一种高载乳酸菌肉用直投式发酵剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及发酵剂技术领域，特别是涉及一种高载乳酸菌肉用直投式发酵剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.乳酸菌是一类革兰氏阳性菌，需氧或兼性厌氧，可以通过多种途径抑制某些腐败菌的生长，如产生苯乳酸、乙酸或乳酸等有机酸而导致环境ph值降低，从而抑制不耐酸细菌的生长；其次乳酸菌能产生抑菌活性的代谢产物，即细菌素(尼森、罗氏菌素、片球菌素、链球菌素等)以及类细菌素，同时其产生的有机酸既可以延长产品货架期还可以增加肉制品的风味，广泛应用于发酵工业。
3.发酵肉制品是指在微生物或酶的作用下，自然或人为控制条件形成的一类具有特殊风味、质地和色泽，且能保存较长时间的高档肉制品。我国传统发酵肉制品制作周期长，生产季节性、区域性较强，标准化生产不足，因此，开发直投式发酵剂不仅有助于缩短生产周期，实现规模化生产，而且可以提升产品的安全性，抑制腐败微生物和病原微生物生长，提高产品的稳定性、感官质量和保存性。
4.国外对发酵剂的研究从上世纪80年代开始，我国起步较晚，且市售发酵剂多用于发酵泡菜、乳制品，肉用发酵剂较为罕见。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种高载乳酸菌肉用直投式发酵剂及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该发酵剂中植物乳杆菌sj-4具有较高的密度和活性，可用于制备获得质地和色泽较好且风味独特的发酵肉制品。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
7.本发明提供一种高载乳酸菌肉用直投式发酵剂，包含植物乳杆菌sj-4，所述植物乳杆菌sj-4已在中国工业微生物菌种保藏中心保藏，保藏编号为cicc no.11119s，保藏地址为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼，保藏日期为2020年12月22日。
8.进一步地，所述高载乳酸菌肉用直投式发酵剂中植物乳杆菌sj-4活菌数≥10
11
cfu/g。
9.本发明还提供一种上述的高载乳酸菌肉用直投式发酵剂的制备方法，包括如下步骤：
10.植物乳杆菌sj-4经高密度培养后离心收集菌泥，并向其中加入由脱脂乳、精氨酸和甘油组成的复合保护剂，之后进行冷冻干燥，即得所述高载乳酸菌肉用直投式发酵剂。
11.进一步地，所述高密度培养具体为：将植物乳杆菌sj-4按体积百分比5％接种量接种于优化培养基，37℃100r/min摇床培养16h。
12.进一步地，所述优化培养基包括2％w/v葡萄糖、1.5％w/v酵母粉、1.5％w/v胰蛋白胨、4％w/v黄瓜汁、0.2％w/v 0.2mol/l na2hpo
4-0.2mol/lkh2po4、0.5％w/v乙酸钠、0.2％
w/v柠檬酸三胺、0.1％w/v吐温80、0.02％w/v硫酸镁和0.005％w/v硫酸锰，余量为水。
13.进一步地，所述复合保护剂通过以下步骤获得：先将11g脱脂乳和6g精氨酸溶于100ml蒸馏水中115℃灭菌15min，再加入6g甘油121℃灭菌20min。
14.进一步地，所述复合保护剂加入量与所述植物乳杆菌sj-4经高密度培养后得到的菌液的体积比是1:10。
15.本发明还提供一种上述的高载乳酸菌肉用直投式发酵剂在制备发酵肉制品中的应用。
16.进一步地，所述发酵肉制品的制备方法为：
17.向处理后的肉样中加入2.5wt％食盐、0.01wt％亚硝酸钠、0.15wt％异抗坏血酸钠、0.8wt％花椒粉、0.5wt％三聚磷酸钠、0.8wt％白糖、0.5wt％白胡椒和0.5wt％五香粉，0-4℃发酵24h后加入所述高载乳酸菌肉用直投式发酵剂，真空滚揉30min后于30℃发酵48h，结束发酵后50℃烘烤3h。
18.进一步地，所述高载乳酸菌肉用直投式发酵剂的加入量为0.001-0.002％w/v。
19.本发明公开了以下技术效果：
20.1.在本发明的直投式发酵剂中，植物乳杆菌sj-4具有较好的产酸能力和生长速度，能满足作为肉用发酵剂的安全性、生产适应性等条件，可提高肉制品品质，缩短生产周期。
21.2.在本发明的直投式发酵剂中，植物乳杆菌sj-4经高密度培养后制成冻干粉，其中冷冻保护剂可以保护该菌株在低温条件下避免损伤，使菌种具有较高的密度和活性。
22.3.采用本发明制得的直投式发酵剂用于发酵里脊火腿，可得到质地和色泽较好，且风味独特的发酵肉制品。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为本发明基于16s rdna基因序列建立的植物乳杆菌sj-4系统发育树；
25.图2为本发明植物乳杆菌sj-4生长曲线及产酸曲线；
26.图3为本发明直投式发酵剂冻干粉图片；
27.图4为实施例4、对比例1和对比例2的发酵剂对发酵里脊火腿电子舌味觉响应雷达图。
具体实施方式
