一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及抗菌功能多肽技术领域，具体为一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用。


背景技术：

2.抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类具有抗菌活性的碱性多肽物质，分子量在2000～7000左右，由20～60个氨基酸残基组成。这类活性多肽多数具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点。世界上第一个被发现的抗菌肽的是1980年由瑞典科学家g.boman等人经注射阴沟通杆菌及大肠杆菌诱导惜古比天蚕蛹产生的具有抗菌活性的多肽，定名为cecropins。
3.抗菌肽依其结构可分为多种类型，其中cathelicidin和defensin为主要的类型；可将其分为5类:(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的cecropins和从非洲爪蟾中分离到的magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。
4.现有药物制备一般提取植物或动物产生的免疫基因，或动物细胞中产生的肽类制取，操作步骤繁琐，精密度交低，对比数据不准确的缺点。


技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供了一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，解决了上述背景技术中提出现有药物制备一般提取植物或动物产生的免疫基因，或动物细胞中产生的肽类制取，操作步骤繁琐，精密度交低，对比数据不准确的缺点的问题。
6.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，所述包括有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽。
7.可选的，所述抗菌功能多肽的制备方法包括以下步骤：
8.s1、培养菌落：将牛中性粒细胞放置于培养皿，添加入酵母浸膏、胰蛋白胨、d-葡萄糖，培养，取用牛中性粒细胞培养液转接到细胞培养基中继续培养，直至合适一段时间，接着，将培养液置入细胞离心机，离心，收集菌体；
9.s2、质粒制备液：取用上述步骤s1、培养菌落中的培养菌液倒入实验震荡器中，将震荡液携带的沉淀物过滤出来，以及离心管的上清液中加入取冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心，置室温中使核酸沉淀自然干燥，而沉淀物溶于te缓冲液中，混合器混匀，即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用；
10.s3、取提取的重组质粒进行双酶切检测：根据有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽的特性，通过人工合成，下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活化学工艺
常用hbtu/hctu/hitu/hatu nmm/dipea或hobt dic作激活剂，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键，在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成，以及将上述反应反复循环直到合成完成；氨基酸缩合结束后，可用适量tfa进行洗脱，根据起酸碱性，可选择10％tfa/dcm溶液，至100％tfa。
11.可选的，所述步骤s1、培养菌落中，添加入2-5％胰蛋白胨、5-10％d-葡萄糖、5-10％酵母浸膏。
12.可选的，所述步骤s1、培养菌落中，在25-35℃条件下培养菌落，培养12-24h。
13.可选的，所述步骤s1、培养菌落中，取300-500μl转接到500ml培养基中继续培养。
14.可选的，所述步骤s1、培养菌落中，细胞离心机的型号为axtd4，最高转速4000r/min，最大相对离心力2200
×
g。
15.可选的，所述步骤s2、质粒制备液中，实验震荡器的型号为lyz-2102，旋转频率40～300rpm，以及摆振幅度φ26mm。
16.可选的，所述步骤s2、质粒制备液中，添加入5-10ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁。
17.可选的，所述步骤s2、质粒制备液中，培养菌液离心5-10min。
18.可选的，所述抗菌功能多肽的应用于制备抗菌药物的制备。
19.本发明提供了一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，具备以下有益效果：
20.抗菌功能多肽的制备方法简单，所涉及的对比试验多，拥有相同条件下的对比试验对比数据，从而判断对比条件下，抗菌功能多肽含量不同产生的有益效果，以及可将不同含量的抗菌功能多肽制备于药物，从而能够调节不同适应范围。
具体实施方式
21.下面，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
22.实施案例一
23.本发明提供一种技术方案：一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，包括有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽。
24.抗菌功能多肽的制备方法包括以下步骤：
25.s1、培养菌落：将牛中性粒细胞放置于培养皿，添加入酵母浸膏、胰蛋白胨、d-葡萄糖，培养，取用牛中性粒细胞培养液转接到细胞培养基中继续培养，直至合适一段时间，接着，将培养液置入细胞离心机，离心，收集菌体；
26.s2、质粒制备液：取用上述步骤s1、培养菌落中的培养菌液倒入实验震荡器中，将震荡液携带的沉淀物过滤出来，以及离心管的上清液中加入取冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心，置室温中使核酸沉淀自然干燥，而沉淀物溶于te缓冲液中，混合器混匀，即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用；
