抗Dsg1抗体及其应用

抗dsg1抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及抗dsg1抗体，特别是fc-fcγr相互作用减弱或增强的抗dsg1抗体、其药物组合物及应用。


背景技术：

2.天疱疮是一种严重的慢性、复发性自身免疫性皮肤病。虽然发病率不高(0.5～3.2/100000人)，但患者非常痛苦，而且死亡率很高，在没有使用类固醇的年代，天疱疮的死亡率高达8成，被称为最严重的皮肤病之一。自身抗体识别组织器官中的特定抗原并破坏组织器官正常生理功能是天疱疮和多种其它自身免疫疾病的一个共同特点，同时也是自身免疫疾病发病的关键因素。
3.落叶型天疱疮病人存在识别表皮上层桥粒芯糖蛋白1(dsg1)的自身抗体。落叶型天疱疮的靶抗原dsg1是桥粒的重要组成部分，在维持细胞间的连接以及表皮的正常结构中发挥一定的作用。dsg1主要分布在表皮上层，当自身抗体结合并破坏角质形成细胞表面的dsg1时，细胞间粘附丧失，从而在角质层下或颗粒层出现棘层松解现象，患者表现为水疱表浅、尼氏征多为阳性，病理上出现典型的表皮内上层裂隙，直接免疫荧光表现为表皮上层细胞间igg强阳性沉积。
4.目前尚无dsg1人源化小鼠，几乎所有关于落叶型天疱疮抗体致病性的体内研究结果均来自新生鼠模型，新生鼠模型存在以下缺陷：1)落叶型天疱疮好发于中老年人，与新生鼠在年龄上不一致；2)该病在患者体内一般为慢性过程，而被动转移抗体给新生鼠诱导的为急性模型，新生鼠存活时间有限，不能在该模型上重现落叶型天疱疮的整个病程，比如观察复发；3)不适用于药物疗效检测；4)新生鼠的免疫系统不完善，不能完整的反映患者免疫应答情况。因此，迫切需要一个更成熟的模型来研究落叶型天疱疮。
5.对以完全不同的方式发挥功能的封闭性(抗pd1-pdl1抗体)和激动性抗体(抗cd40抗体)的研究，揭示了小鼠和人igg亚型以及fc-fcγr相互作用对这些抗体活性的关键影响。但是，目前尚不清楚致病性抗dsg1抗体介导的自身免疫性疾病是否受到igg亚型和fc-fcγr相互作用的影响。研究igg亚型和fc-fcγr相互作用是否以及如何影响自身抗体的致病性有助于了解自身抗体的作用方式和疾病发病机制并开发治疗性药物。


技术实现要素：

6.本发明第一方面提供抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，所述抗dsg1抗体变体含有：(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-6、seq id no:7-12、seq id no:13-18、seq id no:19-24、seq id no:25-30和seq id no:31-36，和(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于或小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
7.在一个或多个实施方案中，所述抗dsg1抗体变体含有：(1)lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中，所述hcdr1含有seq id no:1-6中的任一条序列，所述hcdr2含
有seq id no:7-12中的任一条序列，所述hcdr3含有seq id no:13-18中的任一条序列，所述lcdr1含有seq id no:19-24中的任一条序列，所述lcdr2含有seq id no:25-30中的任一条序列，所述lcdr3含有seq id no:31-36中的任一条序列，和(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于或小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
8.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2和如seq id no:13所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:25所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3。
9.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2和如seq id no:14所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:20所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:32所示的lcdr3。
10.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:3所示的hcdr1、如seq id no:9所示的hcdr2和如seq id no:15所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:21所示的lcdr1、如seq id no:27所示的lcdr2和如seq id no:33所示的lcdr3。
11.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:4所示的hcdr1、如seq id no:10所示的hcdr2和如seq id no:16所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:22所示的lcdr1、如seq id no:28所示的lcdr2和如seq id no:34所示的lcdr3。
12.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:5所示的hcdr1、如seq id no:11所示的hcdr2和如seq id no:17所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:23所示的lcdr1、如seq id no:29所示的lcdr2和如seq id no:35所示的lcdr3。
13.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:6所示的hcdr1、如seq id no:12所示的hcdr2和如seq id no:18所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:24所示的lcdr1、如seq id no:30所示的lcdr2和如seq id no:36所示的lcdr3。
14.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。
15.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变。
16.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的轻链恒定区如seq id no:51-54中任一所示。
17.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:37-42中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或所述抗体变体的vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:43-48中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体变体的vh的fr区为选自seq id no:37-42的任一vh的fr区，和vl的fr区为选自seq id no:43-48的任一vl的fr区。
18.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-42
中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-48中任一所示。优选地，抗体变体的vh如seq id no:37所示，vl如seq id no:43所示；抗体变体的vh如seq id no:38所示，vl如seq id no:44所示；抗体变体的vh如seq id no:39所示，vl如seq id no:45所示；抗体变体的vh如seq id no:40所示，vl如seq id no:46所示；抗体变体的vh如seq id no:41所示，vl如seq id no:47所示；抗体变体的vh如seq id no:42所示，vl如seq id no:48所示。
19.在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的抗体或其变体为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
20.本发明还提供一种核酸分子或含有该核酸分子的载体，所述核酸分子具有：
21.(1)编码本文第一方面所述的抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段的多核苷酸序列；和/或
22.(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
23.本发明还提供一种宿主细胞，所述宿主细胞：
24.(1)表达本文第一方面所述的抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段；和/或
25.(2)包含本文任一实施方案所述的核酸分子或含有该核酸分子的载体。
26.本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方面任一实施方案所述的抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，和药学上可接受的赋形剂或载剂。
27.本发明还提供一种制备天疱疮动物模型的方法，包括给予动物抗dsg1抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗dsg1抗体含有至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-2、seq id no:7-8、seq id no:13-14、seq id no:19-20、seq id no:25-26和seq id no:31-32，所述动物是2-30周龄(例如6-20、8-10周龄)的小鼠。
28.在一个或多个实施方案中，所述天疱疮是由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。
29.在一个或多个实施方案中，所述小鼠是野生型小鼠、fcγr人源化小鼠(hfcgr
tg
)和/或fcγr缺陷型小鼠(fcγrα
null
)。
30.在一个或多个实施方案中，所述给予是胃肠外给予，例如皮下或静脉给予。
31.在一个或多个实施方案中，所述抗dsg1抗体含有lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述hcdr1含有seq id no:1或2所示的序列，所述hcdr2含有seq id no:7或8所示的序列，所述hcdr3含有seq id no:13或14所示的序列，所述lcdr1含有seq id no:19或20所示的序列，所述lcdr2含有seq id no:25或26所示的序列。
32.在一个或多个实施方案中，所述抗体的hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no:13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；
33.在一个或多个实施方案中，所述抗体含有如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2和如seq id no:13所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:25所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3。
34.在一个或多个实施方案中，所述抗体含有如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2和如seq id no:14所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:20所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:32所示的lcdr3。
35.在一个或多个实施方案中，所述抗体的重链恒定区是人igg1或igg4的重链恒定
区。优选地，所述抗体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列。
36.在一个或多个实施方案中，所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列，优选seq id no:51所示的序列。
37.在一个或多个实施方案中，所述抗体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:37-38中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或所述抗体的vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:43-44中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体的vh的fr区为选自seq id no:37-38的任一vh的fr区，和vl的fr区为选自seq id no:43-44的任一vl的fr区。
38.在一个或多个实施方案中，所述抗体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-38中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-44中任一所示。优选地，抗体的vh如seq id no:37所示，vl如seq id no:43所示；抗体的vh如seq id no:38所示，vl如seq id no:44所示。
39.本发明第二方面提供一种制备天疱疮动物模型的方法，包括给予动物抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，所述抗dsg1抗体变体含有
40.(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-2、seq id no:7-8、seq id no:13-14、seq id no:19-20、seq id no:25-26和seq id no:31-32，和
41.(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
42.在一个或多个实施方案中，所述天疱疮是由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。
43.在一个或多个实施方案中，所述动物是小鼠。优选地，所述动物是出生2周内(例如48h内)的小鼠或2-30周龄(例如6-20、8-10周龄)的小鼠。
44.在一个或多个实施方案中，所述小鼠是野生型小鼠、fcγr人源化小鼠和/或fcγr缺陷型小鼠。
45.在一个或多个实施方案中，所述给予是胃肠外给予，例如皮下或静脉给予。
46.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3，所述hcdr1含有seq id no:1或2所示的序列，所述hcdr2含有seq id no:7或8所示的序列，所述hcdr3含有seq id no:13或14所示的序列，所述lcdr1含有seq id no:19或20所示的序列，所述lcdr2含有seq id no:25或26所示的序列。
47.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no:13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；
48.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2和如seq id no:13所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:25所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3。
49.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2和如seq id no:14所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:20所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:32所示的lcdr3。
