一种高灵敏度HPV病毒检测试剂盒的制作方法

一种高灵敏度hpv病毒检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种高灵敏度hpv病毒检测试剂盒。


背景技术：

2.人乳头瘤病毒(human papillomavirus，hpv)是一种属于乳多空病毒科乳头瘤空泡病毒a属的球形dna病毒，能通过上皮的微创口感染宿主细胞，引起人体皮肤和黏膜的鳞状上皮细胞增殖、病变，引发多种人类良性和恶性肿瘤性疾病。目前已发现的hpv病毒基因型有200多种，可分为主要引发恶性病变的高危型(hr-hpv)和一般导致良性病变的低危型(lr-hpv)，其中，hpv-16和hpv-18是最常见的致癌型别，也是引发宫颈恶性肿瘤的主要因素。目前，对hpv病毒的检测通常采用pcr法，从待测样本中提取出核酸后，对目的片段进行pcr扩增，进而实现定性或定量检测。
3.磁珠法利用磁珠表面的特殊性质，在一定条件下吸附核酸，而后通过改变条件将核酸从磁珠上洗脱下来，从而实现核酸的分离纯化，其能够实现自动化、大批量操作，具有操作简单、用时短等优点，是目前提取核酸的主要方法之一。用于核酸提取的磁珠主要包括二氧化硅磁珠、羧基磁珠和正电荷磁珠(如氨基磁珠、咪唑基磁珠)。
4.正电荷磁珠通过静电引力吸附核酸，对核酸的吸附较强，但洗脱难度大，会造成收率偏低。由于上述问题的存在，现有技术中采用的通常是二氧化硅磁珠和羧基磁珠(如专利cn201511007550.7和cn202110951242.9)，这两种磁珠表面带有负电荷，主要利用体系中带正电荷的盐离子，在磁珠与带负电的核酸之间形成盐桥，从而实现磁珠对核酸的吸附，这种方式易于将核酸从磁珠上洗脱下来(通过去除体系中的盐离子即可)，但磁珠对核酸的吸附效果较差，在洗脱前对磁珠进行洗涤以去除蛋白质等杂质的过程中，核酸易从磁珠上脱落，同样会造成收率偏低。而高收率对于病毒检测的灵敏度非常重要，特别是在疾病早期，待测样本中的病毒核酸含量通常较低，若不能高收率地提取核酸，则很容易出现假阴性，导致漏检。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高灵敏度hpv病毒检测试剂盒。本发明采用的磁珠以特定的方式接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，对核酸具有较好的吸附和洗脱效果，能提高核酸提取的收率，进而提高hpv病毒检测试剂盒的灵敏度。
6.本发明的具体技术方案为：第一方面，本发明提供了一种用于核酸提取的高收率磁珠，所述高收率磁珠的表面接枝有半胱氨酸-门冬酰胺二肽；所述半胱氨酸-门冬酰胺二肽通过半胱氨酸中的羧基接枝在高收率磁珠的表面。
7.本发明在磁珠表面接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够利用磁珠表面电荷随ph的变化，实现核酸的吸附和洗脱，具体而言：在半胱氨酸-门冬酰胺二肽中，半胱氨酸中的α-羧基与磁珠形成共价键，α-氨基与门冬酰胺中的α-羧基形成酰胺键，巯基为游离基团，门冬酰
胺中的α-氨基为游离基团；半胱氨酸中巯基在ph较小时不带电，当ph大于一定值(该巯基的pk值)时带负电；门冬酰胺中α-氨基在ph较小时带正电，当ph大于一定值(该氨基的pk值)时不带电。当将ph控制在7～8范围内时，能使门冬酰胺中的α-氨基带正电，二肽中其他基团(包括半胱氨酸中的巯基)均不带电，且核酸带负电，故磁珠与核酸之间能产生静电引力，将核酸吸附到磁珠上；当将ph控制在9.8～10.5范围内时，核酸仍带负电，并能使半胱氨酸中的巯基带负电，二肽中其他基团(包括门冬酰胺中的游离α-氨基)均不带电，故核酸与磁珠之间能产生静电斥力，有助于将核酸从磁珠上洗脱下来。要实现上述作用，必须使二肽中游离的基团具有合适的pk，因而对两种氨基酸的类型以及二肽连接顺序均有限制。
8.在上述过程中，本发明的磁珠通过静电引力吸附核酸，因而吸附力较强，对核酸的吸附效果较好，能够防止核酸在洗脱前的洗涤过程中从磁珠上脱落；并且，利用静电斥力能够提高核酸的洗脱效果；此外，由于半胱氨酸和门冬酰胺并非分开接枝在磁珠上，而是以二肽的形式接枝，这种方式能减小两种氨基酸之间的距离，进而在洗脱时，增大巯基与吸附于磁珠上的核酸之间的静电斥力，进一步提高洗脱效果。因此，采用本发明的磁珠提取核酸，能提高收率。