28.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
29.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中
间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
30.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
31.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
32.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
33.实施例1菌株的分离纯化、鉴定与保藏
34.1.菌株分离
35.以贵州农家自制酸肉作为分离源，将肉样剪碎成米粒大小或黄豆大小的肉沫，称取10g肉沫，向其中加入90ml无菌生理盐水，经无菌均质机拍打后作10倍系列稀释，选取3个适当稀释浓度分别吸取200μl涂布于msr琼脂培养基，37℃恒温培养48h，选取白色，圆形，表面湿润不透明，边缘整齐的单个菌落反复划线直至革兰氏染色镜检结果显示没有杂菌，停止分离纯化，将纯化的革兰氏阳性菌株4℃斜面保存，同时保存于-80℃的40％甘油管中。
36.2.菌株初筛
37.2.1以提取的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白作为菌株初筛的原料，其制备方法分述如下：
38.肌原纤维蛋白的制备：称取10g肉样于离心管中，加入200ml 50mmol/l ph 7.5预冷的磷酸盐缓冲液，12000r/min匀浆3次后于4℃8000r/min离心15min，重复3次收集沉淀并冷冻干燥成粉末。
39.肌浆蛋白的制备：将新鲜碎肉分散在十倍体积的磷酸盐缓冲溶液(40mmol/l nah2po4/na2hpo4，50mmol/l nacl ph 6.0)中，12000rpm均质30s后12000r/min 4℃离心15min，用纱布快速过滤收集上清液，加入硫酸铵至饱和，连续搅拌析出肌浆蛋白，10000r/min 4℃离心15min收集沉淀的蛋白质并冷冻干燥成粉末。
40.2.2蛋白质降解实验：在mrs培养基中加入1wt％上述预先提取的肌原纤维蛋白和肌浆蛋白，115℃灭菌后使用7mm打孔器打孔，加入100μl菌液，37℃培养24h选出出现降解圈的菌株。
41.2.3产酸实验：吸取上述实验筛选的400μl菌液至20ml mrs液体培养基，37℃恒温培养24h，选出ph 6.0以下菌株。
42.2.4发酵葡萄糖产气实验：在1l py培养基中加入30g葡萄糖、0.5ml吐温80、1.4ml 1.6g/100ml溴甲酚紫，分装10ml试管后放入倒置的杜氏小管，灭菌后分别接入产酸实验选出的200μl菌液，使用无菌石蜡液封，37℃恒温培养24h，选出杜氏小管中无气泡的阴性菌株。
43.3.菌株复筛
44.3.1菌株生产适应性
45.3.1.1耐盐性实验：将2.4筛选出的活菌数为10
7-108cfu/ml的菌株按2％接种量活化3代后接入含有6％nacl的mrs肉汤培养基中37℃培养24h测定od
600
，选择od
600
值偏高的菌株。
46.3.1.2耐亚硝酸盐实验：将3.1.1筛选出的活菌数为10
7-108cfu/ml的菌株按2％接种量活化3代后接入含150mg/kg nano2的mrs肉汤培养基中，37℃培养24小时测定od
600
，选择od
600
值偏高的菌株。
47.3.2耐酸实验：将3.1.2筛选的活菌数为10
7-108cfu/ml的菌株按2％接种量活化3代后接入ph 5.0的mrs肉汤培养基，37培培养24h测定其od
600
，选择od
600
值偏高的菌株。
48.3.3菌株安全性
49.3.3.1氨基酸脱羧酶活性实验：分别吸取3.2筛选的300μl菌液于细菌微量生化鉴定管(赖氨酸脱羧酶肉汤、l-精氨酸双水解酶分别为实验组、氨基酸脱羧酶为对照组)中，接种后覆盖300μl无菌液体石蜡，37℃培养24h，选出试验管和对照管均为黄色的阴性菌株。
50.3.4菌株作为肉用发酵剂的评定
51.3.4.1硝酸盐还原酶实验：在mrs培养基中加入0.2％硝酸钾，将3.3.1筛选的菌株的纯菌落划线后37℃培养48h，滴入griess试剂a液(150ml20％盐酸中加入0.5g对氨基苯磺酸)、b液(0.2g盐酸萘乙二胺溶于100ml蒸馏水)，菌落周围未出现红圈。
52.3.4.2产氨实验：将0.5g nacl、0.5g精氨酸溶于100ml脱脂牛乳中，接入0.2％的3.4.1选出的菌株菌液，37℃培养24h后滴入1滴纳赛尔试剂，选出无沉淀的阴性菌株。
53.3.4.3产粘性实验：将3.4.2选出的菌株的菌落接种于mrs培养基，37℃培养24h，挑取单个菌落进行观察，选出不产粘性的菌株。
54.3.4.4产硫化氢实验：将3.4.3选出的菌落穿刺于硫化氢细菌微量生化鉴定管，37℃培养24h，选出穿刺线清晰无变化的阴性菌株。
55.3.4.5蛋白酶降解活性实验：见2.菌株初筛