50.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所
示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。
51.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列，优选具有seq id no:51所示的序列。
52.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:37-38中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或所述抗体变体的vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:43-44中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体变体的vh的fr区为选自seq id no:37-38的任一vh的fr区，和vl的fr区为选自seq id no:43-44的任一vl的fr区。
53.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-38中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-44中任一所示。优选地，抗体变体的vh如seq id no:37所示，vl如seq id no:43所示；抗体的vh如seq id no:38所示，vl如seq id no:44所示。
54.本发明还提供抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段在制备天疱疮动物模型中的应用，所述抗dsg1抗体变体含有：
55.(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-2、seq id no:7-8、seq id no:13-14、seq id no:19-20、seq id no:25-26和seq id no:31-32，和
56.(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力等于或小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
57.所述应用的其他特征如本文第二方面的任意实施方案中所述。
58.本发明第三方面提供抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防天疱疮的药物中的应用，所述抗dsg1抗体变体含有：
59.(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:3-6、seq id no:9-12、seq id no:15-18、seq id no:21-24、seq id no:27-30和seq id no:33-36，和
60.(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
61.在一个或多个实施方案中，所述天疱疮是由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。
62.在一个或多个实施方案中，所述对象是哺乳动物。
63.在一个或多个实施方案中，所述给予是胃肠外给予，例如皮下或静脉给予。
64.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变。
65.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。
66.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有lcdr1、lcdr2、lcdr3、hcdr1、hcdr2和hcdr3，其中，所述hcdr1含有seq id no:3-6中的任一条序列，所述hcdr2含有seq id no:
9-12中的任一条序列，所述hcdr3含有seq id no:15-18中的任一条序列，所述lcdr1含有seq id no:21-24中的任一条序列，所述lcdr2含有seq id no:27-30中的任一条序列，所述lcdr3含有seq id no:33-36中的任一条序列。
67.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:3-6中任一所示的hcdr1、如seq id no:9-12中任一所示的hcdr2和如seq id no:15-18中任一所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:21-24中任一所示的lcdr1、如seq id no:27-30中任一所示的lcdr2和如seq id no:33-36中任一所示的lcdr3。
68.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:3所示的hcdr1、如seq id no:9所示的hcdr2和如seq id no:15所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:21所示的lcdr1、如seq id no:27所示的lcdr2和如seq id no:33所示的lcdr3。所述抗体变体的轻链恒定区优选具有seq id no:52所示的序列。
69.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:4所示的hcdr1、如seq id no:10所示的hcdr2和如seq id no:16所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:22所示的lcdr1、如seq id no:28所示的lcdr2和如seq id no:34所示的lcdr3。所述抗体变体的轻链恒定区优选具有seq id no:52所示的序列。
70.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:5所示的hcdr1、如seq id no:11所示的hcdr2和如seq id no:17所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:23所示的lcdr1、如seq id no:29所示的lcdr2和如seq id no:35所示的lcdr3。所述抗体变体的轻链恒定区优选具有seq id no:53所示的序列。
71.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:6所示的hcdr1、如seq id no:12所示的hcdr2和如seq id no:18所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:24所示的lcdr1、如seq id no:30所示的lcdr2和如seq id no:36所示的lcdr3。所述抗体变体的轻链恒定区优选具有seq id no:54所示的序列。
72.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:39-42中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或所述抗体的vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:45-48中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体的vh的fr区为seq id no:39-42中任一所示vh的fr区，和vl的fr区为seq id no:45-48中任一所示vl的fr区。
73.在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的vh的氨基酸序列如seq id no:39-42中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:45-48中任一所示。优选地，抗体变体的vh如seq id no:39所示，vl如seq id no:45所示；抗体变体的vh如seq id no:40所示，vl如seq id no:46所示；抗体变体的vh如seq id no:41所示，vl如seq id no:47所示；抗体变体的vh如seq id no:42所示，vl如seq id no:48所示。
74.在一个或多个实施方案中，所述天疱疮是致病性抗dsg1抗体或其变体介导的天疱疮。优选地，所述致病性抗dsg1抗体如本文任一实施方案中所述。
75.本发明还提供一种治疗天疱疮的方法，包括给予对象治疗有效量的抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，或含有所述抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段的药物组合物，所述抗dsg1抗体变体含有：
76.(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:3-6、seq id no:9-12、seq id no:
15-18、seq id no:21-24、seq id no:27-30和seq id no:33-36，和
77.(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
78.所述方法的其他特征如本文第三方面的任意实施方案中所述。
79.本发明优点：
80.(1)与目前应用较广泛的新生鼠模型相比，成年鼠模型具有以下优势：1)存活时间长，可用于观察疾病预后及药物疗效比较；2)落叶型天疱疮患者发病年龄多为40-60岁，与新生鼠在年龄上不一致；3)新生鼠免疫系统发育不完善，成年鼠可有效避免该问题；4)hfcgr
tg
小鼠为fc受体人源化小鼠，更利于研究人的不同igg亚型及变体的作用。
81.(2)与野生型致病性抗dsg1抗体(igg1、igg4)相比，n297a(pf1-8-15)和n297a(24-9)诱导的落叶型天疱疮小鼠模型皮损症状存在更长，预后更慢，接近落叶型天疱疮为慢性疾病的特征。
82.(3)非致病性的抗dsg1抗体克隆，如pf2-22、pf1-2-6、pf1-8-2/5、pf24-2/6/13/16等，耦联可以增强与激活性fc受体结合的igg恒定区后，具有治疗和预防天疱疮的作用。
附图说明
83.图1，抗dsg1自身抗体的特征。(a)用hek293系统表达致病性抗dsg1(克隆：pf24-9和pf1-8-15)igg1(g1)、igg4(g4)抗体，protein g纯化后跑8％sds-page胶，并进行考马斯亮蓝染色。-βme为非还原型， βme为还原型。(b)用elisa检测两个克隆的抗dsg1 igg1和igg4抗体结合dsg1的能力。1％bsa为阴性对照，阳性血清和阴性血清均来自商品化试剂盒。所用检测抗体为hrp耦联的羊抗人igg fc。(c)用hek293系统表达致病性抗dsg1(克隆：pf24-9和pf1-8-15)igg1变体n297a(n突变)和gasdalie(g突变)，protein g纯化后跑8％sds-page胶，并进行考马斯亮蓝染色。-βme为非还原型， βme为还原型。(d)elisa检测带有不同fc的pf1-8-15抗dsg1抗体结合人dsg1的动力学特征，抗adamts13igg1为对照无关人igg。(e)elisa检测不同igg亚型及变体抗dsg1 pf1-8-15抗体结合鼠fc受体的能力。
84.图2，致病性抗dsg1自身抗体诱导新生鼠皮损。给予新生鼠一定剂量的对照人igg或致病性(pf24-9或pf1-8-15)抗dsg1 igg1或igg4抗体后，he染色显示小鼠皮肤出现棘层松解的情况。
85.图3，落叶型天疱疮成年鼠模式。(a)给予hfcgr
tg
小鼠一定剂量(1mg*3doses，隔天给药)的抗dsg1 pf24-9(igg1)抗体或不予任何处理，6天后可见抗体处理组小鼠毛发脱落、皮肤明显病变(包括裸露皮肤红肿糜烂、结痂且增厚)、人igg在耳朵皮肤处沉积(dif)、皮肤和耳组织的he结果反映表皮内水疱和局部炎症。(b)用于评估hfcgr
tg
小鼠中抗dsg1自身抗体致病性的实验设计示意图。即在第0天和第2天分别经尾静脉给hfcgr
tg
小鼠注射0.5mg ctrl higg或pf24-9(igg1)或pf24-9(igg4)抗dsg1抗体。在第4天，处死小鼠，取小鼠皮肤和耳朵组织进行he染色。(c)给予hfcgr
tg
小鼠上述处理(b)后，he染色显示小鼠皮肤和耳朵组织炎性细胞浸润和表皮内水疱情况。比例尺：200μm(he)，100μm(dif)。
86.图4.抗dsg1 igg4自身抗体的致病性不比igg1弱，且二者均会因fcγrs缺陷而加重。(a)给予hfcgr
tg
小鼠和fcγrα
null
小鼠0.5mg对照人igg或抗dsg1 pf24-9(igg1)或pf24-9(igg4)抗体3天后取小鼠耳朵进行he染色。比例尺：200μm。(b)流式细胞分析术检测各组小
鼠耳朵中cd11b阳性髓系细胞浸润情况。(c)cd11b阳性细胞在cd45阳性免疫细胞中所占百分比。(d)小鼠耳朵中cd11b阳性细胞的绝对数量。(e)流式细胞分析术检测各组小鼠耳朵中cd11b阳性gr1高表达的中性粒细胞浸润情况。(f)gr1高表达中性粒细胞在cd45阳性免疫细胞中所占百分比。(g)小鼠耳朵中gr1高表达中性粒细胞的绝对数量。结果用平均值
±
标准误表示。每个符号均来自1只单独的小鼠。用tukey多重比较测试的双向方差分析(c，d，f，g)进行统计分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
87.图5，与fcγr亲和力较低的pf24-9抗dsg1自身抗体更具致病性。(a)用于评估hfcgr
tg
小鼠中抗dsg1自身抗体(克隆pf24-9)致病性的实验设计示意图。即在第0天经尾静脉给hfcgr
tg
小鼠注射0.5mg ctrl higg或pf24-9(n297a)或pf24-9(gasdalie)抗dsg1抗体。3天后处死小鼠，取小鼠耳朵组织进行he染色和流式检测，并收集血清检测抗体残留。(b)处理后各组小鼠耳朵he染色结果。比例尺：200μm。(c)用游标卡尺测量各组小鼠耳朵厚度。(d)各组小鼠耳朵的重量。(e)流式细胞分析术检测各组小鼠耳朵中cd11b阳性gr1高表达的中性粒细胞浸润情况。(f)gr1高表达中性粒细胞在cd45阳性免疫细胞中所占百分比。(g)小鼠耳朵中gr1高表达中性粒细胞的绝对数量。(h)elisa检测小鼠血清中所给人igg残留含量。结果用平均值
±
标准误表示。每个符号均来自1只单独的小鼠。用tukey多重比较测试的单向方差分析(c，d，f，g，h)进行统计分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
88.图6，与fcγr亲和力较低的pf1-8-15抗dsg1自身抗体更具致病性。组织病理学显示抗体处理3天(a)和6天(b)后小鼠耳朵he染色结果。比例尺：200μm。(c)用游标卡尺测量抗体处理6天后各组小鼠耳朵厚度。(d)抗体处理6天后各组小鼠耳朵的重量。(e)流式细胞分析术检测第6天各组小鼠耳朵中cd11b阳性gr1高表达的中性粒细胞浸润情况。(f)gr1高表达中性粒细胞在cd45阳性免疫细胞中所占百分比。(g)小鼠耳朵中gr1高表达中性粒细胞的绝对数量。(h)elisa检测抗体处理3天后小鼠血清中所给人igg残留含量。结果用平均值
±
标准误表示。每个符号均来自1只单独的小鼠。用tukey多重比较测试的单向方差分析(c，d，f，g，h)进行统计分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
89.图7，裸鼠中与fcγr亲和力较低的抗dsg1自身抗体更具致病性。(a)经尾静脉给裸鼠注射0.4mg ctrl higg或pf1-8-15(n297a)或pf1-8-15(gasdalie)2天后的小鼠腹侧头颈部位照片(n＝5)，pf1-8-15(n297a)处理组小鼠可见明显皮损。(b)经尾静脉给裸鼠注射0.5mg ctrl higg或pf1-8-15(n297a)或pf1-8-15(gasdalie)4天后的小鼠腹部照片(n＝5)，pf1-8-15(n297a)处理组小鼠皮屑脱落较慢。每张图片来自1只单独的小鼠。