9.作为优选，所述高收率磁珠包括磁珠内核和包覆在所述磁珠内核外的超支化葡聚糖；所述半胱氨酸-门冬酰胺二肽通过半胱氨酸中的羧基接枝在超支化葡聚糖上。
10.超支化葡聚糖是一种天然超支化多糖，其分子链中带有较多的分支结构，且每个葡萄糖单体中均带有较多的羟基，将其包覆于磁珠表面形成交联网络后，能在磁珠表面引入大量且分布均匀的羟基，利用其中的羟基接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够使二肽具有较高的接枝量和接枝均匀性，有利于进一步提高核酸提取的效率。
11.第二方面，本发明提供了一种所述高收率磁珠的制备方法，包括以下步骤：(a)接枝超支化葡聚糖：将超支化葡聚糖和酯化催化剂溶于水中，加入羧基磁珠，分散均匀后，进行酯化反应，而后依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得葡聚糖-磁珠；步骤(a)中，利用羧基磁珠表面的羧基与超支化葡聚糖中的羟基，进行酯化反应，将超支化葡聚糖共价接枝到磁珠表面，从而在磁珠表面引入大量羟基。
12.(b)接枝半胱氨酸：将巯基上连接有保护基的半胱氨酸和酯化催化剂溶于水中，加入葡聚糖-磁珠，分散均匀后，进行酯化反应，而后依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得cys(保护基)-磁珠；步骤(b)中，利用葡聚糖-磁珠表面的羟基与半胱氨酸中的羧基，进行酯化反应，将半胱氨酸接枝到磁珠上；(c)接枝门冬酰胺：将α-氨基和酰胺基上连接有保护基的门冬酰胺、缩合剂溶解到有机溶剂中，进行羧基活化后，加入cys(保护基)-磁珠，分散均匀后，进行脱水缩合，获得asn(保护基)-cys(保护基)-磁珠；脱除保护基，获得asn-cys-磁珠，即高收率磁珠；步骤(c)中，利用cys(保护基)-磁珠上的氨基(来自半胱氨酸)与门冬酰胺中的羧基，进行脱水缩合形成酰胺键，将门冬酰胺接枝到半胱氨酸上；步骤(b)和(c)中，半胱氨酸的巯基以及门冬酰胺的α-氨基和酰胺基上均连接有保护基，能防止这些基团在步骤(c)中发生反应，导致每个半胱氨酸上接枝的门冬酰胺过多，影响洗脱效果。
13.在上述过程中，相较于先合成二肽，再将二肽接枝到磁珠上而言，本发明采用依次在磁珠上接枝半胱氨酸和门冬酰胺的方法，便于控制二肽中的游离基团为半胱氨酸上的巯
基和门冬酰胺上的α-氨基，而非两种氨基酸上的α-羧基或半胱氨酸上的α-氨基，从而实现ph对核酸吸附和洗脱的调控。
14.作为优选，步骤(a)中，所述磁珠、超支化葡聚糖与水的质量体积比为1g:1.5～2.5g:100～120ml。
15.作为优选，步骤(b)中，所述葡聚糖-磁珠、巯基上连接有保护基的半胱氨酸与水的质量体积比为1g:0.5～1.0g:15～25ml。
16.作为优选，步骤(c)中，所述cys(保护基)-磁珠、氨基上连接有保护基的门冬酰胺与有机溶剂的质量体积比为1g:0.8～1.6g:15～25ml。
17.第三方面，本发明提供了一种高灵敏度hpv病毒检测试剂盒，包括所述高收率磁珠。
18.本发明的试剂盒采用特制的磁珠，能提高核酸提取的收率，进而提高hpv病毒检测的灵敏度，减少假阴性的出现。
19.作为优选，所述试剂盒包括核酸提取试剂和pcr扩增试剂；所述核酸提取试剂包括磁珠悬浮液、裂解液、清洗液a、清洗液b和洗脱液；所述磁珠悬浮液中含有所述高收率磁珠。
20.该试剂盒的使用过程如下：首先将待测样本(如宫颈脱落细胞、皮肤脱落细胞、泌尿生殖道分泌物)、磁珠悬浮液和裂解液混合，控制ph在7～8范围内，进行细胞和病毒的裂解，释放出核酸，并将核酸吸附到磁珠上；分离出磁珠后，依次用清洗液a和清洗液b进行洗涤；将洗涤后的磁珠与洗脱液混合，控制ph在9.8～10.5范围内，将核酸从磁珠上洗脱下来；而后将分离出的核酸进行pcr扩增，以实现定量或定性检测。
21.进一步地，所述磁珠悬浮液中，高收率磁珠的含量为20～30mg/ml。
22.进一步地，所述裂解液为含有异硫氰酸胍和triton x-100的tris-hcl缓冲液；其中，所述异硫氰酸胍和tris-hcl的浓度分别为3～4mol/l和10～30mmol/l，triton x-100的体积浓度为1～3％。
