使用遗传修饰的自体t细胞免疫疗法的治疗方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年10月8日提交的美国临时专利申请序列号62/912,545的优先权，其内容通过引用的方式整体纳入，并要求其优先权。
3.序列表
4.本说明书参考了序列表(2020年10月8日以电子方式提交的名称为“0875200153sl.txt”的.txt文件)。.txt文件于2020年10月8日生成，大小为1,030字节。序列表的全部内容通过引用纳入本文。
背景技术：
5.已经确定了t细胞免疫在控制多组人类癌症中的临床相关性。在免疫肿瘤学试验中和用批准的药物中观察到的临床活性通常取决于在每个癌症患者中释放预先存在的内在t细胞免疫应答。用抗pd1/抗pd-l1抗体药物治疗后内源性t细胞免疫应答的释放通常被观察为在开始治疗后快速和持久的肿瘤减少。使用这些免疫检查点阻断疗法对患者进行治疗已导致在一系列肿瘤类型中的晚期恶性肿瘤患者的总体生存期得到改善(robert，等人，2015)(herbst，等人，2014)(wolchok，等人，2013)(hamid，等人，2013)(brahmer，等人，2012)(topalian，等人，2012)。然而，尽管免疫疗法取得了这些成功，但很大一部分经治疗的实体瘤患者没有反应，这代表患者从新的免疫疗法方法中获得临床益处的高度未得到满足的需求。
技术实现要素：
6.本公开提供了组合物，其包含：a)第一neotcr细胞群，其包含结合第一新抗原的第一neotcr；b)第一neotcr细胞群和第二neotcr细胞群，所述第一neotcr细胞群包含结合第一新抗原的第一neotcr，所述第二neotcr细胞群包含结合第二新抗原的第二neotcr；或c)第一neotcr细胞群、第二neotcr细胞群和第三neotcr细胞群，所述第一neotcr细胞群包含结合第一新抗原的第一neotcr、所述二neotcr细胞群包含结合第二新抗原的第二neotcr，所述第三neotcr细胞群包含结合第三新抗原的第三neotcr；其中每种neotcr与其他的不同，并且其中每种neotcr都源自患者。
7.在某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原由单个基因表达。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原由不同基因表达。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原中的两种由单个基因表达。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr结合单个主要组织相容性复合体。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr结合不同的主要组织相容性复合体。在某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr中的两种结合单个主要组织相容性复合体。
8.在某些实施方案中，组合物包含药学上可接受的载体。在某些实施方案中，组合物包含冷冻保存剂。在某些实施方案中，组合物包含血清白蛋白。在某些实施方案中，组合物包含晶体样溶液。在某些实施方案中，组合物包含血浆-lyte a(plasma-lyte a)、人血清白
lyte a、人血清白蛋白(has)和
18.本公开提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括施用多种细胞，包括：i)第一修饰的细胞，其包含编码结合第一抗原的第一neotcr的第一外源多核苷酸，其中所述第一外源多核苷酸整合在所述第一修饰的细胞的内源型trac和/或trbc基因座中；ii)第二修饰的细胞，其包含编码结合第二抗原的第二neotcr的第二外源多核苷酸，其中所述第二外源多核苷酸整合在所述第二修饰的细胞的内源型trac和/或trbc基因座中；iii)第三修饰的细胞，其包含编码结合第三抗原的第三neotcr的第三外源多核苷酸，其中所述第三外源多核苷酸整合在所述第三修饰的细胞的内源型trac和/或trbc基因座中；或iv)其组合；其中第一、第二和第三neotcr是患者来源的，并且其中第一、第二和第三修饰的细胞是患者来源的原代细胞，从而治疗受试者的癌症。
19.在某些实施方案中，第一、第二和第三抗原是癌抗原。在某些实施方案中，其中癌抗原是新抗原。在某些实施方案中，原代细胞是淋巴细胞。在某些实施方案中，原代细胞是t细胞，任选地其中t细胞是：a)cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95-、ccr7 和cd27 ；b)cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95 、cd27 、ccr7 ；或c)cd45ro 、cd62l 、cd28 、cd95 、ccr7 、cd27 、cd127 。
20.在某些实施方案中，该方法还包括施用组合剂。在某些实施方案中，组合剂是细胞因子、pd-轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂、pd-l2结合剂或其组合。在某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂、il-7试剂、il-10试剂、il-12试剂、il-15试剂、il-18试剂、il-21试剂，或其组合。在某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂。在某些实施方案中，细胞因子是il-15试剂。在某些实施方案中，pd轴结合剂包括纳武单抗、帕博利珠单抗或阿替利珠单抗。在某些实施方案中，癌症是液体癌症或实体癌症。
21.本公开提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括：a)施用有效量的修饰的细胞，所述修饰的细胞包含编码结合肿瘤抗原的neotcr的外源多核苷酸，其中所述外源多核苷酸整合在修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中；和b)施用有效量的组合剂；从而治疗受试者的癌症。
22.在某些实施方案中，组合剂包含化疗剂、抗激素剂、内分泌治疗剂、细胞毒剂、细胞因子、pd-轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂、pd-l2结合剂，或其组合。在某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂、il-7试剂、il-10试剂、il-12试剂、il-15试剂、il-18试剂、il-21试剂，或其组合。在某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂。在某些实施方案中，细胞因子是il-15试剂。在某些实施方案中，pd轴结合剂包括纳武单抗、帕博利珠单抗或阿替利珠单抗。在某些实施方案中，癌症是液体癌症或实体癌症。
附图说明
23.图1示出了使用延时活显微术(第0、1和2天)获得的代表性图像，显示与表达同源的neo12肽-hla的靶标t细胞共培养的neo12-tcr t细胞(代表性neotcr产品)的抗原特异性细胞毒活性和增殖(右列)，但与表达无关肽的靶标t细胞共培养时无抗原特异性细胞毒活性和增殖(左列)。neo12是一种neotcr，其通过肿瘤和血液筛查以及后来的精密基因组改造到t细胞中并制成neotcr产品来鉴定。这些实验中使用的肿瘤细胞以稳定和均质的方式表达绿色荧光蛋白(gfp或zsgreen)的变体。这些细胞表现出高度均匀的绿色荧光，允许通过
荧光显微术鉴定细胞。为了检测实时细胞凋亡，将高选择性磷脂酰丝氨酸花菁荧光染料(红色的incucyte annexin v)添加到共培养物中。在neo12-tcr t细胞存在的情况下，不展示适当抗原的肿瘤细胞继续生长(左列)。相比之下，大多数展示neo12抗原的肿瘤细胞在2天内凋亡或死亡(右列)。本实验中未标记t细胞，但可以通过2天期间增加的t细胞数量直观地了解抗原特异性增殖(右列)。使用isoplexis图像处理软件分析细胞样品的原始显微镜和微阵列扫描(加载到单细胞条形码芯片上)和蛋白质分泌数据，以确定包含单细胞的腔室的位置，然后提取它们的分泌读数。来自空细胞腔室的数据用于测量每种分析的蛋白质的背景强度水平。然后使用背景读数对单细胞读数进行归一化，以确定显著的分泌并比较测定间的概况。isoplexis专有软件和r统计软件包用于统计数据分析。本研究中使用的t细胞由健康供体产生。编辑后的t细胞与靶标肿瘤细胞以2∶1的比例孵育，然后加载到isoplexis平台上进行效应蛋白分泌曲线分析。
24.图2示出了cd4和cd8 t细胞被改造以在遇到同源抗原时表达neo12或f5 tcr的百分比，其分泌2、3、4或大于等于5种细胞因子(灰色阴影)。细胞与无肽、10nm或100nm特异性肽脉冲的靶标t细胞或在其表面组成型表达phla的靶标t细胞共培养(n：neo12肽-hla-a2受体表达肿瘤细胞；m：mart1肽-hla-a2受体表达肿瘤细胞)。在共培养24小时后评估分泌的细胞因子水平。来自整个t细胞群的单个t细胞在刺激时表达两种或多种效应分子的比例在每个条形中显示为不同的颜色阴影。分泌两种或更多种效应蛋白的细胞被认为是多功能的。
25.图3示出了用癌症疫苗治疗的黑素瘤患者中neoe t细胞应答的代表性纵向分析。
26.图4a和4b示出了对从pbmc获得的不同tcr响应抗pd-1抗体治疗的纵向监测。图4a示出了每10
×
106cd8 t细胞中新抗原特异性(neoe特异性)t细胞的数量。图4b示出了新抗原的mrna表达。
27.图5示出了neotcr候选细胞对自体肿瘤细胞的功能表征的代表性模型。在使用这种功能表征方法进行的实验中，neotcr t细胞与自体肿瘤细胞系以10∶1的产物与靶标比(p∶t)共培养。neotcr细胞作为单种neotcr产品、由两种neotcr细胞中的每一种的1/2组成的2 neotcr产品(即，等量的每种neotcr细胞)，或作为由三种tcr的每一种的1/3组成的3 neotcr产品(即等量的每种neotcr细胞)被测试。neotcr产品中使用的neotcr与靶向的不同的新表位和/或hla组合进行了测试。将自体肿瘤细胞转导以表达红色荧光蛋白，然后在incucyte系统中随时间测量红色汇合度(confluency)的量。红色荧光蛋白阳性细胞百分比的降低被用来衡量neotcr产品的细胞毒活性。本实验的阴性对照是：(1)仅用培养基的肿瘤细胞；(2)与来自不同患者的肿瘤细胞系共培养的neotcr细胞；(3)不相关的neotcr(neo12)产品与自体肿瘤细胞系的共培养物。
28.图6a和6b示出在测试的p∶t比为30∶1时，用单种neotcr产品杀死自体肿瘤细胞是无效的。图6a示出了1 neotcr产品均未显示超过100小时的持续杀伤。相比之下，图6b示出所有3 neotcr产品都表现出超过100小时的持续杀伤。rpmi m490细胞在图6a和6b中均用作对照。虽然并未示出所有数据，但在所有23种不同的neotcr中，都用于制备1 neotcr产品、2 neotcr产品和3 neotcr产品。图6b中示出的加框3 neotcr产品是用作图7和图8中实例的3 neotcr产品。
29.图7a-7d示出了包括neotcr 408、neotcr 409和neotcr 429的3 neotcr产品，如图6b所示。图7a示出了每种neotcr的单种neotcr产品与对照(rpmi m490和neo12)相比，并与
包含所有三种neotcr的3 neotcr产品(等量的neotcr 408细胞、neotcr 409细胞、和neotcr 429细胞的每一种)相比。图7b-7d示出了三个图，示出了1 neotcr产品与对照(rpmi m490和neo12)的比较以及与包含两种neotcr的2 neotcr产品(两种neotcr细胞中的每一种的量相等)的比较。如图7a和7b-7d所示，虽然2 neotcr产品表现出杀伤作用，但2 neotcr组合中没有一种表现出与3 neotcr产品相同程度的杀伤作用。图7c示出每种neotcr具有不同的新表位，hla存在多样性，并且neotcr的生理特性存在差异。
30.图8a-8d示出了包括neotcr 409、neotcr 429和neotcr 421的3 neotcr产品，如图6b所示。图8a示出了每种neotcr的单种neotcr产品与对照(rpmi m490和neo12)相比，并与包含所有三种neotcr的3 neotcr产品(等量的neotcr 409细胞、neotcr 429细胞、和neotcr 421细胞的每一种)相比。图8b-8d示出了1 neotcr产品与对照(rpmi m490和neo12)的比较以及与包含两种neotcr的2 neotcr产品(两种neotcr细胞中的每一种的量相等)的比较。如图所示，虽然2 neotcr产品表现出杀伤力，但2 neotcr组合中没有一种表现出与3 neotcr产品相同的杀伤程度，如左上图所示。图8e示出了两个图表：第一个图表示出在图7a-7d中示出的neotcr产品中使用的3 neotcr具有不同的新表位，hla存在多样性，并且neotcr的生理特性存在差异；第二个图表示出，图8a-8d所示的neotcr产品中使用的每种neotcr具有不同的新表位、不同的hla，以及neotcr的生理特性差异。
31.图9a-9c示出通过用ifnγ预处理可以增强m490细胞系的hla表达水平以更好地模拟肿瘤细胞hla表达。图9a示出了没有ifnγ预处理的m490细胞上的内源性hla表达。图9b示出了ifnγ预处理上调hla表达(fmo是对照，无染色)。图9c示出了rnaseq数据，该数据示出了在m486和m490细胞中ifnγ预处理后hla i类上调的热图。在这些实验中，m490细胞系被改造为表达neotcr。因此，图9b和9c示出ifnγ预处理可用于通过上调hla 1类和新抗原呈递来诱导癌细胞的更自然表型。
32.图10a和10b示出，尽管ifnγ预处理对m490细胞系具有细胞抑制作用(图10a)，但它不影响细胞成活力(图10b)。
33.图11a和11b示出neotcr产品在用ifnγ预处理时表现出更高程度的细胞毒性。图11a示出了使用1 neotcr产品(和未用neotcr转染的m490细胞系作为对照)的肿瘤杀伤测定。如图所示，某些1 neotcr产品没有显示出杀伤作用(neotcr 423、neotcr 418和neotcr 433显示出没有杀伤作用，与同样没有显示出杀伤作用的对照m490细胞一致)。
34.图11b示出了与图11a所示相同的肿瘤杀伤测定，但使用了ifnγ预处理。这表明ifnγ预处理增加了neotcr产品的杀伤能力。
35.图12示出了肽脉冲实验的实验装置。如图所示，肿瘤细胞(从患者活组织检查中培养的黑色素瘤细胞)用一种新肽脉冲，该新肽对在neotcr产品上表达的新表位(即neotcr的同源新肽)具有特异性。在有和没有ifnγ预处理的情况下进行杀伤测定，并通过incucyte测定测量杀伤。在这些实验中，p∶t比(neotcr细胞∶肿瘤细胞比)为10∶1。
36.图13a和13b示出具有neotcr 409的neotcr产品(图13a)和具有neotcr 422的neotcr产品(图13b)，这两种neotcr都是hla-a02限制的，在肽用同源新肽脉冲处理后显示出对自体肿瘤细胞的优异细胞毒性。
37.图14a-14c示出具有neotcr 418的neotcr产品(图14a)、具有neotcr 433的neotcr产品(图14b)和具有neotcr 423的neotcr产品(图14c)，每种neotcr都是hla-b15限制性的，
在用ifnγ预处理和肽用同源新肽脉冲处理后，示出自体肿瘤细胞杀伤。与图13a和13b中所示的hla-a02限制性neotcr产品相反，图14a-14c中所示的hla-b15限制性neotcr产品在用ifnγ预处理时显示出显著的肿瘤细胞杀伤增加，这表明hla呈递依赖于hla。
38.图15示出了neotcr引发实验的实验设计。具体来说，该实验旨在检验如下假设：两种neotcr可以协同工作以促进肿瘤细胞杀伤。在该实验中，制备了两种neotcr产品，每种产品都对肿瘤细胞(从患者活检培养的黑色素瘤细胞)上表达的两种新抗原中的一种具有特异性。肿瘤细胞首先用第一种neotcr产品培养20小时，然后用或不用第二种neotcr产品培养。
39.图16示出了引发实验的结果。使用的两种neotcr产品是：1)具有neotcr 422的neotcr产品(产品1)，以及2)具有neotcr 421的neotcr产品(产品2)。假设是，如果用第一种neotcr产品引发肿瘤细胞，它将诱导凋亡信号并使肿瘤细胞更容易随后被第二种neotcr产品杀死。用产品1或产品2引发肿瘤细胞20小时。除去含有产品1或产品2的引发培养基，然后用单独的rpmi培养基或用另一种产品处理细胞。本实验中使用的p∶t比值为30∶1。如图所示，两种neotcr产品在用另一种neotcr产品预处理后都表现出增强的杀伤能力。
40.图17a和17b示出用第一种neotcr产品引发肿瘤细胞增强了第二种neotcr产品的杀伤力。图17a示出表达neotcr 429的neotcr产品在表达neotcr 422的neotcr产品引发肿瘤细胞后表现出增强的杀伤力。图17a示出表达neotcr 429的neotcr产品在表达neotcr 421的neotcr产品引发肿瘤细胞后表现出增强的杀伤力。在这两个实验中，虽然引发培养基确实诱导了一些肿瘤细胞的杀伤，但引发加上第二种neotcr产品诱导了显著更多的杀伤。
41.图18a-18d示出了不同neotcr细胞之间的意料不到的协同作用。图18a示出虽然表达neotcr422的neotcr产品(neotcr产品1)、表达neotcr 429的neotcr产品(neotcr产品2)和表达neotcr 421的neotcr产品(neotcr产品3)的每一种均表现出一定程度的肿瘤细胞杀伤，但neotcr产品4(包含表达neotcr 422、neotcr 429或neotcr 421的neotcr细胞；每种neotcr细胞占neotcr产品4中总neotcr细胞的1/3，如图5中所述)显示出显著更多的肿瘤细胞杀伤，证明了neotcr产品中的3 neotcr的协同作用。为了了解3 neotcr产品是否优于2 neotcr产品，使用neotcr 422、neotcr 429或neotcr 421的每种组合制备了2 neotcr产品(图18b-18d)。这些实验是使用图6b中所示的3 neotcr组合中的每一种进行的，并且在每个实验中都显示了3 neotcr与1或2 neotcr的意料不到的协同作用。
42.图19示出了1 neotcr产品在有限的10∶1 p∶t比值下不能有效杀伤自体肿瘤细胞，并且还示出了cd8独立与cd8依赖性neotcr的功效。
43.图20示出了由从患者分离的neotcr组成的3 neotcr产品对自体肿瘤细胞系的细胞毒性的协同作用。3 neotcr的组合靶向不同的新表位和不同的hla。当作为单种neotcr进行测试时，neotcr无法控制肿瘤细胞系。当组合测试时，neotcr显示出协同作用，并且能够控制肿瘤细胞系，如红色荧光细胞百分比的降低所说明的。用rpmi或表达neo12tcr的t细胞(对照)未观察到对肿瘤细胞生长的影响。右侧的流程图显示了cd4和cd8细胞上的dextramer和2a染色。测试的3 neotcr，tcr406、tcr418和tcr429是cd8依赖的neotcr。在这些neotcr中，cd4细胞中dextramer结合的百分比小于cd8细胞中dextramer结合的50％。
44.发明详述
45.本公开提供了具有增强的免疫疗法活性和功效的组合物。本公开部分基于令人意
外的结果，该结果显示靶向肿瘤抗原(例如，新抗原)并且在单独时不显示或显示可忽略不计的细胞毒活性的修饰的细胞组合时，具有增加的活性(例如，细胞毒性、细胞增殖和/或细胞持久性)。本公开还提供了产生本文公开的多种细胞和组合物的方法，以及使用这些细胞治疗和/或预防癌症的方法。
46.本公开的非限制性实施方案由本说明书和实施例描述。出于公开的清楚目的而非限制的目的，详细描述分为以下小节：
47.1.定义；
48.2.neotcr细胞和neotcr产品；
49.3.治疗性组合物和制备方法；
50.4.治疗方法；
51.5.药物制剂；
52.6.制品；
53.7.基因组编辑方法；
54.8.同源重组模板；和
55.9.试剂盒。
56.1.定义
57.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有本领域技术人员通常理解的含义。以下参考文献为技术人员提供了本公开主题中使用的许多术语的一般定义：singleton等人，dictionary of microbiology and molecular biology(第二版，1994)；the cambridge dictionary of science and technology(walker ed.，1988)；the glossary of genetics，5th ed.，r.rieger等人(eds.)，springer verlag(1991)；和hale&marham，the harper collins dictionary of biology(1991)。如本文所用，除非另有说明，否则以下术语具有以下赋予它们的含义。
58.应当理解，本文描述的本发明的方面和实施方案包括“包含”、“由......组成”和“基本上由......组成”方面和实施方案。术语“包含(comprises)”和“包含(comprising)”旨在具有美国专利法赋予它们的广泛含义，可以表示“包括(includes)”、“包括(including)”等。
59.如本文所用，术语“约”或“大约”是指在由本领域技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即，测量系统的局限性。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在3个或超过3个标准差内。或者，“约”可表示给定值的最多20％，例如最多10％、最多5％或最多1％的范围。或者，特别是就生物系统或过程而言，该术语可表示值的一个数量级内，例如在5倍或2倍内。
60.如本文所用，“对乙酰氨基酚”是指对乙酰氨基酚和相同和/或治疗上相似的试剂如扑热息痛的任何其他品牌或缓释的替代品。
61.如本文所用，“施用”是指给予受试者一定剂量的化合物(例如，neotcr产品、组合剂或本文所述的其他试剂)或组合物(例如，neotcr产品的药物制剂、组合剂或本文所述的其他试剂)的方法。在本文所述的方法中使用的组合物可以例如静脉内、腹膜内、囊内、瘤内和皮下施用。其他施用方式包括但不限于鞘内、淋巴结注射、肌内、皮内、动脉内、病变内、颅内、胸膜内、气管内、玻璃体内、腹腔内和脐内。本文公开的任何施用可以通过注射、通过输
注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗来进行。施用方法可以根据各种因素(例如，所治疗的病症、疾病或紊乱的严重程度，以及所治疗的癌症或增殖性疾病的类型)而变化。
62.如本文所用的“抗体”以最广泛的含义使用并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性和三特异性抗体)和抗体片段(例如，双-fab)，只要它们表现出所需的抗原结合活性。如本文所用，“抗体片段”是指除完整抗体之外的分子，其包含完整抗体的一部分，其与完整抗体结合的抗原结合。抗体片段的实例包括但不限于双-fab；fv；fab；fab，fab
′‑
sh；f(ab
′
)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scfv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
63.术语“癌症”和“肿瘤”在本文中可互换使用。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有癌前和癌细胞和组织。这些术语还用于指或描述哺乳动物的生理状况，其通常以不受调节的细胞生长/增殖为特征。癌症的实例包括但不限于本文描述的那些。如本文所用，术语“癌症”或“肿瘤”和“增殖性病症”并不相互排斥。
