一种血清淀粉样蛋白A检测试剂盒及其制备方法与流程

一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体涉及一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.血清淀粉样蛋白a(saa)，分子量约12kd。血浆中saa的主要功能：与血浆高密度脂蛋白结合，转运胆固醇到肝脏代谢；募集免疫细胞至炎症部位；诱导降解细胞外基质的酶表达；saa降解产物能以淀粉样蛋白a原纤维的方式沉淀在不同器官中，参与慢性炎症病理组织学改变。急性时相反应时，在il-1、il-6和肿瘤坏死因子等细胞因子刺激下，肝细胞、被激活的巨噬细胞、成纤维细胞乃至脂肪细胞都可大量表达saa，血浆浓度可升高10-1000倍，而其半衰竭只有50分钟左右，因此是一种灵敏的正性急性时相反应蛋白。
3.作为急性时相反蛋白，saa和c-反应蛋白一样可用于：了解机体急性时相反应程度；辅助鉴别细菌性和除腺病毒外的其他病毒性感染，评估抗菌药疗效和停药指征；早期发现器官移植后排斥反应等；由于前述急性时相反应中saa大幅度升高及短半衰期等特点，有研究认为saa和c-反应蛋白更敏感。
4.自1974年发现至今，许多检测方法已应用于检测患者的血清saa。目前，用于临床血清saa检测的方法主要包括放射性免疫测定法(ria)、酶联免疫吸附试验(elisa)、乳胶免疫比浊法等。放射性免疫测定法具有分析灵敏度高、特异性好等优点，但同时存在放射线辐射等污染问题，限制临床大面积使用；elisa法具有定量、高敏感性等优点，但此方法操作复杂，用时较长，不适用于自动化批量检测；乳胶免疫比浊法具有操作简便、快速、定量准确、敏感度高等优点，可满足门急诊等需要，在临床研究中应用越来越广泛。但是，现有市售血清淀粉样蛋白a测定试剂盒多存在试剂不稳定，线性范围窄，存在hook效应等缺陷，造成部分高值样本检测出现假阴性，影响检测结果的准确性。


技术实现要素：

5.本发明的目的是解决上述的不足，提供一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒及其制备方法。
6.为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂、稀释液和校准品，所述r1试剂包括缓冲液
①
、促凝剂、稳定剂
①
、抑制剂和防腐剂；所述r2试剂包括人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒、缓冲液
②
、稳定剂
②
和防腐剂；所述稀释液为添加稳定剂
③
和防腐剂的生理盐水；所述校准品包括抗原和稀释液。
7.进一步的，所述抑制剂包括质量体积百分比浓度为0.1％-1％的氯化胆碱、0.1％-1％的氯化钙和0.1％-1％的甘油。
8.进一步的，所述稳定剂
①
包括质量体积百分比浓度为0.8％-0.9％的氯化钠和0.5％-3％的甘露醇。
9.进一步的，所述r1试剂中的缓冲液
①
为浓度为50-100mmol/l的磷酸盐缓冲液、mes、hepes、mops或pipes中的任意一种，优选为磷酸盐缓冲液；
10.所述促凝剂为质量体积百分比浓度为1.5％-4.0％的聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000或pvc中的任意一种，优选为聚乙二醇8000；
11.所述防腐剂为质量体积百分比浓度为0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为proclin300。
12.进一步的，所述稳定剂
②
包括质量体积百分比浓度为0.9％-8％的氯化钠、1％-5％的海藻糖、1％-4％的牛血清白蛋白和1％-4％的甘氨酸。
13.进一步的，所述r2试剂中的人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒为鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体与平均粒径为100-120nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒通过化学交联法致敏得到；
14.所述缓冲液
②
为浓度为10-100mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、mes、tris或pbs中的任意一种，优选为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
15.所述防腐剂为质量体积百分比浓度为0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为proclin300。
16.进一步的，所述r2试剂中的人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒是由鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体与平均粒径为100-120nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，在含有稳定剂
②
和防腐剂的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中分散而成。
17.进一步的，所述稀释液中的稳定剂
③