90.图8，fc-fcγr相互作用可减轻dsg1自身抗体的致病性。(a)用于评估抗dsg1 gasdalie变体在hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠中致病性的实验设计示意图。即在第0天经尾静脉给hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠注射0.5mg ctrl higg或pf1-8-15(gasdalie)抗dsg1抗体。3天后处死小鼠，取小鼠耳朵进行he染色和流式检测，并留取血清进行残余人igg含量检测。(b)各组小鼠耳朵he染色结果。比例尺：200μm。(c)抗体处理3天后各组小鼠耳朵的重量。(d)流式细胞分析术检测各组小鼠耳朵中cd11b阳性gr1高表达的中性粒细胞浸润情况。(e)gr1高表达中性粒细胞在cd45阳性免疫细胞中所占百分比。(f)小鼠耳朵中gr1高表达中性粒细胞的绝对数量。(g)elisa检测抗体处理3天后小鼠血清中人igg残留含量。结果用平均值
±
标准误表示。每个符号均来自1只单独的小鼠。用tukey多重比较测试的双向方差分析(c，e-g)进行统计分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
91.图9，fcγr介导的效应功能可促进抗dsg1自身抗体诱导的免疫复合物和凋亡角质形成细胞的清除。(a)elisa检测各组裸鼠血清中残余人igg的含量。(b)elisa检测各组裸鼠血清中游离dsg1-抗dsg1抗体免疫复合物的含量。(c)he染色结果显示抗dsg1抗体fc变体诱导裸鼠表皮内水疱和局部炎症的能力。(d)经pf1-8-15(n297a)或pf1-8-15(gasdalie)处理后裸鼠皮肤组织tunel染色结果，其中位于表皮的绿色致密核表示凋亡细胞。结果用平均值
±
标准误表示。每个符号均来自1只单独的小鼠。用tukey多重比较测试的单向方差分析(a，b)进行统计分析。*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。比例尺：200μm(he)，100μm(dif)。
92.图10，非致病性抗dsg1自身抗体pf1-2-22的特征。(a)用hek293系统表达非致病性抗dsg1(克隆：pf1-2-22)igg1(g1)、igg4(g4)以及gasdalie抗体，protein g纯化后跑10％sds-page胶，并进行考马斯亮蓝染色。-βme为非还原型， βme为还原型。(b)用间接法elisa检测pf1-8-15、pf24-9、pf1-2-22结合dsg1的能力。tbs-ca为阴性对照。(c)用竞争法elisa检测pf24-9、pf1-2-22结合dsg1的表位是否与克隆pf1-8-15抗dsg1 igg1的识别表位存在竞争关系。αcd40(igg1)为阴性对照。
93.图11，增强与fcγr结合的非致病性抗dsg1自身抗体可减轻致病性抗dsg1抗体引发的皮肤损伤。(a)用于评估非致病性抗dsg1 igg1(pf1-2-22(gasdalie))对致病性pf1-8-15(n297a)的致病性影响的实验设计示意图。即经尾静脉给实验组裸鼠等剂量的非致病性抗dsg1 pf1-2-22(gasdalie)抗体和致病性pf1-8-15(n297a)抗体，对照组只给致病性的pf1-8-15(n297a)抗体，2天后给小鼠拍照，处死小鼠，并取皮肤组织进行he和tunel染色。(b)两组小鼠嘴巴周围皮肤损伤照片。(c)两组小鼠皮肤he染色结果。(d)两组裸鼠皮肤组织tunel染色结果，其中位于表皮的绿色致密核表示凋亡细胞。每张图片均来自1只单独的小鼠。比例尺：200μm(he)，100μm(dif)。
具体实施方式
94.除非另有定义，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分解释，诸如molecular cloning：a laboratory manual，第二版(sambrook等，1989)；oligonucleotide synthesis(m.j.gait编辑，1984)；animal cell culture(r.i.freshney编辑，1987)；methods in enzymology(academic press，inc.)；current protocols in molecular biology(f.m.ausubel等编辑，1987版及其定期更新版本)；pcr：the polymerase chain reaction(mullis等编辑，1994)；a practical guide to molecular cloning(perbal bernard v.，1988)；phage display：a laboratory manual(barbas等，2001)。
95.抗dsg1抗体
96.本发明提供特异性地结合dsg1的抗体。
97.本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，fab，f(ab’)2和fv)。本文中，术语“免疫球蛋白”(ig)和“抗体”可互换地使用。本文所述抗体包括抗体的变体。
98.基本的4链抗体单元是由两条相同的轻链(l)和两条相同的重链(h)构成的异四聚体糖蛋白。igm抗体由5个基本的异四聚体单元及称作j链的另外多肽组成，包含10个抗原结合位点；而iga抗体包含2-5个基本的4链单元，其可与j链组合聚合形成多价装配物。在igg的情况中，4链单元通常约150,000道尔顿。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而两条重链通过一个或多个二硫键彼此相连，二硫键的数目取决于重链的同种型。每条重链和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在n-末端具有可变结构域(vh)，接着是三个(对于每种α和γ链，ch1、ch2和ch3)和四个(对于μ和ε同种型，ch1、ch2、ch3和ch4)恒定结构域(ch)以及位于ch1结构域与ch2结构域之间的绞链区(hinge)。每条轻链在n-末端具有可变结构域(vl)，接着是其另一端的恒定结构域(cl)。vl与vh排列在一起，而cl与重链的第一恒定结构域(ch1)排列在一起。特定的氨基酸残基被认为在轻链和重链可变结构域之间形成界面。成对的vh和vl一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如basic and clinical immunology，第八版，daniel p.sties，abba i.terr和tristram g.parsolw编辑，appleton&lange，norwalk，ct，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据其重链恒定结构域(ch)氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类或同种型。有五类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，分别具有称作α、δ、ε、γ和μ的重链。根据ch序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
99.抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“vh”和“vl”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
100.术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(hvr)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的hcdr1、hcdr2、hcdr3以及轻链可变区的lcdr1、lcdr2和lcdr3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个fr区(fr1、fr2、fr3和fr4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个hvr连接。每条链中的hvr通过fr区非常接近的保持在一起，并与另一条链的hvr一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见kabat等，sequences of immunological interest，第五版，国立卫生研究所，bethesda，md，1991)。通常，轻链可变区的结构为fr1-lcdr1-fr2-lcdr2-fr3-lcdr3-fr4，重链可变区的结构为fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。
[0101]“fc区”(可结晶片段区域)或“fc结构域”或“fc”是指抗体重链的c-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的fc受体的结合，或者与经典补体系统的第一组分(c1q)的结合。在igg，iga和igd抗体同种型中，fc区由来自抗体两条重链的ch2结构域和ch3结构域的两个相同的蛋白片段构成；igm和ige的fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(ch结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的fc区的边界可以变化，但是人igg重链fc区通常定义为从重链位置c226或p230
的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据eu索引，如在kabat中一样。如本文所使用的，fc区可以是天然序列fc或变体fc。
[0102]“fc受体”或“fcr”是结合免疫球蛋白fc区的受体。结合igg抗体的fcr包括fcγr家族的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。人fcγ受体家族包括几个成员：fcγri(cd64)、fcγriia(cd32a)、fcγriib(cd32b)、fcγriiia(cd16a)、fcγriiib(cd16b)。其中，fcγriib是唯一的抑制性fcγ受体，其它均为活化型fcγ受体。大多数天然效应器细胞类型共表达一种或多种激活性fcγr和抑制性fcγriib，而自然杀伤(nk)细胞选择性地表达一种激活性fcγ受体(在小鼠中是fcγriii，在人中是fcγriiia)，但在小鼠和人类中不表达抑制性fcγriib。这些fcγ受体的分子结构不同，也因此对各igg抗体亚类具有不同的亲和力。在这些fcγ受体中fcγri是高亲和力受体，而fcγriia、fcγriib和fcγriiia是低亲和力受体。基因多态性也存在于这些不同的fcγ受体中并影响它们的结合亲和力。最常见的基因多态性是fcγriia的r131/h131和fcγriiia的v158/f158等多态形式。这些多态形式中有的被发现与多种疾病有相关性，一些特定治疗抗体的效果也依赖于病人是否带有特定的fcγ受体基因多态形式。
[0103]
本发明所述的“对激活性fcγ受体以及抑制性fcγ受体的亲和力比值”或者“a/i比值”指蛋白分子对激活性fc受体的亲和力和对抑制性fc受体的亲和力的比值，在本发明中a/i比值采用如下方式计算：a/i比值＝[kd(hfcγriia)和/或kd(hfcγriiia)]/kd(hfcγriib)；其中kd(hfcγriia)为该分子对hfcγriia受体(以变体hfcγriia-r131为代表)的平衡解离常数，kd(hfcγriiia)为该分子对hfcγriiia受体(以变体hfcγriiia-f158为代表)的平衡解离常数，kd(hfcγriib)为该分子对hfcγriib受体的平衡解离常数；hfcγriia是指人的fcγriia受体，hfcγriiia是指人的fcγriiia受体，hfcγriib是指人的fcγriib受体。所述的“亲和力”是指两个分子之间的结合能力的大小，通常地可以用kd来衡量。
[0104]“kd”指两个分子(例如：特定抗体和抗原或者配体和受体)相互作用的平衡解离常数。“抗原结合模块”是指以高亲和力特异性结合抗原的蛋白质，包括，但不仅限于，抗体的抗原结合片段、adnectin、纳米抗体(nanobody)、微型抗体、亲和体(affibodies)、affilin、受体的靶结合区、细胞粘附分子、配体、酶、细胞因子、和趋化因子等。抗原结合模块所靶向的抗原包括，但不限于，tnf受体超家族成员、免疫抑制性受体分子等。
[0105]
本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如，kohler和milstein，nature，256：495-97(1975)；hongo等，hybridoma，14(3)：253-260(1995)，harlow等，antibodies：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，第二版.1988；hammerling等，在：monoclonal antibodies and t-cell hybridomas，563-681，elsevier，n.y.，1981)、重组
dna法(例如us 4,816,567)、噬菌体展示技术(例如，clackson等，nature，352：624-628(1991)；marks等，j.mol.biol.，222：581-597(1992)；sidhu等，j.mol.biol.，338(2)：299-310(2004)；lee等，j.mol.biol.，340(5)：1073-1093(2004)；fellouse，proc.natl.acad.sci.usa，101(34)：12467-12472(2004)；和lee等j.immunol.methods，284(1-2)：119-132(2004))、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术(例如，wo1998/24893；wo1996/34096；wo1996/33735；wo 1991/10741；jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa，90：2551(1993)；jakobovits等，nature，362：255-258(1993)；bruggemann等，year in immunol.，7：33(1993)；us 5,545,807；us 5,545,806；us 5,569,825；us 5,625,126；us 5,633,425；和us 5,661,016；marks等，bio/technology，10：779-783(1992)；lonberg等，nature，368：856-859(1994)；morrison，nature，368：812-813(1994)；fishwild等，nature biotechnol.，14：845-851(1996)；neuberger，nature biotechnol.，14：826(1996)；和lonberg和huszar，intern.rev.immunol.，13：65-93(1995)、单细胞测序法(nat biotechnol.2013feb；31(2):166-9.)。
[0106]
术语“全长抗体”、“完整抗体”或“完全抗体”可互换地使用，是指基本上是其完整形式的抗体(与抗体片段相对比)。具体而言，完全抗体包括那些具有重链和轻链包括fc区的抗体。恒定结构域可以是天然序列恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况中，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。
[0107]“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括fab、fab’、f(ab’)2和fv片段；双抗体；线性抗体(参见美国专利5,641,870，实施例2；zapata等，protein eng.，8(10)：1057-1062，1995)；单链抗体分子；scfv-fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。用木瓜蛋白酶消化抗体产生称作“fab”片段的两个相同的抗原结合片段，和一个残余“fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。fab片段由完整轻链及重链可变结构域(vh)和一条重链第一恒定结构域(ch1)组成。每个fab片段在抗原结合方面是单价的，即其具有单个抗原结合位点。胃蛋白酶处理抗体产生一个较大f(ab’)2片段，它粗略相当于两个通过二硫键相连的fab片段，具有不同抗原结合活性且仍能够交联抗原。fab’片段因在ch1结构域的羧基末端增加了一些另外的残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而与fab片段有所不同。f(ab’)2抗体片段最初是作为成对fab’片段生成的，在fab’片段之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。fc片段包含通过二硫键保持在一起的两条重链的羧基末端部分。抗体的效应子功能是由fc区中的序列决定的，该区还是由在某些类型细胞上发现的fc受体(fcr)所识别的区。
