一种用于治疗脓毒症的miRNAs组合物及其应用

一种用于治疗脓毒症的mirnas组合物及其应用
技术领域：
1.本发明属于医药技术领域，涉及7种mirnas构成的组合物，分别为mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p，及其在制备治疗脓毒症的药物中的用途。


背景技术：

2.脓毒症(sepsis)是由微生物感染引起的全身性炎症反应，导致感染的病原微生物主要有细菌、真菌和病毒，感染后通过识别病原体相关的分子模式(pamp)或损伤相关的分子模式(damp)产生大量炎性细胞因子，进一步引发炎症因子风暴，最终通过对内皮，上皮和免疫细胞不可逆转的损伤而发展到急性器官衰竭，具有很高的死亡率，全世界范围每年约有1100万人因脓毒症而死亡。脓毒症具体发病机制复杂，目前针对脓毒症的治疗方法仅局限于一些抗生素药物和手术切除感染部位等，预后效果并不理想，暂无十分有效的治疗方法。
3.mirna是一类长度约为19-25nt的内源性非编码rna。mirna参与基因转录后调控，能够调节细胞和机体的生长，发育，并与人类的疾病相关。本技术通过建立脓毒症细胞模型发现黑色素瘤细胞能够产生诱导型外泌体来对抗脓毒症，而对外泌体的成分分析中证明以mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir7651-5p为主的7种mirnas发挥抵抗脓毒症的主要作用。7种mirnas通过协同影响tnf、nf-κb、cams等通路来影响免疫细胞功能，并稳定内皮细胞功能，减少炎症因子il-6、il-8、tnf-α以及粘附分子的产生，降低炎症因子风暴产生的可能性，对脓毒症环境下的多器官功能具有保护作用。
4.出于安全考量，为了提供肿瘤细胞来源外泌体的替代方法，本技术设计并合成了装载有7种关键mirnas的纳米颗粒作为外泌体模拟物，并分析了它们对内皮细胞、巨噬细胞及动物模型的影响。基于ha-pei的纳米颗粒被用作mirnas的递送系统，因为它们靶向cd44阳性细胞(巨噬细胞和内皮细胞高度表达cd44，一种细胞表面糖蛋白和ha受体)，无免疫原性，并且可生物降解。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于治疗脓毒症的mirnas组合物，包括mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir7651-5p及其应用。
6.本发明提供的技术方案之一，是一种mirnas组合物，所述组合物包括：mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p；
7.进一步地，所述mirnas组合物中，mir-146a-5p、mir-466i-5p、mir-206-3p、mir-690、mir-6239、mir-615-5p与mir-7651-5p的重量比为：1-12：2-6：1-5：3-8：1-3：1-6：1-7；
8.优选地，所述mir-146a-5p、mir-466i-5p、mir-206-3p、mir-690、mir-6239、mir-615-5p与mir-7651-5p的重量比为：6：2：2：4：1：1：1；
9.所述mir-146a-5p，具有seq id no.1所示的核苷酸序列；
10.所述mir-466i-5p，具有seq id no.2所示的核苷酸序列；
11.所述mir-206-3p，具有seq id no.3所示的核苷酸序列；
12.所述mir-690，具有seq id no.4所示的核苷酸序列；
13.所述mir-6239，具有seq id no.5所示的核苷酸序列；
14.所述mir-615-5p，具有seq id no.6所示的核苷酸序列；
15.所述mir-7651-5p，具有seq id no.7所示的核苷酸序列；
16.进一步地，所述mir-146a-5p的互补序列，具有seq id no.8所示的核苷酸序列；
17.进一步地，所述mir-466i-5p的互补序列，具有seq id no.9所示的核苷酸序列；
18.进一步地，所述mir-206-3p的互补序列，具有seq id no.10所示的核苷酸序列；
