GLP-1/GCG双受体激动剂多肽及其融合蛋白的制作方法

glp-1/gcg双受体激动剂多肽及其融合蛋白
技术领域
1.本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及glp-1/gcg双受体激动剂多肽、融合蛋白、核酸、构建体、重组细胞、药物组合物以及制药用途。


背景技术：

2.肥胖与ⅱ型糖尿病、高血脂和高血压等有着密切的联系。目前一线治疗二型糖尿病的药物主要作用为降糖，而减重作用非常有限，如何开发出同时具有良好降糖减重效果的药物是该领域当前的研发热点。
3.胰高血糖素样肽-1(glp-1)是一种进食后由肠道l-细胞分泌的多肽激素，能刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，从而稳定餐后血糖的波动。其降低血糖的作用具有葡萄糖浓度依赖性，在调节血糖的同时，大大降低了低血糖的风险。近几年基于glp-1的药物，如利拉鲁肽、度拉鲁肽及索马鲁肽，逐渐在糖尿病药物中占据了非常重要的地位。而glp-1类药物在降低血糖时还有减重的效果，其机理为glp-1作用于胃肠道延缓胃排空和肠道蠕动，以及作用于中枢神经系统抑制食欲等，从而达到减少摄食的目的。此前利拉鲁肽已批准成为减肥药，而其升级产品索马鲁肽(商品名wegovy)减重效果更佳，已于2021年6月获fda批准上市。
4.然而，临床试验证明glp-1受体激动剂的缺点也很明显，主要有以下几个方面：首先，半衰期较短导致注射频率密集，给病人带来不便；其次，减重降糖效果仍有限，仍存在一定未被满足的临床需求。临床前研究表明，胰高血糖素样肽1和胰高血糖素(glp-1/gcg)双受体激动剂表现出了相对于单靶glp-1激动剂更好的减重降糖作用，具有非常大的开发潜力。
5.胃泌酸调节素(oxm)作为一种激活胰高血糖素样肽-1(glp-1)和胰高血糖素(gcg)的双受体激动剂，已有研究证明oxm在动物模型中具有良好的降糖减重作用，明显优于现有glp-1类药物，如利拉鲁肽。但胃泌酸调节素(oxm)存在的一些问题，如稳定性差、受体活性低等，导致其给药剂量大，很难达到控糖减重的最佳效果。


技术实现要素：

6.为解决以上问题，发明人对oxm进行了优化改造，提高了其稳定性，延长了体内半衰期，并提高了受体活性，优化了受体间的平衡，达到了最佳的控糖减重效果。
7.基于上述优化改造结果，本发明所采用的技术方案是：
8.在本发明的第一方面，本发明提出了一种glp-1/gcg双受体激动剂多肽。根据本发明的实施例，所述多肽具有如下所示的氨基酸序列：5’
x1sqgt ftsdy skyld ekx
18
ak x
21
fx
23
ew lx
27
x
28
x
29
x
303’，其中，其中，x1为h或y；x
18
为r，a或k；x
21
为e或d；x
23
为v或i；x
27
为l或i；x
28
为a或e；x
29
为a或g；x
30
为gpssgappps或不存在；当x27为l时，x28为e。
9.根据本发明的实施例，上述多肽还可以进一步具有如下附加技术特征至少之一：
10.根据本发明的实施例，所述多肽具有如下所示的氨基酸序列：5’
x1sqgt ftsdy skyld ekx
18
ak efx
23
ew lx
27
x
28
gx
303’，其中，x1为h或y，x
18
为r，a或k，x
23
为v或i，x
27
为l或i，
x
28
为a或e。
11.根据本发明的实施例，所述多肽具有如下所示的氨基酸序列：hsqgt ftsdy skyld ekx
18
ak efx
23
ew lx
27
x
28
g；
12.其中，x
18
为r，a或k，x
23
为v或i，x
27
为l或i，x
28
为a或e。
13.根据本发明的实施例，所述多肽具有前面所述的氨基酸序列，而且多肽的氨基酸序列中，x23或x27中至少一个为i。
14.根据本发明的实施例，所述多肽具有seq id no:1～5任一所示的氨基酸序列。
15.hsqgt ftsdy skyld ekaak efiew lleg(seq id no:1)。
16.hsqgt ftsdy skyld ekrak efiew liag(seq id no:2)。
17.hsqgt ftsdy skyld ekrak efvew liag(seq id no:3)。
18.hsqgt ftsdy skyld ekkak efiew liag(seq id no:4)。