23.进一步地，所述核酸提取试剂还包括蛋白酶k溶液；所述蛋白酶k溶液中，蛋白酶k的浓度为5～10wt％。
24.进一步地，所述洗脱液是浓度为10～30mmol/l的tris-hcl缓冲液。
25.进一步地，所述清洗液a是体积比为2～4:1的tris-hcl缓冲液和乙醇的混合液；所述tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为10～30mmol/l，tris-hcl缓冲液的ph为7～8。
26.进一步地，所述清洗液b是体积比为1:3～4的tris-hcl缓冲液和乙醇的混合液；所述tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为10～30mmol/l，tris-hcl缓冲液的ph为7～8。
27.进一步地，所述pcr扩增试剂包括hpv扩增引物、hpv检测taqman探针、内标引物、内标taqman探针、taq酶、dntps、tris-hcl缓冲液和ung酶。
28.进一步地，所述pcr扩增试剂还包括阴性对照和阳性对照。
29.与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)通过半胱氨酸中的羧基，在磁珠表面接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够使本发明的磁珠具有较高的核酸提取收率，进而使本发明的hpv病毒检测试剂盒具有较高的灵敏度；(2)通过在磁珠表面包覆超支化葡聚糖，利用其中的羟基接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够使二肽具有较高的接枝量和接枝均匀性，有利于进一步提高核酸提取的效率和
试剂盒的检测灵敏度。
具体实施方式
30.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
31.总实施例制备一种用于核酸提取的高收率磁珠，步骤如下：(a)接枝超支化葡聚糖：将超支化葡聚糖和酯化催化剂溶于水中，加入羧基磁珠，分散均匀后，进行酯化反应，而后依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得葡聚糖-磁珠；(b)接枝半胱氨酸：将巯基上连接有保护基的半胱氨酸和酯化催化剂溶于水中，加入葡聚糖-磁珠，分散均匀后，进行酯化反应，而后依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得cys(保护基)-磁珠；(c)接枝门冬酰胺：将α-氨基和酰胺基上连接有保护基的门冬酰胺、缩合剂溶解到有机溶剂中，进行羧基活化后，加入cys(保护基)-磁珠，分散均匀后，进行脱水缩合，获得asn(保护基)-cys(保护基)-磁珠；脱除保护基，获得asn-cys-磁珠，即高收率磁珠。
32.在一些优选的方式中，步骤(a)的具体过程如下：将超支化葡聚糖和钨磷酸溶于水中，加入羧基磁珠，分散均匀后，在75～85℃下搅拌反应6～8h，而后依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得葡聚糖-磁珠。
33.其中，可选地，所述磁珠、超支化葡聚糖、钨磷酸和水的质量体积比为1g:1.5～2.5g:7～10g:100～120ml。
34.在一些优选的方式中，步骤(b)的具体过程如下：将s-三苯甲基-l-半胱氨酸和钨磷酸溶于水中，加入葡聚糖-磁珠，分散均匀后，在60～70℃下搅拌反应3～5h，依次进行磁性分离、洗涤、干燥后，获得cys(trt)-磁珠。
35.其中，可选地，所述葡聚糖-磁珠、s-三苯甲基-l-半胱氨酸、钨磷酸和水的质量体积比为1g:0.5～1.0g:1～3g:15～25ml。
36.在一些优选的方式中，步骤(c)的具体过程如下：将fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺、缩合剂hbtu和碱diea溶于溶剂dmf中，在室温下搅拌活化10～15min后，加入cys(保护基)-磁珠，分散均匀后，在室温下搅拌反应2～3h，依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得asn(保护基)-cys(保护基)-磁珠；脱除保护基，获得asn-cys-磁珠，即高收率磁珠。