19.进一步地，所述mir-690的互补序列，具有seq id no.11所示的核苷酸序列；
20.进一步地，所述mir-6239的互补序列，具有seq id no.12所示的核苷酸序列；
21.进一步地，所述mir-615-5p的互补序列，具有seq id no.13所示的核苷酸序列；
22.进一步地，所述mir-7651-5p的互补序列，具有seq id no.14所示的核苷酸序列。
23.本发明提供的技术方案之二，是上述含有mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p的mirnas组合物的应用；
24.进一步地，所述应用是所述mirnas组合物在自身免疫性疾病中的应用，以及在制备预防或治疗炎症因子风暴相关疾病中的应用，特别是在制备治疗脓毒症的药物中的应用。
25.本发明提供的技术方案之三，是含有上述技术方案一所述mirnas组合物的的纳米颗粒，所述纳米颗粒的组成包括：ha-pei聚合物，mirnas组合物，溶剂；
26.进一步地，所述的纳米颗粒，包括如下重量份数的组分：0.1-5份mirnas组合物，20-35份ha-pei，5-20份溶剂；
27.优选地，所述的纳米颗粒，包括如下重量份数的组分：1份mirnas组合物，27份ha-pei，11份溶剂；
28.进一步地，所述ha-pei聚合物的制备方法如下：
29.将100mg ha(透明质酸)溶解在10ml 1m nacl中；将50mg edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和50mg nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)溶解在蒸馏水中后，加入到上述ha溶液中，并在室温下反应30分钟。随后，向混合物溶液中加入15mg pei(聚乙烯亚胺)，并在室温下连续搅拌下反应12小时。将反应后的混合物置于透析膜内，用1m nacl透析6小时，然后用去离子水透析18小时获得纯化的ha-pei纳米颗。将纯化的ha-pei纳米颗粒冷冻干燥48小时，并储存于-20℃。
30.进一步地，所述溶剂包括但不限于pbs、生理盐水、去离子水等；
31.进一步地，所述mirnas组合物中，mir-146a-5p、mir-466i-5p、mir-206-3p、mir-690、mir-6239、mir-615-5p与mir-7651-5p的重量比为：1-12：2-6：1-5：3-8：1-3：1-6：1-7；
32.优选地，所述mir-146a-5p、mir-466i-5p、mir-206-3p、mir-690、mir-6239、mir-615-5p与mir-7651-5p的重量比为：6：2：2：4：1：1：1；
33.更进一步地，上述纳米颗粒中添加的mirna，可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子；所述单链核酸分子是根据seq id no.1-seq id no.7中的核苷酸序列合成的核酸分子；所述双链核酸分子是分别根据seq id no.1-seq id no.7中的核苷酸序列及其互
补序列seq id no.8-seq id no.14合成的双链核酸分子。
34.本发明提供的技术方案之四，是技术方案三所述纳米颗粒的应用，所述纳米颗粒可通过多种通路保护内皮细胞、抑制炎性反应、平衡机体免疫功能，从而用于制备抵抗炎症因子风暴或治疗脓毒症的药物。
35.本发明的有益效果：
36.本发明筛选出的mirnas(mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p)有良好的保护内皮细胞、抑制炎性反应的活性，将上述mirnas组合物在机体中应用，可作为抵抗炎症因子风暴或治疗自身免疫性疾病、脓毒症的药物组合物。
37.本发明提供了一种含有mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p组合物的纳米颗粒，为脓毒症、免疫亢进等治疗药物或核酸药物的开发提供新的研究方向和研发基础。