[0108]“fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个hvr的半个fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。
[0109]“单链fv”也可缩写为“sfv”或“scfv”，是包含抗体vh和vl结构域的连接成一条多
肽链的抗体片段。优选的是，sfv多肽在vh和vl结构域之间还包含多肽接头，使得sfv形成期望的抗原结合结构。关于sfv的综述参见the pharmacology of monoclonal antibodies，第113卷，rosenburg和moore编辑，springer-verlag，new york，pp.269-315(1994)。
[0110]
所述片段的“化学修饰”包括添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，peg化”)，包括fv、scfv、fab、f(ab’)2和fab'的聚乙二醇化片段，即fv-peg、scfv-peg、fab-peg、f(ab’)2-peg和fab'-peg。这类片段具有egfr结合活性。
[0111]
优选地，所述抗体片段，尤其是抗原结合片段，由其来源抗体的重链可变区或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于dsg1，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种抗体片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
[0112]
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(us4,816,567；morrison等，proc.nat.acad.sci.usa，81：6851-6855，1984)。
[0113]
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除cdr以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除cdr以外)。cdr(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的cdr来决定。这类抗体的产生例如在wo92/11018；jones，1986，nature，321：522-525；verhoeyen等，1988，science，239：1534-1536中有描述。人源化抗体也可以使用具有基因工程免疫系统的小鼠而产生(见roque等，2004，biotechnol.prog.，20：639-654)。
[0114]“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。这类技术可参见hoogenboom和winter，分子生物学杂志，227：381(1991)；marks等，分子生物学杂志，222：581(1991)。可获得的制备人单克隆抗体的方法在cole等，单克隆抗体和癌症治疗，alan r.liss，p.77(1985)；boerner等，免疫学杂志，147(1)：86-95(1991)中描述。还参见van dijk和van de winkel，现代药学评论，5：368-74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原激发生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如us 6,075,181和6,150,584，关于xenomousetm技术)。还可参见例如li等，美国国家科学院学报，103：3557-3562(2006)，关于经人b细胞杂交瘤技术产生的人抗体。
[0115]
本发明的抗dsg1抗体也可以是微型抗体。微型抗体是包含与ch3结构域连接的scfv的最小化抗体样蛋白(hu等，1996，cancer res.，56：3055-3061)。本发明的抗dsg1抗体还可以是结构域抗体，参见例如us 6,248,516。结构域抗体(dab)是抗体的功能结合结构域，对应于人抗体dab的重链(vh)或轻链(vl)的可变区，具有约13kda的分子量或小于完整
抗体的十分之一尺寸。dab在包括细菌、酵母和哺乳动物细胞系统的多种宿主中充分表达。另外，即使在经受严酷条件，诸如冷冻干燥或热变性后，dab仍高度稳定且保持活性。参见例如us 6,291,158；us 6,582,915；us 6,593,081；us 6,172,197；us 2004/0110941；ep 0368684；us 6,696,245、wo04/058821、wo04/003019和wo03/002609。
[0116]
本文中，各抗体的重链和轻链恒定区可使用本领域中任何其他重链和轻链恒定区而不影响抗体与抗原的结合能力。
[0117]
本发明的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。应理解，本发明实施例所提供的抗体为完全人抗体。
[0118]
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列取代、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区的fr和/或cdr区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。取代优选是保守性取代；可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序blast，尤其是blastp或tblastn。
[0119]
本发明的抗dsg1抗体可以被修饰以影响功能。本发明包括具有修饰的糖基化模式的抗dsg1抗体。可进行修饰以除去不期望的糖基化位点，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分以增强抗体的依赖性细胞毒性(adcc)功能，或可进行半乳糖基化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(cdc)。
[0120]
本发明抗dsg1抗体的通常可具备约10-9
至约10-13
m的亲和力常数。
[0121]
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗dsg1抗体，如本领域熟知的杂交瘤技术。或者，本发明的抗dsg1抗体可在除杂交瘤细胞系以外的细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转染合适的哺乳动物宿主细胞。转染可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将dna直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、幼仓鼠肾(bhk)细胞、猴肾细胞(cos)、人肝细胞癌细胞(例如，hepg2)等。尤其优选的细胞系通过确定哪些细胞系具有高表达水平并产生具有基本ox40结合特性的抗体来进行选择。
[0122]
本发明抗dsg1抗体可含有至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-6、seq id no:7-12、seq id no:13-18、seq id no:19-24、seq id no:25-30和seq id no:31-36，和重链恒定区，所述重链恒定区是人igg1或igg4的重链恒定区。
[0123]
本发明抗dsg1抗体的变体可含有至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-6、seq id no:7-12、seq id no:13-18、seq id no:19-24、seq id no:25-30和seq id no:31-36，和重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于或小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。
[0124]
致病性抗dsg1抗体及其变体
[0125]
致病性抗dsg1抗体及其变体可诱导由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。在致病性抗dsg1抗体示例中，hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no:13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；重链恒定区是人igg1或igg4的重链恒定区。所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列。所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。
[0126]
在致病性抗dsg1抗体的变体示例中，hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no:13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。在一个或多个实施方案中，致病性抗dsg1抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。
[0127]
在具体实施方案中，所述抗体的变体含有如seq id no:1所示的hcdr1、如seq id no:7所示的hcdr2和如seq id no:13所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:19所示的lcdr1、如seq id no:25所示的lcdr2和如seq id no:31所示的lcdr3，并且，所述抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。在另一具体实施方案中，所述抗体的变体含有如seq id no:2所示的hcdr1、如seq id no:8所示的hcdr2和如seq id no:14所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:20所示的lcdr1、如seq id no:26所示的lcdr2和如seq id no:32所示的lcdr3，并且，所述抗体变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。
[0128]
在一个或多个实施方案中，致病性抗dsg1抗体或其变体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:37-38中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:43-44中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体或其变体的vh的fr区为选自seq id no:37-38的任一vh的fr区，和vl的fr区为选自seq id no:43-44的任一vl的fr区。
[0129]
在一个或多个实施方案中，致病性抗dsg1抗体或其变体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-38中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-44中任一所示。优选地，致病性抗dsg1抗体或其变体的vh如seq id no:37所示，vl如seq id no:43所示；或者，致病性抗dsg1抗体或其变体的vh如seq id no:38所示，vl如seq id no:44所示。
[0130]
在一个或多个实施方案中，致病性抗dsg1抗体或其变体具有表1的第1行所示的各区段，或第2行所示的各区段，并且所述变体的重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。
[0131]
非致病性抗dsg1抗体及其变体
[0132]
非致病性抗dsg1抗体及其变体可治疗由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。在非致病性抗dsg1抗体示例中，hcdr1包含seq id no:3-6中任一所示的序列、hcdr2包含seq id no:9-12中任一所示的序列、hcdr3包含seq id no:15-18中任一所示的序列、lcdr1包含seq id no:21-24中任一所示的序列、lcdr2包含seq id no:27-30中任一所示的序列和lcdr3包含seq id no:33-36中任一所示的序列；重链恒定区是人igg1或igg4的重链恒定区。所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列。所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。
[0133]
在致病性抗dsg1抗体的变体示例中，hcdr1包含seq id no:3-6中任一所示的序列、hcdr2包含seq id no:9-12中任一所示的序列、hcdr3包含seq id no:15-18中任一所示的序列、lcdr1包含seq id no:21-24中任一所示的序列、lcdr1包含seq id no:27-30中任一所示的序列和lcdr1包含seq id no:33-36中任一所示的序列；重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。在一个或多个实施方案中，非致病性抗dsg1抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变。所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。
[0134]
在具体实施方案中，所述抗体变体含有如seq id no:3所示的hcdr1、如seq id no:9所示的hcdr2和如seq id no:15所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:21所示的lcdr1、如seq id no:27所示的lcdr2和如seq id no:33所示的lcdr3；所述抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变；所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:52所示的序列；
[0135]
或者，所述抗体变体含有如seq id no:4所示的hcdr1、如seq id no:10所示的hcdr2和如seq id no:16所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:22所示的lcdr1、如seq id no:28所示的lcdr2和如seq id no:34所示的lcdr3；所述抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变；所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:52所示的序列；
[0136]
或者，所述抗体变体含有如seq id no:5所示的hcdr1、如seq id no:11所示的hcdr2和如seq id no:17所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:23所示的lcdr1、如seq id no:29所示的lcdr2和如seq id no:35所示的lcdr3；所述抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和
k334e突变；所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:53所示的序列；
[0137]
或者，所述抗体变体含有如seq id no:6所示的hcdr1、如seq id no:12所示的hcdr2和如seq id no:18所示的hcdr3，和/或含有如seq id no:24所示的lcdr1、如seq id no:30所示的lcdr2和如seq id no:36所示的lcdr3；所述抗体的变体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列并包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变；所述抗体变体的轻链恒定区具有seq id no:54所示的序列。
[0138]