包括质量体积百分比浓度为1％-3％的牛血清白蛋白和3％-8％的甘露醇；
18.防腐剂为质量体积百分比浓度0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为叠氮钠。
19.进一步的，所述校准品包括6个通过采用所述稀释液稀释后的不同浓度水平的市售人重组血清淀粉样蛋白a。
20.一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒的制备方法，用于制备上述的血清淀粉样蛋白a检测试剂盒，包括如下步骤：
21.步骤1，r1试剂配制：取用缓冲液
①
，在缓冲液
①
内分别加入促凝剂、稳定剂
①
、抑制剂和防腐剂，之后采用氢氧化钠调节混合后的溶液ph值为6.5-8.5；
22.步骤2，r2试剂配制：
23.a.取用聚苯乙烯微球颗粒，对聚苯乙烯微球颗粒进行活化，得到活化聚苯乙烯微球溶液；
24.b.将鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体用缓冲液
②
稀释得到单抗溶液；
25.c.将单抗溶液匀速加入活化聚苯乙烯微球溶液中，混匀后置于磁力水浴箱中搅拌偶联；
26.d.偶联结束后，对偶联后的溶液离心去上清，用缓冲液
②
洗涤1次，再用缓冲液
②
将洗涤后的溶液分散成乳白色悬液；
27.e.对乳白色悬液匀质2次，在匀质分散完成的溶液中加入部分稳定剂
②
和防腐剂，搅拌混匀后在磁力水浴箱中搅拌封闭；
28.f.在封闭完成的溶液中加入剩余的稳定剂
②
之后混匀，即得r2试剂；
29.步骤3，稀释液配制：在含有防腐剂的生理盐水中添加稳定剂
③
；
30.步骤4，校准品配置：将市售人重组血清淀粉样蛋白a用稀释液稀释成6个不同浓度水平。
31.本文涉及“质量体积百分比浓度”的描述，单位均为g/l。
32.对比现有技术，本发明具有如下的有益效果：
33.1、本发明通过在r1和r2试剂中分别添加稳定剂
①
和稳定剂
②
，从而改善了胶乳试剂的稳定性，提高了试剂的准确度和精密度性能；
34.2、本发明通过在r1试剂中添加抑制剂，能够有效的延迟hook效应的出现，使在常规临床检测范围内(如0mg/l-5000mg/l)可准确的判断阴阳性，不至于由于hook效应而使的临床高值出现假阴性的结果，影响临床诊断。
附图说明
35.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
36.图1为本发明的校准曲线。
37.图2为本发明的线性范围相关性。
具体实施方式
38.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
39.如图1-2所示，本发明一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒，包括r1试剂、r2试剂、稀释液和校准品，所述r1试剂包括缓冲液
①
、促凝剂、稳定剂
①
、抑制剂和防腐剂；所述r2试剂包括人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒、缓冲液
②
、稳定剂
②
和防腐剂；所述稀释液为添加稳定剂
③
和防腐剂的生理盐水；所述校准品包括抗原和稀释液。
40.在一实施例中，所述抑制剂包括质量体积百分比浓度为0.1％-1％的氯化胆碱、0.1％-1％的氯化钙和0.1％-1％的甘油。
41.在一实施例中，所述稳定剂
①
包括质量体积百分比浓度为0.8％-0.9％的氯化钠和0.5％-3％的甘露醇。
42.在一实施例中，所述r1试剂中的缓冲液
①
为浓度为50-100mmol/l的磷酸盐缓冲液、mes、hepes、mops或pipes中的任意一种，优选为磷酸盐缓冲液；
43.所述促凝剂为质量体积百分比浓度为1.5％-4.0％的聚乙二醇6000、聚乙二醇8000、聚乙二醇10000、聚乙二醇20000或pvc中的任意一种，优选为聚乙二醇8000；
44.所述防腐剂为质量体积百分比浓度为0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为proclin300。
45.在一实施例中，所述稳定剂
②
包括质量体积百分比浓度为0.9％-8％的氯化钠、
1％-5％的海藻糖、1％-4％的牛血清白蛋白和1％-4％的甘氨酸。
46.在一实施例中，所述r2试剂中的人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒为鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体与平均粒径为100-120nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒通过化学交联法致敏得到；
47.所述缓冲液
②
为浓度为10-100mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、mes、tris或pbs中的任意一种，优选为4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
48.所述防腐剂为质量体积百分比浓度为0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为proclin300。