56.3.4.6脂肪酶分解活性实验：mrs琼脂培养基121℃灭菌20min后冷却至80℃，加入1％灭菌的三丁酸甘油油脂，挑取3.4.5选出的单个菌落接种于培养基中，37℃培养48h，菌落周围未出现降解圈。
57.3.5生理生化鉴定
58.3.5.1发酵葡萄糖产气实验：见2.菌株初筛
59.3.5.2石蕊牛奶实验：在100ml脱脂牛乳中加入4ml 25g/ml石蕊试剂，分装10ml试管灭菌后接入0.2％3.5.1选出的菌液37℃培养2d选出使石蕊牛奶凝固的菌株。
60.3.5.3接触酶实验(过氧化氢实验)：挑取3.5.2筛选的单个菌落至pyg培养基中，滴加3％过氧化氢，选出无气泡的阴性菌株。
61.3.5.4甲基红实验：接种2％3.5.3筛选的菌液至pyg培养基培养24h后滴入甲基红指示剂，选出变黄的阴性菌株。
62.3.5.5乙酰甲基甲醇实验(v-p实验)：挑取3.5.4选出的单个菌落穿刺v-p半固体琼脂细菌微量生化鉴定管，37℃培养24h，滴入试剂a(α-萘酚乙醇溶液)6滴，试剂b(40％氢氧化钠水溶液)2滴，静置30min后选出穿刺线无明显变化的阴性菌株。
63.4.菌株sj-4的鉴定
64.菌株sj-4 16s rdna分子生物学鉴定：将3.5.5筛选出来的菌液使用细菌通用引物27f(5
′‑
agagtttgatcmtggctcag-3
′
)、1492r(5
′‑
tacggytaccttgttacgactt-3
′
)扩增细菌16s rdna，使用1％浓度琼脂糖凝胶，电泳20min，送至武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序，测序结果如下(seq id no：1)：
65.gagtgagtggcgaactggtgagtaacacgtgggaaacctgcccagaagcgggggataacacctggaaacagatgctaataccgcataacaacttggaccgcatggtccgagtttgaaagatggcttcggctatcacttttggatggtcccgcggcgtattagctagatggtggggtaacggctcaccatggcaatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgaaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaactctgttgttaaagaagaacatatctgagagtaactgttcaggtattgacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcatcggaaactgggaaacttgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagtatgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccataccgtaaacgatgaatgctaagtgttggagggtttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatactatgcaaatctaagagattagacgttcccttcggggacatggatacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattaagttgggcactctggtgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgaactcgcgagagtaagctaatctcttaaagccattctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagtcggtggggtaaccttttaggaaccagccgccta
66.将测序结果进入ncbi网站中blast程序进行同源性比对，使用mega-x软件构建系统发育树，如图1，明确菌株sj-4为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)。
67.5.菌株sj-4的保藏
68.菌株sj-4的分类命名为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，已于2020年12月22日保藏于中国工业微生物菌种保藏中心(简称cicc，地址为：北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号楼)，保藏编号：cicc no.11119s。
69.6.菌株sj-4生长条件的优化
70.6.1菌株sj-4最适生长温度的确定：将菌液以4％接种量接种于ph＝6.0的mrs液体培养基中，并分别在17、22、27、32、37、42、47℃下恒温培养24h后测定菌液od
600
，结果表明，菌株sj-4在37℃条件下有最高od
600
为1.584，即该菌株最适生长温度为37℃。