37.其中，可选地，所述cys(保护基)-磁珠、fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺、hbtu、diea与dmf的质量比为1g:0.8～1.6g:0.7～1.4g:0.9～1.8g:15～25ml。
38.在一些优选的方式中，步骤(b)中，所述半胱氨酸巯基上连接的保护基为三苯甲基；步骤(b)中，所述门冬酰胺α-氨基上连接的保护基为9-芴基甲氧基羰基，酰胺基上连接的保护基为三苯甲基；步骤(c)中，脱除保护基的具体过程如下：将哌啶溶于dmf中，加入asn(保护基)-cys(保护基)-磁珠，搅拌反应0.5～1.5h；而后加入i2，搅拌反应1～2h后，依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得asn-cys-磁珠，即高收率磁珠。
39.利用上述磁珠制成一种高灵敏度hpv病毒检测试剂盒，该试剂盒包括核酸提取试剂和pcr扩增试剂；所述核酸提取试剂包括磁珠悬浮液、裂解液、蛋白酶k溶液、清洗液a、清洗液b和洗脱液；所述磁珠悬浮液中含有所述高收率磁珠。
40.可选地，所述磁珠悬浮液中，高收率磁珠的含量为20～30mg/ml。
41.可选地，所述裂解液为含有异硫氰酸胍和triton x-100的tris-hcl缓冲液；其中，所述异硫氰酸胍和tris-hcl的浓度分别为3～4mol/l和10～30mmol/l，triton x-100的体积浓度为1～3％。
42.可选地，所述洗脱液是浓度为10～30mmol/l的tris-hcl缓冲液。
43.可选地，所述核酸提取试剂还包括蛋白酶k溶液；所述蛋白酶k溶液中，蛋白酶k的浓度为5～10wt％。
44.可选地，所述清洗液a是体积比为2～4:1的tris-hcl缓冲液和乙醇的混合液；所述tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为10～30mmol/l，tris-hcl缓冲液的ph为7～8。
45.可选地，所述清洗液b是体积比为1:3～4的tris-hcl缓冲液和乙醇的混合液；所述tris-hcl缓冲液中，tris-hcl的浓度为10～30mmol/l，tris-hcl缓冲液的ph为7～8。
46.可选地，所述pcr扩增试剂包括hpv扩增引物、hpv检测taqman探针、内标引物、内标taqman探针、taq酶、dntps、mgcl2、tris-hcl缓冲液和ung酶，还包括阴性对照和阳性对照。其中，hpv扩增引物可采用hpv扩增的通用引物(如gp5 /gp6 、spf1/gp6 等)。
47.上述试剂盒的使用方法包括以下步骤：(1)将待测样本、蛋白酶k溶液、磁珠悬浮液和裂解液混合，用盐酸和氨水将ph调节至7.0～8.0后，进行裂解和核酸吸附，磁性分离后，获得吸附有核酸的磁珠；(2)依次用清洗液a和清洗液b对吸附有核酸的磁珠进行洗涤，获得洗涤后的磁珠；(3)将洗涤后的磁珠与洗脱液混合，用盐酸和氨水将ph调节至9.8～10.3后，进行洗脱，磁性分离后，获得含有核酸的洗脱液。
48.实施例1：制备高收率磁珠制备一种用于核酸提取的高收率磁珠，步骤如下：(a)接枝超支化葡聚糖：按照1g:4g:50ml的比例将超支化葡聚糖和钨磷酸溶于水中，加入羧基磁珠(与超支化葡聚糖的质量比为1:2)，分散均匀后，在80℃下搅拌反应7h，而后依次进行磁性分离、乙醇水溶液洗涤、干燥，获得葡聚糖-磁珠；(b)接枝半胱氨酸：按照0.4g:1g:10ml的比例将s-三苯甲基-l-半胱氨酸和钨磷酸溶于水中，加入葡聚糖-磁珠(与s-三苯甲基-l-半胱氨酸的质量比为1:0.8)，分散均匀后，在65℃下搅拌反应4h，依次进行磁性分离、乙醇水溶液洗涤、干燥后，获得cys(trt)-磁珠；(c)接枝门冬酰胺：按照1.2g:1g:1.5g:20ml的比例将fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺、缩合剂hbtu和碱diea溶于溶剂dmf中，在室温下搅拌活化10～15min后，加入cys(trt)-磁珠(与fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺的质量比为1:1.2)，分散均匀后，在室温下搅拌反应2～3h，依次进行磁性分离、乙醇和水洗涤、干燥，获得fmoc-asn(trt)-cys(trt)-磁珠；(d)脱除保护基：按照1:4的体积比将哌啶与dmf混合，加入fmoc-asn(trt)-cys(trt)-磁珠(与dmf的质量体积比为1g:40ml)，搅拌反应1h；而后加入i2(与dmf的质量体积比为1g:10ml)，搅拌反应1.5h后，依次进行磁性分离、洗涤、干燥，获得asn-cys-磁珠，即高收率磁珠。