49.在一实施例中，所述r2试剂中的人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒为鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体与平均粒径为100-120nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒通过化学交联法致敏得到；
50.所述缓冲液
②
为浓度为10-100mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液；
51.所述防腐剂为质量体积百分比浓度为0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为proclin300。
52.在一实施例中，所述r2试剂中的人重组血清淀粉样蛋白a抗体胶乳颗粒是由鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体与平均粒径为100-120nm的羧化改性聚苯乙烯胶乳颗粒在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液中通过化学交联法致敏，再经离心、洗涤后，在含有稳定剂
②
和防腐剂的4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液中分散而成。
53.在一实施例中，所述稀释液中的稳定剂
③
包括质量体积百分比浓度为1％-3％的牛血清白蛋白和3％-8％的甘露醇；
54.防腐剂为质量体积百分比浓度0.1％的proclin300、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞或庆大霉素中的任意一种，优选为叠氮钠。
55.在一实施例中，所述校准品包括6个通过采用所述稀释液稀释后的不同浓度水平的市售人重组血清淀粉样蛋白a。
56.一种血清淀粉样蛋白a检测试剂盒的制备方法，以上述优选组分为原材料，选用其他组分替代优选组分进行实验的数据与采用优选组分进行实验的数据相差不大，故在此处仅采用优选组分进行实验，针对其他组分的实验不做赘述，包括如下步骤：
57.步骤1，r1试剂配制：取用50mmol/l的十二水合磷酸二氢钠和5mmol/l的磷酸氢二钾作为磷酸盐缓冲液，在磷酸盐缓冲液内加入0.9％的氯化钠、1.5％的聚乙二醇8000、0.5％的氯化胆碱、0.3％的氯化钙、0.45％甘油、0.1％的proclin300，采用5mol/l的氢氧化钠调节混合后的溶液ph值为6.5-8.5；
58.步骤2，r2试剂配制：
59.a.取用粒径为95nm、浓度为10％的聚苯乙烯微球，加纯化水稀释，得到100ml质量体积百分比浓度为0.2％的微球稀释溶液；
60.b.采用纯化水分别溶解1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(edc)、n-n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，得到浓度为0.2mg/ml的碳化二亚胺溶液、琥珀酰亚胺溶液；
61.c.以微球稀释溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计，按80％的活化比例将edc/nhs溶液加入微球稀释溶液中，25℃搅拌活化20min，磁力搅拌速度为100r/min，得到活化的聚苯乙烯微球，聚苯乙烯微球充分凝集，2000r/min离心10min后去上清，再加入浓度
50mmol/l的hepes溶液100ml，超声分散混合均匀；
62.d.将鼠抗人血清淀粉样蛋白a单克隆抗体用ph 7.5，浓度50mmol/l的hepes溶液稀释至终浓度为0.08mg/ml的单抗溶液，溶液体积为100ml；
63.e.将单抗溶液匀速加入活化聚苯乙烯微球溶液中，混匀后置于37℃磁力水浴箱中搅拌偶联2h，搅拌速度为50r/min；
64.f.偶联结束后，对偶联后的溶液离心去上清，用100ml ph 7.0，浓度为50mmol/l的hepes洗涤1次，再以同样100ml的hepes储存液分散成乳白色悬液；
65.g.对乳白色悬液采用1000kpa 40r/min匀质2次，在匀质分散完成的溶液中加入终浓度3％bsa、0.1％proclin300、3％海藻糖和2.35％的甘氨酸，使终体积为120ml，搅拌混匀后在37℃磁力水浴箱中搅拌封闭1.5h；
66.h.在封闭完成的溶液中加入8％氯化钠混匀，即得r2试剂；
67.步骤3，稀释液配制：在含有0.1％的叠氮钠的生理盐水中添加3％bsa、1.25％甘露醇；
68.步骤4，校准品配置：将市售人重组血清淀粉样蛋白a用稀释液稀释成6个不同浓度水平。
69.优选的，市售人重组血清淀粉样蛋白a为桂林英美特生物生产的人重组血清淀粉样蛋白a试剂，浓度水平分别为340mg/l、170mg/l、85mg/l、42.5mg/l、25mg/l、0mg/l。
70.本发明专利主要旨在突出两个方面：一方面试剂盒解决了线性范围窄的问题，有效延迟了hook效应的出现，提高了高值样本检测的准确性；第二方面试剂盒稳定性好这一特点，通过上述试剂盒的制备方法进行实验，以下几点是维持试剂盒稳定性的充分必要条件，具体如下：
71.1、试剂r1中抑制剂
①
的组成成分与含量筛选：试剂r1中抑制剂
①
的组成成分前期进行了大量的实验筛选，通过hook性能验证测试，最终选择hook点最高的抑制剂
①
成分，包括：抑制剂
①
为氯化胆碱，氯化钙，甘油。此外对抑制剂
①
中各成分的含量进行实验筛选，实验设计方案如表1所示：