38.本发明公开的mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p，协同影响tnf、nf-κb、cams等多种通路减少炎症因子il-6、il-8、tnf-α以及粘附分子的产生，降低炎症因子风暴产生的可能性，对脓毒症环境下的多器官功能具有保护作用。可以为炎症相关的研究提供机制支持，为相关药物的研发提供更广阔的空间。
附图说明：
39.图1为诱导型外泌体与对照外泌体之间差异表达的mirnas的火山图。
40.图2为mirnas组合物在诱导型外泌体中的天然占比及其共调控的通路分析。其中：
41.图2a为诱导型外泌体中7种mirnas的占比；
42.图2b为根据7种mirnas的占比对调控的通路进行加权分析的网络图。
43.图3为纳米颗粒包裹mirnas组合物示意图及电镜图。其中：
44.图3a为纳米颗粒包裹mirnas组合物的示意图；
45.图3b为含有mirnas组合物的纳米颗粒电镜图。
46.图4为含有不同配比mirnas组合物的纳米颗粒的活性验证。其中：
47.图4a为huvec细胞cck8活性检测；
48.图4b为纳米颗粒治疗后huvec细胞炎症模型中的il-6(上图)和il-8(下图)水平；图4c为纳米颗粒治疗后raw264.7细胞炎症模型中的tnf-α(上图)和il-6(下图)水平。
49.图5为含有mirnas组合物的纳米颗粒在脓毒症小鼠模型的验证。其中：
50.图5a为纳米颗粒治疗后脓毒症模型小鼠的存活率；
51.图5b为lps诱导的脓毒症模型小鼠代表性样本的病理性肝、肾和肺损伤评分；
52.图5c为纳米颗粒治疗后脓毒症模型小鼠血清中的il-6(左图)和tnf-α(右图)水平。
53.图6为cii纳米颗粒或单一mirna治疗后脓毒症模型小鼠的存活率。
具体实施方式
54.下面将结合实施例及附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施
例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
55.下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。
56.在本发明中，mir代表mirna；本发明使用的mirna是根据序列进行人工合成所获得的；本发明实施例中所使用的mirnas组合物或纳米颗粒中添加的mirna是双链核酸分子，所述双链核酸分子是分别根据seq id no.1-seq id no.7中的核苷酸序列及其互补序列seq id no.8-seq id no.14合成的双链核酸分子。
57.附图中**及##代表p《0.01，#代表p《0.05，n.s代表无显著性；显著性标识下的横线代表横线两端所对应分组的显著性比较；折线图中的显著性标识代表与模型组相比较所具有的显著性。
58.实施例1：mirna的筛选和鉴定
59.1、lps诱导细胞产生功能性外泌体
60.为避免外源性外泌体带来的影响，通过超速离心除去血清中的外泌体。超速离心专用管预先用75％乙醇浸泡12h灭菌，敞盖置于超净工作台中挥发干燥待用。将胎牛血清分装置于无菌超速离心管中，配平，超速离心机4℃，120000
×
g，离心12h，贴底白色沉淀即为血清中外泌体。在超净工作台中小心保留上清，可用0.22μm滤膜过滤避免引入菌种污染。后续实验所有需要提取外泌体的细胞培养过程均使用无外泌体血清配制完全培养基。
61.待黑色素瘤细胞b16-f10在含10％fbs的dmem培养基中复苏培养至细胞生长状态良好，细胞密度为30％时，加入lps至终浓度为1μg/ml，静置于37℃、5％co2培养箱继续培养细胞48h后，收集细胞培养上清，通过超速离心法提取诱导的功能性外泌体(iexo)。对照组加入与lps相同体积pbs，维持相同条件培养48h收集细胞上清，通过超速离心法提取普通外泌体(nexo)。
62.2、超速离心法提取外泌体
63.收集细胞培养上清于50ml离心管中，离心机4℃预冷，300
×
g，10min，弃去沉淀的细胞，保留上清；2000
×
g，10min，弃去沉淀的残留死细胞，保留上清；10000
×
g，30min离心，除去沉淀的细胞碎片，上清用0.22μm滤膜过滤；收集至超速离心管中，每管液体需保证至少达到3/4离心管体积，配平，设置超速离心机4℃预冷，100000
×