19.hsqgt ftsdy skyld ekkak efvew liag(seq id no:5)。
20.发明人发现，具有seq id no:1～5所示的氨基酸序列的glp-1/gcg双受体激动剂多肽对glp-1r与gcgr细胞都有较强的体外生物活性作用，同时，体内实验研究结果显示，具有seq id no:1～5所示的氨基酸序列的glp-1/gcg双受体激动剂多肽在控制体重和降低血糖方面效果显著。
21.在本发明的第二方面，本发明提出了一种融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括前面所述的多肽、连接肽以及igg fc片段，所述连接肽设置于所述多肽和igg fc片段的首尾之间。根据本发明实施例的融合蛋白降糖减重效果佳，体内半衰期长，是一种有效的长效减重控糖类药物。
22.根据本发明的实施例，上述融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
23.根据本发明的实施例，所述连接肽的n端与所述多肽的c端相连，所述连接肽的c端与所述igg fc片段的n端相连。
24.根据本发明的实施例，所述连接肽具有seq id no:6-8任一所示的氨基酸序列。
25.ggggsggggsggggs(seq id no:6)。
26.ggggsggggsggggsa(seq id no:7)。
27.ggggsggggs(seq id no:8)。
28.用于本发明的igg fc片段来自人igg1、igg2或igg4的fc区或其突变体。优选来自人igg4的fc区或其突变体。
29.根据本发明的实施例，所述igg fc片段来自人igg4的fc区突变体，其包含以下氨基酸序列：
30.eskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:9)。
31.其中，所述igg4 fc突变体与人igg4野生型的fc相比具有s228p，f234a及l235a三个位点突变(eu编号方式)，这些突变分别对应于seq id no:9中的第10、16位及17位。上述突变可进一步消除igg4 fc的效应功能，如adcc与cdc，以提高融合蛋白的安全性。同时将其
c末端的k447赖氨基酸缺失，避免出现融合蛋白的异质性情况。
32.根据本发明的实施例，所述融合蛋白具有seq id no:10～14任一项所示的氨基酸序列。
33.hsqgtftsdyskyldekaakefiewllegggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:10)。
34.hsqgtftsdyskyldekrakefiewliagggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:11)。
35.hsqgtftsdyskyldekrakefvewliagggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:12)。
36.hsqgtftsdyskyldekkakefiewliagggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:13)。
37.hsqgtftsdyskyldekkakefvewliagggggsggggsggggsaeskygppcppcpapeaaggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:14)。
38.在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白。
39.在本发明的第四方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体携带前面所述的核酸。
40.根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
41.根据本发明的实施例，所述构建体的载体为pxc17.4。
42.在本发明的第五方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞表达前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白。
