图2)不上调pd-l1表达。添加重组gm-csf与cm的组合(cm gm-csf)增加了pd-l1的表达，指示gm-csf诱导pd-l1在表型mdsc上的表达。pdpd-l1中的尖峰在具有低基线pd-l1表达且仅具有cm的细胞系(例如，panc-1和hela细胞)中更明显。还检查了抗gm-csfrα抗体对pd-l1表达的作用。在不存在或存在重组gm-csf(分别为cm ab和cm gm-csf ab)的情况下用cm中的抗gm-csfrα抗体处理mdsc导致与仅cm或cm gm-csf相比pd-l1水平显著降低。这些数据显示，抗gm-csfrα抗体抑制用来自表达gm-csf的癌细胞系调节的条件培养基处理的cdcd14 单核细胞(mdsc)中pd-l1上调。
[0191]
实例4.抗gm-csfrα抗体抑制mdsc中的pd-l1表达
[0192]
本实例中的研究显示，gm-csf拮抗剂能够抑制用来自表达gm-csf的癌细胞系的培养基(cm)处理的mdsc上的pd-l1表达，无论gm-csf拮抗剂是与cm处理同时添加或gm-csf拮抗剂在cm处理之后当mdsc上的pd-l1水平已经增加时添加。
[0193]
如图5a所示，在第1天，将有或没有重组gm-csf(10ng/ml)的来自gm-csf癌细胞系的条件培养基(cm)和抗gm-csfrα抗体(100μg/ml)(如表1所示)一起添加到cd14 单核细胞(mdsc)中。在三天温育后，分析mdsc细胞的pd-l1的表达。
[0194]
表1.
[0195][0196]
与实例3一致，将来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基(b；cm)或具有重组gm-csf的cm(d；cm gm-csf)添加到mdsc与基线(a；仅培养基)相比增加pd-l1表达水平。此外，当抗gm-csfrα抗体与cm或cm gm-csf同时添加时，分别如图5a的样品c和e所示，观察到pd-l1降低，表明抗gm-csfrα抗体阻断mdsc上pd-l1的上调。
[0197]
接下来，已经建立在mdsc与条件培养基一起温育之后添加抗gm-csfrα抗体的作用，以检查当mdsc上的pd-l1水平升高时，gm-csf阻断对pd-l1表达水平的作用。在这种特定设置中，将mdsc在具有或不具有重组gm-csf的条件培养基中培养(图5b的样品b-e)持续48小时。然后，在第3天将抗gm-csfrα抗体添加到图5b的样品c和e(48小时后)。将样品a中的mdsc在培养基中温育三天作为对照。在第4天进行mdsc的表型分析。如图5b所示，在mdsc与来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基(样品c和e)一起培养之后用抗gm-csfrα抗体处理mdsc抑制mdsc上pd-l1的表达水平。值得注意的是，在用抗gm-csfrα抗体仅处理24小时之后，分别与样品b和d相比，样品c和e中的pd-l1表达降低。
[0198]
实例5.抗gm-csfrα抗体减少mdsc介导的t细胞抑制
[0199]
本实例中的研究进一步说明，gm-csf拮抗剂可抑制骨髓细胞群对t细胞增殖的抑制潜力。
[0200]
在此特定实验中，将用来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基处理的单核细胞用于t细胞增殖测定。简言之，将单核细胞在来自表达gm-csf的癌细胞系的条件培养基(cm)中培养三天(经cm处理的单核细胞)。通过在imdm细胞培养基中用1μm cfse标记并用10ng/ml il-2和10ul可溶性cd3/cd28 t细胞活化剂刺激来制备t细胞(1
×
105个细胞)。然后，在如图6所示的混合淋巴细胞反应(mlr)中将受刺激的t细胞与经cm处理的单核细胞(以2:1单核细胞:t细胞的比率)在有或没有补充的人重组gm-csf(10ng/ml)和/或抗-gm-csfrα抗体(100μg/ml)的情况下一起共培养。将imdm培养基中的受刺激的t细胞与健康单核细胞一起用作对照。将t细胞扩增5天，收集并针对cd4和cd8染色，所述cd4和cd8是辅助t和细胞毒性t细胞的标记物。通过流动式细胞测量术来测量细胞增殖，并且通过cfse稀释来评价。
[0201]
图6显示了以占增殖细胞的百分比(左图)和通过流动式细胞测量术以占最大(mfi)的百分比(cd4 或cd8 细胞中cfse稀释的信号检测)(右图)表示的t细胞增殖测定结果。如图6中所示，与对照相比，经cm处理的单核细胞抑制了t细胞增殖，并且添加重组gm-csf进一步抑制了t细胞增殖。用抗gm-csfrα抗体(ab)处理降低mdsc介导的t细胞抑制。
[0202]
等价方案
[0203]
本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验确定本文所述本发明的特定实施例的许多等价方案。本发明的范围并不预期限于上文说明书，而是如下述权利要求
中所述。