g，70min离心沉淀为外泌体，小心分离上清，内含细胞因子，保留沉淀；加入pbs至超速离心管3/4体积，重悬外泌体，100000
×
g超速离心70min弃上清。取50μl pbs重悬外泌体，分装冻存于-80℃备用。
64.通过盲肠结扎穿孔(clp)建立小鼠脓毒症模型，分别采用上述制备的iexo、nexo进行给药，结果显示iexo处理组小鼠生存率(66.67％)显著提高，而nexo组(33.33％)与模型组(pbs组，16.67％)无显著差异。相比于nexo组，iexo治疗组有效抑制了肠道化脓性病变，无明显腹腔积液，各器官都得到了一定程度的保护。
65.基于此，发明人针对上述制备的iexo、nexo的mirna进行提取、鉴定和分析。
66.3.rna提取和质量检测
67.利用trizol(赛默飞，美国)法提取上述收集的外泌体样品的总rna。用琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整度，电泳显示28s和18s条带清晰，无降解；用超微量分光光度计(天根，背景)检测rna的浓度和纯度，od260/280值在1.8～2.2之间，od260/230≥2.0，表明rna纯度
合格。rna样品浓度≥200ng/μl，总量≥2μg。rna初步检测质量合格，以保证下游高质量small rna-seq文库的构建。进行进一步质控和mirna测序。
68.4.文库构建：
69.检验合格的rna用于构建mirna文库，取适量总rna进行接头连接反应，利用成熟mirna的5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，这一区别于其他rna的结构，在t4 rna连接酶2和t4 rna连接酶的作用下，在两端加上已知序列的3’接头和5’接头。对于已连接5’和3’接头的rna，利用与接头上序列互补的逆转录合成第一链的cdna。以上一步反应产物作为模板，利用pcr合成、扩增mirna的双链文库。利用聚丙烯酰氨凝胶电泳来分离插入片段大小在22-24nt的mirna文库。对构建好的测序文库进行质检和定量评估是否适合上机。
70.5.上机测序
71.对于质检合格的样品经过稀释后，根据不同样品测序通量要求，按相应比例对样品进行上机。采用illumina高通量测序平台，双端测序策略对文库进行测序。
72.6.生物信息分析
73.为了保证信息分析质量，对测序得到的原始测序序列(raw reads)进行过滤，得到clean reads用于后续分析。利用fastx-toolkit软件进行质量过滤。对质控后的序列进行小rna长度分布统计，mirna集中在21nt或22nt。此外，将质控后的序列与mirbase数据库中对应物种的成熟mirna序列进行blast比对，以及与rfam数据库和参考基因组比对，以便对测序结果进行初步评价。对不同类型small rna分类注释结果。
74.将log2fc》1且pvalue《0.05作为筛选条件，经过比对获得的7种mirnas是iexo相对于nexo高丰度且具有显著性差异的mirna，分别为mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p，图1所示。图1为诱导型外泌体与对照外泌体之间差异表达的mirnas的火山图，横坐标代表iexo相对于nexo所检测到的mirna的相对变化倍数，纵坐标代表iexo相对于nexo所检测到的mirna的p值，图中的原点代表nexo和iexo中所有检测到的mirnas，图中右侧方框区域内为根据上述筛选条件，而获得的7种mirnas。
75.根据上述筛选所获得的7种mirnas，人工合成了其双链核酸分子，其成熟序列分别如序列表seq id no.1～no.7所示，其互补序列分别如序列表seq id no.8～no.14所示。
76.seq id no.1(mir-146a-5p成熟序列)：ugagaacugaauuccauggguu(22bp)。
77.seq id no.2(mir-466i-5p成熟序列)：ugugugugugugugugugug(20bp)。
78.seq id no.3(mir-206-3p成熟序列)：uggaauguaaggaagugugugg(22bp)。
79.seq id no.4(mir-690成熟序列)：aaaggcuaggcucacaaccaaa(22bp)。
