三叶鬼针草与其植物化学物质在预防及治疗下痢的用途的制作方法

1.本发明总体上是关于一种三叶鬼针草(bidens pilosa)用于预防、减轻及治疗下痢的用途，更具体地是关于一种三叶鬼针草及其植物化学物质用于预防、减轻及治疗猪下痢的用途。


背景技术：

2.下痢(diarrhea)和赤痢(dysentery)是养猪业最重要的问题，从断奶到肥育期的最后一天都可能发生。它可能成为持续数周的慢性疾病。抗微生物生长促进剂(antimicrobial growth promoters,agp)作为饲料添加剂已被证明可以有效减少猪下痢的情形并提高养猪业猪只生长成效。然而，agp会诱导病原体对抗生素的耐受性。因此自2006年以来，欧盟已禁止agp使用于动物。
3.自古以来植物便是用于治疗动物以及人类疾病的重要药物来源。草本药物方法可降低或替代对猪只施予agp的滥用及误用，并有助于肉量的产出。


技术实现要素：

4.在一方面，本发明涉及一种包含三叶鬼针草或自该三叶鬼针草分离出的活性化合物的组合物用于制备治疗、抑制及/或减少有此需要的动物体内出现致病性肠道微生物的药物的用途，其中所述致病性肠道微生物是选自由短螺菌(brachyspira spp.)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,pedv)、传染性胃肠炎冠状病毒(transmissible gastroenteritis coronavirus,tgev)和轮状病毒(rotavirus,rv)组成的群组中的至少一种。
5.本发明的组合物还用于增加猪屠体重和骨重百分比。
6.另一方面，本发明涉及一种包含三叶鬼针草或自该三叶鬼针草分离出的活性化合物的组合物用于制备治疗、抑制及/或减少发生猪下痢(swine diarrhea)、猪赤痢(swine dysentery)、猪病毒感染(swine viral infection)和增加猪屠体重和骨重百分比的药物的用途。
7.在又一方面，本发明涉及一种包含三叶鬼针草或自该三叶鬼针草分离出的活性化合物的组合物用于制备治疗及/或减少由短螺菌属(brachyspira)引起的猪赤痢和增加猪屠体重和骨重百分比的药物的用途。
8.在本发明的一个实施方式中，所述猪下痢、猪赤痢和猪病毒感染与至少一种致病性肠道微生物有关，该致病性肠道微生物选自由短螺菌属、猪流行性腹泻病毒(pedv)、传染性胃肠炎冠状病毒(tgev)和轮状病毒(rv)组成的群组。
9.在一个实施方式中，所述致病性肠道微生物可以选自短螺菌。所述致病性肠道微生物为猪赤痢短螺菌(brachyspira hyodysenteriae)。所述有此需要的动物可为断奶的猪或成长中的猪。
10.在另一个实施方式中，自该三叶鬼针草分离出的活性化合物为式(i)的聚乙炔化
合物：
[0011][0012]
其中r1为h或ch3；
[0013]
r2为单糖；
[0014]
r3为h或coch2cooh；
[0015]
m＝3或4；
[0016]
n＝0或1；
[0017]
o＝1或2；以及
[0018]
p＝1或2。
[0019]
在另一个实施方式中，自该三叶鬼针草分离出的活性化合物选自由
[0020][0021]
以及
[0022]
组成的群组。
[0023]
所述三叶鬼针草可为粉末形式。所述组合物可为食物、动物饲料材料或药品的形式。
[0024]
在另一个实施方式中，所述组合物的投与剂型选自由口服剂型、胶囊剂型、栓剂剂
型以及非经肠胃的剂型组成的群组。
[0025]
在另一个实施方式中，所述三叶鬼针草或自该三叶鬼针草分离出的活性化合物投与有此需要的动物的剂量为不少于1μg/kg体重。
[0026]
在另一个实施方式中，所述组合物包含动物饲料及介于0.0005％-15％(w/w)的所述三叶鬼针草。
[0027]