43.在本发明的第六方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞含有前面所述的构建体或基因组中整合有前面所述的核酸。
44.根据本发明的实施例，上述重组细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
45.根据本发明的实施例，所述重组细胞为cho细胞。
46.在本发明的第七方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白。
47.根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
48.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括药物上可接受的载体。
49.根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括其他抗糖尿病药物，所述其他抗糖尿病药物包括选自胰岛素类、双胍类、磺酰脲类、罗格列酮或匹格列酮、α-葡萄糖苷酶抑制剂以及氨基二肽酶iv抑制剂的至少之一。
50.在本发明的第八方面，本发明提出了一种蛋白制剂。根据本发明的实施例，包括前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白。根据本发明实施例的蛋白制剂是一种有效的长效减重控糖类药物。
51.在本发明的第九方面，本发明提出了前面所述的多肽或前面所述的融合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防代谢疾病。
52.根据本发明的实施例，所述代谢疾病包括选自非酒精性脂肪肝病(nafld)、非酒精性脂肪肝炎(nash)、糖尿病、肥胖症的至少之一。
附图说明
53.图1是根据本发明实施例的糖负荷小鼠给药后不同时间点的血糖浓度-时间曲线；
54.图2是根据本发明实施例的糖负荷小鼠给药后不同时间点的血糖浓度-时间曲线；
55.图3是根据本发明实施例的融合蛋白对dio小鼠糖耐量的影响实验结果图；
56.图4是根据本发明实施例的融合蛋白对dio小鼠体重影响的实验结果图；
57.图5是根据本发明实施例的融合蛋白hec-c70对dio小鼠糖耐量的实验结果图；
58.图6是根据本发明实施例的融合蛋白hec-c70对dio小鼠体重影响的实验结果图；
59.图7是根据本发明实施例的融合蛋白hec-c70对db/db小鼠随机血糖的实验结果图；
60.图8是根据本发明实施例的融合蛋白hec-c70对db/db小鼠体重的影响实验结果图。
具体实施方式
61.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
62.术语定义
63.术语“蛋白质”和“多肽”可互换使用，并且在其最广泛的意义下，是指两个或更多个亚单位氨基酸、氨基酸类似物或肽模拟物的化合物。亚单位可通过肽键连接。在另一实施方案中，亚单位可通过其他键连接，如酯、醚、氨基，等等。蛋白质或多肽必须含有至少两个氨基酸并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有设限。如本文所用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括氨基酸的d和l光学异构体，例如甘氨酸及d和l光学异构体、氨基酸类似物和肽模拟物。
64.本文所述“fc片段”由抗体的铰链区、ch2和ch3恒定区结构组成。抗体包含两个在功能上独立的部分，称为“fab”的与抗原结合的可变结构域和称为“fc”的参与效应物功能(例如补体活化和被吞噬细胞攻击)的恒定结构域。fc具有长的血清半寿期，而fab是短寿的
(capon等，1989，nature 337：525-31)。当与治疗蛋白质连接在一起时，fc结构域可提供较长的半寿期，或者掺入如fc受体结合、蛋白a结合、补体结合或许甚至胎盘转移的这类功能(capon等，1989)。这里所使用的术语“fc”指的是野生型fc序列来自天然抗体(例如,人类igg1，igg2，igg3或igg4)，还包括他们的变体。变体可能包括已经披露的一个或多个氨基酸替换、添加和/或删除。在一些实施例中，所述fc变体具备野生型fc的活性，如与fc受体的结合。