72.表1实验设计方案
[0073][0074]
各组实验数据如表2所示：
[0075]
表2实验数据
[0076][0077]
由上述实验数据可知，第组(1％氯化钙 0.5％氯化胆碱 1％甘油)线性范围最宽，hook点最高；
[0078]
以第组(1％氯化钙 0.5％氯化胆碱 1％甘油)的数据为基准进行对照实验，设计方案包括对照
①
组(1％氯化钙 0.5％氯化胆碱)、对照
②
组(1％氯化钙 1％甘油)、对照
③
组(0.5％氯化胆碱 1％甘油)三次对照实验，各组实验数据如表3所示：
[0079]
表3实验数据
[0080][0081][0082]
由上述实验数据可知，第组(1％氯化钙 0.5％氯化胆碱 1％甘油)线性范围最宽，hook点最高，三种组分同时配合使用效果最好。
[0083]
2、试剂r2缓冲液筛选：配制50mmol/l的4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液、50mmol/l的三羟甲基氨基甲烷(tris)缓冲液、50mmol/l的磷酸盐缓冲液(pbs)、50mmol/l的2-(n-吗啉)乙磺酸(mes)缓冲液，分别用同一批样品进行37℃加速稳定性测试，观察测试的od值结果选择稳定性最佳的hepes缓冲液作为缓冲体系，实验数据如表4所示：
[0084]
表4实验数据
[0085][0086][0087]
3、试剂r2中稳定剂
②
的组成成分与含量筛选：试剂r2中稳定剂
②
的组成成分前期进行了大量的实验筛选，通过37℃加速稳定性测试，最终选择稳定性最佳的稳定剂
②
成分，包括：牛血清白蛋白、氯化钠、海藻糖、甘氨酸。此外对稳定剂
②
中各成分的含量进行实验筛选，实验设计方案如表5所示：
[0088]
表5实验设计方案
[0089][0090]
各组实验的稳定性数据如表6所示：
[0091]
表6稳定性数据
[0092][0093][0094]
由上述实验数据可知，第组(4％氯化钠 5％甘氨酸 3％牛血清白蛋白 3％海藻糖)37℃加速稳定性最佳；
[0095]
其中，4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲液是一种两性离子有机化学缓冲剂，属于“good”缓冲液，ph值介于6.0和8.0之间，具有高溶解性，耐化学作用等特点；而稳定剂
②
成分中的牛血清白蛋白能够对胶乳颗粒表面交联的抗体起到很好的胶体保护作用，且可与胶乳颗粒中游离的-cooh位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成的影响；海藻糖属于糖类大分子，降低胶乳颗粒的移动速度，使胶乳颗粒不易聚集；无机盐氯化钠可调节胶乳颗粒表面电荷量，改变溶液的热力学性质，使得偶联在胶乳颗粒表面的抗体的稳定性得到增强；另外高温可改变交联到免疫乳胶颗粒表面的抗体的空间结构，增加稳定剂
②
对免疫乳胶试剂的稳定作用。
[0096]
4、活化偶联条件筛选：在r2试剂制备过程中微球的活化比例分别设置成50％、80％、100％。
[0097]
根据上述选择的最佳缓冲体系以及稳定剂
②
的组成成分及含量制备完成的r2试剂，进行线性和hook实验观察，具体实验数据如表7所示：
[0098]
表7实验数据
[0099][0100][0101]
根据实验结果可知，试剂r2在4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)缓冲体系下，添加稳定剂
②
成分为4％氯化钠 5％甘氨酸 3％牛血清白蛋白 3％海藻糖，并且通过微球80％活化偶联，可以得到稳定性佳的并且线性范围宽，hook效应延后的胶乳试剂盒。因为羧基微球的活化程度，决定了偶联到单个微球上的抗体数量，在抗力过量的情况下，活化比例越高，单个微球上偶联的抗体越多，抗体越多，抗原抗体结合的前带效应越滞后，但是当微球活化比例太高的时候，抗原抗体的亲和力又太高，以至于结合速度太快，而让前带效应提前。所以80％的活化比例是最优的。
[0102]
对本发明制备方法制得的试剂盒进行校准曲线、线性范围实验、重复性试验和稳定性试验，表8为校准信号值实验数据、表9为线性范围实验数据、表10为重复性实验数据、表11为开瓶稳定性实验数据、表12为37℃加速稳定性实验数据，图1为校准曲线图，图2为线性范围相关性，如下所示：
[0103]
表8校准信号值
[0104][0105]
表9线性范围
[0106]
[0107][0108]
表10重复性
[0109]
测试次数saa-低值saa-中值saa-高值16.4010.9574.6325.9910.6974.5136.0410.9175.4545.6510.8075.1056.2910.5174.8565.6810.6975.1375.9310.8574.0985.5910.4974.7496.5910.4074.96105.9310.8274.85ave6.00910.71174.831sd0.33260.18940.3746cv5.54％1.77％0.50％max6.5910.9575.45min5.5910.474.09range10.551.36
[0110]
表11开瓶稳定性
[0111][0112]
表12 37℃加速稳定性
[0113][0114][0115]
本文涉及“质量体积百分比浓度”的描述，单位均为g/l。
[0116]
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。