在另一个实施方式中，所述组合物包含动物饲料及介于0.05％-15％(w/w)的所述三叶鬼针草。所述组合物可以包含动物饲料及介于0.1％-15％(w/w)，1％-15％(w/w)，1％-10％(w/w)的所述三叶鬼针草。
[0028]
在另一个实施方式中，自该三叶鬼针草分离出的活性化合物为聚多炔糖苷(cytopiloyne)。
[0029]
通过结合以下附图对优选实施方式的以下描述，这些和其他方面将变得显而易见，但是在不脱离本公开的新颖概念的精神和范围的情况下可以实施变化和修改。
[0030]
下述用于阐述一个或多个本发明实施方式的图式及其说明，是用以解释本发明的原理。只要有可能，图式中所使用的相同附图标记代表实施方式中相同或相似的组件。
附图说明
[0031]
图1显示了投与时间表。以抗生素生长促进剂(agp)、标准饲料(0％bp)和含三叶鬼针草粉末的标准饲料(lbp、mbp、hbp)喂养5组经4周治疗的断奶仔猪4周。lbp、mbp和hpb分别指含1、2、5％三叶鬼针草粉末的饲料。
[0032]
图2显示了三叶鬼针草对断奶仔猪下痢的影响。仔猪于自然感染后出现下痢的情形。连续28天每日监测仔猪下痢的状况。每组仔猪数为10只。利用kaplan-meier log-rank检验估计p值，以确定对照组(0％bp)与各治疗组的结果差异，并且显示p＜0.05(*)(a)。表格呈现了无下痢曲线两两比较的p值(b)。
[0033]
图3显示了三叶鬼针草影响猪肠道病理学检验结果。(a)猪的十二指肠(第1横排)、空肠(第2横排)、回肠(第3横排)的苏木精-伊红(h&e)染色。(b)猪的十二指肠(左栏)、空肠(中栏)、回肠(右栏)的绒毛-隐窝长度比。采用方差分析(anova)比较对照组(0％bp)与各治疗组的差异，并且显示p＜0.05(*)。
[0034]
图4显示了三叶鬼针草对于断奶仔猪体长(4a)、体重百分率(4b)、和骨重百分率(4c)的影响。5组经4周治疗的断奶仔猪分别给予标准饲料(0％bp)和含三叶鬼针草粉末(bp)与agp的标准饲料4周。每周监测体型大小(4a)、体重(4b)、和骨重量(4c)共4周。每组仔猪10只。在第4周结束时，以anova比较对照组(0％bp)与各治疗组之间的差异。
[0035]
图5显示了三叶鬼针草对断奶仔猪肠道微生物群(益生菌)百分比变化的影响。
[0036]
图6显示了三叶鬼针草对断奶仔猪肠道微生物群(病原菌)百分比变化的影响。
[0037]
图7显示了三叶鬼针草对于生长期/肥育期(growing/finishing stage)的猪只赤痢的影响。猪只在短螺菌(brachyspira spp.)感染后出现猪赤痢。对于断奶后至35周龄的猪赤痢发生情况进行每日监测。每组猪只数为10只。通过kaplan-meier log-rank检验估计p值，以确定对照组(0％bp)与各治疗组的结果差异，并且显示p＜0.05(*)(a)。表格显示无猪赤痢曲线两两比较的p值(b)。
具体实施方式
[0038]
动物饲料是指给予家畜、家禽及宠物(伴侣动物)的食物。
[0039]
本文所述的“纯化合物”一词是指具有至少80％(例如95％或99％)的纯度的化合物。
[0040]
本文所述的“治疗中”、或“治疗”一词是指施予有此需要的个体有效量的试剂用于治愈、缓解、舒缓、修补、改善、减少或预防疾病、该疾病的症状或疑似的倾向。
[0041]
美国健康与人类服务部食品与药物管理局(u.s.department of health and human services food and drug administration)公开的“评估健康成人自愿者于临床试验治疗时安全起始剂量的厂商与审查员指引”(guidance for industry and reviewers estimating the safe starting dose in clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers)揭示一种可以从以下公式算得人类等效剂量(a human equivalent dose)：