65.本文所述igg4 fc片段的氨基酸编号为根据eu编号系统编号，例如，所述“s228p”是指按eu编号系统编号第228位的丝氨酸被脯氨酸替代；“k447”是指按eu编号系统编号第447位的赖氨酸缺失或不存在。
66.术语“融合蛋白”通常指由两个或更多个蛋白或多肽融合得到的蛋白。编码所述两个或更多个蛋白或多肽的基因或核酸分子可彼此连接而形成融合基因或融合的核酸分子，该融合基因或融合的核酸分子可编码所述融合蛋白。所述融合基因的翻译产生单一多肽，其具有融合前的所述两个或更多个蛋白或多肽中至少一个、甚至每一个的性质。重组融合蛋白通过用于生物学研究或治疗的重组dna技术人工创造。重组融合蛋白是通过融合基因的遗传工程创造的蛋白质。本发明涉及重组融合蛋白，并且术语融合蛋白和重组融合蛋白在本文以相同含义使用。本文描述的融合蛋白通常包含至少两个结构域(a和c)，并且任选地包含第三组分，介于所述两个结构域之间的接头。重组融合蛋白的生成是本领域已知的，并且通常涉及自编码第一蛋白或多肽的cdna序列去除终止密码子，然后通过连接或重叠延伸pcr以符合读框的方式附接第二蛋白的cdna序列。该dna序列然后会由细胞表达成为单一蛋白质。该蛋白质可以经工程化以包括两种原始蛋白质或多肽的完整序列，或仅仅任一的一部分。
67.当形成本发明的融合蛋白时，可以但并非必须使用接头或连接肽。本发明所述富含g的多肽，可以选自(g)3-s(即“gggs”)、(g)4-s(即“ggggs”)和(g)5-s(即“gggggs”)。在一些实施方案中，连接肽包含ggggsggggs(seq id no:8)、ggggsggggsggggs(seq id no:6)或ggggsggggsggggsa(seq id no:7)。本文所述接头是示例性的，本发明接头可以为长得多的接头以及包含其它残基的接头。本发明接头还可为非肽接头。
68.如本文所用，术语“包含”或“包括”通常是指包括所述要素，但不排除其他要素。
69.实施例1glp-1/gcg双受体激动剂多肽的制备方法
70.通过在编码多肽基因的5’端添加sumo标签的基因序列，从而形成融合基因。将该融合基因克隆至原核表达载体，并在大肠杆菌细胞中进行诱导表达。离心收菌体后，超声破碎并离心取上清，然后通过镍柱纯化获得融合蛋白。最后sumo蛋白酶酶切处理后，经反相纯化获得目标多肽。具体过程如下：
71.1.载体构建与引物合成
72.以pet-28a为表达载体，bl21(de3)作为宿主，制备多肽的具体步骤如下：
73.1)设计引物，引物之间互为模板，扩增出多肽基因片段。并以多肽基因片段以及与sumo基因片段为模板，通过融合pcr方法扩增出融合基因片段。
74.2)构建重组表达载体：融合基因片段，克隆至原核表达载体pet-28a中，转化大肠杆菌bl21(de3)，挑选重组子，重组表达质粒样品送至广州艾基生物技术有限公司测序验证。
75.2.表达纯化
76.构建得到的bl21(de3)菌株，于lb中培养，加入终浓度为50μg/ml的卡那霉素(kanamycin)，培养后用iptg诱导表达5h。取离心后的菌体，用平衡缓冲液(20mm tris-hcl，ph8.0，150mm的nacl)溶解，超声仪破碎菌体，离心后上清用于融合蛋白纯化。通过ni-nta亲和层析柱(ge healthcare)纯化，用洗脱缓冲液(20mm tris-hcl，ph8.0，150mm的nacl，200mm咪唑)洗脱得到融合蛋白。
77.3.融合蛋白酶切
78.用平衡缓冲液稀释蛋白液后，按照蛋白量:sumo蛋白酶为50:1的比例加入sumo蛋白酶，室温酶切1.5h。
79.4.多肽的纯化
80.将酶切后所得的多肽溶液，加入终浓度为20％的乙腈。通过粒径8μm的4.6*250mm c8填充柱(纳微unisil 8-120c8 ultra plus 8um 4.6*250mm，苏州纳微科技股份有限公司)。在akta纯化系统进行制备纯化。用20％乙腈/h2o(含20mm tris-hcl，ph8.0)为起始，以梯度(1％/min的速度增加乙腈的比例)，流速为1ml/min，洗脱时间30分钟，收集含有肽的组分。用液质联用分析分离出的产物。所获得的glp-1/gcg双受体激动剂多肽的氨基酸序列以及所对应的多肽样品的样品名称如表1所示。
81.表1
[0082][0083]
实施例2测定多肽的体外活性
[0084]