64.如本文所用，“化疗剂”是指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派、环磷酰胺替莫唑胺treosultan和盐酸苯达莫司汀烷基磺酸酯，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类，例如benzodopa、卡波醌、meturedopa和uredopa；乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类，包括六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺和三甲基三聚氰胺；番荔枝内酯类(尤其是布拉它辛和布拉它辛酮)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚，)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙素；桦木酸；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康cpt-11(伊立替康、)、伊立替康脂质体注射剂乙酰喜树碱、东莨菪素(scopolectin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素；callystatin；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他丁；多卡霉素(包括合成类似物，kw-2189和cb1-tm1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇(a sarcodictyin)；海绵抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌氮芥、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥盐酸盐、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福泰氮芥、罗氮芥、尼莫司汀和雷诺氮芥；抗生素，例如烯二炔抗生素(例如，加利车霉素，尤其是加利车霉素γ1i和加利车霉素ωi1(参见，例如，nicolaou等人，angew.chem intl.ed.engl.，33：183-186(1994))；cdp323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；dynemicin，包括dynemicina；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发色团和相关的色蛋白烯二炔抗生素发色团)、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素d、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧-l-正亮氨酸、阿霉素(包括吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2-吡咯啉代阿霉素、盐酸阿霉素脂质体注射液脂质体阿霉素tlc d-99聚乙二醇化脂质体阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星、依柔比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝
裂霉素如丝裂霉素c、霉酚酸、诺加拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑霉素、链脲霉素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，例如甲氨蝶呤、吉西他滨替加氟卡培他滨一种埃博霉素和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨和奈拉滨嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如frolinic acid；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；阿莫司汀(bestrabucil)；比生群；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；lonidainine；美登素，例如美登素和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；mopidanmol；nitraerine；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；多糖复合物(jhs natural products，eugene，or)；雷佐生；根瘤菌素；西佐糖；螺旋锗；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2，2
′
，2
′‑
三氯三乙胺；单端孢菌素(尤其是t-2毒素、verracurina、杆孢菌素a和蛇形菌素)；聚氨酯；长春地辛达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“ara-c”)；噻替哌；紫杉烷，例如紫杉醇紫杉醇的白蛋白工程纳米颗粒制剂(abraxanetm)、卡巴他赛和多西他赛苯丁酸氮芥；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂剂，例如顺铂、奥沙利铂(例如)和卡铂；vincas，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱长春新碱硫酸长春新碱脂质体长春地辛长春氟宁和长春瑞滨依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；亚叶酸；novantrone；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸盐；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类维生素a，如视黄酸，包括贝沙罗汀二膦酸盐，例如氯屈膦酸盐(例如)、依替膦酸盐ne-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐阿仑膦酸盐氨羟二磷酸二钠替鲁膦酸盐或利塞膦酸盐troxacitabine(一种1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是抑制与异常细胞增殖有关的信号通路中基因表达的那些，例如pkc-α、raf、h-ras和表皮生长因子受体(egf-r)；疫苗，例如疫苗和基因治疗疫苗，例如疫苗、疫苗和疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如)；rmrh(例如，)；索拉非尼(例如)；su-11248(舒尼替尼、辉瑞)；哌立福辛、cox-2抑制剂(例如塞来昔布或
etoricoxib)、蛋白酶体抑制剂(例如ps341)，例如卡非佐米和ixazomib柠檬酸盐硼替佐米cci-779；替匹法尼(r11577)；orafenib，abt510；bcl-2抑制剂，例如奥利美生钠和venetoclax匹克蒽醌(pixantrone)；egfr抑制剂(见下文定义)，例如吉非替尼酪氨酸激酶抑制剂(见下文定义)，例如波舒替尼卡博替尼-s-苹果酸盐二马来酸afatinib甲磺酸伊马替尼盐酸帕纳替尼阿昔替尼依鲁替尼甲苯磺酸索拉非尼达沙替尼奥希替尼(osimertinib)盐酸埃罗替尼尼罗替尼二甲苯磺酸拉帕替尼克里唑替尼和盐酸帕唑帕尼丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，例如雷帕霉素(西罗莫司，)、依维莫司和西罗莫司脂化物法尼基转移酶抑制剂，例如lonafarnib(sch 6636，sarasartm)；nk1受体拮抗剂，例如奈妥匹坦(netupitant)和罗拉匹坦(rolapitant)盐酸盐咪喹莫特间变性淋巴瘤激酶(alk)抑制剂，例如alectinib和ceritinil组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如贝林司他(belinostat)和伏林司他嘌呤核苷抗代谢物，如氯法拉滨；丝裂原活化蛋白激酶激酶(mek)抑制剂，例如cobimetinib和曲美替尼核酸合成抑制剂，例如地西他滨hedgehog信号通路抑制剂，例如vismodegib和sonidegib组蛋白去乙酰化酶抑制剂，例如panobinostat抗叶酸剂，例如pralatrexate雷替曲塞和培美曲塞二钠有丝分裂抑制剂，例如甲磺酸艾立布林(eribulin)周期蛋白依赖性激酶的抑制剂，例如帕博西尼(palbociclib)缩酚酸肽，例如romidepsin埃博霉素b类似物，例如ixabepilonejanus激酶抑制剂，例如磷酸ruxolitinib多种激酶抑制剂，例如lenvatinib甲磺酸盐凡他尼布瑞格拉非尼nintedanib核苷类似物，例如曲氟尿苷；胸苷磷酸化酶抑制剂，例如盐酸tipiracil；parp抑制剂，例如奥拉帕尼沙利度胺及其衍生物，例如泊马度胺和来那度胺合成皮质类固醇，如泼尼松；生长抑素类似物，例如醋酸兰瑞肽蛋白质翻译抑制剂，例如奥西他辛甲哌丁二酸盐(omacetaxine mepesuccinate)相关酶b-raf的抑制剂，例如达非替尼印威罗菲尼三氧化二砷尿苷三乙酸酯二氯化镭223
曲贝替定磷酸肌醇3-激酶抑制剂，例如idelalisibmilfamurtide以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合，例如chop，环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合治疗的缩写；和folfox，奥沙利铂(eloxatintm)组合5-fu和醛氢叶酸的治疗方案的缩写。
65.本文定义的化疗剂包括“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”，其起到调控、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的作用。它们本身可能是激素，包括但不限于：具有混合激动剂/拮抗剂特征的抗雌激素，包括他莫昔芬4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬艾多昔芬、屈洛昔芬、雷洛昔芬曲奥昔芬、keoxifene和选择性雌激素受体调节剂(serm)，例如serm3；促性腺激素释放激素(gnrh)拮抗剂，例如地加瑞克、亮丙瑞林和曲普瑞林；不含激动剂特性的纯抗雌激素，例如氟维司群和em800(此类试剂可阻断雌激素受体(er)二聚化、抑制dna结合、增加er转换和/或抑制er水平)；芳香酶抑制剂，包括甾体芳香酶抑制剂，例如福美司坦和依西美坦以及非甾体芳香酶抑制剂，例如阿那曲唑来曲唑和氨鲁米特，和其他芳香酶抑制剂包括伏氯唑醋酸甲地孕酮法曲唑和4(5)-咪唑；促黄体激素释放激素激动剂，包括亮丙瑞林性瑞林、布舍瑞林、组氨瑞林和曲普瑞林；性类固醇，包括孕激素，例如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮，雌激素，例如己烯雌酚和普雷马林，以及雄激素/类维生素a，例如氟甲睾酮、全反式维甲酸和芬维a胺；地塞米松；奥那司酮；抗黄体酮；雌激素受体下调剂(erds)；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特(例如)、醋酸阿比特龙醋酸环丙孕酮恩杂鲁胺和比卡鲁胺；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两种或多种的组合。
66.如本文所用，“组合剂”是指可以与一种或多种neotcr产品同时或连续施用的任何其他活性剂。
67.如本文所用，“完全反应”是指所有癌症迹象响应治疗而消失。
68.如本文所用，“细胞毒剂”是指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞死亡或破坏的物质。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如，at
211
、i
131
、i
125
、y
90
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186
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188
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153
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212
、p
32
、pb
212
和lu的放射性同位素)；化疗剂或药物(例如，甲氨蝶呤、阿霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春碱、依托泊苷)、多柔比星(doxorubicin)、美法仑、丝裂霉素c、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道诺霉素或其他嵌合剂)；生长抑制剂；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体；以及各种抗肿瘤或抗癌剂，例如大分子(例如抗体、肽和蛋白质，例如细胞因子)、细胞疗法和癌症疫苗。
69.如本文所用，“延迟进展”或“延迟的进展”意指推迟、阻碍、减缓、延迟、稳定和/或推迟细胞增殖性病症例如癌症的发展。这种延迟可能有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在接受治疗的个体。正如对于本领域技术人员显而易见的，充分或显著的延迟
2细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
76.如本文所用，“il-7试剂”是指任何il-7细胞因子、包含il-7细胞因子或其功能片段的分子、il-7细胞因子的衍生物、修饰的il-7细胞因子、聚乙二醇化的il-7细胞因子、与il-7细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-7细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-7细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
77.如本文所用，“il-10试剂”是指任何il-10细胞因子、包含il-10细胞因子或其功能片段的分子、il-10细胞因子的衍生物、修饰的il-10细胞因子、聚乙二醇化的il-10细胞因子、与il-10细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-10细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-10细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
78.如本文所用，“il-12试剂”是指任何il-12细胞因子、包含il-12细胞因子或其功能片段的分子、il-12细胞因子的衍生物、修饰的il-12细胞因子、聚乙二醇化的il-12细胞因子、与il-12细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-12细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-12细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
79.如本文所用，“il-15试剂”是指任何il-15细胞因子、包含il-15细胞因子或其功能片段的分子、il-15细胞因子的衍生物、修饰的il-15细胞因子、聚乙二醇化的il-15细胞因子、与il-15细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-15细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-15细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
80.如本文所用，“il-18试剂”是指任何il-18细胞因子、包含il-18细胞因子或其功能片段的分子、il-18细胞因子的衍生物、修饰的il-18细胞因子、聚乙二醇化的il-18细胞因子、与il-18细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-18细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-18细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
81.如本文所用，“il-21试剂”是指任何il-21细胞因子、包含il-21细胞因子或其功能片段的分子、il-21细胞因子的衍生物、修饰的il-21细胞因子、聚乙二醇化的il-21细胞因子、与il-21细胞因子或其功能片段融合的抗体、与il-21细胞因子或其功能片段融合的fc、或与il-21细胞因子或其功能片段融合的另一抗体片段。
[0082]“标签”或“包装插页”用于指通常包含在治疗产品商业包装中的说明，其中包含有关使用此类治疗产品的适应证、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症和/或警告的信息。除非本文另有说明，否则“标签”或“包装插页”是指neotcr产品的标签或包装插页。
[0083]
如本文所用，术语“新抗原”、“新表位”或“neoe”是指新形成的抗原决定簇，其产生于例如体细胞突变并被识别为“非自身的”。产生“新抗原”、“新表位”或“neoe”的突变可包括移码或非移码插入缺失、错义或无义置换、剪接位点改变(例如，选择性剪接的转录物)、基因组重排或基因融合、任何基因组或表达改变，或任何翻译后修饰。
[0084]“neotcr”和“tcr”可互换使用，如本文所用，意指新表位特异性t细胞受体。
[0085]
如本文所用，“neotcr细胞”或“neotcr细胞”是指一种或多种细胞，其经过精密改造以表达一种或多种neotcr。在某些实施方案中，细胞是t细胞。在某些实施方案中，t细胞是cd8 和/或cd4 t细胞。在某些实施方案中，cd8 和cd4 t细胞(即neotcr细胞)是来自将对其施用neotcr产品的患者的自体细胞。
[0086]
如本文所用，“neotcr细胞群”是指neotcr细胞群，其中群中的每个细胞都经过精密改造以表达相同的neotcr。
[0087]
如本文所用，“neotcr产品”或“tcr产品”是指包含一种或多种neotcr的药物制剂。neotcr产品包括自体精密基因组改造的cd8 和cd4 t细胞。例如，使用靶向dna介导的非病毒精密基因组改造方法，内源性tcr的表达被消除，并被从外周cd8 t细胞中分离出来的患者特异性neotcr替代，所述外周cd8 t细胞靶向肿瘤专属新表位。在某些实施方案中，所得改造的cd8 和cd4 t细胞在其天然序列、天然表达水平和天然tcr功能的表面上表达neotcr。neotcr外部结合结构域和细胞质信号传导结构域的序列未从从天然cd8 t细胞中分离的tcr修饰。neotcr基因表达的调控由位于neotcr基因盒整合到基因组中位置的上游的天然内源性tcr启动子驱动。通过这种方法，在未刺激和抗原激活的t细胞状态中观察到neotcr表达的天然水平。
[0088]
为每位患者生产的neotcr产物代表一定剂量的自体cd8 和cd4 t细胞，这些细胞进行精密基因组改造，以表达从neoe特异性cd8 t细胞克隆的单种neoe特异性tcr，所述neoe特异性cd8 t细胞从相同患者的外周血中单独分离。
[0089]
在某些实施方案中，neotcr产品包含多个不同的neotcr细胞群，每个群靶向不同的新抗原。在某些实施方案中，neotcr产品包含一个neotcr细胞群(即，该群的所有neotcr细胞靶向相同的新抗原)。在某些实施方案中，neotcr产品包含两个neotcr细胞群(即，第一neotcr细胞群的所有neotcr细胞靶向一种新抗原，并且第二neotcr细胞群的所有neotcr细胞靶向第二新抗原)。在某些实施方案中，neotcr产品包含三个neotcr细胞群(即，第一neotcr细胞群的所有neotcr细胞靶向一种新抗原，第二neotcr细胞群的所有neotcr细胞靶向第二新抗原，第三neotcr细胞群的所有neotcr细胞靶向第三新抗原)。在某些实施方案中，neotcr产品包含两种或更多种neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含三种或更多种neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含五种或更多种neotcr细胞。在某些实施方案中，具有两个或更多个neotcr细胞群的neotcr产品中每个neotcr细胞群的每种neotcr细胞的数量彼此大致相等(即，具有三个neotcr细胞群的neotcr产品包含1/3的第一neotcr细胞群、1/3的第二neotcr群和1/3的第三neotcr群)。
[0090]
neotcr产品是指所有neotcr产品，包括但不限于如下定义的一种neotcr产品、两种neotcr产品和三种neotcr产品。
[0091]
如本文所用，“一neotcr产品”或“1 neotcr产品”是指包含仅表达单一neotcr的细胞的neotcr产品。
[0092]
如本文所用，“二neotcr产品”或“2 neotcr产品”是指包含两个细胞群的neotcr产品：一个群表达第一neotcr，第二群表达第二neotcr。在某些实施方案中，2 neotcr产品具有大约相等数量的两个细胞群中的每一个。在某些实施方案中，2 neotcr产品不具有大约相等数量的两个细胞群中的每一个。在某些实施方案中，每个细胞群都可以被认为是neotcr产品并且两个细胞群中的每一个的组合也被认为是neotcr产品。
[0093]
如本文所用，“三neotcr产品”或“3 neotcr产品”是指包含三个细胞群的neotcr产品：一个群表达第一neotcr，第二群表达第二neotcr，和第三群表达第三neotcr。在某些实施方案中，3 neotcr产品具有大约相等数量的三个细胞群中的每一个。在某些实施方案中，3 neotcr产品不具有大约相等数量的三个细胞群中的每一个。在某些实施方案中，每个细胞群可以被认为是neotcr产品并且三个细胞群中的每一个的组合也被认为是neotcr产品。
[0094]
在本文中，“2a”和“2a肽”可互换使用，是指一类长度为18-22个氨基酸的病毒自切
割肽，它们能够在真核细胞翻译过程中介导肽的切割。2a肽类的四个众所周知的成员是t2a、p2a、e2a和f2a。t2a肽首先在东亚细亚(thosea asigna)病毒2a中鉴定。p2a肽首先在猪捷申病毒-1(porcine teschovirus-1)2a中鉴定。e2a肽首先在马鼻炎a病毒中被鉴定。f2a肽首先在口蹄疫病毒中被鉴定。
[0095]
如本文所用，“组合”是指将本文公开的多种细胞和一种或多种试剂，例如pd-1轴结合剂，作为治疗方案或计划的一部分施用于受试者。
[0096]
如本文所用，“部分反应”是指响应治疗，肿瘤大小的缩小或体内癌症程度的减轻。
[0097]
如本文所用，“pd”是指药效学。
[0098]
术语“pd-1轴结合剂”是指一种分子，其抑制pd-1轴结合配偶体与其一种或多种结合配偶体相互作用，以消除由pd-1信号传导-轴上的信号传导导致的t细胞功能障碍，其结果是恢复或增强t细胞功能(例如，增殖、细胞因子产生、靶细胞杀伤)。如本文所用，pd-1轴结合剂包括pd-1结合剂、pd-l1结合剂和pd-l2结合剂。
[0099]
术语“pd-1结合剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-1与其一种或多种结合配偶体(例如pd-l1和/或pd-l2)的相互作用导致的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-1结合剂是抑制pd-1与其一种或多种结合配偶体结合的分子。在具体实施方案中，pd-1结合剂抑制pd-1与pd-l1和/或pd-l2的结合。例如，pd-1结合剂包括抗pd-1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-1与pd-l1和/或pd-l2相互作用导致的信号转导的分子。在一个实施方案中，pd-1结合剂减少由或通过在t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负的共刺激信号通过pd-1介导的信号传导，从而使功能失调的t细胞的功能失调降低(例如，增强对抗原识别的效应反应)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是抗pd-1抗体。在某些实施方案中，pd-1结合剂是md
×‑
1106(纳武单抗)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是mk-3475(帕博利珠单抗)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是西米普利单抗(cemiplimab)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是jtx-4014。在某些实施方案中，pd-1结合剂是spartalizumab。在某些实施方案中，pd-1结合剂是信迪利单抗(sintilimab)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是替雷利珠单抗。在某些实施方案中，pd-1结合剂是特瑞普利单抗。在某些实施方案中，pd-1结合剂是多塔利单抗(dostarlimab)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是mga012。在某些实施方案中，pd-1结合剂是amp-514。在某些实施方案中，pd-1结合剂是ct-011(匹地利珠单抗)(pidilizumab)。在某些实施方案中，pd-1结合剂是amp-224。在某些实施方案中，pd-1结合剂是med1-0680。在某些实施方案中，pd-1结合剂是pdr001。在某些实施方案中，pd-1结合剂是regn2810。在某些实施方案中，pd-1结合剂是bgb-108。
[0100]
