一种利用制备色谱从孕马尿中分离纯化结合雌激素的方法

1.本方法涉及动物药用成分分离纯化技术领域，具体是一种利用制备色谱从孕马尿中分离纯化天然结合雌激素的方法。


背景技术：

2.结合雌激素(conjugated estrogen hormone；conjugated estrogens，简称ce)是对最早从孕马尿(怀孕的母马尿液)中提取的多种天然固醇类水溶性结合态雌激素混合物的统称。临床上主要用于激素替代疗法，以缓解任何因雌激素不足引起的临床症状。它对于治疗妇女更年期综合症和卵巢切除后的常见病有独特疗效，还可以预防和治疗心脏病、老年骨质疏松症，具有激活身体机能、降低循环血脂水平，皮肤抗皱延缓衰老的功效。
3.随着社会的进步和人口的老龄化，越来越多的妇女追求生活的高质量，安全、有效的雌激素类产品。欧洲50％以上，美国30％以上的更年期女性应用激素替代疗法，结合雌激素在全球雌激素补充市场上占有近80％的份额。该产品在世界上已有近70年用药史，英文商品名为premarin，中文名为倍美力。
4.自1942年在美国首次上市以来长盛不衰。尽管有众多的合成雌激素药品，但孕马来源的天然结合雌激素在激素补充疗法中的地位是无以替代的。
5.每升孕马尿中富含雌激素的平均含量为70～130mg，每匹孕马在孕期内可形成雌激素5～100g。孕马尿中含有大量的可溶性杂质，如无机盐、尿素、糖类、黄酮及异黄酮等、酚类及多酚类成分等，这些成分是孕马的代谢产物。同时还含有不可溶性杂质，如尿内存在的不溶性盐类，具体的如已经产生的沉淀及存放过程中产生的沉淀：碳酸钙、碳酸氢钙、磷酸钙、磷酸氢钙等钙盐碳酸盐、草酸盐等。以上这些杂质的干扰会影响雌激素的纯化分离。
6.目前大部分工艺是采用萃取法及沉淀法，极性大孔吸附树脂或离子交换树脂进行分离纯化结合雌激素，目前已有很多相关专利公开树脂纯化方法，但其缺点是大孔树脂机械强度低，容易破碎，回收次数少，工艺不稳定，回收率低，用水量大，污染严重。随着新的技术和材料的开发，孕马尿的分离纯化需要不断优化调整以适应市场需求。
7.鉴于以上技术背景及发展前景，提出本发明。