通过将表达制备的多肽、人源glp-1(seq id no:17，tocris公司，货号为5374(bath:2a)和人源gcg(seq id no:18，诺和诺德公司，诺和生)分别作用于表达glp-1r或gcgr的hek293细胞，具体操作为：
[0085]
1在金唯智公司优化并常规合成基因gcgr和glp-1r，将基因克隆至载体puc57-amp，制备mini-scale重组质粒dna和含有该重组质粒的穿刺菌；
[0086]
2取puc57-gcgr重组质粒dna用hindⅲ与ecor i双酶切，取puc57-glp-1r用hindiii与xhoi双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，用洁净刀片切下目标条带，使用胶回收试剂盒回收目的片段；
[0087]
3目标片段酶切回收产物与载体质粒pcdna3.1片段经t4 ligase连接后转化dh5α感受态细胞，涂布平板分离单菌落，挑取转化子扩培进行酶切验证及测序验证。
[0088]
4接种200ml验证正确的菌液用于质粒大提，使用试剂盒为：purelink hipure plasmid maxiprep kit，按说明书进行操作。质粒经pcr验证及酶切验证无误后，使用pvui
限制性内切酶进行线性化。最后采用乙醇沉淀法回收质粒。
[0089]
5宿主细胞为hek293，转染前一天，将细胞按照2x10^6cells/孔的密度铺6孔板,1ml/孔。使用lipofectamine 3000脂质体转染法将回收的线性化质粒转染至hek293细胞中，加g418筛选得到混合株后，进行有限稀释分离得到单克隆，进行活性检测验证。
[0090]
6用camp检测试剂盒(cisbio，62am6pec)、依据操作说明书所述步骤检测受体细胞所产生camp，具体步骤如下：
[0091]
1)配制assay buffer：取完全培养液(dmem培养基 10％fbs)，再加入4/1000的500mm ibmx母液，camp-d2工作液和anti-camp-crytate工作液按试剂盒说明书进行配制；
[0092]
2)将待测样品及对照样品人源glp-1和gcg，稀释至初始浓度为500nm的母液，然后按20μl加入到80μl assay buffer(稀释5倍)的梯度逐稀释，包括母液共计8个化合物梯度；
[0093]
人glp-1:haegt ftsdv ssyle gqaak efiaw lvkgrg(seq id no:17)
[0094]
人gcg:hsqgt ftsdy skyld srraq dfvqw lmnt(seq id no:18)
[0095]
3)细胞悬液制备：液氮罐中取出细胞hek293-glp-1r及hek293-gcgr后，立即37℃水浴，1.5min内完全融化后，于超净台将细胞逐滴加入至装有8ml温热培养基的15ml离心管中，900rpm离心5min，弃上清，1ml完全培养液将细胞重悬后(吹打15次)，立即取20μl悬液与等体积的台盼蓝混合，取20μl计算活细胞数后，将细胞稀释至4x10^5cells/ml；
[0096]
4)将384孔板划分为glp-1r细胞、gcgr细胞区域，用12道变道可调分液器按每孔5μl将细胞悬液加入相应区域的孔中，再用12道变道可调分液器将供试品和阳性对照品梯度稀释液加入对应细胞的384孔板中，每孔5μl(相同浓度样品平行2个复孔)；阴性对照：10μl assay buffer/每孔，每块384孔板设置3个孔，盖上白色封板膜，放入37℃恒温培养箱，半小时后取出；
[0097]
5)临用前用hi-range试剂盒中lysis buffer将camp-d2工作液和anti-camp-crytate
[0098]
工作液稀释20倍后1:1混合均匀配成camp检测试剂混合溶液，样品组每孔加入10μlcamp检测试剂混合溶液，阴性对照每孔加入5μl lysis buffer和5μl稀释后的anti-camp-crytate工作液，盖上白色盖子，于室温避光放置1h；
[0099]
6)于多功能酶标仪中检测665nm、620nm的荧光值；
[0100]
7)以此建立量效曲线，并计算ec50值、进行相互比较，具体结果如表2所示。
[0101]
表2多肽体外活性测定
[0102]
[0103][0104]
由表2实验结果可知，本发明所获得的glp-1/gcg双受体激动剂多肽都能够分别显著激活glp-1受体细胞与gcg受体细胞。
[0105]
实施例3融合蛋白载体的构建
[0106]