在一个或多个实施方案中，非致病性抗dsg1抗体或其变体的vh的fr1、fr2、fr3、fr4各自独立地选自seq id no:39-42中任一所示的vh的fr1、fr2、fr3、fr4；和/或vl的fr1、fr2、fr3和fr4各自独立地选自seq id no:45-48中任一所示的vl的fr1、fr2、fr3、fr4。优选地，所述抗体或其变体的vh的fr区为seq id no:39-42中任一所示vh的fr区，和vl的fr区为seq id no:45-48中任一所示vl的fr区。
[0139]
在一个或多个实施方案中，非致病性抗dsg1抗体或其变体的vh的氨基酸序列如seq id no:39-42中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:45-48中任一所示。
[0140]
在一个或多个实施方案中，非致病性抗dsg1抗体或其变体具有表1的第3-6行中任一行所示的各区段，并且所述变体的重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变。
[0141]
本文所述各序列编号与来源抗体的对应关系如下表1所示：
[0142]
表1
[0143][0144][0145]
编码抗dsg1抗体的多核苷酸序列
[0146]
本发明提供核酸分子，其包括编码本发明所述抗dsg1抗体的多核苷酸序列。本文提供编码重链可变区、轻链可变区、重链、轻链以及各cdr的多核苷酸序列。
[0147]
本发明的核酸分子包括单链和双链形式的dna和rna，以及相应的互补序列。dna包括例如cdna、基因组dna、化学合成的dna、pcr扩增的dna及其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cdna分子以及其片段的组合。本发明的核酸优选地源自人来源，但本发明也包括源自非人的核酸。
[0148]
本发明中，分离的核酸分子指独立片段形式或作为较大核酸构建体组分的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸基本上不含污染性的内源物质。核酸分子优选地源自以基本上纯的形式至少分离一次的dna或rna且其量或浓度使得能够通过标准生物化学方法
来识别、操纵和回收其组分核苷酸序列。所述序列优选地以未受内部非翻译序列或内含子(典型地在真核基因中存在)中断的开放阅读框形式来提供和/或构建。非翻译dna的序列可存在于开放阅读框的5'或3'处，其同样不影响编码区的操纵或表达。
[0149]
本发明还包括在适度严苛的条件下、优选在高度严苛的条件下与如本文中所述编码抗dsg1抗体的核酸杂交的核酸。影响杂交条件选择的基本参数和关于设计合适条件的指导可参见sambrook,fritsch和maniatis(1989，molecular cloning：a laboratory manual，cold spring harbor laboratory press，cold spring harbor，n.y.，第9章和第11章；和current protocols in molecular biology，1995，ausubel等编，john wiley&sons,inc.，章节2.10和6.3-6.4)。
[0150]
如本文中所概述，通常使用盒式诱变或pcr诱变或本领域中熟知的其它技术在编码抗dsg1抗体的dna中通过核苷酸的位点特异性诱变以产生编码变体的dna，且此后在细胞培养物中表达重组dna来制备根据本发明的变体。然而，可以通过使用确定的技术体外合成来制备包含具有多达约100-150个残基的的抗原结合片段。
[0151]
如本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，可制得极大量的核酸，它们全部编码本发明的抗dsg1抗体或其抗原结合片段。因此，在已鉴定特定氨基酸序列的情况下，本领域技术人员可通过以不改变编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单地修饰一个或多个密码子的序列来制得任何数量的不同的核酸。
[0152]
本发明还提供包含至少一个如上述多核苷酸的质粒、表达载体、转录盒或表达盒形式的表达系统和构建体。另外，本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。
[0153]
任何宿主细胞中所用的表达载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于插入编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。下文论述每个这些序列。
[0154]
载体可任选地含有“标签”编码序列，即位于抗dsg1抗体编码序列的5'或3'末端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码聚组氨酸(诸如6his)或另一种“标签”，诸如flag、ha(血球凝集素流感病毒)或myc，它们存在市场上有售的抗体中。此标签在表达多肽时典型地与多肽融合，且可充当用于从宿主细胞亲和力纯化或检测抗dsg1抗体的一种方式。亲和力纯化例如可通过使用针对此标签的抗体作为亲和力基质的柱色谱法来完成。标签任选地可通过诸如使用某些用于裂解的肽酶的各种方式从经过纯化的抗dsg1抗体除去。
[0155]
侧翼序列可以是同源的(即，来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源的(即，来自除宿主细胞物种或菌株以外的物种)、杂合的(即，来自一种以上来源的侧翼序列的组合)、合成的或天然的。同样地，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体或任何植物，条件是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用且可由宿主细胞机制活化。
[0156]
复制起点典型地是在市场上购买的那些原核表达载体的一部分，且此起点有助于载体在宿主细胞中扩增。如果选择的载体不含复制起点位点，则可以基于已知的序列来化学合成并连接到载体中。举例来说，来自质粒pbr322(new england biolabs，beverly，ma)
的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，且各种病毒起点(例如，sv40、多瘤病毒、腺病毒、水泡性口炎病毒(vsv)或乳头瘤病毒，诸如hpv或bpv)适用于在哺乳动物细胞中克隆载体。哺乳动物表达载体通常不需要复制起点组分(例如，常常只使用sv40起点，因为它也含有病毒早期启动子)。
[0157]
转录终止序列典型地位于多肽编码区的3'末端，用以终止转录。原核细胞中的转录终止序列通常是富含g-c的片段，接着是多聚胸苷酸序列。
[0158]
可选的标记基因编码对于在选择性培养基中生长的宿主细胞的存活和生长而言必要的一种蛋白质。典型的选择标记基因编码(a)赋予对于抗生素或其它毒素(例如，对于原核宿主细胞而言为氨苄青霉素、四环素或卡那霉素)的抗性；(b)补足细胞的营养缺陷型；或(c)提供无法从复合物或确定的培养基获得的重要营养素的蛋白质。特异性的可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可以用于在原核和真核宿主细胞中进行选择。
[0159]
核糖体结合位点对于mrna的翻译起始而言通常是必要的而且由shine-dalgarno序列(原核生物)或kozak序列(真核生物)来表征。此元件典型地位于启动子的3'和将要表达的多肽的编码序列的5'。
[0160]
本发明的表达和克隆载体将典型地含有由宿主生物体识别并与编码抗dsg1抗体的分子可操作性连接的启动子。启动子是位于控制结构基因转录的结构基因(通常在约100至1000bp以内)的起始密码子上游的非转录序列。
[0161]
本领域中也熟知与酵母宿主一起使用的合适启动子。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。熟知与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子且包括但不限于由诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、b型肝炎病毒和最优选的猿猴病毒40(sv40)的病毒基因组获得的些启动子。其它合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
[0162]
可将增强子序列插入载体中以通过高等真核生物增加编码组成本发明的抗dsg1抗体的轻链或重链的dna的转录。增强子是作用于启动子以增加转录的dna的顺式作用元件，长度通常约为10-300bp。增强子具有相对的方向和位置独立性，已在转录单元的5’和3’位置处发现增强子。已知可获自哺乳动物基因的若干种增强子序列，例如球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素的增强子序列。然而，典型地使用来自病毒的增强子。本领域中已知的sv40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。
[0163]
本发明的表达载体可以由起始载体(诸如市售载体)来构建。这类载体可含有或可不含所有所需的侧翼序列。如果本文所述侧翼序列的一个或多个并非已存在于载体中，则其可单独获得并与载体连接。本领域技术人员熟知用于获得各个侧翼序列的方法。
[0164]
在构建载体并将编码包含抗dsg1抗体的轻链、重链或轻链和重链的核酸分子插入载体的适当位点后，可将已完成的载体插入合适的宿主细胞中用于扩增和/或多肽表达。可通过众所周知的方法将抗dsg1抗体的表达载体转化至所选的宿主细胞中，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、微注射、脂转染、deae-葡聚糖介导的转染或其它已知的技术。所选方法部分可随待使用的宿主细胞类型而变化。
[0165]
当培养在适当的条件下培养宿主细胞，使其合成抗dsg1抗体，抗dsg1抗体随后可
从培养基收集(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生其的宿主细胞中收集(如果不分泌的话)。适当的宿主细胞如前文所述。
[0166]
抗dsg1抗体用于构建动物模型
[0167]
本领域中，新生鼠模型是目前研究天疱疮自身抗体最常用的模型，但是，天疱疮的发生是在持续不断的免疫反应中逐渐形成的，通常是一种影响成年人和老年人的慢性疾病，与新生鼠在年龄上不匹配；并且新生鼠寿命有限，只能进行短时间(通常为数小时)的观察和研究，不适合进行预后及药物疗效观察；新生鼠免疫系统未完全发育，不能反映病人的真实情况。基于此，发明人开发了基于成年小鼠的天疱疮模型。本文中，天疱疮是由dsg1介导的天疱疮，例如落叶型天疱疮。
[0168]
发明人发现，通过给予一定剂量的致病性抗dsg1抗体，成年小鼠可以再现pf患者的临床、组织学和免疫学特征，包括糜烂面、结痂、人igg在病变部位及邻近皮肤组织表皮细胞间沉积，以及包括耳朵和皮肤表皮起泡在内的组织病理学变化。并且，小鼠疾病发作期间还观察到了病变部位表皮增厚以及白细胞浸润。免疫细胞浸润的结果与现有技术中对天疱疮患者的皮肤样本进行的分析以及对患者病变部位淋巴细胞浸润的最新描述一致。因此，致病性抗dsg1抗体的过继转移足以在成年小鼠中引发天疱疮，该模型使用fc受体人源化小鼠，更适合对人源抗体的研究，且该模型可以在完整免疫系统的背景下研究不同抗dsg1自身抗体在疾病发作和预后过程中的致病性。
[0169]
同时，发明人还发现，抗dsg1抗体的致病性与抗体和fcγr的亲和力相关。与fcγr亲和力低的抗dsg1抗体更具致病性。因此，可用于构建天疱疮成年动物模型的抗体包括本文所述的致病性抗dsg1抗体及其变体，具体例如pf1-8-15、pf24-9以及其fcγr亲和力降低的变体。经发明人验证，重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变的抗体变体具有更低的fcγr亲和力和更强的致病性：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a。
[0170]
因此，本发明提供利用抗dsg1抗体制备天疱疮动物模型的方法，包括给予动物致病性抗dsg1抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗dsg1抗体含有至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:1-2、seq id no:7-8、seq id no:13-14、seq id no:19-20、seq id no:25-26和seq id no:31-32和天然的恒定区，所述动物是2-30周龄(例如6-20、8-10周龄)的小鼠。在一个或多个实施方案中，所述抗体的hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；所述抗体的重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列；所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。优选地，所述抗体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-38中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-44中任一所示。
[0171]
在另一方面中，本发明提供利用抗dsg1抗体变体制备天疱疮动物模型的方法，包括给予动物致病性抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，所述抗dsg1抗体变体含有(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:7-8、seq id no:13-14、seq id no:19-20、seq id no:25-26和seq id no:31-32，和(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力小于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力，所述动物是出生2周内(例如48h内)的小鼠或2-30周龄(例如6-20、8-10周龄)的小鼠。
在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的hcdr1选自seq id no:1或2、hcdr2选自seq id no:7或8、hcdr3选自seq id no13或14、lcdr1选自seq id no:19或20、lcdr2选自seq id no:25或26和lcdr3选自seq id no:31或32；所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)n297a、(2)n297g、(3)n297q、(4)d265a、(5)n297a和d265a、(6)g236r和l328r、(7)l235e、(8)l234a和l235a；所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。优选地，所述抗体变体的vh的氨基酸序列如seq id no:37-38中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:43-44中任一所示。
[0172]
本文中，用于构建模型的小鼠包括野生型小鼠、fcγr人源化小鼠和/或fcγr缺陷型小鼠。小鼠的种系可以是balb/c小鼠或c57 bl/6小鼠。
[0173]
抗dsg1抗体用于治疗目的的用途
[0174]
发明人发现，促进fcγr诱导的对循环免疫复合物及凋亡角质细胞的清除即可促进皮损的愈合速度，并且，增强与fcγr结合的非致病性抗dsg1抗体可削弱天疱疮的皮肤损伤。所以，本文所述的非致病性抗dsg1抗体及其变体，具体例如pf1-2-6、pf1-8-2/5、pf24-2/6/13/16(us8846867b2，其通过引用纳入本文)、pf1-2-22及其与激活性fcγr亲和力增加的变体可用于治疗天疱疮。经发明人验证，重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变的抗体变体具有更高的fcγr亲和力和治疗效果：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变。
[0175]