术语“pd-l1结合剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一种或多种结合配偶体(例如pd-1，b7-1)相互作用产生的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l1结合剂是抑制pd-l1与其结合配偶体结合的分子。在具体实施方案中，pd-l1结合剂抑制pd-l1与pd-1和/或b7-1的结合。在一些实施方案中，pd-l1结合剂包括抗pd-l1抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽和减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l1与其一个或多个结合配偶体(例如pd-1、b7-1)相互作用导致的信号转导的其他分子。在一个实施方案中，pd-l1结合剂减少由或通过在t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负的共刺激信号通过pd-l1介导的信号传导，从而使功能失调的t细胞的功能失调降低(例如，增强对抗原识别
的效应反应)。在一些实施方案中，pd-l1结合拮抗剂是抗pd-l1抗体。在又一个具体实施方案中，抗pd-l1抗体是mpdl3280a(阿替利珠单抗(atezolizumab)，以tecentriq
tm
销售，具有who药物信息(国际药用物质非专有名)，推荐的inn：列表74，第29卷，编号3，2015(参见第387页))。在具体实施方案中，抗pd-l1抗体是yw243.55.s70。在另一个具体实施方案中，抗pd-l1抗体是mdx-1105。在另一个具体实施方案中，抗pd-l1抗体是msb0015718c。在另一个具体实施方案中，抗pd-l1抗体是med14736。
[0101]
术语“pd-l2结合剂”是指减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l2与其一种或多种结合配偶体(例如pd-1)相互作用产生的信号转导的分子。在一些实施方案中，pd-l2结合剂是抑制pd-l2与其一种或多种结合配偶体结合的分子。在具体实施方案中，pd-l2结合剂抑制pd-l2与pd-1的结合。在一些实施方案中，pd-l2试剂包括抗pd-l2抗体、其抗原结合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽和其他减少、阻断、抑制、消除或干扰由pd-l2与其一个或多个结合配偶体(例如pd-1)相互作用引起的信号转导的分子。在一个实施方案中，pd-l2结合剂减少由或通过在t淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白介导的负的共刺激信号通过pd-l2介导的信号传导，从而使功能失调的t细胞的功能失调降低(例如，增强对抗原识别的效应反应)。在一些实施方案中，pd-l2结合剂是免疫黏附素。
[0102]“药物制剂”是指这样一种制剂，其形式允许包含在其中的活性成分的生物活性是有效的，并且不包含对将要施用该制剂的受试者具有不可接受的毒性的额外组分。为清楚起见，neotcr产品中使用的dmso的数量不被认为具有不可接受的毒性。
[0103]
如本文所用，“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在某些实施方案中，增殖性病症是癌症。
[0104]
用于治疗目的的“受试者”、“患者”或“个体”是指归类为哺乳动物的任何动物，包括人类、家养和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，例如狗、马、猫、牛等。优选地，哺乳动物是人。
[0105]
如本文所用，“tcr”是指t细胞受体。
[0106]
如本文所用，“tla”是指靶向基因座扩增。
[0107]“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”可互换使用，并且如本文所用是指获得有益的或期望的结果，包括临床结果。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、减轻症状、减轻疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速度、改善或缓解疾病状态，缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的neotcr产物用于延迟增殖性病症(例如，癌症)的发展或减缓此类疾病的进展。
[0108]
如本文所用，“主干的”或“主干突变”是指系统发育树的主干中的由肿瘤的所有克隆共有的祖先突变，而“亚克隆”相反是指已从主干分化的谱系中的突变。每个患者的肿瘤都有一组独特的共享突变，以表明共同的进化起源。因此，如本文所用，患者的主干突变是指患者中相同谱系的所有肿瘤的共有突变。
[0109]
如本文所用，术语“多核苷酸”和“核酸分子”是指单链或双链共价连接的核苷酸序列，其中每个核苷酸上的3
′
和5
′
末端通过磷酸二酯键连接。核酸分子可以包括脱氧核糖核苷酸碱基或核糖核苷酸碱基，并且可以在体外合成制造或从天然来源分离。
[0110]
本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”是指由至少两个氨基酸连接形成的分子。一个氨基酸残基和下一个氨基酸残基之间的连接是酰胺键，有时
也称为肽键。多肽可以通过本领域已知的合适方法获得，包括从天然来源分离、在重组表达系统中表达、化学合成或酶促合成。这些术语可以适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0111]
如本文所用，术语“内源的”是指通常在细胞或组织中表达的核酸分子或多肽。
[0112]
如本文所用，术语“外源的”是指非内源性存在于细胞中的核酸分子或多肽。因此，术语“外源的”将包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外来的、异源的和过表达的核酸分子和多肽。“外源”核酸是指不存在于天然野生型细胞中的核酸；例如，外源核酸可以在序列、位置/定位或两者上与内源对应物不同。为清楚起见，相对于其天然内源对应物，外源核酸可具有相同或不同的序列；它可以通过基因工程引入细胞本身或其祖细胞中，并且可以任选地连接到备选控制序列，例如非天然启动子或分泌序列。
[0113]
如本文所用，术语“液体癌症”是指存在于体液，例如血液、淋巴液和骨髓中的癌细胞。在某些非限制性实施方案中，例如，液体癌症包括滤泡性淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓性白血病(aml)。
[0114]
如本文所用，术语“实体癌症”是指由不包括流体区域的组织产生的癌细胞。在某些非限制性实施方案中，例如，实体癌症包括黑素瘤、胸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、妇科癌、中枢神经系统癌、皮肤癌、hpv 癌症、食道癌、甲状腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆管癌、肾细胞癌、膀胱癌、睾丸癌、肉瘤和结直肠癌。
[0115]
与t细胞相关的“年轻”或“更年轻”或“年轻t细胞”是指记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆细胞(t
cm
)。这些细胞在特定激活时具有t细胞增殖，并且能够进行多次细胞分裂。它们还具有在重新输注后植入的能力，在暴露于其同族抗原后迅速分化为效应t细胞并靶向和杀死肿瘤细胞，以及持续进行癌症监视和控制。
[0116]
2.neotcr细胞和neotcr产品
[0117]
本公开提供了多种基因组改造的细胞，其中每种细胞靶向肿瘤抗原(例如，新抗原)。在某些实施方案中，当与靶向不同肿瘤抗原的其他基因组改造的细胞组合时，基因组改造的细胞表现出改善的活性(例如，细胞毒性)。在某些实施方案中，多种基因组改造的细胞表现出协同作用。当一起使用的活性成分(例如，两种或多种neotcr细胞)显示出大于单独使用活性成分产生的效果的总和时，实现了协同作用。
[0118]
在某些实施方案中，使用整体纳入本文的国际专利申请号pct/us2020/017887和国际专利申请号pct/us2019/025415中描述的基因编辑技术和neotcr分离技术，将neotcr通过精密的基因组工程克隆到来自同一癌症患者的自体cd8 和cd4 t细胞中，使自体cd8 和cd4 t细胞表达neotcr。在某些实施方案中，neotcr是肿瘤特异性的。在某些实施方案中，neotcr在癌症患者中被鉴定。在某些实施方案中，编码neotcr的多核苷酸被克隆并在免疫细胞中表达。在某些实施方案中，细胞是t细胞。在某些实施方案中，t细胞是年轻t细胞。
[0119]
在某些实施方案中，所述多个细胞是从癌症患者的t细胞开始制造的。在某些实施方案中，多种细胞中的每种细胞具有相当的基因编辑效率。在某些实施方案中，多种细胞中的每种细胞具有相当的活性(例如，抗原依赖性细胞毒性、增殖、细胞因子产生)。在某些实施方案中，多种细胞显示出安全的耐受性谱(profile)。
[0120]
在某些实施方案中，多种细胞的基因编辑包括用核糖核蛋白(rnp)复合体对细胞
进行电穿孔。在某些实施方案中，rnp复合体包含向导rna。在某些实施方案中，rnp复合体包含核酸酶。在某些实施方案中，核酸酶是cas9核酸酶。在某些实施方案中，rnp复合体靶向内源基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向tcr基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trac基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trbc基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trac和trbc基因座。
[0121]
在某些实施方案中，本公开包括用于确定本文公开的多种细胞的安全谱的方法。在某些非限制性实施方案中，例如，可以通过检测基因组不稳定性(例如，通过进行靶向基因座扩增(tla)或标准fish细胞遗传学)或通过检测脱靶整合(例如，通过guide-序列分析)来评估安全谱。
[0122]
在某些非限制性实施方案中，本公开包含将不同肿瘤抗原靶向到neotcr产品中的多种neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品的第一neotcr细胞靶向第一肿瘤抗原并在与靶向第二肿瘤抗原的第二neotcr细胞组合时表现出改善的活性(例如，细胞毒性)。在某些实施方案中，多种neotcr细胞表现出协同作用。
[0123]
在某些实施方案中，neotcr产品是从癌症患者的t细胞开始制造的。在某些实施方案中，neotcr产品的多种neotcr细胞具有相当的基因编辑效率。在某些实施方案中，neotcr产品的多种neotcr细胞具有相当的活性(例如，抗原依赖性细胞毒性、增殖、细胞因子产生)。在某些实施方案中，neotcr产品显示出安全的耐受性谱。
[0124]
在某些实施方案中，neotcr细胞的基因编辑包括用核糖核蛋白(rnp)复合体对细胞进行电穿孔。在某些实施方案中，rnp复合体包含向导rna。在某些实施方案中，rnp复合体包含核酸酶。在某些实施方案中，核酸酶是cas9核酸酶。在某些实施方案中，rnp复合体靶向内源基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向tcr基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trac基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trbc基因座。在某些实施方案中，rnp复合体靶向trac和trbc基因座。
[0125]
在某些实施方案中，本公开方法用于确定本文公开的多种细胞的安全谱的方法。在某些非限制性实施方案中，例如，可以通过检测基因组不稳定性(例如，通过进行靶向基因座扩增(tla)或标准fish细胞遗传学)或通过检测脱靶整合(例如，通过guide-序列分析)来评估安全谱。
[0126]
本文描述的基因组改造方法能够高效生成定制的neotcr t细胞(即neotcr产品)，用于实体和液体肿瘤患者的个性化过继细胞疗法。此外，改造方法不仅限于在t细胞中使用，还可以应用于其他原代细胞类型，包括自然杀伤细胞和造血干细胞。
[0127]
3.治疗性组合物和制备方法
[0128]
成分
[0129]
如本文所述，已开发出用于生产neotcr产品的良好生产规范(gmp)的质粒dna介导的(非病毒)精密基因组工程方法。例如，但不限于，患者特异性neotcr的靶向整合可以通过将crispr核酸内切酶核糖核蛋白(rnp)与由质粒dna编码的个性化neotcr基因盒一起电穿孔来实现。
[0130]
在某些实施方案中，使用本文所述的临床制造方法将neotcr产品配制成药物产品。在这些方法中，neotcr产品被冷冻保存在cryomacs冷冻袋中。根据患者需要，可为每位患者运送一个或多个袋子到现场。在某些实施方案中，该产品由单采血液成分术衍生的、患
者自体的cd8和cd4t细胞组成，这些细胞已被精密基因组改造以表达一种或多种靶向与内源性hla受体之一复合的新表位的自体neotcr，例如，主要或仅在该患者的肿瘤细胞表面上呈递。
[0131]
在某些实施方案中，最终的neotcr产品包含5％二甲亚砜(dmso)、人血清白蛋白和血浆-lyte。在某些实施方案中，最终的neotcr产品包含表1中提供的成分列表。
[0132]
表1：neotcr产品的组成
[0133][0134]
产品包装
[0135]
在某些实施方案中，neotcr产品最终药物产品在一个或多个cryomacs 250冷冻袋中提供给每个临床部位，该冷冻袋在30-70ml的推荐填充体积内填充有neotcr产品。
[0136]
cryomacs冷冻袋由乙烯醋酸乙烯酯管状薄膜制成。袋子通过包含注射端口和公母鲁尔锁组件的集成管组填充，这些组件为使用各种一次性转移装置、注射器或无菌连接装置进行无菌处理提供了灵活性。作为袋子组件的一部分，有两个尖刺端口可供使用，通过附接无菌输血组件，可以访问袋子内容物以用于产品的治疗用途。这些尖刺端口用密封的拧开保护盖固定，以防止交叉污染，并包含内部保护管，可在取出解冻的细胞产品期间防止冷冻袋穿孔。
[0137]
在某些实施方案中，产品标签附在袋子上，在冷冻之前直接贴在袋子的表面上，复制标签附在储存盒上，以确保产品对特定患者的可追溯性。此外，在某些实施方案中，包含基本信息(即，患者规定的id)的截短的标签被插入冷冻袋的标签袋中，以在主标签因任何原因丢失或难以辨认的情况下进行识别。
[0138]
在某些实施方案中，开发了用于neotcr产品的受控速率冷冻方法。此方法的关键要素是不使用为cryomacs冷冻袋提供的外包装。因此，冷冻保存neotcr产品的示例性方法包括用neotcr产品填充cryomacs冷冻袋，并使用受控速率冷冻曲线冷冻保存neotcr产品，而不使用cryomacs冷冻袋外包装。这不会影响cryomacs袋在临床中的使用方式。在某些实施方案中，金属储存盒在冷冻保存和运输期间保护冷冻袋。
[0139]
非临床药理学
[0140]
为评估neotcr产品而进行的药效学研究列表见表2。安全药理学研究列于表3。
[0141]
表2：neotcr产品的药理学研究
[0142][0143]
表3：neotcr产品的安全药理学研究
[0144][0145]
药效学
[0146]
本文所述的药效学研究使用精密基因组改造的人neotcr-t细胞(即neotcr产品)的离体测定概括了抗原特异性t细胞增殖、细胞因子产生和靶t细胞杀伤活性。
[0147]
已经用neotcr细胞进行了支持pact neotcr产品作用机制的药效学研究。试剂包括用于t细胞选择的抗体、用于精密基因组改造的试剂、培养基和细胞因子。起始材料可以选自白细胞或抽血。t细胞的扩增发生在容器例如g-rex容器或centricult容器中。细胞扩增的其他方法可以在t瓶、培养袋、封闭系统生物反应器中进行(非限制性实例包括xuri系统(general electric)、ambr系统(sartorius)、quantum系统(terumo cvt)和cocoon系统(lonza)、任选地针对非贴壁细胞优化的细胞堆，以及任选地针对非贴壁细胞进行优化的细胞工厂。
neotcr的实例，参见图7a和8e)。在某些实施方案中，三个neotcr群中的每一个都表达对三种不同基因特异的neotcr(例如，每个对不同基因特异的3 neotcr的实例，参见图8a和8e)。在某些实施方案中，三个neotcr群中的每一个都表达对相同hla特异的neotcr。在某些实施方案中，三个neotcr群中的每一个都表达对两种不同hla特异的neotcr(例如，对一种hla特异的2 neotcr和对第二hla特异性的1 neotcr的实例，参见图7a和8e)。在某些实施方案中，三个neotcr群中的每一个都表达对三种不同hla特异的neotcr(例如，每个对不同hla特异的3 neotcr的实例，参见图8a和8e)。
[0160]
在某些实施方案中，neotcr产品包含表4或表5中描述的大约细胞数。
[0161]
表4：包含2 neotcr细胞群的neotcr产品
[0162][0163]
表5：包含3 neotcr细胞群的neotcr产品
[0164]
[0165]
[0166]
[0167][0168]
在表4和表5中，“大于4
×
10
9”小于对患者产生剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。
[0169]
在某些实施方案中，neotcr产品包含四个细胞群(即，neotcr产品包含三个neotcr
细胞群：一个群表达第一neotcr，第二群表达第二neotcr，第三群表达第三neotcr，以及第四群表达第四neotcr)。在某些实施方案中，包含四个细胞群的neotcr产品包含：1)四个细胞群，每个细胞群对同一基因表达neotcr，2)四个细胞群，每个细胞群对不同基因表达neotcr，3)四个细胞群，其中一个表达第一基因的neotcr，其中三个表达第二基因的neotcr，或4)四个细胞群，其中两个表达第一基因的neotcr，其中两个表达第二基因的neotcr。在某些实施方案中，包含四个细胞群的neotcr产品包含：1)四个细胞群，每个细胞群对同一hla表达neotcr，2)四个细胞群，每个细胞群对不同hla表达neotcr，3)四个细胞群，其中一个表达第一hla的neotcr，其中三个表达第二hla的neotcr，或4)四个细胞群，其中两个表达第一hla的neotcr，其中两个表达第二hla的neotcr。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群中的每一个都包含大约相等数量的细胞。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群之一包含小于neotcr产品中neotcr细胞总数的1/4，并且调整其他三个neotcr细胞群以提供neotcr产品中neotcr细胞总数大约等于4
×
108、1.33
×
109、4
×
109、＞4
×
108和＜1.33
×
109、＞1.33
×
109和＜4
×
109、或＜4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群中的两个包含小于neotcr产品中的neotcr细胞总数的1/2(每个小于1/4)，并且调整其他两个neotcr细胞群以提供neotcr产品中的neotcr细胞总数大约等于4
×
108、1.33
×
109、4
×
109、＞4
×
108和＜1.33
×
109、＞1.33
×
109和＜4
×
109、或＜4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群中的三个包含小于neotcr产品中的neotcr细胞总数的3/4(每个小于1/4)，并且调整其他一个neotcr细胞群以提供neotcr产品中的neotcr细胞总数大约等于4
×
108、1.33
×
109、4
×
109、＞4
×
108和＜1.33
×
109、＞1.33
×
109和＜4
×
109、或＜4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群之一包含小于neotcr产品中的neotcr的细胞总数的1/4，并且调整其他三个neotcr细胞群以提供neotcr产品中的neotcr细胞总数大约等于大约4
×
108、大约1.33
×
109、大约4
×
109、大于大约4
×
108和小于大约1.33
×
109、大于大约1.33
×
109和小于大约4
×
109、或小于大约4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群中的两个包含小于neotcr产品中的neotcr细胞总数的1/2(每个小于1/4)，并且调整其他两个neotcr细胞群以提供neotcr产品中的neotcr细胞总数大约等于大约4
×
108、大约1.33
×
109、大约4
×
109、大于大约4
×
108和小于大约1.33
×
109、大于大约1.33
×
109和小于大约4
×
109、或小于大约4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，neotcr产品的四个neotcr细胞群中的三个包含小于neotcr产品中的neotcr细胞总数的3/4(每个小于1/4)，并且调整其他一个neotcr细胞群以提供neotcr产品中的neotcr细胞总数大约等于大约4
×
108、大约1.33
×
109、大约4
×
109、大于大约4
×
108和小于大约1.33
×
109、大于大约1.33
×
109和小于大约4
×
109、或小于大约4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。
[0170]
在某些实施方案中，本领域技术人员可以继续增加neotcr产品中的不同neotcr细胞群的数量，同时保持neotcr细胞的总剂量大约等于4
×
108、1.33
×
109、4
×
109、＞4
×
108和＜1.33
×
109，＞1.33
×
109和＜4
×
109，或＜4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。在某些实施方案中，本领域技术人员可以继续增加neotcr产品中的不
同neotcr细胞群的数量，同时保持neotcr细胞的总剂量大约等于大约4
×
108、大约1.33
×
109、大约4
×
109、大于大约4
×
108和小于大约1.33
×
109，大于大约1.33
×
109和小于大约4
×
109，或小于大约4
×
109但小于导致对患者的剂量限制性毒性的neotcr细胞总数。然而，本领域技术人员还应考虑产生临床效果所需的每个neotcr细胞群的最小数量。因此，每个neotcr产品的neotcr细胞群数量应受限于提供每个neotcr细胞群的最小数量的需要。
[0171]
在某些实施方案中，在包含三个不同neotcr细胞群的neotcr产品中表达的三种不同neotcr导致三种neotcr之间的协同作用。在某些实施方案中，与一种neotcr或两种neotcr群体neotcr产品相比，这种协同作用是协同的肿瘤细胞杀伤作用。参见例如图15、18a-18d和20。
[0172]
在某些实施方案中，neotcr产品在调理化疗(conditioning chemotherapy)后施用。在某些实施方案中，调理neotcr产品是氟达拉滨和环磷酰胺(flu-cy)的组合。在某些实施方案中，flu-cy在neotcr产品输注前-5天至-3天施用。
[0173]
在某些实施方案中，flu-cy在neotcr产品输注前-5天和-4天施用。在某些实施方案中，flu-cy在neotcr产品输注前-4天和-3天施用。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前一天或更多天连续三天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前两天或更多天连续三天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前三天或更多天连续三天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前三天连续三天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前一天或更多天连续两天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前两天或更多天连续两天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前三天或更多天连续两天施用flu-cy。在某些实施方案中，在施用neotcr产品前三天连续两天施用flu-cy。
[0174]
在某些实施方案中，在施用neotcr产品的日期前两天连续三天每天施用一次flu-cy。