80.seq id no.5(mir-6239成熟序列)：uagcguuggaucacucggug(20bp)。
81.seq id no.6(mir-615-5p成熟序列)：ggggguccccggugcucggauc(22bp)。
82.seq id no.7(mir-7651-5p成熟序列)：aaguggaaagccagccugagau(22bp)。
83.实施例2含有mirnas组合物的纳米颗粒的制备
84.mirnas组合物的配方设置为ci，cii，ciii，civ和cv五组，各组配方均如下：27份ha
–
pei，1份mirnas组合物，11份溶剂；
85.ci，cii，ciii，civ和cv的区别在于7种mirnas的比例不同：
86.ci：根据iexo的测序结果分析了7种mirnas在iexo中的配比，mir-146a-5p：mir-466i-5p：mir-206-3p：mir-690：mir-6239：mir-615-5p：mir-7651-5p为6：2：2：4：1：1：1(图
2a)，将含有与上述比例相同的mirnas的纳米颗粒称为组分i(ci)。
87.cii：比例与ci相同，使用时剂量翻倍称为cii组。
88.ciii：根据mirnas调控网络(图2b)，在内皮相关功能的研究中，调节cam途径的四种mirnas：mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-7651-5p以3倍重量比定量，而余下的三种mirnas：mir-146a-5p，mir-6239，mir-615-5p以1倍重量比定量。
89.civ：根据mirnas调控网络(图2b)，在免疫相关功能的评估中，调节nf-κb通路的五种mirnas：mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-690，mir-615-5p，mir-7651-5p以3倍重量比定量，mir-206-3p，mir-6239以1倍重量比定量。
90.cv：根据mirnas调控网络(图2b)，对7种mirnas调控的通路数量按重量比进行定量称为cv。
91.ci，cii，ciii，civ和cv中，7种mirnas：mir-146a-5p：mir-466i-5p：mir-206-3p：mir-690：mir-6239：mir-615-5p：mir-7651-5p的具体重量配比如下：
92.ci:6:2:2:4:1:1:1；
93.cii:6:2:2:4:1:1:1；
94.ciii:1:3:3:3:1:1:3；
95.civ:3:3:1:3:1:3:3；
96.cv:4:6:5:6:3:6:7。
97.根据上述配方，按照如下方法进行配置：
98.在试管中将ha(100mg)溶解在10ml 1m nacl中。将50mg edc和50mg nhs溶解在蒸馏水中后，加入到上述ha溶液中，并在室温下反应30分钟。随后，向混合物溶液中加入15mg pei，并在室温下连续搅拌下反应12小时。将反应后的混合物置于透析膜(solarbio，中国)内，用1m nacl透析6小时，然后用去离子水透析18小时获得纯化的ha-pei纳米颗。然后使用冷冻干燥机将纯化的ha-pei纳米颗粒冷冻干燥48小时，并储存于-20℃。
99.mirnas被包裹在ha
–
pei纳米颗粒中：按ha
–
pei：mirnas组合物：pbs质量比＝27：1：11制备。预先将mirnas按ci，cii，ciii，civ和cv五组不同比例混合，并按上述质量比称取ha
–
pei和mirnas组合物，将ha-pei纳米颗粒溶解在pbs(ph＝7.4)中(浓度为3mg/ml)取9ml，并加入2ml(浓度为0.5mg/ml,溶剂为pbs)mirnas溶液。然后将混合物在室温下搅拌20分钟即制备完成，示意图见图3a，包裹mirnas后的电镜图见图3b。
100.实施例3含有mirnas组合物的纳米颗粒可以抑制lps诱导的炎症反应1.cck8实验
101.1)细胞样品的制备
102.人类脐静脉内皮细胞(huvec细胞)培养在添加10％的胎牛血清(bi，以色列)和100u/ml的青霉素链霉素混合液(美仑，中国)的dmem(gibco，美国)中，并在37℃，5％浓度的co2培养箱中生长；