[0042]
hed＝以mg/kg计的动物剂量
×
(以kg计的动物重量/以kg计的人类重量)
0.33
。
[0043]
本发明涉及一种植生素(phytogenic)，用以在猪饲料添加剂中替代抗微生物生长促进剂(agp)以减少猪只下痢(porcine diarrhea)、改善猪只健康以及提高生长成效。
[0044]
首先，制备三叶鬼针草粉末。通过不同比例的三叶鬼针草粉末混合动物饲料来配制。
[0045]
三叶鬼针草制品。藉由下列方式得到制品：于升高的温度(如：于50℃或100℃)下，在水中搅拌粉碎的三叶鬼针草植物以形成悬浮液，并且收集该悬浮液的上清液。所述上清液可以进一步用醇类(如：正丁醇)萃取，以提供浓缩制品。该三叶鬼针草制品(萃取物)包含一种或多种聚乙炔化合物，例如：其包含聚多炔糖苷：
[0046][0047]
如果适用，前述的聚乙炔化合物包含化合物本身，以及其盐类、前药及溶剂化物。此种盐类例如可藉由聚乙炔化合物上的负电荷取代基(如：羧酸盐)与阳离子间的相互作用来形成。合适的阳离子包括但不限于钠离子、钾离子、镁离子、钙离子以及铵阳离子(如：四甲基铵离子)。相同地，聚乙炔化合物上的正电荷取代基(如：氨基)与带负电的反离子形成盐类。合适的反离子包括但不限定于氯化物、溴化物、碘化物、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐或乙酸盐。前药的例子包括酯类及其它医药可接受的衍生物，其为给予个体时能提供上述化合物。溶剂化物是指聚乙炔化合物与医药可接受溶剂之间形成的复合物。医药可接受溶剂的例子包括水、乙醇、异丙醇、正丁醇、乙酸乙酯及乙酸。
[0048]
所述聚乙炔化合物可包含一个或多个不对称中心或非芳族的双键。因此，该化合物可以外消旋物及外消旋混合物、单一对映异构物、个别非对映异构物、非对映异构物混合物以及顺式或反式异构体形式存在，所有这样的异构体形式皆可被考虑。
[0049]
聚乙炔化合物
[0050]
聚乙炔化合物(例如聚多炔糖苷)可自三叶鬼针草中分离得到。首先将整株三叶鬼针草磨碎，接着置于热水中搅拌。待移除不可溶的物质后(例如通过过滤、倾析或离心)，将所得的上清液进行液相色谱法(例如高压液相色谱法)或其他适用方法以得到纯粹的聚乙
炔化合物。由此得到的纯化合物可进一步衍生以提供数种本发明的其他聚乙炔化合物(美国专利号7,763,285及kusano等人(jp 2004083463)，所有这些文献内容通过引用整并至本文中)。
[0051]
前述的聚乙炔化合物亦可以通过传统方法制备。以下三个反应式用于阐述本发明的聚乙炔化合物的合成途径。
[0052]
反应式1
[0053][0054]
将丁烷-1,2,4-三醇(butane-1,2,4-triol)(i)与丙酮反应以形成被保护的1,2,4-三醇化合物(1,2,4-triol compound)(ii)，其可被转形成为碘基衍生物(iii)。在碱性条件(例如：n-buli)下，化合物(iii)接着与乙炔基三甲基硅烷(ethynyltrimethylsilane)反应，以得到(4-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基)丁-1-炔基)三甲基硅烷((4-(2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl)but-1-ynyl)trimethylsilane)(iv)。化合物(iv)接着以酸(例如：乙酸)处理，接着与2-溴化吡喃葡萄糖(2-bromoglucopyranose)进行偶合反应以得到加合物(v)。化合物(v)可进一步以氟化钾处理以得到2-苯基-4h-色烯-4-酮(2-phenyl-4h-chromen-4-one)(vi)。
[0055]