采用分子克隆方法，将glp-1/gcg双受体激动剂多肽与带有连接肽(seq id no:6)的igg4-fc(seq id no:9)进行融合，所得序列经双酶切后，插入到哺乳动物细胞表达载体的相同酶切位点间，构建一系列突变体载体，经测序验证正确后，采用去内毒素的质粒提取试剂盒(omega)提取质粒载体，-20℃保藏。其中载体中的glp-1/gcg双受体激动剂多肽的氨基酸序列以及所对应的多肽样品名称如表1所示。实施例2所构建的包含glp-1/gcg双受体激动剂多肽的融合蛋白的样品名称与实施例1所获得的glp-1/gcg双受体激动剂多肽的样品名称一致。
[0107]
实施例4载体转染及在细胞中表达
[0108]
将中国仓鼠卵巢细胞(cho)复苏后传代培养，至密度约为6*106细胞/ml时收集细胞进行转染，采用expichofectaminetm cho transfection kit(thermofisher scientific)，实施例2所构建载体终浓度为1μg/ml。转染第二天加入增强剂等试剂维持转染细胞的生长。细胞活率降至约80％时收获细胞培养液。
[0109]
实施例5融合蛋白纯化及鉴定
[0110]
将细胞培养液离心收集上层清液，并用0.22μm滤膜过滤除去残余细胞碎片。对收集的细胞培养液采用protein a层析柱进行纯化，收集目标峰，再用阴离子交换层析进一步精纯，蛋白最终用0.02m pbs洗脱收集。样品采用微量核酸蛋白测定仪定量(nanodrop 2000/2000cspectrophotometer)。样品经12％sds-page电泳检测，电泳图谱显示条带单一。通过质谱测定融合蛋白的精确分子量，与理论分子量基本一致。
[0111]
实施例6测定融合蛋白的体外活性
[0112]
通过融合蛋白刺激表达glp-1r或gcgr的hek293细胞，用camp检测试剂盒(cisbio，62am6pec)检测受体细胞所产生的camp，建立量效曲线，计算其ec
50
，结果如表3所示，并进行相互比较。
[0113]
表3融合蛋白体外活性测定
[0114]
[0115][0116]
由表3实验结果可知，本发明所获得的glp-1/gcg双受体激动剂样品能够显著分别激活glp-1受体细胞与gcg受体细胞。
[0117]
实施例7候选物对正常c57bl/6小鼠糖耐量的影响
[0118]
实验方法：正常c57bl/6小鼠按照血糖和体重分为6组(control、dulaglutide-7.5nmol/kg、hec-c80-7.5nmol/kg、hec-c85-7.5nmol/kg、hec-c86-7.5nmol/kg、hec-c87-7.5nmol/kg)，每组6只，皮下注射给予相应溶媒或者候选物，给药后56h动物禁食，给药后72h各组动物腹腔注射2g/kg的葡萄糖，并于给糖前及给糖后15、30、60、90min进行血糖检测。结果见表4。根据不同时间点测定的血糖值绘制血糖浓度-时间曲线如图1所示，计算各剂量组auc
0～90min glu
及血糖峰值时的降糖率。
[0119]
实验结果：
[0120]
表4：融合蛋白对糖负荷小鼠血糖的影响
[0121][0122]
实验结论：hec-c80、hec-c85、hec-c86与hec-c87均可显著降低糖负荷小鼠血糖水平。
[0123]
实施例8候选物对正常c57bl/6小鼠糖耐量的影响
[0124]
实验方法：正常c57bl/6小鼠按照血糖和体重分为3组(control、dulaglutide-7.5nmol/kg、hec-c70-7.5nmol/kg)，每组8只，皮下注射给予相应溶媒或者候选物，给药后56h动物禁食，给药后72h各组动物腹腔注射2g/kg的葡萄糖，并于给糖前及给糖后15、30、60、90min进行血糖检测。结果见表5。根据不同时间点测定的血糖值绘制血糖浓度-时间曲线如图2所示，计算各剂量组auc
0～90min glu
及血糖峰值时的降糖率。
[0125]
实验结果：
[0126]
表5：hec-c70对糖负荷小鼠血糖的影响
[0127][0128]
实验结论：hec-c70可显著降低糖负荷小鼠血糖水平。
[0129]
实施例9候选物对dio小鼠糖耐量和体重的影响
[0130]