[0175]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以30mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用细胞磷酰胺。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了10％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了20％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了30％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了40％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了50％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了60％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约10％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约20％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约30％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约40％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约50％。在某些实施方案中，氟达拉滨的输注总量减少了大约60％。在某些实施方案中，环磷酰胺(cytophosphamide)以300mg/m2体表面积施用，而与氟达拉滨的减少无关。
[0176]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以27mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以24mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以21mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在
某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以18mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以15mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨并且以300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以12mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。
[0177]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约27mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约24mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约21mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约18mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约15mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，以大约12mg/m2体表面积静脉内施用氟达拉滨，并且以300mg/m2或约300mg/m2体表面积施用环磷酰胺(cytophosphamide)。
[0178]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以30mg/m2或以约30mg/m2体表面积静脉内连续四天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以600mg/m2或约600mg/m2体表面积静脉内连续三天施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以30mg/m2或以约30mg/m2体表面积静脉内连续四天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以约300mg/m2至约600mg/m2体表面积之间的剂量静脉内连续三天施用环磷酰胺(cytophosphamide)。
[0179]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续四天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续两天施用环磷酰胺(cytophosphamide)。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续四天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续三天施用环磷酰胺。
[0180]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续五天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续两天施用环磷酰胺。在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续五天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续三天施用环磷酰胺。
[0181]
在某些实施方案中，每天向患者施用flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续六天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续两天施用环磷酰胺。在某些实施方案中，每天向患者施用
flu-cy，在施用neotcr产品前，每天以25mg/m2或以约25mg/m2体表面积静脉内连续六天施用氟达拉滨，和在施用neotcr产品前，每天以60mg/kg或约60mg/kg静脉内连续三天施用环磷酰胺。
[0182]
在某些实施方案中，皮下il-2试剂与neotcr产品的施用同时施用。
[0183]
在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用。
[0184]
在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用7天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用7天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用5天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用6天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用8或9天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用10或11天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用12或3天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用14天。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用15至20天之间的任何时间。在某些实施方案中，皮下il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以500,000iu/m2或大约500,000iu/m2的剂量每天两次(bid)皮下施用20天。
[0185]
在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品之后施用，并且以600,000iu/kg或大约600，iu/kg的剂量每天一次静脉内施用7天。在某些实施方案中，在施用neotcr产品后施用il-2试剂，并且以600,000iu/kg或约600,000iu/kg的剂量每8小时静脉内施用至耐受。在某些实施方案中，在施用neotcr产品后施用il-2试剂，并以720,000iu/kg或约720,000iu/kg的剂量每8小时静脉内施用至耐受，在neotcr产品输注后5天的疗程达14次连续剂量。在某些实施方案中，在施用neotcr产品后施用il-2试剂，并且以720,000iu/kg或约720,000，iu/kg的剂量每8小时静脉内施用至耐受。在某些实施方案中，在施用neotcr产品后施用il-2试剂，并以720,000iu/kg或约720,000iu/kg的剂量每8小时静脉内施用至耐受，在neotcr产品输注后5天的疗程达14次连续剂量。在某些实施方案中，在施用neotcr产品后施用il-2试剂，并以约600,000iu/kg或约720,000iu/kg的剂量每8小时静脉内施用至耐受，以输注neotcr产品后5天(一个周期)的疗程达14次连续剂量，然后在完成第一个周期后大约8-10天的休息期后进行任选的第二il-2试剂周期。
[0186]
在某些实施方案中，il-2试剂是阿地白介素或其生物等效物。
[0187]
在某些实施方案中，il-2试剂是聚乙二醇化的il-2试剂。
[0188]
neotcr产品的益处和其他疗法的局限性。
[0189]
越来越多的证据表明，对检查点治疗有反应的实体瘤更可能具有更高的体细胞突变负荷(导致肿瘤专有的新抗原的表达)，并且肿瘤表现出更高的cd8 t细胞浸润和/或表现
出预先存在的高pd-l1肿瘤表达(schumacher&schreiber，2015)。这些特征中的每一个都代表了这些肿瘤内源性免疫原性的更高潜力，即这些患者的免疫系统可能在开始免疫治疗之前已经启动了显著的t细胞免疫应答(lawrence，等人，2013)；(tumeh，等人，2014)；(wargo，等人，2017)。下一代肿瘤深度测序的应用和内源性肿瘤靶向t细胞应答的免疫分析为癌症免疫治疗益处、肿瘤突变负荷和预先存在的新抗原特异性t细胞群之间的联系提供了强有力的证据。新抗原特异性t细胞群特异性识别和杀死具有这些肿瘤专有的突变的肿瘤细胞(新抗原)，被认为是有效癌症免疫疗法的主要介质，以触发临床益处(tran，等人，2017)(schumacher&schreiber，2015)。
[0190]
最近开发了几种方法来显著增加癌症患者中肿瘤靶向t细胞的数量。嵌合抗原受体(car)改造的自体t细胞治疗在化疗难治性淋巴瘤和白血病患者中产生了显著的完全缓解率的临床益处。从肿瘤浸润性t细胞(til)扩增的自体t细胞的施用已被证明可诱导患有黑色素瘤和传统上对检查点抑制剂药物治疗无反应的肿瘤类型(例如胆管癌、微卫星稳定[mss]]结直肠癌[crc]和激素受体阳性[hr ]乳腺癌(paulson等人，2018)；(tran，等人，2016)(tran，等人，2014)的患者的临床反应。此外，针对共同的肿瘤或表达的病毒抗原(即在许多患者中表达的相同抗原，与每个单独的患者的肿瘤私有的新抗原或新表位形成对比)的改造的自体tcr-t细胞的施用显示了患者持久反应的证据。
[0191]
个性化的癌症突变靶向疗法，例如靶向癌症新抗原的基于rna或基于肽的疫苗是一种很有前途的新治疗方式，有可能增加预先存在的突变靶向t细胞反应的幅度以及产生针对肿瘤新抗原的从头免疫应答(sahin&t
ü
reci，2018)(ott，等人，2017)。新抗原癌症疫苗对低突变负荷的肿瘤类型特别有益，例如前列腺癌、mss crc或其他易位驱动的肿瘤，在这些肿瘤中，本质上t细胞克隆数量不足引发了肿瘤抗原。尽管如此，新抗原癌症疫苗的潜在益处可能会受到以下因素的限制：在疫苗施用前无法验证预测的抗原靶点、人群对t细胞疫苗的可变反应以及通过逐渐(因此太慢)扩大的抗肿瘤t细胞免疫应答根除大型或快速生长肿瘤的挑战。
[0192]
靶向新表位的过继性tcr-t细胞疗法具有克服上述限制的潜力。本文描述的neotcr产品是一种用天然序列的自体neotcr改造的新型的过继性tcr-t细胞疗法，该天然序列的自体neotcr从患者的个人内在t细胞癌免疫应答中被鉴定和分离。最初代表每个患者的创始人(主干)突变的肿瘤特异性基因组改变，包括癌症病理学的“驱动”突变，随着时间的推移，数量会增加，并随着时间的推移而多样化，成为晚期恶性肿瘤的“分支”或“乘客”突变。这些累积的肿瘤特异性突变谱代表了每个癌症患者免疫识别靶标的独特私有特征(私有新抗原)。靶向这些私有和肿瘤专有的新抗原(新表位或neoe特异性t细胞)的t细胞具有专门靶向和杀死肿瘤细胞的潜力，而忽略不表达这些肿瘤特异性突变的健康细胞。通过这种方式，每位患者的免疫系统都会参与到肿瘤中，并且在适当利用时，适当规模的内在免疫应答已被证明可以根除肿瘤。
[0193]
由于所有癌症都是由潜在的创始者或主干突变驱动的，因此靶向主干新表位的过继性neotcr t细胞疗法具有治疗任何癌症患者的潜力。在某些实施方案中，neotcr产品过继个性化细胞疗法涉及改造个体自身的cd8和cd4 t细胞以表达已经识别肿瘤专有的新抗原的天然存在的neotcr。因此，在某些实施方案中，这些neotcr具有天然序列，源自预先存在的靶向突变的cd8 t细胞，并通过专有的分离技术从外周血中捕获，该技术可验证每位患
者的肿瘤专有的neoe靶标。在制造过程中，来自同一患者的白细胞单采术的新鲜衍生的cd4和cd8 t细胞经过精密基因组改造，以重构“天然”自体t细胞功能的方式表达一种neotcr，并且已被验证可在整个选择过程中与自体患者预测的抗原相互作用。因此，对癌症参与者的临床益处源于提供单剂量的体外改造的、靶向肿瘤突变的自体neotcr细胞，从而提供了在患者中引发快速和持久反应的潜力，其中一些患者没有治愈性治疗选择。
[0194]
具有显著预先存在的t细胞免疫的患者更有可能在施用pd-1轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂或pd-l2结合剂中的任何一种时受益。由于neotcr产品施用对每位患有癌症的研究参与者来说代表了一种显著且全面的肿瘤靶向t细胞免疫应答，因此包含pd-1轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂或pd-l2结合剂可以为那些在neotcr产品给药前肿瘤已经存在pd-l1/pd-1/pd-l2免疫抗性或neotcr产品施用后快速获得pd-l1/pd-1/pd-l2免疫抗性的患者提供有意义的临床益处。因此，本公开提供了pd-1轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂或pd-l2结合剂加neotcr产品施用的联合疗法。在某些实施方案中，联合疗法包含抗pd-1抗体和本文公开的neotcr产品。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是mdx-1106(纳武单抗)。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是mk-3475(帕博利珠单抗)。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是西米普利单抗(cemiplimab)。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是jtx-4014。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是spartalizumab。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是信迪利单抗。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是替雷利珠单抗。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是特瑞普利单抗。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是多塔利单抗。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是mga012。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是amp-514。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是ct-011(匹地利珠单抗)。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是amp-224。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是med1-0680。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是pdr001。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是regn2810。在某些实施方案中，抗pd-1抗体是bgb-108。
[0195]
预计这种联合疗法将克服免疫抗性，因为当患者中已记录到由较高的肿瘤pd-1轴表达水平引起的显著的预先存在的抗肿瘤t细胞免疫反应和免疫抗性时，在从免疫检查点治疗中获得临床益处的最佳情况。
[0196]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供il-2试剂和本文公开的neotcr产品的联合疗法。在某些实施方案中，il-2试剂是重组il-2。在某些实施方案中，il-2试剂是修饰的il-2。在某些实施方案中，il-2试剂是聚乙二醇化的il-2。在某些实施方案中，il-2试剂是与il-2融合的抗体。在某些实施方案中，il-2试剂是长效il-2。在某些实施方案中，il-2试剂是短效il-2。在某些实施方案中，il-2试剂是阿地白介素。在某些实施方案中，il-2试剂是在某些实施方案中，il-2试剂是bempegaldesleukin。
[0197]
在某些非限制性实施方案中，本公开提供了il-15试剂和本文公开的neotcr产品的联合疗法。在某些实施方案中，il-15试剂是重组il-15。在某些实施方案中，il-15试剂是修饰的il-15。在某些实施方案中，il-15试剂是聚乙二醇化的il-15。在某些实施方案中，il-15试剂是与il-15融合的抗体。在某些实施方案中，il-15试剂是长效il-15。在某些实施方案中，il-15试剂是短效il-15。在某些实施方案中，il-15试剂是alt-803。在某些实施方案中，il-15试剂是nktr-255。在某些实施方案中，il-15试剂是nl-201。在某些实施方案中，il-15试剂是soc101。
[0198]
在某些实施方案中，本公开包括在施用neotcr产品之前施用的化疗预调理方案。
[0199]
在某些实施方案中，本文所述的neotcr产品包含在与表达新抗原的同源肿瘤细胞接触时具有有效的抗原特异性杀伤、效应细胞因子分泌和增殖活性的neotcr细胞。此外，在某些实施方案中，neotcr产品以强烈的多功能效应蛋白分泌反应响应靶肿瘤细胞(例如，如通过大量t细胞和单细胞分泌组分析所证明的)。预计多功能t细胞效应表型有助于将neotcr产品以一定的方式输注到癌症患者体内，从而产生临床益处的潜力，该方式类似于将多功能car-t细胞输注到血液系统恶性肿瘤患者体内所观察到的方式。
[0200]
在某些实施方案中，neotcr产品包含记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆(t
cm
)t细胞表型，这是本文所述的离体制造过程的结果。这些“更年轻”或分化程度较低的t细胞表型被描述为在小鼠模型和血液系统恶性肿瘤患者中改造的car-t细胞的临床试验中提高了植入潜力并延长了输注后的持久性。因此，包含“年轻”t细胞表型的neotcr产品的施用有可能通过提高植入潜力、延长输注后持久性以及快速分化为效应t细胞以根除全身肿瘤细胞，从而使癌症患者受益。
[0201]
在某些实施方案中，本公开包括neotcr产品制造过程，该过程涉及对结合到向导rna序列的crispr-cas9核酸酶的双核糖核蛋白种类进行电穿孔，其中每个种类靶向基因组tcrα和基因组tcrβ基因座。将cas9核酸酶靶向每个基因组基因座的特异性先前已在文献中描述为高度特异的。在某些实施方案中，本公开内容包括对neotcr产品的全面测试，以调查可能的脱靶基因组切割位点。例如，没有任何限制，可以使用cosmid和guide-seq来检测脱靶位点。
[0202]
精密基因组改造过程的其他方面已经过安全性评估。在某些实施方案中，本文公开的组合物没有显示精密基因组改造后基因组不稳定性的证据。在某些非限制性实施方案中，例如，基因组不稳定性可以通过靶向基因座扩增(tla)或标准fish细胞遗传学来评估。
[0203]
对neotcr产品和精密基因组改造方法的综合评估表明，neotcr产品在输回患者体内后具有良好的耐受性。
[0204]
5.药物制剂
[0205]
neotcr产品的药物制剂是通过将neotcr细胞混合在溶液中来制备的，该溶液可以在冷冻保存状态下保存细胞的“年轻”表型。上述表1提供了一种此类药物制剂的实例。或者，neotcr产品的药物制剂可以通过将neotcr细胞混合在溶液中来制备，该溶液可以保存细胞的“年轻”表型，而无需冷冻或冷冻保存产品(即，neotcr产品保存在水溶液中或作为非冷冻/冷冻保存的细胞沉淀)。
[0206]
还可以将额外的药学上可接受的载体、缓冲剂、稳定剂和/或防腐剂添加到冷冻保存溶液或水性保存溶液中(如果neotcr产品不是冷冻保存的)。任何冷冻保存剂和/或培养基都可用于冷冻保存neotcr产品，包括但不限于cryostor、cryostor cs5、cellbanker和定制的冷冻保存培养基(任选地包含dmso)。
[0207]
在某些实施方案中，本公开的药物制剂包含多个细胞群，所述细胞群包含第一和第二修饰的细胞群。在某些实施方案中，第一修饰的细胞包含与第一抗原结合的第一neotcr。在某些实施方案中，第二修饰的细胞包含结合第二抗原的第二neotcr。在某些实施方案中，多种细胞对包含第一和第二抗原的细胞表现出细胞毒活性。在某些实施方案中，多种细胞包括第三修饰的细胞。在某些实施方案中，第三修饰的细胞包含结合第三抗原的第三neotcr。在某些实施方案中，多种细胞对包含第一、第二和第三抗原的细胞表现出细胞毒
活性。在某些非限制性实施方案中，多种细胞包括四种或更多种修饰的细胞、五种或更多种修饰的细胞、十种或更多种修饰的细胞。
[0208]
在某些实施方案中，本公开的neotcr产品包含第一和第二neotcr细胞群。在某些实施方案中，第一neotcr细胞靶向第一抗原。在某些实施方案中，第二neotcr细胞靶向第二抗原。在某些实施方案中，neotcr细胞对包含第一和第二抗原的细胞表现出细胞毒活性。在某些实施方案中，neotcr产品包含第三neotcr细胞。在某些实施方案中，第三neotcr细胞靶向第三抗原。在某些实施方案中，包含第一、第二和第三neotcr细胞的neotcr产品对包含第一、第二和第三抗原的细胞表现出细胞毒活性。在某些非限制性实施方案中，neotcr产品包含四种或更多种neotcr细胞、五种或更多种neotcr细胞、十种或更多种neotcr细胞。
[0209]
6.制品
[0210]
neotcr产品可与生产的制品结合使用。此类制品可用于预防或治疗增殖性病症(例如，癌症)。制品的实例包括但不限于容器(例如，输液袋、瓶子、储存容器、烧瓶、小瓶、注射器、管和iv溶液袋)和容器上或与容器相关的标签或包装插页。在某些实施方案中，容器由任何材料制成，这些材料对于储存和保存neotcr产品中处于“年轻”状态的neotcr细胞是可接受的。在某些实施方案中，容器是静脉溶液袋或具有可被皮下注射针刺穿的塞子的小瓶。在某些实施方案中，容器是cryomacs冷冻袋。在某些实施方案中，标签或包装插页表明neotcr产品用于治疗选择的病症和起源的患者。在某些实施方案中，患者在neotcr产品的容器上被识别，因为neotcr产品由自体细胞制成并改造为患者特异性的个体化治疗。
[0211]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品。
[0212]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品；2)第二容器，其中含有与第一容器相同的neotcr产品。任选地，在某些实施方案中，可以准备和制造具有与第一和第二容器相同的neotcr产品的另外的容器。任选地，在某些实施方案中，含有包含不同细胞毒性剂或其他治疗剂的组合物的另外的容器也可以与上述容器组合。
[0213]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品；和2)第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。
[0214]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有两种neotcr产品(即，包含两个neotcr细胞群的neotcr产品，其中每个neotcr细胞群表达不同的neotcr(例如，参见表4)；和2)第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。为清楚起见，对于包含两个neotcr细胞群的产品，每个群都可以被称为neotcr产品，或者两个neotcr细胞群的组合(无论是组合到单个容器中还是包装在单独的容器中)可以被称为neotcr产品。