27.s3、取提取的重组质粒进行双酶切检测：根据有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽的特性，通过人工合成，下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活化学工艺常用hbtu/hctu/hitu/hatu nmm/dipea或hobt dic作激活剂，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键，在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成，以及将上述反应反复循
环直到合成完成；氨基酸缩合结束后，可用适量tfa进行洗脱，根据起酸碱性，可选择10％tfa/dcm溶液，至100％tfa。
28.步骤s1、培养菌落中，添加入2％胰蛋白胨、5％d-葡萄糖、5％酵母浸膏。
29.步骤s1、培养菌落中，在25℃条件下培养菌落，培养12h。
30.步骤s1、培养菌落中，取300μl转接到500ml培养基中继续培养。
31.步骤s1、培养菌落中，细胞离心机的型号为axtd4，最高转速4000r/min，最大相对离心力2200
×
g。
32.步骤s2、质粒制备液中，实验震荡器的型号为lyz-2102，旋转频率40～300rpm，以及摆振幅度φ26mm。
33.步骤s2、质粒制备液中，添加入570％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁。
34.步骤s2、质粒制备液中，培养菌液离心5min。
35.抗菌功能多肽的应用于制备抗菌药物的制备。
36.实施案例二
37.本发明提供一种技术方案：一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，包括有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽。
38.抗菌功能多肽的制备方法包括以下步骤：
39.s1、培养菌落：将牛中性粒细胞放置于培养皿，添加入酵母浸膏、胰蛋白胨、d-葡萄糖，培养，取用牛中性粒细胞培养液转接到细胞培养基中继续培养，直至合适一段时间，接着，将培养液置入细胞离心机，离心，收集菌体；
40.s2、质粒制备液：取用上述步骤s1、培养菌落中的培养菌液倒入实验震荡器中，将震荡液携带的沉淀物过滤出来，以及离心管的上清液中加入取冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心，置室温中使核酸沉淀自然干燥，而沉淀物溶于te缓冲液中，混合器混匀，即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用；
41.s3、取提取的重组质粒进行双酶切检测：根据有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽的特性，通过人工合成，下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活化学工艺常用hbtu/hctu/hitu/hatu nmm/dipea或hobt dic作激活剂，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键，在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成，以及将上述反应反复循环直到合成完成；氨基酸缩合结束后，可用适量tfa进行洗脱，根据起酸碱性，可选择10％tfa/dcm溶液，至100％tfa。
42.步骤s1、培养菌落中，添加入3.5％胰蛋白胨、7.5％d-葡萄糖、7.5％酵母浸膏。
43.步骤s1、培养菌落中，在30℃条件下培养菌落，培养18h。
44.步骤s1、培养菌落中，取400μl转接到500ml培养基中继续培养。
45.步骤s1、培养菌落中，细胞离心机的型号为axtd4，最高转速4000r/min，最大相对离心力2200
×
g。
46.步骤s2、质粒制备液中，实验震荡器的型号为lyz-2102，旋转频率40～300rpm，以及摆振幅度φ26mm。
47.步骤s2、质粒制备液中，添加入7.5ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁。
48.步骤s2、质粒制备液中，培养菌液离心7.5min。
49.抗菌功能多肽的应用于制备抗菌药物的制备。
50.实施案例三
51.本发明提供一种技术方案：一种抗菌功能多肽及其制备方法和应用，包括有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽。
52.抗菌功能多肽的制备方法包括以下步骤：
53.s1、培养菌落：将牛中性粒细胞放置于培养皿，添加入酵母浸膏、胰蛋白胨、d-葡萄糖，培养，取用牛中性粒细胞培养液转接到细胞培养基中继续培养，直至合适一段时间，接着，将培养液置入细胞离心机，离心，收集菌体；
54.s2、质粒制备液：取用上述步骤s1、培养菌落中的培养菌液倒入实验震荡器中，将震荡液携带的沉淀物过滤出来，以及离心管的上清液中加入取冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁，离心，置室温中使核酸沉淀自然干燥，而沉淀物溶于te缓冲液中，混合器混匀，即成质粒制备液，制备的质粒供下一步实验使用；
55.s3、取提取的重组质粒进行双酶切检测：根据有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽的特性，通过人工合成，下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活化学工艺常用hbtu/hctu/hitu/hatu nmm/dipea或hobt dic作激活剂，激活的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键，在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成，以及将上述反应反复循环直到合成完成；氨基酸缩合结束后，可用适量tfa进行洗脱，根据起酸碱性，可选择10％tfa/dcm溶液，至100％tfa。
56.步骤s1、培养菌落中，添加入5％胰蛋白胨、10％d-葡萄糖、10％酵母浸膏。
57.步骤s1、培养菌落中，在35℃条件下培养菌落，培养24h。
58.步骤s1、培养菌落中，取500μl转接到500ml培养基中继续培养。
59.步骤s1、培养菌落中，细胞离心机的型号为axtd4，最高转速4000r/min，最大相对离心力2200
×
g。
60.步骤s2、质粒制备液中，实验震荡器的型号为lyz-2102，旋转频率40～300rpm，以及摆振幅度φ26mm。
61.步骤s2、质粒制备液中，添加入10ml70％冷乙醇，缓慢淋洗离心管内壁。
62.步骤s2、质粒制备液中，培养菌液离心10min。
63.抗菌功能多肽的应用于制备抗菌药物的制备。
64.以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。