103.向上述经过培养的huvec细胞中通过lipo2000转染试剂(赛默飞，美国)向每孔(96孔板)中加入占总体积5％的炎症血清的同时转染ci-cv纳米颗粒(实施例2制备)及iexo(实施例1制备)，刺激24h后进行cck8检测。具体如下：
104.对照组：(1)ctrl组：上述人类脐静脉内皮细胞(huvec细胞)正常培养不做任何处理(无炎症血清刺激)；
105.(2)c-np组：ctrl组加入纳米颗粒空载(无炎症血清刺激)；
106.纳米颗粒空载：采用实施例2制备的纳米颗粒的方法，不含有mirnas组合物，其余均相同，即将纳米颗粒空载按照ha
–
pei：pbs质量比＝27：11制备；
107.模型组(炎症血清刺激组，np)：c-np组基础上加入占总体积5％的炎症血清刺激；
108.实验组(5％炎症血清 ci-cv纳米颗粒、iexo组)：ctrl组基础上加入占总体积5％的炎症血清刺激的同时分别转染ci、cii、ciii、civ、cv纳米颗粒或iexo。
109.转染说明：以96孔板为例，其他培养材料参考说明书转染规模调整，所有数量和体积均是按每孔计算。细胞接种于100μl不含抗生素的培养基中，使其在转染时长至70％融合，弃掉培养基。转染时，每孔细胞用量如下：向45μlopti-mem培养基中加入含有mirnas总量为0.25pmol的纳米颗粒(c-np组、模型组加入纳米颗粒空载89.1ng，ci、ciii、civ、cv组mirnas总量为0.25pmol，cii组mirnas总量为0.5pmol)或0.1μg iexo，轻轻混匀。取0.25μl lipo2000在50μl opti-mem培养基中稀释，室温孵育5分钟。将前两步溶液混合(使总体积约为95μl)，轻轻混匀，室温放置20分钟后加入5μl的炎症血清(对照组无炎症血清刺激)，形成100μl的混合溶液。在每孔细胞中加入上述溶液，轻轻摇匀。
110.2)细胞活力检测
111.利用cell counting kit-8(cck-8)(apexbio，美国)进行细胞活力的检测。
112.向上述经过刺激24h时的96孔板的每个孔中加入10μl cck-8溶液。将培养板放在培养箱中孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。细胞增殖越多，颜色越深；细胞毒性越强，颜色越浅。
113.由图4a可知，空载纳米颗粒并不会对细胞活力产生影响，模型组5％炎症血清刺激显著降低了huvec细胞的细胞活力，降低了huvec细胞的存活率。相比于模型组，大部分实验组都一定程度提高了细胞活力，进一步来看，cii、cv纳米颗粒能够明显改善5％炎症血清引发的huvec细胞的活力下降。
114.2.elisa法检测il-6/il-8基因表达(huvec细胞)
115.收集步骤1-1)经过刺激24h时的各组的细胞上清液，使用elisa试剂盒(proteintech，中国)，按elisa试剂盒说明要求测量细胞上清液中的il-6和il-8水平，结果如图4b。
116.如图可知，与模型组相比，各实验组中的il-6/il-8均有一定程度的降低，其中cii、cv组与模型组相比差异更为显著，具有更强的抗炎活性。
117.3.elisa法检测il-6/tnf-α基因表达(raw264.7细胞)
118.将步骤1-1)中的huvec细胞替换为raw264.7细胞，5％炎症血清替换为终浓度1μg/ml lps，其余设置不变。
119.收集经过刺激24h时的各组的细胞上清液，使用elisa试剂盒(proteintech，中国)，按elisa试剂盒说明要求测量细胞上清液中的il-6和tnf-α水平，结果如图4c。
120.如图可知，与模型组相比，各实验组中的il-6/tnf-α均有一定程度的降低，其中cii、cv组与模型组相比差异更为显著，具有更强的抗炎活性。
121.实施例4ci-cv纳米颗粒可以有效抑制lps诱导的脓毒症反应
122.1、小鼠脓毒症模型的建立
123.将c57bl/6小鼠(雌性，6-8周)随机分组，每组n＝6。试验样品为实施例2制备的ci-cv纳米颗粒。
124.对照组小鼠腹腔注射200μl的生理盐水。