[0215]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品，所述neotcr产品包含第一neotcr细胞群；2)第二容器，其中含有第二neotcr产品，所述第二neotcr产品包含第二neotcr细胞群；和3)任选地第三容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在某些实施方案中，第一和第二neotcr产品是不同的neotcr产品，其中第一neotcr产品包含表达第一neotcr的neotcr细胞，第二neotcr产品包含表达与第一neotcr细胞群不同的neotcr的neotcr细胞。在某些实施方案中，第一和第二neotcr产品是相同的neotcr产品。
[0216]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有三种neotcr产品(即，包含三
个neotcr细胞群的neotcr产品，其中每个neotcr细胞群表达不同的neotcr(例如，参见表5)；和2)任选地，第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。
[0217]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品，所述neotcr产品包含第一neotcr细胞群；2)第二容器，其中含有第二neotcr产品，所述第二neotcr产品包含第二neotcr细胞群；3)第三容器，其中含有第三neotcr产品，所述第三neotcr产品包含第三neotcr细胞群；和4)任选地第四容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在某些实施方案中，第一、第二和第三neotcr产品是不同的neotcr产品，其中第一neotcr产品包含表达第一neotcr的neotcr细胞，第二neotcr产品包含表达与第一neotcr细胞群不同的neotcr的neotcr细胞，并且第三neotcr产品包含表达与第一和第二neotcr细胞群不同的neotcr的neotcr细胞。在某些实施方案中，第一、第二和第三neotcr产品是相同的neotcr产品。在某些实施方案中，第一、第二和第三neotcr产品中的两个是相同的neotcr产品。为清楚起见，对于包含三个neotcr细胞群的产品，每个群可以被称为neotcr产品，或者三个neotcr细胞群的组合(无论是组合到单个容器中还是包装在单独的容器中)可以被称为neotcr产品。
[0218]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有四种neotcr产品(即4个neotcr细胞群)；和2)任选地，第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。
[0219]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品；2)第二容器，其中含有第二neotcr产品；3)第三容器，其中含有第三neotcr产品；4)第四容器，其中含有第四neotcr产品；和5)任选地，第五容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在某些实施方案中，第一、第二、第三和第四neotcr产品是不同的neotcr产品。在某些实施方案中，第一、第二、第三和第四neotcr产品是相同的neotcr产品。在某些实施方案中，第一、第二、第三和第四neotcr产品中的两个是相同的neotcr产品。在某些实施方案中，第一、第二、第三和第四neotcr产品中的三个是相同的neotcr产品。为清楚起见，对于包含四个neotcr细胞群的产品，每个群可以被称为neotcr产品，或者四个neotcr细胞群的组合(无论是组合到单个容器中还是包装在单独的容器中)可以被称为neotcr产品。
[0220]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有五个或更多个neotcr产品(即5个neotcr细胞群)；和2)任选地，第二容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。
[0221]
在某些实施方案中，制品包括：1)第一容器，其中含有neotcr产品；2)第二容器，其中含有第二neotcr产品；3)第三容器，其中含有第三neotcr产品；4)第四容器，其中含有第四neotcr产品；5)第五容器，其中含有第五neotcr产品；6)任选地，第六或更多的另外的容器，其中含有第六或更多的neotcr产品；和7)任选地另外的容器，其中含有组合物，其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其他治疗剂。在某些实施方案中，所有neotcr产品的容器都是不同的neotcr产品。在某些实施方案中，所有neotcr产品的容器都是相同的neotcr产品。在某些实施方案中，基于患者肿瘤样品中可检测neotcr的可用性、需要和/或希望具有用于患者的多种neotcr产品，以及可能需要或受益于一个或多个容器的任何一种neotcr
产品的可用性，五个或更多个容器中可以有相同或不同的neotcr产品的任意组合。为清楚起见，对于包含五个neotcr细胞群的产品，每个群可以被称为neotcr产品，或者五个neotcr细胞群的组合(无论是组合到单个容器中还是包装在单独的容器中)可以被称为neotcr产品。
[0222]
此外，在某些实施方案中，本文所述的任何neotcr产品的容器可以分成两个、三个或四个单独的容器用于多个施用时间点和/或基于患者的适当剂量。
[0223]
在某些实施方案中，neotcr产品以试剂盒提供。通过非限制性实例，该试剂盒可以包含包装说明书、标签、使用neotcr产品的说明、注射器、处置说明、施用说明、管、针头以及临床医生需要的任何其他物品以便正确施用neotcr产品。
[0224]
7.基因组编辑方法
[0225]
在某些实施方案中，本公开部分地涉及改造人类细胞例如改造的t细胞或改造的人类干细胞的方法。在某些实施方案中，本公开部分地涉及改造人类细胞，例如nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、造血干细胞(hsc)、源自hsc的细胞或树突/抗原呈递细胞的方法。在某些实施方案中，此类改造涉及基因组编辑。例如，但不作为限制，这种基因组编辑可以用靶向一个或多个内源基因座，例如tcrα(tcrα)基因座和tcrβ(tcrβ)基因座的核酸酶来完成。在某些实施方案中，核酸酶可以在内源性靶序列中产生单链dna缺口或双链dna断裂。在某些实施方案中，核酸酶可以靶向基因组的编码或非编码部分，例如外显子、内含子。在某些实施方案中，本文设想的核酸酶包括归巢核酸内切酶、大范围核酸酶、megatal核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(talen)、锌指核酸酶(zfn)和成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/cas核酸酶。在某些实施方案中，核酸酶本身可以被改造，例如通过引入氨基酸置换和/或缺失，以增加切割活性的效率。
[0226]
在某些实施方案中，通过使用非病毒递送系统进行基因组编辑。例如，可以通过在脂质转染的存在下给予核酸(feigner等人，proc.natl.acad.sci.usa 84：7413，1987；ono等人，neuroscience letters 17：259，1990；brigham等人，am.j.med.sci.298：278，1989；staubinger等人，methods in enzymology 101：512，1983)，无唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸结合(wu等人，journal of biological chemistry 263：14621，1988；wu等人，journal of biological chemistry 264：16985，1989)，或通过手术条件下的显微注射(wolff等人，science 247：1465，1990)来将核酸分子引入细胞中。用于基因转移的其他非病毒方法包括使用磷酸钙、deae葡聚糖、电穿孔和原生质体融合进行体外转染。脂质体也可能有利于将dna递送到细胞中。将正常基因移植到受试者的受影响组织中也可以通过将正常核酸转移到离体可培养的细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)中来实现，然后将该细胞(或其后代)注射到靶标组织或全身注射。
[0227]
在某些实施方案中，通过使用病毒递送系统进行基因组编辑。在某些实施方案中，病毒方法包括靶向整合(包括但不限于aav)和随机整合(包括但不限于慢病毒方法)。在某些实施方案中，病毒递送将在没有整合核酸酶的情况下完成。在这样的实施方案中，病毒递送系统可以是lentiflash或另一个类似的递送系统。
[0228]
关于在本公开的上下文中有用的基因组编辑方法的附加信息可以在国际专利申请号pct/us2018/058230，例如在第[00219]-[00226]段找到，其内容通过引用纳入本文用于所有目的。
[0229]
8.同源重组模板
[0230]
在某些实施方案中，本公开提供细胞的基因组编辑方法，通过将同源重组(hr)模板核酸序列引入和重组到细胞的内源基因座中来进行。在某些实施方案中，hr模板核酸序列是线性的。在某些实施方案中，hr模板核酸序列是环状的。在某些实施方案中，环状hr模板可以是质粒、微环或纳米质粒。在某些实施方案中，hr模板核酸序列包含第一和第二同源臂。在某些实施方案中，同源臂可为约300个碱基至约2,000个碱基。例如，每个同源臂可以是1,000个碱基。在某些实施方案中，同源臂可以与细胞的第一和第二内源序列同源。在某些实施方案中，内源基因座是tcr基因座。例如，第一和第二内源序列在tcrα基因座或tcrβ基因座内。在某些实施方案中，hr模板包含tcr基因序列。在非限制性实施方案中，tcr基因序列是患者特异性tcr基因序列。在非限制性实施方案中，tcr基因序列是肿瘤特异性的。在非限制性实施方案中，可以使用pct/us2020/017887中描述的方法鉴定和获得tcr基因序列，其内容通过引用纳入本文。在某些实施方案中，hr模板包含tcrα基因序列和tcrβ基因序列。
[0231]
在某些实施方案中，hr模板是多顺反子多核苷酸。在某些实施方案中，hr模板包含编码柔性多肽序列(例如，gly-ser-gly序列)的序列。在某些实施方案中，hr模板包含编码内部核糖体进入位点(ires)的序列。在某些实施方案中，hr模板包含编码2a肽(例如，p2a、t2a、e2a和f2a)的序列。在某些实施方案中，hr模板包含编码相同氨基酸序列的密码子发散序列。例如，但不限于，hr模板包含编码具有相同氨基酸序列的第一和第二2a肽(例如p2a)的第一和第二密码子发散序列。关于hr模板核酸和修饰其细胞的方法的其他信息可以在国际专利申请号pct/us2018/058230中找到，其内容通过引用纳入本文。
[0232]
9.试剂盒
[0233]
本公开提供了用于在需要其的受试者中诱导和/或增强免疫应答和/或治疗和/或预防癌症的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含有效量的目前公开的多种细胞或包含其的药物组合物。在某些实施方案中，试剂盒包括无菌容器；这种容器可以是盒子、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡罩包装或本领域已知的其他合适的容器形式。这种容器可以由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适合盛放药物的材料制成。在某些非限制性实施方案中，试剂盒包括编码当前公开的hr模板的分离的核酸分子。
[0234]
在某些实施方案中，试剂盒包括输注neotcr产品所需的耗材；包括但不限于1)填充组件，包括鲁尔锁连接器、滚子夹、pvc管和注射端口和2)cryomacs袋(或等效袋)，其填充有neotcr产品，任选地进一步包含在外包装袋中，并标有患者识别信息，以确保将为患者个性化设计和制造的neotcr产品注入患者体内。在某些实施方案中，该试剂盒还包括关于如何在温水浴中解冻neotcr产品以及如何将neotcr细胞均匀悬浮在cryomacs袋(或等效物袋)中解冻的neotcr产品中的说明。
[0235]
如果需要，可将多种细胞连同包括关于用于治疗和/或预防癌症的信息的说明一起提供。在某些实施方案中，说明书包括以下内容中的至少一项：治疗剂的描述；用于治疗或预防瘤形成、病原体感染或免疫紊乱或其症状的剂量方案和施用；预防措施；警告；适应证；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床研究；和/或参考。说明可以直接印在容器上(如果有)，或者作为贴在容器上的标签，或者作为单独的纸张、小册子、卡片或文件夹提供在容器中或随容器一起提供。
[0236]
在某些实施方案中，neotcr产品被填充并储存在cryomacs袋(或等效袋)中，总活细胞浓度为10-100
×
104细胞/ml。在某些实施方案中，neotcr产品被填充并储存在cryomacs袋(或等效袋)中，总活细胞浓度为10-100
×
104个细胞/ml，总体积为35ml。在某些实施方案中，一个袋子被填充和储存。在某些实施方案中，两个袋子被填充和储存。
[0237]
在某些实施方案中，neotcr产品在cryomacs袋(或等效袋)中运输，总活细胞浓度为10-100
×
104个细胞/ml。在某些实施方案中，neotcr产品在cryomacs袋子(或等效袋子)中运输，总活细胞浓度为10-100
×
104个细胞/ml，总体积为35ml。在某些实施方案中，一个袋子被填充和运输。在某些实施方案中，两个袋子被填充和运输。
[0238]
在某些实施方案中，neotcr产品上的标签为“总活细胞浓度10-100
×
104个细胞/ml”。在某些实施方案中，neotcr产品上的标签为“总活细胞浓度10-100
×
104个细胞/ml，35ml”。
[0239]
在某些实施方案中，neotcr产品以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括关于如何计算正确的产品毫升数以输注到患者体内以输注表4和5中列出的细胞数量和剂量的说明。
[0240]
在某些实施方案中，neotcr产品以试剂盒的形式提供，该试剂盒包括关于如何解冻冷冻保存的产品的说明。在某些实施方案中，关于如何解冻neotcr产品的说明包括一个或多个以下步骤(可接受具有相同含义的替代措辞)：
[0241]
1)从液氮冷冻箱中带盒取出一袋neotcr产品，将其放在干冰上以运输到水浴中。
[0242]
2)从盒中取出装有neotcr产品的冷冻袋(例如cryomacs袋)。
[0243]
3)将neotcr产品冷冻袋放入新的可重新密封(例如自封式)塑料袋中。密封包含neotcr产品的可重新密封袋。
[0244]
4)将neotcr产品冷冻袋(密封在可重新密封袋内)浸入温度为37℃
±
2℃的水浴中。将袋子浸入水浴后不要移动袋子。
[0245]
5)观察neotcr产品冷冻袋的解冻进度，并在剩余一小块冰块时从水浴中取出。轻轻摇动袋子，直到neotcr产品完全解冻。
[0246]
6)从可重新密封的袋子中取出neotcr产品冷冻袋。
[0247]
7)用吸水的一次性抹布轻轻擦干袋子的外部，以去除任何冷凝物。观察冷冻袋是否有任何泄漏，并确保目视验证冷冻袋的完整性。如果完整性受到损害，请不要继续输注。
[0248]
8)对neotcr产品的其他冷冻袋重复解冻程序(如适用)，以达到规定剂量。
[0249]
在某些实施方案中，neotcr产品附有在解冻后4小时内使用该产品的说明。
[0250]
10.示例性实施方案
[0251]
在某些实施方案中，本公开提供了组合物，其包含：a)第一neotcr细胞群，其包含结合第一新抗原的第一neotcr；b)第一neotcr细胞群和第二neotcr细胞群，所述第一neotcr细胞群包含结合第一新抗原的第一neotcr，和所述第二neotcr细胞群包含结合第二新抗原的第二neotcr；或c)第一neotcr细胞群、第二neotcr细胞群和第三neotcr细胞群，所述第一neotcr细胞群包含结合第一新抗原的第一neotcr、所述二neotcr细胞群包含结合第二新抗原的第二neotcr，所述第三neotcr细胞群包含结合第三新抗原的第三neotcr；其中每个neotcr与其他的不同，并且其中每个neotcr都源自患者。
[0252]
在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原由单个基因表达。在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原由不同基因表
达。在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三新抗原由单个基因表达。在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr结合单个主要组织相容性复合体。在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr结合不同的主要组织相容性复合体。在本文所述的组合物的某些实施方案中，第一、第二和/或第三neotcr中的两个与单个主要组织相容性复合体结合。
[0253]
在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含药学上可接受的载体。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含冷冻保存剂。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含血清白蛋白。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含晶体状溶液。在本文所述的组合物的某些实施方案中，组合物包含血浆-lyte a、人血清白蛋白(has)和
[0254]
在某些实施方案中，本公开提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，包括施用本文所述的任何组合物。
[0255]
在本文所述方法的某些实施方案中，所述组合物包含约4
×
108个细胞、1.33
×
109个细胞或约4
×
109个细胞的量的neotcr细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，所述组合物包含大于约4
×
108个细胞且小于约1.33
×
109个细胞、大于约1.33
×
109个细胞且小于约4
×
109个细胞，或大于约4
×
109个细胞的量的neotcr细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，所述组合物包含根据表4的量的neotcr细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，所述组合物包含根据表5的量的neotcr细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，组合物以单剂量施用。在本文所述方法的某些实施方案中，组合物以多剂量施用。
[0256]
在本文所述方法的某些实施方案中，该方法还包括施用组合剂。在本文所述方法的某些实施方案中，组合剂是细胞因子、pd-轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂、pd-l2结合剂或其组合。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂、il-7试剂、il-10试剂、il-12试剂、il-15试剂、il-18试剂、il-21试剂，或其组合。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-15试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，pd轴结合剂包括纳武单抗、帕博利珠单抗或阿替利珠单抗。
[0257]
在本文所述方法的某些实施方案中，癌症是液体癌症或实体癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，向患者提供本文所述的flu-cy调理治疗。
[0258]
在某些实施方案中，本公开提供了制造本文所述的任何组合物的方法。在某些实施方案中，本公开提供了用于施用本文所述的任何组合物的试剂盒。
[0259]
在某些实施方案中，本公开提供了多种细胞，其包含：a)第一修饰的细胞，其包含编码结合第一抗原的第一neotcr的第一外源多核苷酸，其中所述第一外源多核苷酸整合在第一修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中；和b)第二修饰的细胞，其包含编码结合第二抗原的第二neotcr的第二外源多核苷酸，其中所述第二外源多核苷酸整合在第二修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中。
[0260]
在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，所述组合物进一步包含第三修饰的细胞，所述第三修饰的细胞包含编码结合第三抗原的第三neotcr的第三外源多核苷酸，其中所述第三外源多核苷酸整合在第三修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三neotcr是患者来源的。在本文所述的
多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三抗原是癌抗原。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，癌抗原是新抗原。
[0261]
在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，癌抗原是患者特异性抗原。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三修饰的细胞是原代细胞。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，原代细胞是患者来源的细胞。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，原代细胞是淋巴细胞。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，原代细胞是t细胞。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，t细胞是cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95-、ccr7 和cd27 。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，t细胞是cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95 、cd27 、ccr7 。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，t细胞是cd45ro 、cd62l 、cd28 、cd95 、ccr7 、cd27 、cd127 。
[0262]
在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸包含信号序列、第一和第二2a编码序列以及tcr基因序列。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸的tcr基因序列位于第一和第二2a编码序列之间。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一和第二2a编码序列编码相同的氨基酸序列并且相对于彼此在密码子上发散。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一和第二2a编码序列是p2a编码序列。
[0263]
在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，外源多核苷酸进一步包含编码氨基酸序列gly ser gly的序列，其位于紧邻第一和/或第二2a编码序列的上游。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，外源多核苷酸进一步包含编码位于第二2a编码序列上游的弗林蛋白酶切割位点的序列。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸还包含第二tcr基因。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸的第二tcr基因位于第二2a编码序列的下游。在本文所述的多种细胞的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸是环状多核苷酸。
[0264]
在某些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含本文所述的多种细胞。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物还包含药学上可接受的赋形剂。在本文所述的组合物的某些实施方案中，将组合物施用于需要其的患者以治疗癌症。