因此，本发明还提供非致病性抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防天疱疮的药物中的应用，所述非致病性抗dsg1抗体变体含有：(1)至少一个选自以下序列的cdr：seq id no:3-6、seq id no:9-12、seq id no:15-18、seq id no:21-24、seq id no:27-30和seq id no:33-36，和(2)重链恒定区，所述重链恒定区是来源于人igg1或igg4的重链恒定区，并且所述重链恒定区与人fcγr的亲和力大于人igg1或igg4与人fcγr的亲和力。在一个或多个实施方案中，所述抗体变体的hcdr1包含seq id no:3-6中任一所示的序列、hcdr2包含seq id no:9-12中任一所示的序列、hcdr3包含seq id no:15-18中任一所示的序列、lcdr1包含seq id no:21-24中任一所示的序列、lcdr2包含seq id no:27-30中任一所示的序列和lcdr3包含seq id no:33-36中任一所示的序列；所述重链恒定区具有seq id no:49或seq id no:50所示的序列，并且所述重链恒定区包含选自以下任一组或多组的突变：(1)g236a、s239d、a330l和i332e；(2)g236a、a330l和i332e；(3)一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变；所述抗体的轻链恒定区具有seq id no:51-54中任一所示的序列。优选地，所述抗体的vh的氨基酸序列如seq id no:39-42中任一所示，和/或vl的氨基酸序列如seq id no:45-48中任一所示。同时，本发明治疗天疱疮的方法，包括给予对象治疗有效量的上述抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段，或含有所述抗dsg1抗体变体或其抗原结合片段的药物组合物。
[0176]
在一个或多个实施方案中，所述天疱疮是致病性抗dsg1抗体介导的天疱疮。所述致病性抗dsg1抗体是本文所述的致病性抗dsg1抗体或其变体。
[0177]
本文所述的治疗性抗dsg1抗体也可用作疫苗佐剂。该疫苗佐剂可以和疫苗(例如
ova)联用，形成疫苗组合物，可用于预防和/或治疗肿瘤，也可用于预防和/或治疗感染。
[0178]
诊断用途、测定和试剂盒
[0179]
本发明的抗dsg1抗体可用于诊断测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织(诸如皮肤)或细胞(诸如角质形成细胞)中表达的dsg1。抗dsg1抗体可用在进一步研究dsg1在疾病中的作用的研究中。
[0180]
本发明的抗dsg1抗体可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与dsg1相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中dsg1的存在。可以体内或体外进行dsg1的检测。适用于检测dsg1的存在的方法实例包括elisa、dif、iif、facs、ria等。
[0181]
对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记抗dsg1抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3h、14c、15n、35s、90y、99tc、111in、125i、131i)、荧光基团(例如，fitc、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团通过各种长度的间隔子臂与抗dsg1抗体偶合以减小潜在的位阻。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
[0182]
本发明的一个方面提供识别表达dsg1的细胞。在一个具体实施方案中，用标记基团标记抗体并检测经过标记的抗体与dsg1的结合。在另一个具体实施方案中，体内检测抗体与dsg1的结合。在另一个具体实施方案中，使用本领域中已知的技术来分离和测量抗体-dsg1。
[0183]
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合dsg1的测试分子的存在。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量dsg1的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合dsg1的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合dsg1。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
[0184]
药物组合物、施用途径
[0185]
本发明提供药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗dsg1抗体以及药学上可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。
[0186]
在某些实施方案中，药物组合物中可接受的稀释剂、载剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂等优选地在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒。在某些实施方案中，药物组合物可含有用于改善、维持或保留例如组合物的ph、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸收或渗透的这类物质。这些物质为现有技术已知，例如可参见remington's pharmaceutical sciences，第18版，a.r.genrmo编，1990，mack publishing company。可视预期的施用途径、递送方式和所需的剂量来确定最佳的药物组合物。
[0187]
可选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。或者，可选择组合物用于吸入或通过消化道(诸如经口)递送。所述药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术内。
[0188]
其它药物组合物将为本领域技术人员显而易见，包括在持续或控制释放递送配制
物中包含抗dsg1抗体的配制物。用于配制多种其它持续或可控传递方式的技术(诸如脂质体载剂、生物易蚀微粒或多孔珠粒和积存注射)也为本领域技术人员所知。
[0189]
用于体内施用的药物组合物通常以无菌制剂的形式提供。通过经无菌过滤膜过滤来实现灭菌。在组合物冻干时，可在冻干和复水之前或之后使用此方法进行灭菌。用于肠胃外施用的组合物可以冻干形式或在溶液中储存。肠胃外组合物通常放在具有无菌进入孔的容器中，例如具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液带或小瓶。
[0190]
药物组合物一经配制，就以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或以脱水或冻干粉末的形式储存在无菌小瓶中。所述配制物可储存成即用形式或在施用前复水的形式(例如，冻干)。本发明还提供用于产生单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可各自含有具有干燥蛋白的第一容器和具有含水配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供含有单腔和多腔预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
[0191]
本发明也提供通过施用本发明任一实施方案所述的抗dsg1抗体或其抗原结合片段或其药物组合物来治疗患者(尤其是患者的t细胞相关疾病，如t细胞相关癌症以及自体免疫疾病)的方法。
[0192]
本文中，术语“患者”、“受试者”、“个体”、“对象”在本文中可互换使用，包括任何生物体，优选动物，更优选哺乳动物(例如大鼠、小鼠、狗、猫、兔等)，且最优选的是人。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。有效治疗患者的治疗方案可根据多种因素(比如患者的疾病状态、年龄、体重及疗法激发受试者的抗癌反应的能力)而变。
[0193]
将采用的含有本发明抗dsg1抗体或其抗原结合片段的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗程度和目标。本领域技术人员将了解，用于治疗的适当剂量水平将部分取决于所递送的分子、适应症、施用途径和患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或状况(年龄和一般健康状况)而变化。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量并改变施用途径来获得最佳的治疗效果。
[0194]
给药频率将取决于所用配制物中特定抗dsg1抗体的药物动力学参数。临床医生典型地施用组合物直到达到实现所需效果的剂量。组合物因此可作为单次剂量施用，或随时间以作为两次或多次剂量(可含有或不含有相同量的所需分子)施用，或通过植入装置或导管以连续输液的方式施用。
[0195]
药物组合物的施用途径是根据已知方法，例如经口、通过静脉内、腹膜内、脑内(脑实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内、门静脉或病灶内途径注射；通过持续释放系统或通过植入装置。
[0196]
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
[0197]
实施例
[0198]
材料与方法
[0199]
1.实验材料
[0200]
1.1小鼠
[0201]
以c57bl/6背景的小鼠，包含新生wt小鼠、成年wt小鼠、fcγ受体人源化小鼠(hfcgr
tg
)(1)、fcγ受体敲除小鼠(fcγrα
null
)(1)和fc通用gamma链敲除小鼠(fcer1g-/-)(2,3)和以balb/c为背景的裸鼠(nude)。
[0202]
(1)c57 bl/6wt新生鼠，雌性，《48h，购自上海斯莱克实验动物中心；
[0203]
(2)c57 bl/6wt小鼠，雌性，8-10周，购自上海斯莱克实验动物中心；
[0204]
(3)hfcgr
tg
小鼠，fcγrα
null
小鼠，fcer1g-/-小鼠均由美国rockefeller大学jeffrey v.ravetch教授实验室惠赠；
[0205]
(4)balb/c nude小鼠，雌性，8-10周，或雄性，7-10周，购自上海斯莱克实验动物中心。
[0206]
1.2试剂与耗材
[0207]
1.2.1试剂
[0208]
1.2.1.1流式抗体及试剂
[0209][0210]
1.2.1.2 elisa试剂
[0211][0212][0213]
1.2.1.3其他试剂
[0214][0215][0216]
2.实验方法
[0217]
2.1抗dsg1单克隆抗体的构建和表达
[0218]
2.1.1质粒序列构建及合成
[0219]
实验所涉及的抗dsg1抗体及质粒如下：
[0220][0221]
上述三种人源抗dsg1抗体scfv克隆均来自于专利(专利号为us8846867b2，其通过引用纳入本文)，序列均来自于噬菌体展示技术，scfv序列包含轻链可变区(vl)和重链可变区(vh)，二者之间由一段连接片段相连，连接片段的氨基酸序列为ggssrssssggggsgggg。
[0222]
根据上述scfv序列，可以获得各个克隆的vl序列(连接片段前)和vh序列(连接片段后)，分别将vl和vh的序列与igblast tool数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)中human的数据进行对比，可以获取可变区v(d)j的信息以及最匹配的胚系(germline sequence)前导序列(leader sequence)。在各个可变区的前导序列前添加酶切位点ecor1的序列gaattc和kozak部分序列ccacc(其中第一个c与ecor1的末位c共用)。
[0223]
为获取轻链恒定区的信息，根据igblast的信息可以获知已知序列所对应的轻链类型，若为κ型，由于人的κ型轻链可变区只有一种，则可确定对应恒定区序列。若已知序列所对应的轻链类型为λ型，则需根据该序列最匹配j序列的使用推测最适恒定区，举例来说，
由于pf1-8-15的轻链对应类型为λ型，igblast的结果显示其最匹配的j为iglj7*01，则其最适c的选取为iglc7*01，可链接至imgt数据库获得iglc7*01的序列。考虑到绝大多数重链vh均以ss氨基酸结束，可根据密码子的简并性在vh结束区附近突变出xho1酶切位点。实验室保存有包含人igg1和igg4重链恒定区序列的表达质粒，所以只需合成xho1前的序列即可。已知表达载体在重链恒定区结束后接有终止密码子taa或tga和酶切位点not1。上述序列经上海铂尚生物技术有限公司合成至puc57质粒上。
[0224]
2.1.2质粒构建
[0225]
2.1.2.1酶切
[0226]
现有抗体目的片段合成于puc57载体上，需将其重构至表达载体pfl_dec上(4)。pfl_dec质粒为jeffrey v.ravetch教授实验室惠赠。轻链为全长合成，用ecor1和not1双酶切后回收目的片段(分子量较小片段，700-800bp)；重链只合成可变区，用ecor1和xho1双酶切后回收目的片段(分子量较小片段，400-500bp)。此次用于构建人igg1和igg4的载体分别带有人igg1和igg4的恒定区。
[0227][0228]
构建igg1的两个fc段变体n297a和gasdalie(g236a/s239d/a330l/i332e)，通过带有人igg1恒定区的表达载体点突变而来。例如，n297a突变所用正向引物为higg1(n297a)_f：gaggagcagtacgccagcacgtaccgtgtggtca，反向引物为higg1(n297a)_r：acggtacgtgctggcgtactgctcctcccgc。点突变的方法如下：
[0229][0230]
阴性对照组样本不加模板，其余与实验组一致。
[0231]
pcr程序为：94℃3min；94℃30s；60℃1min；72℃8min；72℃10min；10℃pause。中间变性、退火、延伸三个步骤进行20个循环。
[0232]
反应结束后取出15μl加1μl的dpn1用于酶切环状模板，再取出15μl不加dpn1，阴性对照组也取出15μl加1μl的dpn1，37℃水浴2h。水浴结束后，全部转化至dh5α感受态中。挑菌测序，序列正确的质粒用于下一步实验。
[0233]
(1)轻链酶切反应体系：50μl反应体系
[0234]
[0235][0236]
质粒包括含有目的片段的3个puc57和含有表达载体pfl_dec的其他克隆质粒。
[0237]
(2)重链酶切反应体系：50μl反应体系
[0238][0239]
质粒包括含有目的片段的3个puc57和含有人igg1和igg4恒定区的表达载体pfl_dec。
[0240]
将上述反应体系至于37℃水浴锅中酶切2h待回收。
[0241]
2.1.2.2连接
[0242]
(1)酶切后经胶回收目的片段，如下所示进行连接搭配和重构质粒
[0243][0244][0245]
(2)连接反应体系：10μl反应体系
[0246][0247]
混匀后室温静置5-10min，用于转化。
[0248]
2.1.2.2转化和测序
[0249]
所得质粒经dh5α感受态细胞转化并提取质粒测序(上海铂尚生物技术有限公司)，核对碱基序列是否与目的序列一致，若完全一致，则新质粒构建成功。
[0250]
用于测序的引物及序列如下：
[0251]
正向引物：pcmv-f：tctaaaagctgcggaattgt
[0252]
或pfl_dec_f：catccactttgcctttctctccac
[0253]
反向引物：pfl_dec_r：ggacaaaccacaactagaatgcagtg
[0254]
若两个反应不能测通，则加测1个反应至目的序列完全测通。
[0255]
2.1.3生产抗体
[0256]
2.1.3.1抗体表达
[0257]
转化成功构建的抗体表达载体并抽取质粒，用其转染经复苏、传代的293t、293s细胞并收集上清。
[0258]
293t细胞转染：待传代细胞生长至70-90％密度时，可进行转染。根据需要转染的细胞盘数(15cm培养皿)计算转染所需质粒、pei、opti-mem和dmem完全培养基用量：每盘细胞需要25μg的igg轻链质粒和25μg的重链质粒，两种质粒共同溶解在0.417ml opti-mem培养基中(v＝0.417ml*n，n为转染盘数)，每盘需50μg的pei(dna:pei＝1:1)，也溶解在0.417ml opti-mem培养基中(v＝0.417ml*n，n为转染盘数)。将pei与质粒混合，室温静置15min，此过程中dna和pei形成油包水结构，混合液变浑浊。此时可弃去待转染细胞中的培养基。将上述混合液加入至新配置的dmem完全培养基中(每盘25ml)，混匀后沿壁缓慢加入到待转染的细胞培养皿中。将细胞置于37℃细胞培养箱中培养。
[0259]
收上清：转染72h后首次收集细胞培养上清，并给细胞换新培养基，48h后再次收集培养上清。每次收集上清后均需充分离心(4000g，35min，降速为4)，并用0.22μm滤器(filter)抽滤弃去上清中的细胞和杂质。将抽滤后的上清保存在4℃冰箱中待纯化。