71.6.2菌株sj-4最适生长ph的测定：将菌液以4％接种量分别接种于ph 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的mrs液体培养基中，37℃培养48h，每12h测定一次菌液od
600
，结果表明，菌株sj-4在ph6.0条件下有最高od
600
为1.611，即该菌株最适生长ph为6.0。
72.6.3菌株sj-4生长曲线和产酸曲线的测定：将4％菌液接种于mrs液体培养基中37℃培养24h，每隔2h测定一次od
600
和ph值，如图2。
73.实施例2菌株sj-4高密度培养条件的优化
74.以mrs液体培养基为参照，选择不同的碳源(1.00％淀粉、1.00％麦芽糖、1.00％葡萄糖、0.33％淀粉 0.67％葡萄糖、0.33％葡萄糖 0.67％淀粉、0.50％淀粉 0.50％葡萄糖)、氮源(1.00％酵母粉、1.00％牛肉膏、1.00％胰蛋白胨、0.50％酵母粉 0.50％牛肉膏、0.50％酵母粉 0.50％胰蛋白胨)、无机盐(0.2mol/l na2hpo
4-0.1mol/l柠檬酸、0.2mol/l naac-0.2mol/l hac、0.2mol/l na2hpo
4-0.2mol/l nah2po4、0.2mol/l na2hpo
4-0.2mol/l kh2po4)、生长因子(平菇、玉米、番茄、黄瓜榨汁后过滤)，培养条件(摇床转速80r/min，90r/min，100r/min，110r/min，120r/min)进行优化。以上％代表质量体积百分浓度。
75.经实验结果显示优选以下成分：葡萄糖、酵母粉 胰蛋白胨、0.2mol/lna2hpo
4-0.2mol/l kh2po4、黄瓜汁；再经浓度优化，最终确定最佳碳源为2％w/v葡萄糖，最佳氮源为1.5％w/v酵母粉 1.5％w/v胰蛋白胨，最佳生长因子为4％w/v黄瓜汁，最佳无机盐为0.2％w/v 0.2mol/lna2hpo
4-0.2mol/l kh2po4稀释4倍，其余含量为：0.5％w/v乙酸钠、0.2％w/v柠檬酸三胺、0.1％w/v吐温80、0.02％w/v硫酸镁、0.005％w/v硫酸锰，再向培养基中添加蒸馏水至1000ml。将甘油管中保存的植物乳杆菌按5％接种量接种于该优化培养基，37℃100r/min摇床培养16h，活化3代后活菌数达109cfu/ml。
76.实施例3直投式发酵剂的制备
77.该直投式发酵剂中冷冻保护剂的原料组成包括11g/100ml脱脂乳、6g/100ml精氨酸溶于蒸馏水中115℃灭菌15min，6g/100ml甘油溶于蒸馏水中121℃灭菌20min，植物乳杆菌sj-4经高密度培养后8000r/min 4℃离心10min收集菌泥，向菌泥中加入离心前菌液1/10体积的复合保护剂，-80℃预冷冻6h，放入真空冷冻干燥箱48h后，得到植物乳杆菌sj-4冻干粉如图3，菌株存活率为70.72％，活菌数达10
11
cfu/g。
78.实施例4直投式发酵剂在发酵里脊火腿中的应用
79.1.发酵里脊火腿的制备
80.1.1将市售里脊使用2wt％高粱酒去腥，风干后加入2.5wt％食盐、0.01wt％亚硝酸钠、0.15wt％异抗坏血酸钠、0.8wt％花椒粉、0.5wt％三聚磷酸钠、0.8wt％白糖、0.5wt％白胡椒、0.5wt％五香粉，0-4℃发酵24h。
81.1.2加入0.001-0.002％w/v直投式发酵剂，加入少量蒸馏水稀释后注射腌制，真空滚揉30min。
82.1.3 30℃发酵48h，结束后50℃烘烤3h，冷却至室温后真空包装即得发酵里脊火腿产品。
83.2.发酵里脊火腿质构的测定
84.将火腿表面切除后，切成2
×2×
2cm的立方体，使用ta/36探头，测前速率1mm/s，测后速率1mm/s，压缩率50％，触发力5g，间隔时间2s，测定硬度、弹性、粘聚性、咀嚼性。
85.3.发酵里脊火腿色泽的测定
86.将火腿表面去除后，切成长宽均为3cm的片状，测定红度值(a*)、黄度值(b*)、亮度值(l*)，使用减少色泽误差。
87.4.发酵里脊火腿电子舌五味的测定
88.将火腿表面切除后，取10g加入100ml蒸馏水使用高压均质机搅碎，30℃浸提3h后于冷冻离心机4℃6000r/min离心15min后取上清液20ml，加入60ml蒸馏水稀释，倒入电子舌
样品杯中稀释，取中间测定数据进行分析。
89.对比例1
90.与实施例4的区别在于，选择0.05％w/v，107cfu/ml的植物乳杆菌sj-4菌液注射腌制。
91.对比例2
92.与实施例4的区别在于，选择由植物乳杆菌sj-4菌液不添加任何保护剂直接在-80℃预冷冻6h，放入真空冷冻干燥箱48h后得到的冻干粉腌制，加入0.001-0.002％w/v该冻干粉。
93.效果验证
94.统计实施例4、对比例1、对比例2制得的里脊火腿的质构、色泽、电子舌五味值测定结果，如表1、图4所示，结果表明直投式发酵剂制得的里脊火腿促进了色泽的形成和稳定，接种后有利于火腿的切片，且添加发酵剂后火腿滋味更丰富，较好地改善了产品的品质。
95.表1各组发酵产品的品质测定结果
[0096][0097]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。