[0265]
在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含冷冻保存剂。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含血清白蛋白。在本文所述的组合物的某些实施方案中，所述组合物包含晶体状溶液。在本文所述的组合物的某些实施方案中，组合物包含血浆-lyte a、人血清白蛋白(has)和
[0266]
在某些实施方案中，本公开提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括施用多种细胞，所述多种细胞包含第一修饰的细胞，所述第一修饰的细胞包含编码结合第一抗原的第一neotcr的第一外源多核苷酸，其中所述第一外源多核苷酸整合在第一修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中；和第二修饰的细胞，所述第二修饰的细胞包含编码结合第二抗原的第二neotcr的第二外源多核苷酸，其中所述第二外源多核苷酸整合在第二修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中；从而治疗受试者的癌症。
[0267]
在本文所述方法的某些实施方案中，所述多种细胞进一步包含第三修饰的细胞，所述第三修饰的细胞包含编码结合第三抗原的第三neotcr的第三外源多核苷酸，其中所述第三外源多核苷酸整合在第三修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中。
[0268]
在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三neotcr是患者来源的。在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三抗原是癌症抗原。在本文所述方法的某些实施方案中，癌抗原是新抗原。在本文所述方法的某些实施方案中，癌抗原是患者特异性抗原。
[0269]
在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三修饰的细胞是原代细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，原代细胞是患者来源的细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，原代细胞是淋巴细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，原代细胞是t细胞。在本文所述方法的某些实施方案中，t细胞是cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95-、ccr7 和cd27 。在本文所述方法的某些实施方案中，t细胞是cd45ra 、cd62l 、cd28 、cd95 、cd27 、ccr7 。在本文所述方法的某些实施方案中，t细胞是cd45ro 、cd62l 、cd28 、cd95 、ccr7 、cd27 、cd127 。
[0270]
在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸包含信号序列、第一和第二2a编码序列以及tcr基因序列。在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸的tcr基因序列位于第一和第二2a编码序列之间。在本文所述方法的某些实施方案中，第一和第二2a编码序列编码相同的氨基酸序列并且相对于彼此在密码子上发散。在本文所述方法的某些实施方案中，第一和第二2a编码序列是p2a编码序列。
[0271]
在本文所述方法的某些实施方案中，外源多核苷酸进一步包含编码氨基酸序列gly ser gly的序列，其位于紧邻第一和/或第二2a编码序列的上游。在本文所述方法的某些实施方案中，外源多核苷酸进一步包含编码位于第二2a编码序列上游的弗林蛋白酶切割位点的序列。
[0272]
在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸还包含第二tcr基因。在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸的第二tcr基因位于第二2a编码序列的下游。在本文所述方法的某些实施方案中，第一、第二和第三外源多核苷酸是环状多核苷酸。
[0273]
在本文所述方法的某些实施方案中，该方法还包括施用组合剂。在本文所述方法的某些实施方案中，组合剂是细胞因子、pd-轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂、pd-l2结合剂或其组合。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂、il-7试剂、il-10试剂、il-12试剂、il-15试剂、il-18试剂、il-21试剂，或其组合。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-15试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，pd轴结合剂是纳武单抗、帕博利珠单抗、阿替利珠单抗或其组合。
[0274]
在本文所述方法的某些实施方案中，癌症是液体癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，液体癌症选自由滤泡性淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤组成的组。在本文所述方法的某些实施方案中，癌症是实体癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，实体癌症选自由黑素瘤、胸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、妇科癌、中枢神经系统癌症、皮肤癌、hpv 癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆管癌、肾细胞癌、膀胱癌、睾丸癌、肉瘤和结直肠癌组成的组。
[0275]
在某些实施方案中，本公开提供了在需要治疗的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括施用有效量的修饰的细胞，所述修饰的细胞包含编码结合肿瘤抗原的neotcr的外源
多核苷酸，其中所述外源多核苷酸整合在修饰的细胞的内源性trac和/或trbc基因座中；并施用有效量的组合剂；从而治疗受试者的癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，组合剂包括化疗剂、抗激素剂、内分泌治疗剂、细胞毒剂、细胞因子、pd轴结合剂、pd-1结合剂、pd-l1结合剂、pd-l2结合剂或其组合。
[0276]
在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂、il-7试剂、il-10试剂、il-12试剂、il-15试剂、il-18试剂、il-21试剂，或其组合。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-2试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，细胞因子是il-15试剂。在本文所述方法的某些实施方案中，pd轴结合剂包括纳武单抗、帕博利珠单抗或阿替利珠单抗。
[0277]
在本文所述方法的某些实施方案中，癌症是液体癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，液体癌症选自由滤泡性淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤组成的组。在本文所述方法的某些实施方案中，癌症是实体癌症。在本文所述方法的某些实施方案中，实体癌症选自由黑素瘤、胸癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、前列腺癌、妇科癌、中枢神经系统癌症、皮肤癌、hpv 癌、食道癌、甲状腺癌、胃癌、肝细胞癌、胆管癌、肾细胞癌、膀胱癌、睾丸癌、肉瘤和结直肠癌组成的组。
实施例
[0278]
以下是本发明的方法和组合物的实施例。应当理解，鉴于上面提供的大体描述，可以实践各种其他实施方案。
[0279]
实施例1 neotcr产品
[0280]
抗原特异性靶t细胞杀伤。突变靶向的、个性化的、过继性t细胞受体(neotcr产品)治疗是一种免疫治疗模式，旨在释放免疫系统特异性识别和杀死显示肿瘤专有的突变靶标的细胞的能力。neotcr细胞经过改造，以表达neo12 tcr(一种代表性的新表位)，该细胞由从黑色素瘤患者血液中分离出来的neo12特异性cd8 t细胞产生，并与同源或不匹配的肿瘤细胞共培养数天，收集延时活体显微术图像。使用延时活体显微术(第0、1和2天；参见图1)获得的代表性图像表明，与表达同源neo12肽-hla的靶t细胞共培养的neotcr-t细胞具有强大的抗原特异性细胞毒活性和增殖能力(右列)，但与表达无关肽的靶t细胞共培养时不具有抗原特异性细胞毒活性和增殖能力(左列)。在neotcr t细胞存在的情况下，不显示适当的neoe-hla靶抗原的肿瘤细胞继续生长(左列，绿色)。相比之下，大多数展示neo12肽的肿瘤细胞在与neo12-tcr t细胞共培养2天内凋亡或死亡(右列，红色)。
[0281]
来自健康供体和癌症患者的t细胞中的效应功能。为了确保neotcr制造过程能够成功地从健康供体以及癌症患者的t细胞中生成产品，通过生成从癌症患者的血液衍生的neotcr细胞来进行离体作用机制(moa)研究，并直接与从表达相同neotcr的健康供体获得的血液中产生的t细胞的活性进行比较。通过将neotcr-t细胞与表达同源或不相关hla-肽复合物的替代肿瘤靶t细胞混合来表征抗原特异性活性。在来自癌症患者和健康供体的表达neotcr的cd8 和cd4 t细胞的研究中，观察到通过t细胞杀伤活性、增殖和细胞因子产生的抗原特异性测量的相当的基因编辑效率和功能活性。在与缺乏hla结合突变的靶肽展示的靶t细胞接触时，没有观察到靶t细胞杀伤或neotcr-t细胞增殖，因此证明了反应的特异性。
[0282]
neotcr-t细胞的多功能性。除了快速转化为功能性效应t细胞表型外，t细胞多功
能性(单个细胞分泌多种效应蛋白的能力)是关键的产品属性，它是临床试验中施用的改造的t细胞非常理想的特性。非霍奇金淋巴瘤患者在输注前给药表现出多功能性的cd19 car-t细胞比给药未表现出多功能性的改造的car-t细胞的患者更有可能经历客观的临床反应(rossi等人，2018)。单细胞分泌组分析证实了激活的cd8 neotcr细胞中细胞因子的剂量依赖性多功能分泌(图2)。不同的细胞因子产生部分的比例在刺激剂量反应中似乎也是一致的。这些数据还表明，经过改造以表达hla i类限制性tcr的cd4 t细胞在暴露于同源neoe-hla靶标后成功地表现出效应功能。然而，对于cd4 t细胞，在用于脉冲靶t细胞的肽浓度下没有观察到剂量反应效应。总之，这些数据揭示了多功能细胞因子反应是由表达neotcr的cd8和cd4 t细胞在其表面上用显示同源neoe-hla靶标的肿瘤细胞刺激后促成的。
[0283]
更年轻的t细胞表型。根据t细胞分化的线性模型，初始细胞在抗原呈递细胞发出适当信号后在初始激活时分化为记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆(t
cm
)细胞表型。这些“更年轻”或分化程度较低的t细胞群已被证明很好地移植到淋巴细胞耗尽的动物中，并且在进一步刺激时会迅速增殖，同时保持记忆细胞池的持久性(klebanoff、gattinoni和restifo，2012)。t细胞亚群的线性分化模型如表6所示。
[0284]
表6：t细胞亚群线性分化模型
[0285][0286][0287]
然而，这些“更年轻”群体在遇到同源neoe-hla表达靶标时，不会分泌从更分化或“更老”的效应记忆(t
em
)和效应t细胞(te)观察到的完整细胞因子和效应蛋白级联。然而，虽然“更老”细胞对杀死靶肿瘤细胞非常有效，但它们缺乏增殖和持续存在的能力。以这种方式，它们已经最终分化，目的是在激活时杀死靶t细胞。
[0288]
来自动物模型和临床研究的已发表报告表明，包含具有“更年轻”或分化程度较低的记忆干细胞表型的t细胞的过继性细胞疗法比施用“更老”或分化程度更高的t效应细胞的研究实现了改善的整体反应和临床结果。来自小鼠模型和cd19靶向car-t细胞临床试验的数据表明，更年轻表型与细胞持久性和总体反应率相关(busch等人，2018)；(sabatino等人，2016)。因此，“更年轻”t细胞表型的施用对癌症患者可能具有更高的益处，这与在暴露于其同源抗原后提高植入潜力、延长输注后持久性以及快速分化为效应t细胞有关。这些特性突出了输注包含t记忆干细胞(t
msc
)和t中枢记忆(t
cm
)表型的表达neotcr的t细胞的价值。
[0289]
本文描述的制造方法是有意开发的，以有利于产生分化程度较低的表型的t细胞群。neotcr产品细胞制造方法产生的t细胞表型的组成通过流式细胞术分析进行了查看(interrogated)。根据需要，记忆干细胞和中枢记忆表型的neotcr细胞代表了neotcr产品谱中重要的t细胞表型。
[0290]
总之，这些离体moa研究表明，从健康供体或癌症患者产生的neotcr细胞被配制成neotcr产品，包含所需更年轻表型亚群(tmsc和tcm)的cd8 和cd4 t细胞。在遇到同源肽-hla后，这些细胞迅速转变为多功能效应细胞，这些细胞具有强大的细胞因子产生、肿瘤杀伤活性和增殖能力，并具有根除全身肿瘤细胞的潜力。
[0291]
实施例2单和多tcr neotcr产品
[0292]
在某些实施方案中，每种neotcr产品包含单种neotcr，该neotcr是精密基因组改造到cd4 和cd8 t细胞中的。鉴于neotcr产品的设计包含具有截短突变的neotcr，仅具有一(1)种neotcr的neotcr产品在治疗增殖性病症(例如癌症)方面可能是足够和有效的。
[0293]
neotcr产品中可以包含的neotcr数量没有执行限制。相反，可以基于以下选择包含在neotcr产品中的neotcr数量：1)基于在患者肿瘤和血样中鉴定的neotcr数量，或2)希望在给定产品中具有多种neotcr。
[0294]
在某些实施方案中，neotcr产品包含单种neotcr。neotcr产品包含单(1)种neotcr，通过筛选患者肿瘤和血样中的neotcr并选择单(1)种neotcr被改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为1-neotcr产品选择的单(1)种neotcr包含主干突变。任何单(1)neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0295]
在某些实施方案中，neotcr产品是多克隆的并且包含两(2)种或更多种neotcr。在某些实施方案中，多克隆neotcr产品在单个容器中包含两种(2)或更多种neotcr。在某些实施方案中，多克隆neotcr产品包含两(2)种或更多种neotcr，其中每种neotcr在它们自己的单独容器中。在某些实施方案中，将包含在neotcr产品中的neotcr依次施用于患者以治疗癌症。在某些实施方案中，将包含在neotcr产品中的neotcr同时施用于患者以治疗癌症。
[0296]
在某些实施方案中，neotcr产品包含两(2)种或三(3)种neotcr。包含两(2)或三(3)种neotcr的neotcr产品可以通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择两(2)或三(3)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的两(2)或三(3)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择两(2)种neotcr，则两(2)种neotcr均包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择三(3)种
neotcr，则三(3)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了三(3)种neotcr，则所有三(3)种neotcr都包含主干突变。任何两(2)或三(3)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0297]
在某些实施方案中，neotcr产品包含四(4)种neotcr。包含四(4)种neotcr的neotcr产品可以通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择四(4)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的四(4)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了四(4)种neotcr，则所有四(4)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择四(4)种neotcr，则四(4)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了四(4)种neotcr，则四(4)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。任何四(4)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0298]
在某些实施方案中，neotcr产品包含五(5)种neotcr。包含五(5)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择五(5)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的五(5)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了五(5)种neotcr，则所有五(5)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了五(5)种neotcr，则五(5)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了五(5)种neotcr，则五(5)种neotcr中的三(，3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了五(5)种neotcr，则五(5)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。任何五(5)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0299]
在某些实施方案中，neotcr产品包含六(6)种neotcr。包括六(6)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择六(6)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的六(6)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了六(6)种neotcr，则所有六(6)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了六(6)种neotcr，则六(6)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了六(6)种neotcr，则六(6)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了六(6)种neotcr，则六(6)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了六(6)种neotcr，则六(6)种neotcr中的五(5)种包含主干突变。任何六(6)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0300]
在某些实施方案中，neotcr产品包含七(7)种neotcr。包括七(7)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择七(7)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的七(7)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则所有七(7)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则七(7)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则七(7)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则七(7)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则七(7)种neotcr中的五(5)种包含主干突变。在某些实施方案
中，如果为neotcr产品选择了七(7)种neotcr，则七(7)种neotcr中的六(6)种包含主干突变。任何七(7)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0301]
在某些实施方案中，neotcr产品包含八(8)种neotcr。包括八(8)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择八(8)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的八(8)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则所有八(8)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的五(5)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的六(6)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了八(8)种neotcr，则八(8)种neotcr中的七(7)种包含主干突变。任何八(8)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0302]
在某些实施方案中，neotcr产品包含九(9)种neotcr。包括九(9)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择九(9)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的九(9)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则所有九(9)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的五(5)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的六(6)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的七(7)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了九(9)种neotcr，则九(9)种neotcr中的八(8)种包含主干突变。任何九(9)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0303]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十(10)种neotcr。包括十(10)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十(10)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十(10)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则所有十(10)种neotcr都包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的两(2)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的三(3)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的四(4)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的五(5)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的六(6)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种