反应式2
[0056][0057]
1-溴丙-1-炔(1-bromoprop-1-yne)(vii)与乙炔基溴化镁(ethynylmagnesium bromide)反应以得到戊-1,3-二炔(penta-1,3-diyne)(viii)，其可进一步转化为庚-1,3,5-三炔(hepta-1,3,5-triyne)(ix)。化合物(ix)可在碱性条件(例如：n-buli)下，并于加上碘基化合物(例如：i2)后，被转形成1-碘庚-1,3,5-三炔(1-iodohepta-1,3,5-triyne)(x)。
[0058]
反应式3
[0059][0060]
反应式3证实从反应式1所得的乙炔衍生物(vi)与从反应式2所得的1-碘庚-1,3,5-三炔(x)之间的的偶合反应，可形成四炔化合物(xi)。去除保护基得到本发明所述化合物，聚乙炔化合物，2β-d-吡喃葡萄糖氧基-1-羟基十三碳-5,7,9,11-四炔(2β-d-glucopyranosyloxy-1-hydroxytrideca-5,7,9,11-[0061]
tetrayne)。
[0062]
适于合成所述的适用化合物的合成化学转换方法，例如，于r.larock所撰的，综合有机转换(comprehensive organic transformations)，vch出版(1989)；t.w.greene及p.g.m.wuts，有机合成中的保护基(protective groups in organic synthesis)，第三版，john wiley及sons(1999)；l.fieser及m.fieser，fieser及fieser的用于有机合成的反应试剂(fieser and fieser’s reagents for organic synthesis)，john wiley及sons(1994)；以及l.paquette,ed.，用于有机合成的试剂大全(encyclopedia of reagents for organic synthesis)，john wiley及sons(1995)及其后续版本。
[0063]
用于口服给药的组合物可为任何口服可接受的剂型，包括胶囊、锭剂、乳剂、及水性悬浮液、分散剂及溶液。作为锭剂时，常用的载剂包括乳糖及玉米淀粉。润滑剂，诸如硬脂酸镁，也常被添加。以胶囊形式进行口服给药时，常用的稀释剂包括乳糖及干的玉米淀粉。当以水性悬浮液或乳剂口服施予时，活性成分可以悬浮或溶解于与乳化剂或悬浮剂结合的油相中。如果想要的话，也可添加某些甜味剂、调味剂或增色剂。
[0064]
收集三叶鬼针草。将全部约10kg的干净且粉碎的植物，于40l的水中进行回流2小时。经移除水相后，将不可溶物质置于25l水中再次进行回流2小时。将合并的水溶液(约65l)于真空中蒸发以得到残留物，该残留物接着悬浮于1.0l水中，并以1.0l正丁醇萃取3次。将正丁醇区段先以真空旋转蒸发器于减压下进行蒸发，接着冻干以得到聚多炔糖苷的粗产物(37.7g)。
[0065]
该粗产物接着以rp-18硅胶管柱及ch3oh/h2o梯度溶剂系统进行色谱法，以得到次区段bpb1、bpb2、bpb3及bpb4。以70％ch3oh洗提出的bpb3区段，进一步以半制备型hplc及ch3oh/h2o溶剂系统进行分级。聚多炔糖苷即可制得，并以1h nmr及
13
c nmr进行表征。
[0066]1h nmr(500mhz,cdod3)δ1.78(2h,q,j＝6.8hz),1.98(3h,s),2.58(2h,t,j＝
6.8hz),3.19(1h,dd,j＝9.1,7.8hz),3.30(1h,m),3.34(1h,m),3.59(2h,m),3.65(1h,dd,j＝12.0,6.5hz),3.75(1h,p,j＝6.8hz),3.85(1h,dd,j＝12.0,1.7hz),4.32(1h,d,j＝7.8hz)；
13