实验方法：8周龄c57bl/6小鼠高脂饮食喂养15周后根据体重分为7组(model、semaglutide-5nmol/kg、hec-c70-5nmol/kg、hec-c80-5nmol/kg、hec-c85-5nmol/kg、hec-c86-5nmol/kg、hec-c87-5nmol/kg)。第16周开始给药(模型组给予相应溶媒)，semaglutide每天给药一次，其余各组每周给药两次，共给药4周，每次给药前进行动物体重称量，给药第4周进行ipgtt实验。
[0131]
实验结果：hec-c70-5nmol/kg改善糖耐量作用近似于semaglutide-5nmol/kg。hec-c70-5nmol/kg、hec-c80-5nmol/kg、hec-c85-5nmol/kg、hec-c86-5nmol/kg和hec-c87-5nmol/kg均具有显著的降低dio小鼠体重的作用，且hec-c70-5nmol/kg和hec-c85-5nmol/kg的降体重作用优于semaglutide-5nmol/kg。具体数据见表6、表7及图3、图4。
[0132]
表6：长期给药对糖负荷dio小鼠血糖下降率的影响
[0133][0134]
表7：长期给药对dio小鼠体重的影响
[0135][0136]
实验结论：hec-c70，hec-c80，hec-c85，hec-c86，hec-c87长期给药可显著改善dio小鼠糖耐量并显著降低dio小鼠体重。
[0137]
实施例10候选物对dio小鼠糖耐量和体重的影响
[0138]
实验方法：6周龄c57bl/6n小鼠高脂饮食喂养15周后根据体重分为6组(model、ly3298176-10nmo/kg、semaglutide-10nmol/kg、medi0382-10nmol/kg、hec-c70-2.5nmol/kg、hec-c70-10nmol/kg)。第16周开始给药(模型组给予相应溶媒)，semaglutide和medi0382每天给药一次，其余各组每周给药两次，共给药4周，每次给药前进行动物体重称
量，给药第4周进行ipgtt实验。
[0139]
对照组ly3298176序列：
[0140]
yx1egtftsdysix2ldkiaqkafvqwliaggpssgappps-nh2(seq id no:15)，其中x1与x2为aib，在位置20的k通过其侧链ε-氨基与([2-(2-氨基-乙氧基)-乙氧基]-乙酰基)
2-γglu-co-(ch2)
18-co2h连接。
[0141]
对照组medi0382序列：hsqgtftsdkseyldserardfvawleagg(seq id no:16)，其中在位置10位的k通过其侧链ε-氨基与γglu-co-(ch2)
14-co2h连接。
[0142]
实验结果：hec-c70-10nmol/kg改善糖耐量作用近似于ly3298176-10nmol/kg，优于semaglutide-10nmol/kg和medi0382-10nmol/kg。hec-c70-10nmol/kg具有显著的降低dio小鼠体重的作用，且优于semaglutide-10nmol/kg。具体数据见表8与表9及图5与图6。
[0143]
表8：长期给药对糖负荷dio小鼠血糖下降率的影响
[0144][0145]
表9：长期给药对dio小鼠体重的影响
[0146][0147]
实验结论：hec-c70长期给药可显著改善dio小鼠糖耐量并显著降低dio小鼠体重。
[0148]
实施例11候选物对db/db小鼠血糖和体重的影响
[0149]
实验方法：6-7周龄ob/ob小鼠根据随机血糖和体重分为3组(model、dulaglutide-30nmo/kg、hec-c70-30nmol/kg)。共给药4周(模型组给予相应溶媒)，dulaglutide和hec-c70每周给药两次，给药期间对各组动物随机血糖及体重进行监测。
[0150]
实验结果：hec-c70-30nmol/kg改善糖耐量作用优于dulaglutide-30nmol/kg。hec-c70-30nmol/kg具有显著的降低db/db小鼠体重的作用，且优于dulaglutide-30nmol/kg。具体数据见表10和表11及图7和图8。
[0151]
表10：长期给药对db/db小鼠血糖的影响
[0152][0153]
表11：长期给药对db/db小鼠体重的影响
[0154][0155]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0156]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。