neotcr中的七(7)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的八(8)种包含主干突变。在某些实施方案中，如果为neotcr产品选择了十(10)种neotcr，则十(10)种neotcr中的九(9)种包含主干突变。任何十(10)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0304]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十一(11)种neotcr。包括十一(11)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十一(11)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十一(11)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十一(11)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十一(11)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0305]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十二(12)种neotcr。包括十二(12)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十二(12)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十二(12)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十二(12)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十二(12)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0306]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十三(13)种neotcr。包括十三(13)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十三(13)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十三(13)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十三(13)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十三(13)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0307]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十四(14)种neotcr。包括十四(14)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十四(14)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十四(14)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十四(14)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十四(14)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0308]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十五(15)种neotcr。包括十五(15)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十五(15)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十五(15)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十五(15)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十五(15)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0309]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十六(16)种neotcr。包括十六(16)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十六(16)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十六(16)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十六(16)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十六(16)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0310]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十七(17)种neotcr。包括十七(17)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十七(17)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十七(17)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十七(17)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十七(17)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0311]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十八(18)种neotcr。包括十八(18)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十八(18)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十八(18)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十八(18)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十八(18)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0312]
在某些实施方案中，neotcr产品包含十九(19)种neotcr。包括十九(19)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择十九(19)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的十九(19)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，十九(19)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何十九(19)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0313]
在某些实施方案中，neotcr产品包含二十(20)种neotcr。包括二十(20)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择二十(20)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的二十(20)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，二十(20)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何二十(20)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0314]
在某些实施方案中，neotcr产品包含二十一(21)种neotcr。包括二十一(21)种的neotcr产品，可通过筛选患者肿瘤和血样的neotcr并选择二十一(21)种neotcr以改造到neotcr产品中来制造。在某些实施方案中，为neotcr产品选择的二十一(21)种neotcr包含主干突变。在某些实施方案中，二十一(21)种neotcr中的一种或多种包含主干突变。任何二十一(21)种neotcr产品可用于使用本文所述的任何方法治疗癌症。
[0315]
在某些实施方案中，包括在neotcr产品中的neotcr的数量仅受通过筛查患者肿瘤和血样检测到的neotcr的数量限制。在某些实施方案中，通过筛选患者肿瘤和血样检测到的每种neotcr都包括在neotcr产品中。
[0316]
实施例3 neotcr产品联合疗法
[0317]
概述。
[0318]
neotcr产品可以单独使用，也可以用于联合治疗。联合疗法可以包括施用neotcr产品和施用1、2、3、4、5、6或7种或更多种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少一种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少两种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少三种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少四种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少五种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少六种另外的治疗剂。在某些实施方案中，联合疗法包括施用neotcr产品和施用至少七种另外的治疗剂。
[0319]
在上面提供的任何实施方案中，neotcr产品可以是单种neotcr产品或两种或更多种neotcr产品，它们任选地同时或彼此连续施用。
[0320]
在上面提供的任何实施方案中，neotcr产品可以包含单种neotcr或两种或更多种neotcr。
[0321]
在某些实施方案中，neotcr产品与一种或多种联合疗法同时施用。在某些实施方
案中，neotcr产品和一种或多种联合疗法连续施用。
[0322]
在某些实施方案中，组合剂是化疗剂。在某些实施方案中，组合剂是两(2)种化疗剂。在某些实施方案中，组合剂是三(3)种化疗剂。在某些实施方案中，组合剂是四(4)种或更多种化疗剂。
[0323]
在某些实施方案中，组合剂是放射疗法。
[0324]
在某些实施方案中，化疗剂是激素疗法。
[0325]
在某些实施方案中，化疗剂是免疫疗法。
[0326]
在某些实施方案中，化疗剂是铂类抗肿瘤剂。在某些实施方案中，化疗剂是烷化剂。在某些实施方案中，化疗剂是铂类试剂。在某些实施方案中，铂类试剂选自由顺铂、卡铂、奥沙利铂组成的组。在某些实施方案中，化疗剂是微管抑制剂。在某些实施方案中，化疗剂是嘌呤类似物。
[0327]
pd-1轴结合剂。
[0328]
通过免疫检查点阻断来调节免疫抑制性肿瘤微环境是增强过继转移t细胞效力的一种有前途的策略。许多小鼠模型的临床前研究结果表明，过继性t细胞疗法与pd1通路阻断相结合可以改善肿瘤负荷控制并延长中位生存期(cherkassky，等人，2016)(moon等人，2015)(kodumudi等人，2016)(rupp等人，2017)。pd-1/pd-l1信号传导的阻断可恢复遇到pd-l1的表达pd-1的t细胞的功能，从而降低t细胞对肿瘤诱导的机能减退的易感性(gerner等人，2013))。通过增强转移的t细胞的增殖，pd1抑制还可以增加肿瘤微环境中的ifnγ水平，从而增加cxcl10的产生和更多的肿瘤反应性t细胞的募集(peng等人，2012)。重要的是，已在临床前肿瘤模型和临床环境中观察到组合pd1/pd-l1阻断和过继转移的肿瘤浸润淋巴细胞(til)的益处(goff等人，2016)。总之，文献研究支持这样的假设，即pd1/pd-l1抑制将增强neotcr产品过继转移后的抗肿瘤免疫反应，并为在临床上进行这种联合治疗提供了强有力的理由。
[0329]
在某些实施方案中，组合剂是pd-1结合剂。在某些实施方案中，pd-1结合剂是帕博利珠单抗。在某些实施方案中，pd-1结合剂是纳武单抗。在某些实施方案中，pd-1结合剂是本文所述的任何其他pd-1结合剂。
[0330]
在某些实施方案中，组合剂是pd-l1结合剂。在某些实施方案中，pd-l1结合剂是阿替利珠单抗。在某些实施方案中，pd-l1结合剂是本文所述的任何其他pd-l1结合剂。
[0331]
在某些实施方案中，组合剂是pd-l2结合剂。
[0332]
在某些实施方案中，pd-1轴结合剂在施用neotcr产品之前施用。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂在施用neotcr产品之后施用。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂与neotcr产品同时施用。
[0333]
在某些实施方案中，pd-1轴结合剂与neotcr产品在同一天施用。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂与neotcr产品连续几天施用(例如，如果pd-1轴结合剂在星期一施用，则neotcr产品在一天后的星期二施用；如果neotcr产品在星期一施用，然后pd-1轴结合剂在一天后的星期二施用)。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂在施用neotcr产品两(2)、三(3)、四(4)、五(5)天、六(6)或七(7)天后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用pd-1轴结合剂两(2)天、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天或七(7)天后施用。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂在施用neotcr产品两(2)周后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用
pd-1轴结合剂两(2)周后施用。在某些实施方案中，pd-1轴结合剂在施用neotcr产品一(1)个月后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用pd-1轴结合一(1)个月剂后施用。
[0334]
细胞因子。
[0335]
在某些实施方案中，具有治疗癌症治疗益处的细胞因子(及其衍生物/修饰物)可以与neotcr产品组合。
[0336]
il-2是一种不直接杀死癌细胞的细胞因子。il-2试剂包括1)il-2及其修饰物和衍生物，它们与天然il-2类似，不会杀死癌细胞，以及2)经过改造和修饰以直接杀死癌细胞的il-2分子。il-2试剂的天然il-2和天然il-2成分通过刺激患者免疫系统中的某些细胞来杀死癌细胞。由于癌细胞能够逃避免疫系统(即免疫系统不会将癌细胞识别为异常或危险)，因此可以将il-2试剂施用于需要其的患者，以增强免疫系统杀死癌细胞、减少癌细胞增殖或阻止癌细胞增殖。
[0337]
在某些实施方案中，il-2试剂是il-2或其药学上可接受的制剂。在某些实施方案中，il-2的药学上可接受的制剂是阿地白介素。
[0338]
在某些实施方案中，il-2试剂是cd122优选的il-2通路激动剂。
[0339]
在某些实施方案中，il-2试剂是聚乙二醇化的il-2。在某些实施方案中，聚乙二醇化il-2是nktr-214(bempegaldesleukin)。
[0340]
在某些实施方案中，il-2试剂是改造的il-2变体(il2v)。在某些实施方案中，il2v是用抗成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗体改造的。在某些实施方案中，il2v是rg7461。
[0341]
在某些实施方案中，il-2试剂是改造的抗cea抗体，其包含il2v部分。在某些实施方案中，含有il2v部分的抗cea抗体是cergutuzumab amunaleukin。
[0342]
在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品之前施用。在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品之后施用。在某些实施方案中，il-2试剂与neotcr产品同时施用。
[0343]
在某些实施方案中，il-2试剂与neotcr产品在同一天施用。在某些实施方案中，il-2试剂与neotcr产品连续几天施用(例如，如果il-2试剂在星期一施用，则neotcr产品在一天后的星期二施用；如果neotcr产品在星期一施用，然后在一天后的星期二施用il-2试剂)。在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品两(2)天、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天或七(7)天后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-2试剂两(2)天、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天或七(7)天后施用。在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品两(2)周后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-2试剂两(2)周后施用。在某些实施方案中，il-2试剂在施用neotcr产品一(1)个月后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-2试剂一(1)个月后施用。
[0344]
在某些实施方案中，il-10试剂或其药学上可接受的制剂可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，il-10试剂是pegilodecakin。
[0345]
在某些实施方案中，il-10试剂在施用neotcr产品之前施用。在某些实施方案中，il-10试剂在施用neotcr产品之后施用。在某些实施方案中，il-10试剂与neotcr产品同时施用。
[0346]
在某些实施方案中，il-10试剂与neotcr产品在同一天施用。在某些实施方案中，il-10试剂与neotcr产品连续几天施用(例如，如果il-10试剂在星期一施用，则neotcr产品
在一天后的星期二施用；如果neotcr产品在星期一施用，然后il-10试剂在一天后的星期二施用)。在某些实施方案中，il-10试剂在施用neotcr产品两(2)、三(3)、四(4)、五(5)天、六(6)或七(7)天后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-10试剂两(2)天、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天或七(7)天后施用。在某些实施方案中，il-10试剂在施用neotcr产品两(2)周后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-10试剂两(2)周后施用。在某些实施方案中，il-10试剂在施用neotcr产品一(1)个月后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-10试剂一(1)个月后施用。
[0347]
在某些实施方案中，il-15试剂可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，增强导致持续抗肿瘤免疫反应的长期免疫记忆形成的il-15试剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0348]
在某些实施方案中，il-15试剂靶向il-15α/il-2rγ受体复合物。在某些实施方案中，il-15试剂是nktr-255。
[0349]
在某些实施方案中，il-15试剂是天然il-15。在某些实施方案中，il-15试剂包含寿司(sushi)结构域。在某些实施方案中，il-15试剂是效力降低的il15-il15rα异二聚体fc融合体。在某些实施方案中，il-15试剂是p22339。在某些实施方案中，il-15试剂是xmab24306。
[0350]
在某些实施方案中，il-15试剂在施用neotcr产品之前施用。在某些实施方案中，il-15试剂在施用neotcr产品之后施用。在某些实施方案中，il-15试剂与neotcr产品同时施用。
[0351]
在某些实施方案中，il-15试剂与neotcr产品在同一天施用。在某些实施方案中，il-15试剂与neotcr产品连续几天施用(例如，如果il-15试剂在星期一施用，则neotcr产品在一天后的星期二施用；如果neotcr产品在星期一施用，然后il-15试剂在一天后的星期二施用)。在某些实施方案中，il-15试剂在施用neotcr产品两(2)、三(3)、四(4)、五(5)天、六(6)或七(7)天后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-15试剂两(2)天、三(3)天、四(4)天、五(5)天、六(6)天或七(7)天后施用。在某些实施方案中，il-15试剂在施用neotcr产品两(2)周后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-15试剂两(2)周后施用。在某些实施方案中，il-15试剂在施用neotcr产品一(1)个月后施用。在某些实施方案中，neotcr产品在施用il-15试剂一(1)个月后施用。
[0352]
在某些实施方案中，il-7试剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0353]
在某些实施方案中，il-12试剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0354]
在某些实施方案中，il-18试剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0355]
在某些实施方案中，il-21剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0356]
细胞因子和pd-1轴结合剂。
[0357]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与1)具有治疗癌症治疗益处的细胞因子(及其修饰物/衍生物)和2)pd-1轴结合剂组合。
[0358]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和pd-1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和pd-l1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和pd-l2结合剂组合。
[0359]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和帕博利珠单抗组
合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-2试剂和阿替利珠单抗组合。
[0360]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与阿地白介素和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与阿地白介素和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与阿地白介素和阿替利珠单抗组合。
[0361]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与cergutuzumab amunaleukin和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与cergutuzumab amunaleukin和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与cergutuzumab amunaleukin和阿替利珠单抗组合。
[0362]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与bempegaldesleukin和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与bempegaldesleukin和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与bempegaldesleukin和阿替利珠单抗组合。