cnmr(125mhz,cdod3)δ3.8,16.1,31.4,60.0,60.9,61.8,62.4,62.6,64.9,65.8,66.2,71.5,75.2,77.9,81.6,104.8。
[0067]
三叶鬼针草粉末(bpp)百分比的计算方法为：三叶鬼针草粉末重量/三叶鬼针草粉末重量 基本鸡饲料＝bpp的百分比(％)。
[0068]
0.0005％到15％(w/w)意即所有位于此范围内的万分之一、千分之一、百分之一、十分之一以及整数的单位数量皆为本发明所揭露的部分。因此，0.0005％、0.0006％、0.0007％...0.001％、0.002％、0.003％...0.01％、0.02％、0.03％...0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％及1％、2％、3％、4％...13％、14％，以及15％单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。
[0069]
0.05％到15％(w/w)意即所有位于此范围内的百分之一、十分之一以及整数的单位数量皆为本发明所揭露的部分。因此，0.05％、0.06％、0.07％
…
0.01％、0.02％、0.03％
…
0.1％、0.2％、0.3％
…
及1％、2％、3％、4％
…
13％、14％以及15％单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。0.1％到15％(w/w)意即所有位于此范围内的十分之一和整数的单位数量皆为本发明所揭露的部分。因此，0.1％、0.2％、0.3％
…
和1％、2％、3％、4％
…
13％、14％及15％的单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。1％到15％(w/w)意即所有位于此范围内的整数单位数量皆为本发明所揭露的部分，因此，1％、2％、3％、4％
…
13％、14％及15％的单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。1％到10％(w/w)意即所有位于此范围内的整数单位数量皆为本发明所揭露的部分。因此，1％、2％、3％、4％
…
8％、9％及10％的单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。1％到5％(w/w)意即所有位于此范围内的整数单位数量皆为本发明所揭露的部分。因此，1％、1-2％、1-3％、1-4％、2％、2-3％、2-4％、2-5％、3％、3-4％、3-5％、4％、4-5％和5％的单位数量皆为本发明的实施方式所包括的数量。
[0070]
实施例
[0071]
在不意图限制本发明的范围的情况下，以下提供根据本发明实施方式的示例性仪器、设备、方法及其相关结果。应注意的是，在实施例中使用的标题或副标题乃为了读者方便阅读，绝非用于限制本发明的范围。此外，本说明书提出并公开了某些理论，然而无论它们是对还是错，只要它们是根据本发明实施的，而非考虑任何特定的理论或作用方案，它们就决不能限制本发明的范围。
[0072]
材料与方法
[0073]
动物，本研究的所有动物相关实验步骤均符合实验动物使用指南(the guidance for the use of laboratory animals)。
[0074]
初生的杂交猪(duroc
×
landrace
×
yorkshire)被饲养于板条形金属地板分娩箱中与母猪饲养，并供应额外的热。猪只皆有剪牙(teeth clicked)、断尾以及注射铁质，公猪被阉割。无提供幼畜补充饲料(creep feed)。饲养24日断奶后，挑选50只体重最接近(7.42
±
0.38kg)的猪只并移至育幼小间(nursery room)，按体重分为五组。每一猪栏尺寸为3.7