[0260]
293s细胞转染：待传代细胞生长至(3-4)*10^6/ml时，可进行转染。首先，给待转染的细胞换液(400g，5min离心弃去培养基，并用提前预热的等量培养基重悬)。根据待转染细胞的体积计算所需抗体质粒和pei用量，即100ml待转染细胞需50μg轻链质粒和50μg重链质粒，以及600μg pei(dna:pei＝1:6)，用1ml(1ml:100ml＝1:100，保持相应比例)无血清培养基分别溶解dna和pei，室温静置2min。然后将稀释后的pei缓慢滴入含有质粒的培养基中，混匀后室温静置5min。将混匀的dna/pei混合物缓慢滴入换液后的细胞中，置于摇床继续培养。4h后加入与转染细胞体积等量的培养基，此时细胞浓度将降至转染密度的一半。补液24h后待细胞密度增至3*10^6/ml左右时向转染细胞中加入vpa(终浓度为3.8mm)以阻止细胞增殖，48-72h之间补充d-( )-葡萄糖(终浓度为4g/l)。之后继续培养2-3天，收取上清，抽滤，置于4℃冰箱，待纯化。
[0261]
2.1.3.2抗体纯化
[0262]
1)protein g琼脂糖(agarose)保存在20％乙醇中，摇匀后吸出适量至15ml离心管中，加10ml pbs清洗(2000g，3min，弃去液体)；
[0263]
2)向转染后的细胞上清中加入适量清洗后的protein g琼脂糖(贴壁培养1l上清加1ml protein g琼脂糖，悬浮培养400ml上清加1ml protein g琼脂糖)，并加入高压灭菌的磁力搅拌子，置于磁力搅拌器上4℃搅拌4h或过夜，使得igg与protein g充分结合；
[0264]
3)静置或离心上述加有protein g琼脂糖的上清，用25ml移液管从上至下吸取上清至纯化柱中，注意尽量不要使protein g琼脂糖悬浮起来，上清通过重力作用缓慢经过柱子。待上清剩余20ml左右时，轻轻混匀protein g琼脂糖，转移至纯化柱中；
[0265]
4)用20ml预冷pbs清洗离心瓶中残余protein g琼脂糖，并转移至纯化柱；
[0266]
5)待上述pbs全部通过纯化柱，加入20ml预冷的pbs再次清洗纯化柱中的protein g琼脂糖；
[0267]
6)待所有pbs充分清除，用ph 2.7的0.1m甘氨酸(glycine)洗脱protein g琼脂糖上结合的igg，并提前准备好ph 8.0-9.0的1m tris-hcl用于中和洗脱下的蛋白溶液(每1ml甘氨酸对应0.15ml的tris-hcl)；
[0268]
7)根据转染体系确定洗脱的管数，10000g，1min离心去气泡和变性蛋白，用nanodrop测igg浓度；
[0269]
8)将有抗体的洗脱液用注射器转移至透析膜中，置于3-5l pbs中4℃透析过夜，第二天换新的pbs，再次透析4h。
[0270]
9)用注射器吸出透析膜内的igg溶液，10000g，1min离心去气泡和变性蛋白，用nanodrop测igg浓度，记录260/280比值，将igg溶液置于4℃冰箱保存。
[0271]
2.1.4抗体质量和活性检测
[0272]
2.1.4.1 igg sds-page蛋白胶
[0273]
1)根据kit配置8％或10％的sds-page胶；
[0274]
2)配置igg上样液：20μl上样液
[0275][0276]
混匀后将还原型抗体上样液置于95-100℃金属浴中煮10min，用于上样。
[0277]
3)将sds-page胶置于电泳槽中，加入适量1x跑胶缓冲液，将蛋白依次加入上样孔，注意正负极不要反；
[0278]
4)200v，35min跑胶，根据指示剂的位置适当调整跑胶时间；
[0279]
5)拆胶，去除浓缩层，将分离层胶片置于考马斯亮蓝染液中室温染5-10min；
[0280]
6)弃去染液，用ddh2o洗去多余的染液，待加入的ddh2o不再变蓝时，置于微波炉中高火煮5min促进胶上非特异结合染液的清除；
[0281]
7)待胶的背景呈无色或淡蓝色，拍照。
[0282]
2.1.4.2 elisa检测抗dsg1 igg与dsg1蛋白的结合
[0283]
1)包被：2-5μg/ml表达纯化的dsg1-flaghis，100μl/孔，用tbs-ca(tbs缓冲液，含1mm cacl2)稀释，4℃孵育过夜；
[0284]
2)封闭：弃去上述孔板里的液体，用tbst-ca(tbs缓冲液，含1mm cacl2and 0.05％tween 20)洗板2次，在干净的吸水纸上拍干，每孔加入1％的bsa溶液，室温孵育2h；若用商品化试剂盒(mbl，7880cn)，则包被和封闭两步可省去；
[0285]
3)加样：弃去封闭液，洗板，根据需要稀释表达上清或纯化后的抗dsg1 igg1/igg4抗体(10μg/ml)，100μl/孔，室温孵育1h；
[0286]
4)检测：弃去样本，用tbst-ca洗板4遍，拍干后加入用tbs-ca稀释的羊抗人igg fc hrp(bethyl，1:5000)，100μl/孔，室温避光孵育1h；
[0287]
5)显色：弃去样本，用tbst-ca洗板6遍，拍干后加入tmb溶液a和溶液b等比配制的hrp的底物，100μl/孔，避光，读取5min，10min，15min，30min，60min的od650吸光值。选取信噪比最高的时间点数值进行计算和统计。
[0288]
2.1.4.3 elisa检测抗dsg1 igg1、igg4及igg1变体n297a和gasdalie与dsg1蛋白的结合动力学
[0289]
1)包被：2μg/ml表达纯化的dsg1-flaghis，100μl/孔，用tbs-ca稀释，4℃孵育过夜；
[0290]
2)封闭：弃去上述孔板里的液体，用tbst-ca洗板2次，在干净的吸水纸上拍干，每孔加入1％的bsa溶液，室温孵育2h；
[0291]
3)加样：弃去封闭液，洗板，加入3.16倍梯度稀释的纯化后的抗dsg1 igg1、igg4及igg1变体n297a和gasdalie抗体(pf1-8-15)，抗adamts13 igg1为无关蛋白对照，样本浓度范围为3.16μg/ml-0.00316μg/ml，tbs-ca为阴性对照(0μg/ml)，每个样本两个复孔，100μl/孔，室温孵育1h；
[0292]
4)检测：弃去样本，用tbst-ca洗板4遍，拍干后加入用tbs-ca稀释的biotin-小鼠抗人igg轻链λ(bd，jdc-12，1:1000)，100μl/孔，室温孵育1h；
[0293]
5)弃去样本，用tbst-ca洗板4遍，拍干后加入用tbs-ca稀释的streptavidin-hrp(bd，1:1250)，100μl/孔，室温孵育1h；
[0294]
6)显色：弃去样本，用tbst-ca洗板6遍，拍干后加入hrp的底物tmb，100μl/孔，读取od650吸光值。选取信噪比最高的时间点数值进行计算和统计。
[0295]
2.1.4.4竞争法elisa检测不同克隆抗dsg1 igg1识别dsg1表位
[0296]
1)包被：2μg/ml tbs-ca稀释的igg1_pf1-8-15、pf24-9、pf1-2-22，tbs-ca为阴性对照，100μl/孔，4℃过夜；
[0297]
2)封闭：弃去包被液，用tbst-ca洗板2遍并拍干，加1％bsa，200μl/孔，室温2h；
[0298]
3)抗原：弃去封闭液，用tbst-ca洗板2遍并拍干，加入1μg/ml dsg1-flaghis，100μl/孔，室温1h；
[0299]
4)加标记抗体：弃去孔中液体，洗板4次并拍干，一组加入竞争抗体：加入生物素标记的igg1_pf1-8-15，以及作为阴性对照的生物素标记igg1_αcd40，1μg/ml，100μl/孔，室温1h；另一组加入检测抗体：用于检测dsg1是否与包被抗体结合的鼠抗flag m2抗体(sigma-aldrich)，1:3000，100μl/孔，室温1h；
[0300]
5)酶标亲和素：弃去孔中液体，洗板4次并拍干，第一组加入hrp标记的streptavidin，1:1000，100μl/孔，室温1h；第二组加入羊抗鼠igg fc hrp(jackson immunoresearch laboratories)，1:5000，100μl/孔，室温1h；
[0301]
6)底物：弃去孔液体，用tbst-ca充分洗板6遍，加入tmb，100μl/孔，不加终止液，读od650信号值，取信噪比最高的时间点数值进行计算和统计。
[0302]
2.1.4.5elisa检测抗dsg1 igg结合mouse fcγrs
[0303]
1)包被：2μg/ml抗dsg1 igg1/4以及igg1变体n297a/gasdalie，克隆为pf1-8-15，100μl/孔，4℃过夜；此次实验所用试剂稀释液均为pbs。
[0304]
2)封闭：弃去包被液，用pbst(pbs缓冲液，含0.05％tween 20)洗板4次并拍干，加1％bsa，200μl/孔，室温孵育2h；
[0305]
3)加标记mfcγrs：弃去封闭液，洗板4次并拍干，分别加入商品化的生物素标记的mfcγr1(cd64-b)、mfcγr2b(cd32-b)、mfcγr3(cd16-2-b)、mfcγr4(cd16-b)。mfcγrs的浓度从1μg/ml开始，3.16倍稀释至0.001μg/ml，pbs作为阴性对照，100μl/孔，室温孵育1h；
[0306]
4)酶标亲和素：弃去孔中液体，用pbst洗板4次并拍干，加入hrp标记的streptavidin，1:1000稀释，100μl/孔，室温1h；
[0307]
5)底物：弃去孔中液体，用pbst洗板6次并拍干。加入tmb，100μl/孔，不加终止液，读od650信号值，取信噪比最高的时间点数值进行计算和统计。
[0308]
2.2抗dsg1抗体诱导小鼠皮损体内实验
[0309]
2.2.1新生鼠模型
[0310]
1)小鼠：c57bl/6新生鼠(斯莱克，中国上海)，出生48h内；
[0311]
2)抗体类型：抗dsg1 igg1和igg4(pf24-9或pf1-8-15)，ctrl higg作为阴性对照；
[0312]
3)抗体剂量：pbs稀释抗体至50μl/小鼠，其中pf1-8-15为10μg/小鼠，pf24-9为15.8μg/小鼠。
[0313]
4)给药途径：左侧皮肤皮下给药(s.c.)；
[0314]
5)观察指标：病理改变(he)；
[0315]
6)实验过程：用pbs稀释纯化的抗dsg1 igg1和igg4抗体至50μl/小鼠，经皮下注射到新生小鼠的左测皮肤，7小时后断头处死小鼠，取左右两侧皮肤用于苏木素-伊红(he)染色。
[0316]
2.2.2构建fcγr人源化成年鼠落叶型天疱疮模型
[0317]
1)小鼠：8-10周雌性hfcgr
tg
小鼠；
[0318]
2)抗体类型：致病性抗dsg1 igg1(pf24-9)；
[0319]
3)抗体剂量：1mg*3剂量致病性抗dsg1 igg1(pf24-9)；
[0320]
4)给药途径：颈部皮下(s.c.)；
[0321]
5)观察指标：肉眼皮损(拍照)、病理改变(he)、直接免疫荧光(dif)；
[0322]
6)实验过程：将hfcgr
tg
小鼠分2组，每组2只。day 0、day 2、day 4分别经颈部皮下给2只小鼠注射1mg抗体(三溴乙醇腹腔麻醉)，另外2只小鼠不做处理。观察小鼠皮肤状态(有无水泡，糜烂和结痂等改变)。day 6实验终止前再次麻醉小鼠，拍照记录皮损，处死小鼠，取耳朵和皮肤固定在4％多聚甲醛或10％甲醛中用于he染色和直接免疫荧光染色(dif)。
[0323]
2.2.3构建fcγr人源化和fcγr缺陷骨髓嵌合小鼠
[0324]
考虑到hfcgr
tg
和fcγrα
null
较珍贵，且数量不足，故构建两种基因型小鼠的骨髓嵌合小鼠(4)，步骤如下：
[0325]
1)取出基因型为hfcgr
tg
和fcγrα
null
的小鼠的后腿骨头，剔去周围肌肉；
[0326]
2)用剪刀剪开骨头两端，用吸有pbs的1ml注射器吹打骨髓腔至骨髓被充分吹出；
[0327]
3)将吹出的骨髓细胞经70μm的细胞筛网过滤后，转移至15ml离心管中，400g离心5min；
[0328]
4)弃去上清，加入5ml预冷的无菌ack溶液(155mm nh4cl，10mm khco3，0.1mm edta-na)冰上裂解5min；
[0329]
5)加9ml pbs终止裂解，400g离心5min；
[0330]
6)弃上清，用适量的pbs重悬，计数，使得细胞的终浓度为1*10^7/ml；
[0331]
7)辐照c57bl/6wt小鼠，分两次辐照，每次4戈瑞(gray)，两次间隔3h；
[0332]
8)辐照完成大于3h后，通过尾静脉给小鼠注射2*10^6个(200μl)特定基因型的骨髓细胞；
[0333]
9)骨髓重建两个月后，眼眶采血，检测cd19

b细胞和cd11b

髓系细胞表面fcγr的表达(2.4g2标记小鼠fcγrii/iii，抗hcd32标记人fcγriib的表达)。
[0334]
2.2.4在fcγr人源化和fcγr缺陷小鼠中比较抗dsg1 igg1/4的致病性
[0335]
1)小鼠：骨髓重建2-4月后的雌性hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠；
[0336]
2)抗体类型：ctrl higg、致病性抗dsg1 igg1和igg4(pf24-9)；
[0337]
3)抗体剂量：0.4mg/鼠；
[0338]
4)给药途径：尾静脉(i.v.)；
[0339]
5)观察指标：病理改变(he)、耳朵炎性细胞浸润(流式细胞术)；
[0340]
6)实验过程：将hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠分别分3组，共6组，每组4-5只小鼠。day 0经尾静脉分别给hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠注射0.4mg的ctrl higg、抗dsg1 igg1和抗dsg1 igg4。观察小鼠皮肤状态(有无水泡，糜烂和结痂等改变)。day 3实验终止前麻醉小鼠，拍照记录皮损，处死小鼠，取1只耳朵固定在4％多聚甲醛或10％甲醛中用于he染色，消化另一只耳朵用于流式检测；
[0341]
7)消化耳朵，制备单细胞悬液：
[0342]
剪下耳朵(从根部剪，但不要太深，不应该观察到出血)；用镊子将耳朵分为背侧和腹侧两部分；将耳朵置于含有2.5mg/ml dispase ii的2％fbs溶液中，然后在37℃的培养箱中孵育90分钟(每只耳朵2ml dispase ii溶液)；分离真表皮，在pbs中清洗，用剪刀将真表皮剪成小碎块，然后将其放入含有100u/ml dnase i和0.5mg/ml胶原蛋白酶iv的2ml rpmi-1640完全培养基中37℃孵育1h；将消化后的真表皮组织及消化液转移到置于50ml离心管上的70μm细胞筛网，用1ml注射器的活塞柄充分碾压组织以获得更多的细胞；通过筛网向消化后的细胞中加30ml预冷的pbs，1000g离心5min清洗细胞；弃上清，加0.6ml facs缓冲液重悬细胞，即获得耳朵细胞单细胞悬液。
[0343]
8)流式检测耳朵炎性细胞浸润：
[0344]
用facs缓冲液配制流式抗体mix，包括cd45.2-af700(bd，克隆104，1:200)，cd11b-apc(ebioscience，克隆m1/70，1:500)，gr1-fitc(ebioscience，克隆rb6-8c5，1:500)；分别
取0.3ml耳朵单细胞悬液置于96孔u底板中，400g离心5min，弃上清；每孔加50μl流式抗体mix重悬细胞，冰上染15min；每孔加150μl pbs，400g离心5min，弃上清，洗去游离的抗体；每孔加200μl pbs，400g离心5min，弃上清，再次洗涤细胞；每孔加300μl含有0.5μg/ml dapi(invitrogen)和1:100稀释countbright
tm absolute counting beads(life technologies)的facs溶液重悬细胞；流式上机检测，所用仪器为bd lsrfortessa
tm x-20分析仪(bd biosciences)。
[0345]
2.2.5在fcγr人源化小鼠中比较抗dsg1 igg1变体gasdalie和n297a的致病性
[0346]
1)小鼠：骨髓重建2-4月后的雌性hfcgr
tg
小鼠；
[0347]
2)抗体类型：ctrl higg、致病性抗dsg1 igg1(pf1-8-15)或(pf24-9)fc变体n297a和gasdalie；
[0348]
3)抗体剂量：0.5mg/鼠；
[0349]
4)给药途径：尾静脉(i.v.)；
[0350]
5)观察指标：病理改变(he)、角质形成细胞凋亡情况(tunel染色)、耳朵炎性细胞浸润(流式细胞术)；
[0351]
6)实验过程：将hfcgr
tg
小鼠分成3组，每组4-5只小鼠。day 0经尾静脉给3组小鼠注射0.5mg的ctrl higg、抗dsg1 n297a和抗dsg1 gasdalie。观察小鼠皮肤状态(有无水泡，糜烂和结痂等改变)。day 3实验终止前麻醉小鼠，拍照记录皮损，处死小鼠，取1只耳朵固定在4％多聚甲醛或10％甲醛中用于he染色和tunel检测，消化另一只耳朵用于流式检测。
[0352]
2.2.6在fcγr人源化和fcγr缺陷小鼠中比较抗dsg1 igg1变体gasdalie的致病性