125.模型组小鼠腹腔注射30mg/kg lps(按小鼠体重每kg小鼠的lps注射量为30mg)的同时注射6.6mg的纳米颗粒空载(采用实施例2制备的纳米颗粒方法，不含有mirnas组合物，其余相同)。
126.实验组小鼠腹腔注射30mg/kg lps后，分别注射ci(3.1mg)，cii(6.2mg)，ciii(3.1mg)，civ(3.1mg)，cv(3.1mg)的纳米颗粒(实施例2制备)或50μg iexo，观察和记录6天内的小鼠存活情况(图5a)。
127.由图5a脓毒症模型小鼠生存曲线分析可知，模型组小鼠在48小时内全部死亡，存活率为0。各实验组小鼠存活率均高于模型组。使用ci，ciii，civ，cv治疗后的小鼠144h存活率分别为33.3％，33.3％，50％，50％，这4种纳米颗粒治疗组与模型组相比具有显著性差异(p《0.05)。进一步来看，在所有实验组中cii组小鼠的存活率最高，总共死亡两只小鼠，存活率为66.7％，且与模型组相比具有极显著差异(p《0.01)，表明对于降低脓毒症小鼠模型死亡率方面，cii组是5种配比中最优的一组。
128.2、he染色
129.6天后处死小鼠，用福尔马林固定上述不同分组小鼠的肺、肝脏以及肾脏组织。按照标准程序，将组织脱水并包埋在石蜡中。获取4μm厚的切片，使用苏木素伊红(he)染色试剂盒(索莱宝，北京)染色。
130.苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining)，简称he染色法，是病理学常规制片中最基本的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
131.石蜡切片于二甲苯中脱蜡2次，每次5-10min。梯度乙醇(100％、95％、85％、75％)复水，每梯度3min。蒸馏水2min。苏木素染液染色2-20min(具体时间根据染色结果和实验要求调整)，蒸馏水洗去浮色。分化液分化3min，自来水冲洗2次，每次2min。置于伊红染液30s-2min，蒸馏水洗2-3s，快速脱水。梯度乙醇(75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和100％乙醇)各浸洗2-3s。100％乙醇浸洗1min，二甲苯透明两次，每次1min，中性树胶封片，镜下观察。
132.对h&e染色结果进行评估。多器官损伤表现包括肺泡隔增厚、肾小管上皮细胞肿胀、炎性细胞浸润、肝细胞肿胀、局灶性坏死和弥漫性凝血。损伤区域分为0级(正常)、1级(小于25％)损伤、2级(25％-50％)损伤、3级(50％-75％)损伤、4级(75％-90％)损伤和5级(大于90％)损伤，统计结果如图5b所示(control组结果0)。
133.对照组对应图5中的ctrl组。
134.模型组对应图5中的np组。
135.实验组对应图5中的：ci、cii、ciii、civ、cv和iexo组。
136.根据染色结果结果发现，组织切片可观察到模型组肾区多见弥散性出血、肾小球肿胀、肾小管细胞损伤等；肺泡壁增厚、炎性细胞浸润及肺气肿；肝组织切片可见肝细胞肿胀，胞浆疏松，炎性细胞浸润、偶见点状坏死。相较于模型组，各实验组的脏器损伤均有一定程度的改善。而cii和cv组相对于模型组，能够显著改善炎性细胞浸润、局灶性坏死和弥漫性凝血等脓毒症导致的脏器损伤，对脓毒症环境下的多器官功能具有保护作用。
137.3.elisa法检测il-6/tnf-α基因表达
138.使用elisa试剂盒(proteintech，中国)，按试剂盒说明说明要求测量上述不同分
组第6天时小鼠血清中的il-6和tnf-α水平，结果如图5c，相较于模型组，各实验组的il-6/tnf-α水平均有一定程度的降低。进一步来看，cii和cv组相对于模型组具有显著差异，其中cii组与iexo的水平相当。
139.综合来看，各实验组均有一定程度改善脓毒症的效果。其中，cii和cv组相较于模型组在组织中显著减轻了脓毒症导致的器官损伤和免疫浸润，同时在血液中降低了il-6和tnf-α炎症因子水平。进一步比较，在这两者之间，cii纳米颗粒显示出优于cv纳米颗粒的治疗效果。这些数据表明，在临床相关的脓毒症小鼠模型中，cii纳米颗粒是诱导型外泌体的可行替代物，可用于减少脓毒症死亡和改善多器官损伤。