×
2.6m，配有板条形金属地板，并包括三个饮水点与两个自动喂食器，以及利用红外加热灯提供额外的热。
[0075]
饲育猪只的饲料以玉米、全脂豆粕与乳清粉为基底，添加了agp或是三种不同剂量(低、中、高剂量)的三叶鬼针草粉末，喂养四周(图1)。饲料的营养成分满足或超过断奶仔猪的需求，无限制供应饲料与给水。饲料形式为粉状。
[0076]
在实验开始、第7、14、21和28天时，对猪只进行称重并量测每个猪栏猪只的摄食量。28日龄猪分别受到猪舍内存在的病原菌感染的自然感染或受到短螺菌感染。计算各时期猪栏内猪只的重量增加、摄食量和饲料增重比。粪便计分以主观评分系统进行每日8：00、12：00与16：00三次的监测。每个猪栏的粪便根据以下标准计分：1、严重下痢；2、中度下痢；3、软便；4、正常的粪便；5、结实但干燥的粪便(song,y.s.,v.g.p
é
rez,j.e.pettigrew,c.martinez-villaluenga,and e.g.de mejia.2010“fermentation of soybean meal and its inclusion in diets for newly weaned pigs reduced diarrhea and measures of immunoreactivity in the plasma”anim.feed sci.technol.159:41-49)。为评估肠道病理学，每一治疗组的仔猪牺牲后将取出的肠子以福尔马林固定并以石蜡包埋。肠道切片以苏木精-伊红(h&e)染色后在显微镜下进行镜检。
[0077]
由三叶鬼针草治疗组或非治疗组的猪只粪便采集的肠道细菌dna，经过纯化后作为pcr扩增的模板，以16s rrna为引物：正向引物5'-tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcctacgggnggcwgcag(seq id no:1)，和反向引物5'-gtctcgtgggctcggagatgtgtataagagacaggactachvgggtatctaatcc(seq id no:2)，以制备16s rrna扩增子文库(amplicons library)。利用illumine miseq系统的16s rrna扩增子对断奶仔猪的肠道微生物进行分类。为了制备16s rrna扩增子文库，引物对排列在v3和v4区域产生了约460bp的单一扩增子。扩增v3和v4区域并使用有限循环pcr，将illumina测序接头和双索引条形码添加到扩增子目标。使用nextera xt索引的完全互补(full complement)，最多可以将96个文库汇集在一起进行测序。miseq上的序列-使用成对的300-bp测序片段(reads)以及miseq v3试剂，每一测序片段的末端重迭以在单次65小时运行中产生v3和v4区域的高质量、全长测序片段。将通过miseq reporter、basespace和greengenes数据库分析16s rrna基因扩增子测序结果，对肠道微生物群进行分类。
[0078]
统计分析
[0079]
数据以statistical graphics公司的statraphic plus软件进行分析。数值以平均数
±
标准偏差(s.d.)表示。采用anova分析和/或student’s t检验来评估对照组(0％bp)与治疗组之间的差异。采用5％的显著标准用于分析。
[0080]
结果
[0081]
三叶鬼针草对于断奶的猪的肠道病变相关下痢的影响
[0082]