[0353]
1)小鼠：骨髓重建2-4月后的雌性hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠；
[0354]
2)抗体类型：ctrl higg和致病性抗dsg1 igg1 fc变体gasdalie(pf1-8-15)；
[0355]
3)抗体剂量：0.5mg/鼠；
[0356]
4)给药途径：尾静脉(i.v.)；
[0357]
5)观察指标：肉眼皮损(拍照)、病理改变(he)、耳朵炎性细胞浸润(流式细胞术)；
[0358]
6)实验过程：将hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠分别分2组，共4组，每组2-4只小鼠。day 0经尾静脉分别给hfcgr
tg
和fcγrα
null
小鼠注射0.5mg的ctrl higg或抗dsg1 gasdalie。观察小鼠皮肤状态(有无水泡，糜烂和结痂等改变)。day 3实验终止前麻醉小鼠，拍照记录皮损，处死小鼠，取1只耳朵固定在4％多聚甲醛或10％甲醛中用于he染色，消化另一只耳朵用于流式检测。
[0359]
2.2.7裸鼠模型
[0360]
2.2.7.1比较抗dsg1 igg1变体gasdalie和n297a的致病性
[0361]
1)小鼠：8-10周的雌性裸鼠(斯莱克，中国上海)；
[0362]
2)抗体类型：抗dsg1 igg1变体n297a和gasdalie(pf1-8-15)，ctrl higg作为阴性对照；
[0363]
3)抗体剂量：0.4mg或0.5mg/鼠；
[0364]
4)给药途径：尾静脉(i.v.)；
[0365]
5)观察指标：肉眼皮损(拍照)、病理改变(he)、tunel染色、elisa检测血清higg残留和dsg1-ab免疫复合物；
whitney检验或双因素方差分析(two-way anova)，带有sidak多重比较试验(sidak's multiple comparisons test)，三组及以上组间均数差异采用单因素方差分析(one-way anova)或双因素方差分析(two-way anova)，带有tukey多重比较试验(tukey's multiple comparisons test)。p《0.05表示差异具有统计学意义，标记为*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
[0380]
实施例1，抗dsg1自身抗体的表达和活性验证
[0381]
制备了两组抗dsg1抗体克隆(pf1-8-15和pf24-9)，每组均表达为igg1和igg4抗体(图1，a)，elisa结果显示两个克隆的igg1和igg4均结合dsg1蛋白(图1，b)。为了研究fc-fcγr相互作用对抗体致病性的影响，还制备了抗dsg1 igg1的两个fc变体n297a和gasdalie(图1，c)。与人dsg1胞外段蛋白的结合实验证实带有不同恒定区的抗体以相似的动力学与dsg1结合(图1，d)，提示抗体的恒定区不影响其对抗原的结合能力。将制备的抗体注射给新生小鼠进行测试时，人igg4和igg1抗dsg1抗体均可诱导新生鼠表皮棘皮松解，即恒定区不改变相应克隆的致病性(图2)。
[0382]
实施例2，构建落叶型天疱疮成年鼠模型
[0383]
虽然新生鼠模型是目前研究天疱疮自身抗体最常用的模型，但由于天疱疮的发生是在持续不断的免疫反应中逐渐形成的，通常是一种影响成年人和老年人的慢性疾病，与新生鼠在年龄上不匹配；并且新生鼠寿命有限，只能进行短时间(通常为数小时)的观察和研究，不适合进行预后及药物疗效观察；新生鼠免疫系统未完全发育，不能反映病人的真实情况，因此我们开发了一个基于成年小鼠的pf模型。如图11所示，给予一定剂量抗dsg1 pf24-9(igg1)自身抗体的成年hfcgr
tg
小鼠可以再现pf患者的临床、组织学和免疫学特征，包括糜烂面、结痂、人igg在病变部位及邻近皮肤组织表皮细胞间沉积，以及包括耳朵和皮肤表皮起泡在内的组织病理学变化(图3，a-c)。此外，我们在小鼠疾病发作期间还观察到了病变部位表皮增厚以及白细胞浸润(图3，c)，症状通常持续几天，取决于自身抗体的用量。免疫细胞浸润的结果与前人对天疱疮患者的皮肤样本进行的分析以及对患者病变部位淋巴细胞浸润的最新描述一致。因此，我们认为致病性抗dsg1抗体的过继转移足以在成年小鼠中引发天疱疮，该模型使用fc受体人源化小鼠，更适合对人源抗体的研究，且该模型可以在完整免疫系统的背景下研究不同抗dsg1自身抗体在疾病发作和预后过程中的致病性。
[0384]
实施例3，抗dsg1 igg4自身抗体的致病性不比igg1弱
[0385]
为了研究igg亚型是否影响抗dsg1自身抗体的致病性，我们先在hfcgr
tg
小鼠中评估了较高剂量pf24-9(igg4)和pf24-9(igg1)自身抗体的致病性(图3，b)。给予pf24-9(igg4)和pf24-9(igg1)自身抗体后，我们在两组小鼠的皮肤和耳朵组织中均观察到了表皮起泡和白细胞浸润(图3，c)。有趣的是，当降低抗dsg1自身抗体的剂量时，就组织病理学检查(he而言)，pf24-9(igg4)的致病性似乎不比pf24-9(igg1)抗体弱，反而比pf24-9(igg1)抗体诱导更严重的表皮内水疱和炎性细胞浸润(图4，a上)。
[0386]
实施例4，抗dsg1自身抗体在fcγr缺陷时具有更强的致病性
[0387]
考虑到igg1和igg4亚型之间最主要的区别之一在于与fcγr的结合能力及诱导的效应不同，为了研究fc-fcγr相互作用是否影响抗dsg1抗体的致病性，我们使用了fcγr缺陷小鼠(fcγrα
null
)。我们给hfcgr
tg
小鼠和fcγrα
null
小鼠同时注射相同剂量的对照人igg和抗dsg1 igg1和igg4抗体，几天后处死小鼠，取小鼠耳朵进行he和流式检测，结果显示与
hfcgr
tg
小鼠相比，pf24-9(igg4)和pf24-9(igg1)自身抗体均诱导fcγrα
null
小鼠出现更严重的耳部损伤(图4，a)。当我们将小鼠耳朵消化制备单细胞悬液，并进行流式检测时，相较于hfcgr
tg
小鼠，无论是pf24-9(igg4)还是pf24-9(igg1)均诱导fcγrα
null
小鼠耳朵出现更明显的髓系细胞浸润(图4，b-d)，尤其是与炎症相关的中性粒细胞(图4，e-g)。这些结果表明抗dsg1自身抗体可诱发皮肤损伤和急性炎症，且fcγr缺陷时疾病更加严重，即fc-fcγr相互作用的存在可减轻抗dsg1自身抗体诱导的皮肤病变。
[0388]
实施例5，与fcγr亲和力低的抗dsg1自身抗体(pf24-9)更具致病性
[0389]
为了进一步研究fc-fcγr相互作用是否减弱了抗dsg1自身抗体的致病性，我们制备了抗dsg1 igg1自身抗体的fc变体n297a和gasdalie(n297a几乎不与fcγr结合，fcγr介导的效应功能削弱；gasdalie与fcγr结合能力更强，fcγr介导的效应功能增强(图1，e)，并在落叶型天疱疮成年鼠模型中评估二者的致病性的强弱(图5，a)。结果显示相较于高亲和力的gasdalie，致病性抗dsg1克隆pf24-9的n297a变体诱导hfcgr
tg
小鼠更明显的耳部病变(图5，b)和更严重的炎症，如图所示，n297a处理组小鼠耳朵的厚度和重量均较相应gasdalie组明显增加(图5，c-d)，且浸润性中性粒细胞也明显增多(图5，e-g)。考虑到gasdalie的效应功能更强，结合抗原形成免疫复合物后被清除的速率可能更快，我们还检测了处理后小鼠血清higg的残留。与预期一致，gasdalie的血清含量明显低于n297a。
[0390]
实施例6，与fcγr亲和力低的抗dsg1自身抗体(pf1-8-15)更具致病性
[0391]
为了研究该现象是否对其他致病性抗dsg1抗体同样适用，我们还在hfcgr
tg
成年鼠中比较了pf1-8-15的两个igg1变体n297a和gasdalie的致病性(图6)。与pf24-9的表型一致，我们发现与fcγr结合能力较弱的n297a组小鼠的皮损(图6，a-b)、耳朵红肿(图6，c-d)和炎性细胞浸润(图6，f-g)均比增强与fcγr结合的gasdalie严重。为了研究抗体亚型及fc-fcγr相互作用对皮损愈合期的影响，取较早的时间点(第3天)(图6，a)和较晚的时间点(第6天)(图6，b)的病变皮肤进行组织病理学分析，结果显示，虽然pf1-8-15(n297a)和pf1-8-15(gasdalie)两种变体均可以诱导皮肤损伤，但pf1-8-15(gasdalie)变体处理组小鼠恢复得更快。检测抗体处理后小鼠血清higg残留可以发现，gasdalie的血清含量明显低于n297a，提示增强与fc受体结合可能会通过加速免疫复合物的清除来减缓疾病的症状，促进疾病的愈合。
[0392]
实施例7，裸鼠中与fcγr亲和力低的抗dsg1自身抗体致病性强且愈后慢
[0393]
考虑到上述成年鼠体表被毛发覆盖，不易直接观察皮损数量和面积，我们还在裸鼠中比较了n297a和gasdalie抗dsg1自身抗体的致病性。裸鼠无毛发，可以更好地观察到皮肤病变。如图7所示，给予相同剂量的抗体后，相较于pf1-8-15(gasdalie)，与之匹配的pf1-8-15(n297a)自身抗体诱导裸鼠出现更严重的皮肤损伤(图7，a)并且恢复也相对较慢(图7，b)。裸鼠实验的结果进一步支持了fc-fcγr相互作用削弱抗dsg1自身抗体致病性的观点，并且该过程不依赖t细胞。
[0394]
实施例8，fc-fcγr相互作用可减轻dsg1自身抗体的致病性
[0395]
为了进一步论证上述观点，我们还在hfcgr
tg
小鼠和fcγrα
null
小鼠中比较了pf1-8-15(gasdalie)自身抗体的致病性(图8，a)，与上述观点一致，结果显示pf1-8-15(gasdalie)自身抗体在缺乏fcγr的fcγrα
null
小鼠中诱导更严重的皮肤病变和炎症(图8，b-c)以及中性粒细胞浸润(图8，d-f)。检测抗体处理3天后小鼠血清人igg残留可以看出fc
γr缺陷时抗dsg1抗体的代谢较慢，而对照抗体的代谢无差异(图8，g)。这些结果均提示fc-fcγr相互作用通过影响免疫复合物的清除来影响抗dsg1抗体的致病性。
[0396]
实施例9，fcγr介导的效应功能促进抗dsg1自身抗体诱导的免疫复合物和凋亡角质形成细胞的清除
[0397]
由于两种针对fc-fcγr相互作用的抗dsg1自身抗体igg1变体n297a和gasdalie均可触发皮肤损伤，这与之前已发表文献中所报道的抗dsg1 scfv或fab即可致病相一致，即抗体fc段不是抗dsg1抗体致病所必需，因此推测实验中观察到的fc-fcγr相互作用减弱抗dsg1自身抗体所致的皮肤损伤发生在组织修复阶段并受到fcγr介导的效应功能影响。fcγr介导的效应功能主要通过清除免疫复合物来实现。检测hfcgr
tg
(图5，h、图6，h和裸鼠血清(图9，a)中残余抗dsg1自身抗体水平，以及在的hfcgr
tg
和fcγrα
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小鼠中比较抗dsg1 gasdalie的残留水平(图8，g)的分析结果表明，当fcγr存在时，与之结合较强的gasdalie抗dsg1自身抗体的耗竭速度要快于几乎不与之结合的n297a抗dsg1自身抗体，这提示多数dsg1-自身抗体免疫复合物的清除是依赖fcγr的。与该观点相一致，相较于pf1-8-15(gasdalie)处理组小鼠(裸鼠)，我们在pf1-8-15(n297a)处理组小鼠血清中检测到了更高水平的dsg1-自身抗体免疫复合物(图9，b)，说明fc-fcγr相互作用影响免疫复合物的清除。除了pf1-8-15(n297a)诱导裸鼠表皮内水疱的能力远远强于pf1-8-15(gasdalie)外(图9，c)，我们还在pf1-8-15(n297a)处理的裸鼠皮肤病变处观察到了较多凋亡的角质形成细胞(图9，d)，表明fcγr介导的效应功能会促进凋亡角质形成细胞的清除。凋亡细胞的不及时清除会引发坏死，坏死为炎症性反应，释放的细胞因子会进一步诱发组织损伤。因此fc-fcγr相互作用不足导致凋亡角质形成细胞的清除受限，会延缓组织修复。
[0398]
实施例10，增强与fcγr结合的非致病性抗dsg1自身抗体可削弱致病性抗dsg1抗体诱导的皮肤损伤
[0399]
综合上述研究结果，我们可将抗dsg1自身抗体在疾病发生发展中的作用分为两部分，一部分是fab诱导的皮损发生，该过程发生的相对较早，与抗体识别表位有关，不依赖fc段；另一部分是fc段介导的损伤修复，该过程发生在皮损出现之后，发生相对较晚，通过fcγr介导的对循环免疫复合物的清除(脱落游离的dsg1)及凋亡角质形成细胞的清除(膜上dsg1)影响皮损的愈合速度。由于促进fcγr诱导的对循环免疫复合物及凋亡角质细胞的清除即可促进皮损的愈合速度，推测非致病性的抗dsg1抗体也可以通过增强fcγr介导的自身抗原-自身抗体免疫复合物的清除，从而促进皮肤损伤的愈合。为此，我们将非致病性抗dsg1 scfv(pf1-2-22)重组成人igg1gasdalie变体(图10，a)，该克隆可通过交叉反应识别鼠dsg1，并与致病性抗dsg1克隆pf1-8-15和pf24-9具有不同的结合表位(图10，b-c)。
[0400]
值得注意的是，当我们给裸鼠同时注射致病性的pf1-8-15(n297a)和等剂量的非致病性pf1-2-22(gasdalie)时(图11，a)，与预期一致，非致病性pf1-2-22(gasdalie)可以减轻裸鼠中致病性pf1-8-15(n297a)自身抗体诱导的皮肤病变，包括皮肤损伤面积的大小(图11，b)和组织病理学染色所见表皮内起泡的范围(图11，c)。此外，相较于只给致病性pf1-8-15(n297a)处理的裸鼠，添加了等剂量非致病性抗dsg1自身抗体的小鼠皮肤组织中表皮中的凋亡角质形成细胞更少(图11，d)，提示非致病性pf1-2-22(gasdalie)亦可通过促进fcγr介导的效应功能影响致病性抗dsg1抗体的致病性。这些结果表明，fcγr介导的效应功能可以通过促进凋亡角质形成细胞的清除而减弱致病性抗dsg1自身抗体诱导的皮肤
损伤，避免这些凋亡的角质形成细胞继发性坏死并引起炎症，因此有助于落叶型天疱疮模型中dsg1自身抗体诱导的皮损愈合。
[0401]
实施例11，与fcγr结合增强的非致病性抗dsg1抗体
[0402]
基于上述实施例可知，gasdalie(pf1-2-22)通过增强与fcγr的结合效应来减弱致病性抗dsg1抗体的致病性。我们研究了其他改变fcγr的结合效应的突变，通过a/i比值发现gaalie(g236a/a330l/i332e)(nature.2020oct 8；1-6、j.clin.invest.129,3952
–
3962(2019)、cell 161,1035
–
1045(2015).和cell 158,1243
–
1253(2014).)和asym-mab1(一条重链恒定区包含l234y、l235q、g236w、s239m、h268d、d270e和s298a突变，另一条重链恒定区包含d270e、k326d、a330m和k334e突变)(mabs.mar-apr 2013；5(2):229-36.和antibodies(basel).2020nov 17；9(4):e64)能增强igg与激活性fc受体结合并获得比gasdalie(pf1-2-22)更强的fcγr的结合效应。
[0403]
a/i比值的意义为抗体fc结构域结合激活性fcγrs和抑制性fcγr亲和力的比值，具体计算为(iia iiia)/iib＝[kd(fcγriia) kd(fcγriiia)]/kd(fcγriib)；或iia/iib＝[kd(fcγriiah131)或/kd(fcγriiar131)]/kd(fcγriib)；或iiia/iib＝[kd(fcγriiiaf158)或/kd(fcγriiiav158)]/kd(fcγriib)。即igg变体a/i比值相对于野生型igg1 a/i比值的倍数改变(fold＝kd(igg1)/kd(变体))。igg变体a/i比值相对于野生型igg1 a/i比值的倍数改变越大，意味着其效应功能越强。
[0404]
结果显示，gasdalie变体(fold＝kd(igg1)/kd(variant)＝20)，gaalie变体(fold＝kd(igg1)/kd(variant)＝40)，asym-mab1变体(fold＝kd(igg1)/kd(variant)＝2188或1032)。上述结果表明：相较于野生型igg1抗体，gaalie与asym-mab1变体的a/i比值增加倍数比gasalie变体大，因此其效应功能强于gasdalie，耦联非致病性抗dsg1抗体克隆也对疾病具有保护作用。
[0405]
因此，gaalie(g236a/a330l/i332e)和asym-mab1是进一步增强igg与激活性fc受体结合的变体，其耦联非致病性抗dsg1抗体克隆(例如pf1-2-22的可变区)后，也可减弱致病性抗dsg1抗体的致病性并治疗天疱疮。
[0406]
此外，发明人还验证了其他非致病性的抗dsg1抗体克隆pf1-2-6、pf1-8-2/5、pf24-2/6/13/16。将这些抗体的可变区与前述实施例中的具有gasdalie突变的恒定区(igg1或igg4)偶联后，也具有减弱致病性抗dsg1抗体的致病性并治疗天疱疮的作用。