技术实现要素：

8.本发明的目的在于提供一种从孕马尿中分离纯化结合雌激素的方法，该方法的原理是依靠固定相表面吸附作用，将结构类似的混合物中的组分在固定相中、随着流动相移动的迁移速度不同，从而按一定的次序由固定相中流出，根据色谱图接取目标馏分即可得到高纯度产品。
9.为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：
10.本发明所述的一种利用制备色谱对孕马尿进行分离纯化的方法，采用色谱的分离机理，对结合雌激素使用有机溶剂混合溶液洗脱，收集结合雌激素目标解析液。
11.本发明所述的一种利用制备色谱对孕马尿进行分离纯化结合雌激素的方法，其特
征在于：色谱分离模式所用的填料为极性基团修饰的hc系列耐纯水硅胶填料，采用极性共聚键合技术，其中与硅胶连接的烷基链长度可调节，其范围为c4～c18，键合量为0.8～5.0μmol/m2，对结合雌激素具有很好的富集效果，其粒径为10μm～100μm，孔径为
12.本发明所述的一种利用制备色谱对孕马尿进行分离纯化结合雌激素的方法，其特征在于：作为优选制备色谱条件，孕马尿的上样体积为10～200倍柱体积。
13.作为优选制备色谱条件，分离温度为15～50℃。
14.本发明所述一种利用制备色谱对孕马尿进行分离纯化结合雌激素的方法，其特征在于：依据色谱图收集目标解析液。
15.浓缩干燥后获得结合雌激素产品，没有刺激性气味，利用质谱检测，对标倍美力产品的60个目标成分，含量均符合要求。
16.本发明所述一种利用制备色谱对孕马尿进行分离纯化结合雌激素的方法，具体步骤如下：
17.1)、直接采用孕马尿作为上样溶液；
18.2)、采用柱系统分离，色谱柱内径4.6～1200mm；采用色谱分离纯化体系，所用填料是极性基团修饰的硅胶。其粒径为5μm～100μm，孔径为是极性基团修饰的硅胶。其粒径为5μm～100μm，孔径为比表面积50～800m2/g，形状为不规则形或球形；其中有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯等常用溶剂中的一种或多种，有机溶剂占流动相总体积的1％～90％；流速为0.02～1.0倍柱体积/min；上样量为1～200倍柱体积。依据色谱图收集目标解析液，该方法可以得到无刺激性气味的结合雌激素产品(质谱分析60个目标物均符合含量要求)。
19.本发明具有如下优点：
20.1、本发明利用制备色谱分离纯化手段，采用使用极性基团修饰的硅胶填料，对孕马尿进行纯化制备获得结合雌激素，与传统硅胶和树脂等其他分离工艺对比，具有快速高效的优点；
21.2、采用制备工艺进行分离纯化，富集效果好，产品质量高，无刺激性气味；
22.3、采用制备工艺进行分离纯化，载样量大，回收率高，更易于实现工业化生产；
23.4、采用制备工艺进行分离纯化，溶剂消耗量少，流程简单，重复性好，操作简单可控，易实现自动化，过程稳定。
附图说明
24.图1是实施例1的孕马尿制备谱图；
25.图2是实施例1的纯化前后液相分析谱图。
具体实施方式
26.现结合实例，对本发明做进一步说明。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。实例仅限于说明本发明，本发明不仅限于此。
27.实施例1
28.将孕马尿6升作为上样液，使用c8hc硅胶填料(制备柱规格：50
×
250mm，粒径30μm，
孔径，质量300g，华谱新创科技有限公司)装填的色谱柱，键合量为2.216μmol/m2，色谱柱温度为30℃，用乙醇：水＝30:70洗脱，流速50ml/min，出目标峰后根据峰形曲线收集180～200min馏分，目标解析液馏分浓缩干燥得到结合雌激素产品，收率96.1％，通过质谱检测与倍美力产品对标，60个目标物均符合含量要求。
29.实施例2
30.将孕马尿0.5升作为上样液，使用c18hc硅胶填料(制备柱规格：20
×
250mm，粒径10μm，孔径，质量50g，华谱新创科技有限公司)装填的色谱柱，键合量为2.151μmol/m2，色谱柱温度为25℃，用甲醇：水＝20:80洗脱，流速10ml/min，出目标峰后根据峰形曲线收集190～210min馏分，目标解析液馏分浓缩干燥得到结合雌激素产品，收率93.9％，通过质谱检测与倍美力产品对标，60个目标物均符合含量要求。
31.实施例3
32.将孕马尿500升作为上样液，使用c4hc硅胶填料(制备柱规格：300
×
250mm，粒径10μm，孔径，质量10kg，华谱新创科技有限公司)装填的色谱柱，键合量为2.882μmol/m2，色谱柱温度为30℃，流速2l/min，用乙醇：水＝25:75洗脱，水洗20min，出目标峰后根据峰形曲线收集280～310min馏分，目标解析液采用薄膜浓缩干燥，产品收率91.8％，通过质谱检测与倍美力产品对标，60个目标物均符合含量要求。
33.对比例1
34.与实施例1不同之处在于，以非键合基团修饰的纯硅胶(100～200目)为分离材料，其它条件同实施例1，产品收率56.2％，通过质谱检测其中60个目标成分中25个丢失，有一定刺鼻气味，质谱检测无法达到倍美力产品质量标准。
35.对比例2
36.与实施例1不同之处在于，以大孔树脂为分离材料，其它条件同实施例1，产品收率68.5％，通过质谱检测其中60个目标成分中9个丢失，产品刺鼻气味较大，质谱检测无法达到倍美力产品质量标准。
37.对比例3
38.与实施例1不同之处在于，采用普通的十八烷基硅烷键合硅胶作为分离材料，其它条件同实施例1，产品收率42.8％，通过质谱检测其中60个目标成分中5个丢失，产品有一定刺激性气味，质谱检测无法达到倍美力产品质量标准。