断奶仔猪分组后分别以抗生素生长促进剂(agp组)、标准饲料(0％bp,ctl组)以及含有三叶鬼针草粉末的标准饲料(lbp组(含有1％三叶鬼针草粉末)、mbp组(含有2％三叶鬼针草粉末)、hbp组(含有5％三叶鬼针草粉末))喂食四周(图1)。猪只于28日龄时被猪舍内病原体感染(自然感染)或被短螺菌感染。每日三次监测该些猪只的粪便并记录下痢情形。喂食标准饲料(0％bp)的断奶仔猪在第一周时100％都表现出较低的分数以及出现下痢的情况(图2)。然而，含有agp或是三叶鬼针草粉末的饲料可以减少断奶仔猪75％到95％下痢情况的发生(图2)。以中和高剂量三叶鬼针草饲料喂养的组别显示出三叶鬼针草能够显著减少猪只下痢的情况(图2)以及增加粪便计分的分数(表1)。检测五个组别的猪只肠道病理状
况。十二指肠、空肠和回肠的绒毛与隐窝在喂养标准饲料(0％bp)的对照组相较于其他喂养含有不同剂量三叶鬼针草与agp的饲料的组别状况较差(图3a)表现。十二指肠、空肠与回肠的绒毛-隐窝长度比在对照组(0％bp)猪只身上也低于其他被喂养含有不同剂量三叶鬼针草与agp饲料的组别(图3b)。数据显示三叶鬼针草确实抑制了猪只下痢与肠道病变。表1显示三叶鬼针草改善断奶仔猪的粪便计分结果。
[0083]
表1
[0084][0085]1采用平均数
±
标准偏差(每治疗组猪数为10只)anova比较对照组(0％bp)与各治疗组第1到第4周的差异，并显示p《0.05(*)。
[0086]2每畜舍粪便计分基准如下：1、严重下痢；2、中度下痢；3、软粪；4、正常的粪便；5、结实但干燥的粪便。
[0087]
三叶鬼针草改善体重增加百分比、屠体重、骨重与降低饲料转化率(fcr)
[0088]
评估三叶鬼针草对于猪只生长表现的益处。首先，监测用标准饲料或含不同剂量三叶鬼针草饲养的猪只体重增加与饲料转化率(feed conversion rate,fcr)。发现用三叶鬼针草饲养的猪只相比于用标准饲料饲养的猪只或agp组具有较佳的体型(图4a)、增重(图4b)、屠体重(表2)、屠体长(表2)以及骨重(图4c)。同样地，三叶鬼针草以剂量依赖方式显著降低三叶鬼针草治疗组猪只的fcr(表3)。数据显示了三叶鬼针草提高了总重量、屠体重与骨重但减少了fcr。表2显示了三叶鬼针草改善了断奶仔猪的屠体质量。表3显示了三叶鬼针草降低断奶仔猪饲料转化率的效果。
[0089]
表2
[0090][0091]
a.
5组4周龄断奶仔猪，分别以标准饲料(ctl)和含有低、中、高剂量的三叶鬼针草粉末(lbp、mbp、hbp)和agp(抗微生物生长促进剂)的标准饲养4周。
[0092]
b.
数据以平均数
±
平均标准误差(sem)表示，各组猪只数为3只。对照组与agp组比较，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0093]
c.
对照组与三叶鬼针草组比较差异有统计学意义(p《0.05)。
[0094]
表3
[0095][0096]
采用平均数
±
标准偏差(各组猪只数为10只)anova比较对照组(0％bp)与各治疗组间的差异，并显示p《0.05(*)。
[0097]
三叶鬼针草治疗组或非治疗组断奶仔猪的肠道微生物研究
[0098]
分析三叶鬼针草对于各组猪只肠道细菌的影响，对56日龄的断奶仔猪肠道细菌16s rrna扩增子进行次世代测序分析，以揭露断奶仔猪肠道细菌群落。发现喂食三叶鬼针草的猪只的细菌属的子集，拟杆菌属(bacteroides)、巨单胞菌属(megamonas)、毛螺菌科(lachnospiraceae)、乳杆菌属(lactobacillus)和瘤胃菌科(ruminococcaceae)在猪只肠道内均有增加(图5)。据报道，上述所有属都是有益的微生物群。并且还发现在猪肠道中与肠道病变相关的10个细菌属减少(图6)。这些细菌包括丁酸球菌属(butyricicoccus)、厌氧支原体属(anaeroplasma)、厌氧棒状菌属(anaerostipes)、考拉杆菌属(phascolarctobacterium)、梭菌科(瘤胃菌科)(clostridiaceae(ruminococcaceae))、肠球菌属(enterococcus)、不动杆菌属(acinetobacter)、弯曲菌属(campylobacteria)、埃希氏菌属(escherichia)/志贺氏菌属(shigella)以及梭菌属(梭菌科)(clostridium(clostridiaceae))，这些菌属被称为伺机性致病菌，也是人畜共通传染病的病源，不仅影响国内畜牧业也导致人类公共卫生问题。