49.实施例2：hpv病毒检测试剂盒本实施例的hpv病毒检测试剂盒由核酸提取试剂和pcr扩增试剂构成，组成分别如表1和表2所述。
50.表1核酸提取试剂
表1中，磁珠悬浮液中的磁珠为实施例1中制得的高收率磁珠。
51.表2 pcr扩增试剂表2中，hpv扩增引物为通用引物gp5 /gp6 ，即上下游引物序列分别为5'-tttgttactgtggtagatacyac-3'和5'-gaaaaataaactgtaaatcatattc-3'；hpv检测taqman探针包括用于hpv-16检测的探针和用于hpv-18检测的探针，序列分别为5'-catacacctccagcacctaa-3'和5'-ggatgctgcaccggtctga-3'；内标引物用于扩增hpv中的β-globin，上下游引物序列分别为5
’‑
gaagagccaaggacaggtac-3’和5
’‑
caacttcatccacgttcacc-3’；内标taqman探针的序列为5'-ccctagggttggccaatctactc-3'。
52.实施例3：hpv病毒检测利用实施例2中的试剂盒，对待测样本进行核酸提取，步骤如下：(1)向离心管中加入400μl待测样本、20μl磁珠悬浮液、20μl蛋白酶k溶液和400μl裂解液，混匀后，用盐酸和氨水将ph调节至8，孵育10min；将磁珠磁吸至离心管的一侧，弃废液；
(2)向离心管中加入600μl清洗液a，混合2min；将磁珠磁吸至离心管的一侧，弃废液；(3)向离心管中加入600μl清洗液b，混合2min；将磁珠磁吸至离心管的一侧，弃废液；(4)向离心管中加入100μl洗脱液，用盐酸和氨水将ph调节至10，混合6min；将磁珠磁吸至离心管的一侧，收集上清液，弃磁珠，获得待测核酸样本；(5)将待测样本换成阴性对照和阳性对照，分别重复上述过程，获得阴性对照核酸样本和阳性对照核酸样本。
53.对制得的核酸样本(待测核酸样本、阴性对照核酸样本和阳性对照核酸样本)分别进行荧光定量pcr，步骤如下：(6)按照表3，配制pcr反应体系；表3 pcr反应体系组分加样量(μl)pcr反应液15引物探针液3taq酶液1ung酶液0.2核酸样本1总体积20.2(7)按照表4中的反应程序，进行pcr扩增：表4 pcr反应程序(8)在pcr扩增过程的步骤3中，采集荧光信号，据此判断待测样本中是否存在hpv-16和hpv-18。
54.对比例1：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，将高收率磁珠换成羧基磁珠，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。
55.对比例2：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。本对比例中使用的磁珠按照实施例1的方法制备，区别仅在于，不进行步骤(b)～(d)，其余过程均与实施例1相同。
56.对比例3：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。本对比例中使用的磁珠按照实施例1的方法制备，区别仅在于，将步骤(a)中的超支化葡聚糖换成葡聚糖，其余过程均与实施例1相同。
57.对比例4：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。本对比例中使用的磁珠按照实施例1的方法制备，区别仅在于，将步骤(b)中的s-三苯甲基-l-半胱氨酸换成等摩尔量的半胱氨酸，步骤(c)中的fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺换成等摩尔量的天冬酰胺，不进行步骤(d)，其余过程均与实施例1相同。