140.实施例5cii纳米颗粒与单一mirna治疗lps诱导的脓毒症
141.(1)按如下配方制备纳米颗粒：
142.mir-146a-5p纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-146a-5p，11份pbs溶剂；
143.mir-466i-5p纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-466i-5p，11份pbs溶剂；
144.mir-206-3p纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-206-3p，11份pbs溶剂；
145.mir-690纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-690，11份pbs溶剂；
146.mir-6239纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-6239，11份pbs溶剂；mir-615-5p纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-615-5p，11份pbs溶剂；
147.mir-7651-5p纳米颗粒：27份ha
–
pei，1份mir-7651-5p，11份pbs溶剂；
148.根据上述配方，按照如下方法进行配置：
149.在试管中将ha(100mg)溶解在10ml 1m nacl中。将50mg edc和50mg nhs溶解在蒸馏水中后，加入到上述ha溶液中，并在室温下反应30分钟。随后，向混合物溶液中加入15mg pei，并在室温下连续搅拌下反应12小时。将反应后的混合物置于透析膜(solarbio，中国)内，用1m nacl透析6小时，然后用去离子水透析18小时获得纯化的ha-pei纳米颗。然后使用冷冻干燥机将纯化的ha-pei纳米颗粒冷冻干燥48小时，并储存于-20℃。
150.mirna被包裹在ha
–
pei纳米颗粒中：按ha
–
pei：mirna：pbs质量比＝27：1：11制备。按上述质量比称取ha
–
pei和各mirna，将ha-pei纳米颗粒溶解在pbs(ph＝7.4)中(浓度为3mg/ml)取9ml，并加入2ml mirna浓度为0.5mg/ml的pbs溶液。然后将混合物在室温下搅拌20分钟即制备完成。
151.(2)治疗lps诱导的脓毒症
152.将c57bl/6小鼠(雌性，6-8周)随机分组，每组n＝6。
153.对照组小鼠腹腔注射200μl的生理盐水。
154.模型组小鼠腹腔注射30mg/kg lps(按小鼠体重每kg小鼠的lps注射量为30mg)的同时注射6.6mg的纳米颗粒空载(采用实施例2制备的纳米颗粒方法，不含有mirnas组合物，其余相同)。
155.实验组小鼠腹腔注射30mg/kg lps后，分别注射cii纳米颗粒(6.2mg，实施例2制备)或分别含有mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-206-3p，mir-690，mir-6239，mir-615-5p，mir-7651-5p的纳米颗粒(6.2mg，步骤(1)制备)，观察和记录6天内的小鼠存活情况(图6)。
156.由图6脓毒症模型小鼠生存曲线分析可知，模型组小鼠在48小时内全部死亡，存活率为0。使用mir-146a-5p，mir-466i-5p，mir-6239，mir-7651-5p治疗后的小鼠在144h时，存活率分别为50％，50％，33.3％，33.3％，这4种mirna治疗组与模型组相比具有显著性差异
(p《0.05)。而使用mir-206-3p，mir-690，mir-615-5p治疗后的小鼠144h时，存活率均为16.7％，这3种mirna治疗组与模型组相比差异不显著(n.s)。进一步来看，在所有实验组中cii组小鼠的存活率最高，仅在48h时死亡一只小鼠，存活率为83.3％，且与模型组相比具有极显著差异(p《0.01)，表明cii纳米颗粒优于使用单一mirna治疗lps诱导的脓毒症。
157.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。