[0099]
三叶鬼针草对于成长期/肥育期猪只的影响
[0100]
监测断奶后至35周龄猪只在成长期/肥育期的临床行为。所有的猪只均以短螺菌感染。以标准饲料饲养的对照组猪只(0％bp，ctl组，图7a)在断奶后的第一个月出现了猪赤痢的情形。以低剂量三叶鬼针草(lbp组，图7a)和高剂量三叶鬼针草(hbp组，图7a)饲养的猪只则分别减少了75％和100％的猪赤痢情形(图7a)。对这些实验进行统计分析结果如图7b所示。
[0101]
三叶鬼针草具有减少猪只体内病毒与细菌的作用
[0102]
检测三叶鬼针草对于自养猪场自然感染情况下猪只体内病毒与致病菌的状况。以标准饲料饲养的七只对照组猪只中有七只感染了猪流行性腹泻病毒(pedv)(ctl组，pedv，表4)。相反地，以含有不同剂量三叶鬼针草的饲料饲养的组别则是剂量依赖地减少了猪流行性腹泻病毒的感染状况(lbp、mbp、和hbp组，pedv，表4)。传染性胃肠炎冠状病毒(tgev，表4)和轮状病毒(rv，表4)也是这种情形。同样的，以标准饲料饲养的七只对照组猪只中有七只的产气荚膜梭菌(c.perfringens)反应为阳性(ctl组，clostridium perfringens，表4)。相反地，以含有不同剂量的三叶鬼针草的饲料喂食的猪只剂量依赖地降低了产气荚膜梭菌的感染情况(lbp、mbp和hbp组，clostridium perfringens，表4)。肠致病性大肠杆菌
(e.coli)和沙门氏菌(salmonella spp.)的情况也一样(e.coli和salmonella spp.，表4)。不过并没有检测到猪赤痢短螺菌(brachyspira hyodysenteriae)(brachyspira hyodysenteriae，表4)。总体而言，三叶鬼针草不只减少了下痢/赤痢的临床症状，也减少了肠道中引起下痢的病原体的比例，显示了此种植物不仅抑制了致病菌和病毒在仔猪断奶期的下痢问题，也减少了生长期/肥育期的猪赤痢。
[0103]
表4显示了断奶末期采用多重pcr dna生物芯片(multiplex pcr dna biochip)或酶联免疫吸附法(elisa)检测其唾液、血液和结肠样本中7种病原菌的猪只数量。表中的“nd”代表“未检出”。
[0104]
表4
[0105][0106][0107]a采用多重pcr dna生物芯片或elisa对7只断奶末期猪只的唾液、血液和结肠样本进行病原检测。结果以阳性与被测试过的样本数量呈现。以多重pcr-dna生物芯片检测流行性腹泻病毒、传染性胃肠炎冠状病毒、轮状病毒。以pcr检测猪赤痢短螺菌，以elisa检测大肠杆菌和沙门氏菌。
[0108]
整体而言，以含有抗生素或是三叶鬼针草作为饲料添加剂的饲料喂食断奶仔猪28天。分析了体重增加、食物摄取量、粪便计分、血清生化、肠道病理学、肠道微生物组成调整、以及屠体质量。显示了以抗生素或三叶鬼针草治疗的动物皆表现出下痢减少的情形。然而，三叶鬼针草治疗组中有75％到95％的仔猪呈现了保护作用，而抗生素治疗组中仅有75％的仔猪受到了保护。此外，对比对照组与抗生素组，三叶鬼针草治疗组的仔猪具有更好的生长优势与体型评分。且在仔猪生长的不同阶段中，三叶鬼针草组与对照组和抗生物组比较，三叶鬼针草治疗组的动物罹患猪赤痢与病毒感染的比例更低。综上所述，三叶鬼针草可减少猪只在不同生长阶段中的下痢与赤痢。
[0109]
本说明书中引用和讨论的所有参考文献均以参考文献的形式完整地纳入本说明书，其程度与每个参考文献以参考文献的方式单独纳入本说明书相同。