58.对比例5：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，并将步骤(4)中的ph 10改为ph 11，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。本对比例中使用的磁珠按照实施例1的方法制备，区别仅在于，将步骤(b)中的s-三苯甲基-l-半胱氨酸换成等摩尔量的n'-(三苯甲基)-l-天冬酰胺，步骤(c)中的fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺换成等摩尔量的fmoc-s-三苯甲基-l-半胱氨酸，其余过程均与实施例1相同。
59.对比例6：hpv病毒检测本对比例与实施例3的区别仅在于，改变试剂盒中的磁珠，试剂盒中的其他成分和hpv病毒检测过程均与实施例3相同。本对比例中使用的磁珠按照实施例1的方法制备，区别仅在于，将步骤(c)中的fmoc-n-三苯甲基-l-天冬酰胺在步骤(b)中与s-三苯甲基-l-半胱氨酸一起加入，不进行步骤(c)，其余过程均与实施例1相同。
60.测试例：灵敏度采用实施例3和对比例1～5中的方法，对60个宫颈脱落细胞样本和37个泌尿生殖道分泌物样本(分散在细胞保存液中)进行检测，统计阴性和阳性的数量，结果见表5。
61.表5 hpv病毒检测结果数据分析：(1)相较于对比例1而言，实施例3两种病毒的检测阳性率明显较高，说明相较于普通羧基磁珠而言，通过本发明在其表面依次接枝超支化葡聚糖和半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够提高试剂盒的检测灵敏度。
62.(2)相较于对比例2而言，实施例3两种病毒的检测阳性率明显较高，说明通过在磁珠表面接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够提高试剂盒的检测灵敏度。这是由于：通过在磁珠表面接枝二肽，能够通过改变ph来改变磁珠表面的电性，使磁珠能通过静电引力吸附核酸，因而吸附力较强，对核酸的吸附效果较好，能够防止核酸在洗脱前的洗涤过程中从磁珠上脱落，同时，能利用静电斥力使核酸与磁珠分离，能够提高核酸的洗脱效果。通过这种方式，能提高核酸提取的收率，进而提高试剂盒的检测灵敏度。
63.(3)相较于对比例3而言，实施例3两种病毒的检测阳性率明显较高，说明相较于葡聚糖而言，采用超支化葡聚糖接枝磁珠，能够提高试剂盒的检测灵敏度。这是由于：超支化葡聚糖分子链中带有较多的分支结构，有利于在磁珠表面引入大量且分布均匀的羟基，利用其中的羟基接枝半胱氨酸-门冬酰胺二肽，能够使二肽具有较高的接枝量和接枝均匀性，有利于进一步提高核酸提取的效率，进而提高试剂盒的检测灵敏度。
64.(4)相较于对比例4而言，实施例3两种病毒的检测阳性率明显较高，说明在接枝半胱氨酸和门冬酰胺的过程中，半胱氨酸的巯基以及门冬酰胺的α-氨基和酰胺基上均连接有保护基，有利于提高试剂盒的检测灵敏度。这是由于：半胱氨酸的巯基以及门冬酰胺的α-氨基和酰胺基上所连接的保护基，能防止这些基团在步骤(c)中发生反应，导致每个半胱氨酸上接枝的门冬酰胺过多，影响洗脱效果。
65.(5)相较于对比例5而言，实施例3两种病毒的检测阳性率较高，说明磁珠上两种氨基酸的接枝顺序会影响试剂盒的检测灵敏度。这是由于：当先接枝门冬酰胺再接枝半胱氨酸时，二肽中的游离基团为半胱氨酸中的α-氨基和巯基，前者的pk大于后者，虽然当ph大于半胱氨酸中的α-氨基时，能使氨基不带电，巯基带负电，但在过高的ph下，dna易变性，产生的单链dna柔性较大，不易通过静电斥力洗脱，因而会对核酸提取的收率造成不利影响。
66.(6)相较于对比例6而言，实施例3两种病毒的检测阳性率明显较高，说明相较于将半胱氨酸和门冬氨酸分散接枝到磁珠上而言，依次接枝更有利于提高试剂盒的检测灵敏度。这是由于：本发明通过酯化反应将半胱氨酸接枝到磁珠上，而后通过脱水缩合将门冬氨酸接枝到半胱氨酸上，能够减小两种氨基酸之间的距离，进而在洗脱时，增大巯基与吸附于磁珠上的核酸之间的静电斥力，进一步提高洗脱效果。
67.本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
68.以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。