[0363]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il2v和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il2v和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il2v和阿替利珠单抗组合。在某些实施方案中，il2v是用抗成纤维细胞激活蛋白(fap)的抗体改造的。在某些实施方案中，il2v是rg7461。
[0364]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和pd-1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和pd-l1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和pd-l2结合剂组合。
[0365]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-10试剂和阿替利珠单抗组合。
[0366]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与pegilodecakin和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与pegilodecakin和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与pegilodecakin和阿替利珠单抗组合。
[0367]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和pd-1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和pd-l1结合剂组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和pd-l2结合剂组合。
[0368]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与il-15试剂和阿替利珠单抗组合。
[0369]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与nktr-255和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与nktr-255和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与nktr-255和阿替利珠单抗组合。
[0370]
通过非限制性实例，在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与xmab24306和帕博利珠单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与xmab24306和纳武单抗组合。在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与xmab24306和阿替利珠单抗组合。
[0371]
血管内皮生长因子试剂
[0372]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0373]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂是抗vegf抗体。在某些实施方案中，抗vegf抗体是贝伐单抗。在某些实施方案中，抗vegf抗体是雷珠单抗(ranibizumab)。在某些实施方案中，抗vegf抗体是雷莫芦单抗。
[0374]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂是抗vegf小分子。在某些实施方案中，抗vegf小分子是pegaptanib。在某些实施方案中，抗vegf小分子是索拉非尼。在某些实施方案中，抗vegf小分子是舒尼替尼。在某些实施方案中，抗vegf小分子是帕唑帕尼。在某些实施方案中，抗vegf小分子是zif-aflibercept。在某些实施方案中，抗vegf小分子是凡德他尼(vandetanib)。在某些实施方案中，抗vegf小分子是阿帕替尼。在某些实施方案中，抗vegf小分子是卡博替尼。
[0375]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂(包括本文公开的任何抗vegf试剂)及其药学上可接受的形式可以与1)一种或多种neotcr产品和2)细胞因子(及其修饰物/衍生物)组合。
[0376]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂(包括本文公开的任何抗vegf试剂)及其药学上可接受的形式可以与1)一种或多种neotcr产品和2)pd-1轴结合剂组合。
[0377]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂(包括本文公开的任何抗vegf试剂)及其药学上可接受的形式可以与1)一种或多种neotcr产品，2)细胞因子(及其修饰物/衍生物)，和3)pd-1轴结合剂组合。
[0378]
在某些实施方案中，靶向vegf的试剂(包括本文公开的任何抗vegf试剂)及其药学上可接受的制剂可以与1)一种或多种neotcr产品，2)任选的细胞因子(及其修饰物/衍生物)，3)任选地pd-1轴结合剂，和4)另一种化疗剂组合。
[0379]
ctla-4试剂
[0380]
在某些实施方案中，靶向ctla-4的试剂(包括但不限于抗ctla-4抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0381]
在某些实施方案中，抗-ctla-4抗体是伊匹单抗。在某些实施方案中，抗-ctla-4抗体是ctla-4-fc融合蛋白。在某些实施方案中，抗ctla-4抗体是靶向ctla-4和pd-1的双特异性抗体。在某些实施方案中，抗-ctla-4抗体是靶向ctla-4和pd-l1的双特异性抗体。
[0382]
tigit试剂
[0383]
在某些实施方案中，靶向tigit的试剂(包括但不限于抗tigit抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0384]
4-1bb试剂
[0385]
在某些实施方案中，靶向4-1bb的试剂(包括但不限于抗4-1bb抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0386]
在某些实施方案中，4-1bb试剂可以是fap-4-1bb双特异性抗体。在某些实施方案中，4-1bb试剂可以是靶向4-1bb和肿瘤表面抗原的任何双特异性抗体。在某些实施方案中，4-1bb试剂可以是靶向4-1bb、nk细胞标记物和任选的肿瘤表面抗原的任何多特异性抗体。多特异性4-1bb抗体的非限制性实例是结合cd19和4-1bb的双特异性抗体。
[0387]
在某些实施方案中，4-1bb试剂可以是car t细胞疗法。在某些实施方案中，car t细胞疗法包括具有4-1bb共刺激结构域的靶向cd19的car t细胞。
[0388]
癌胚抗原(cea)试剂
[0389]
在某些实施方案中，靶向cea的试剂(包括但不限于抗cea抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，cea试剂是与il2v部分(包括但不限于cergutuzumab amunaleukin)融合的抗cea抗体。在某些实施方案中，cea试剂是双特异性抗体，其中双特异性抗体结合cd3和cea。
[0390]
ceacam试剂
[0391]
在某些实施方案中，靶向ceacam的试剂(包括但不限于抗ceacam抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0392]
gpc3试剂
[0393]
在某些实施方案中，靶向gpc3的试剂(包括但不限于抗gpc3抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0394]
tim3试剂
[0395]
在某些实施方案中，靶向tim3的试剂(包括但不限于抗tim3抗体和双特异性抗tim3 抗pd-1抗体)及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0396]
pi3k抑制剂
[0397]
在某些实施方案中，pi3k抑制剂及其药学上可接受的制剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0398]
bet抑制剂
[0399]
在某些实施方案中，bet抑制剂及其药学上可接受的制剂可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0400]
选择性雌激素受体降解剂
[0401]
在某些实施方案中，选择性雌激素受体降解剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0402]
个性化新抗原疫苗
[0403]
在某些实施方案中，个性化新抗原疫苗可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，疫苗是dna疫苗。在某些实施方案中，疫苗是rna疫苗。
[0404]
her2试剂
[0405]
在某些实施方案中，her2试剂及其药学上可接受的制剂可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，her2试剂是抗her2抗体。在某些实施方案中，抗her2试剂是抗her2 抗cd3双特异性抗体。在某些实施方案中，抗her2抗体是曲妥珠单抗。在某些实施方案中，抗her2抗体是ado-trastuzumab emtansine。在某些实施方案中，抗her2抗体是帕妥珠单抗。
[0406]
cd20试剂
[0407]
在某些实施方案中，cd20试剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，cd20试剂是抗cd20抗体。在某些实施方案中，抗cd20抗体是利妥昔单抗。在某些实施方案中，抗cd20抗体是奥比妥珠单抗(obinutuzumab)。在某些实施方案中，抗cd20抗体是抗cd20 抗cd3双特异性抗体。
[0408]
mek抑制剂
[0409]
在某些实施方案中，mek抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，mek抑制剂是考比替尼(cobimetinib)。
[0410]
braf抑制剂
[0411]
在某些实施方案中，braf抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，braf抑制剂是威罗非尼(vemurafenib)。
[0412]
mek抑制剂和braf抑制剂
[0413]
在某些实施方案中，braf抑制剂及其药学上可接受的形式和mek抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，braf抑制剂是威罗非尼并且mek抑制剂是考比替尼。
[0414]
akt抑制剂
[0415]
在某些实施方案中，akt抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，akt抑制剂是ipatasertib。
[0416]
alk抑制剂
[0417]
在某些实施方案中，alk抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，alk抑制剂是alectanib。
[0418]
egfr抑制剂
[0419]
在某些实施方案中，egfr抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，egfr抑制剂是厄洛替尼(erlotinib)。
[0420]
bcl2抑制剂
[0421]
在某些实施方案中，akt抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，akt抑制剂是venetoclax。
[0422]
mdm2抑制剂
[0423]
在某些实施方案中，akt抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，akt抑制剂是依达奴林idasanutlin。
[0424]
ntrk/ros1抑制剂
[0425]
在某些实施方案中，ntrk/ros1抑制剂及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。在某些实施方案中，ntrk/ros1抑制剂是entrectanib。
[0426]
抗cd40抗体
[0427]
在某些实施方案中，抗cd40抗体及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0428]
抗cd79b抗体
[0429]
在某些实施方案中，抗cd40抗体及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0430]
卡培他滨
[0431]
在某些实施方案中，卡培他滨及其药学上可接受的形式可以与一种或多种neotcr产品组合。
[0432]
实施例4实体瘤适应证
[0433]
neotcr产品可用于治疗可以检测到一种或多种neotcr的任何癌症。在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗实体瘤。
[0434]
在某些实施方案中，一种或多种neotcr产品可以与一种或多种化疗剂或放射疗法组合以治疗实体瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗实体瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗实体瘤。
[0435]
治疗乳腺癌的方法
[0436]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗乳腺癌。
[0437]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体(er 和/或pr )阳性乳腺癌。
[0438]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗her2阴性(her2-)乳腺癌。
[0439]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体阳性(er 和/或pr )乳腺癌。
[0440]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗her2阳性(her2 )乳腺癌。
[0441]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体阴性(er-)乳腺癌。
[0442]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体阴性(er-)和her2阴性(her2-)(即三阴性)乳腺癌。
[0443]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体(er 和/或pr )阳性和her2阴性(her2-)乳腺癌。
[0444]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体阳性(er 和/或pr )和her2阳性(her2 )乳腺癌。
[0445]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗激素受体阴性(er-)和her2阳性(her2 )乳腺癌。
[0446]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗brca阳性(brca )乳腺癌。
[0447]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗乳腺癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗乳腺癌。
[0448]
治疗胸癌的方法
[0449]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗肺癌。
[0450]
在某些实施方案中，肺癌是非小细胞肺癌(nsclc)。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是腺癌。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是大细胞癌。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是腺鳞癌。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是未分化癌。在某些实施方案中，非小细胞肺癌是多于一种类型的nsclc的组合。
[0451]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗nsclc。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种联合试剂可以与一种或多种neotcr产品和放射联合使用以治疗nsclc。
[0452]
在某些实施方案中，肺癌是小细胞肺癌(sclc)。
[0453]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种
neotcr产品联合使用以治疗sclc。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射联合使用以治疗sclc。
[0454]
在某些实施方案中，肺癌是间皮瘤。
[0455]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗间皮瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射联合使用以治疗间皮瘤。
[0456]
治疗前列腺癌的方法
[0457]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗前列腺癌。
[0458]
在某些实施方案中，前列腺癌是腺泡腺癌。在某些实施方案中，前列腺癌是导管腺癌。在某些实施方案中，前列腺癌是移行细胞(或尿路上皮)癌。在某些实施方案中，前列腺癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，前列腺癌是小细胞前列腺癌。在某些实施方案中，前列腺癌是神经内分泌癌。在某些实施方案中，前列腺癌是肉瘤。在某些实施方案中，前列腺癌是多于一种类型的前列腺癌的组合。
[0459]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗前列腺癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗前列腺癌。
[0460]
治疗结直肠癌的方法
[0461]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗结直肠癌。
[0462]
在某些实施方案中，结直肠癌是微卫星稳定的。在某些实施方案中，结直肠癌是微卫星不稳定的。
[0463]
在某些实施方案中，结直肠癌是结直肠腺癌。在某些实施方案中，结直肠癌是胃肠道类癌瘤。在某些实施方案中，结直肠癌是原发性结直肠淋巴瘤。在某些实施方案中，结直肠癌是胃肠道间质瘤。在某些实施方案中，结直肠癌是平滑肌肉瘤。在某些实施方案中，结直肠癌是多于一种类型的结直肠癌的组合。
[0464]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗结直肠癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗结直肠癌。
[0465]
治疗妇科癌症的方法
[0466]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗卵巢癌。
[0467]
在某些实施方案中，卵巢癌是腺泡上皮性卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌是生殖细胞卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌是基质细胞卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌是小细胞癌。在某些实施方案中，卵巢癌是铂敏感性卵巢癌。在某些实施方案中，卵巢癌是铂抗性癌症。在某些实施方案中，卵巢癌是多于一种类型的卵巢癌的组合。
[0468]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗卵巢癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗卵巢癌。
[0469]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗子宫癌。
[0470]
在某些实施方案中，子宫癌是子宫内膜癌。在某些实施方案中，子宫癌是子宫肉瘤。在某些实施方案中，子宫内膜癌是浆液性腺癌。在某些实施方案中，子宫内膜癌是腺鳞
癌。在某些实施方案中，子宫内膜癌是子宫癌。在某些实施方案中，子宫肉瘤是子宫平滑肌肉瘤。在某些实施方案中，子宫肉瘤是子宫内膜间质肉瘤。在某些实施方案中，子宫肉瘤是未分化肉瘤。在某些实施方案中，子宫癌是多于一种类型的卵巢癌的组合。
[0471]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗子宫癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗子宫癌。
[0472]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗宫颈癌。
[0473]
在某些实施方案中，宫颈癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，宫颈癌是腺癌。在某些实施方案中，宫颈癌是多于一种类型的宫颈癌的组合。
[0474]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗子宫癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗子宫癌。
[0475]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗阴道癌。
[0476]
在某些实施方案中，阴道癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，阴道癌是腺癌。在某些实施方案中，阴道癌是透明细胞腺癌。在某些实施方案中，阴道癌是黑素瘤。在某些实施方案中，阴道癌是多于一种类型的阴道癌的组合。
[0477]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗阴道癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗阴道癌。
[0478]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗外阴癌。
[0479]
在某些实施方案中，外阴癌是外阴鳞状细胞癌。在某些实施方案中，外阴癌是黑素瘤。在某些实施方案中，外阴癌是多于一种类型的外阴癌的组合。
[0480]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗外阴癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗外阴癌。
[0481]
治疗胰腺癌的方法
[0482]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗胰腺癌。
[0483]
在某些实施方案中，胰腺癌是外分泌肿瘤。在某些实施方案中，胰腺癌是内分泌肿瘤。在某些实施方案中，内分泌肿瘤可以是胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、生长抑素瘤、vipomas或ppomas。在某些实施方案中，胰腺癌是多于一种类型的胰腺癌的组合。
[0484]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品联合使用以治疗胰腺癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射联合使用以治疗胰腺癌。
[0485]
治疗黑素瘤的方法
[0486]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗黑素瘤。
[0487]
在某些实施方案中，黑素瘤是表面扩散的黑素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是结节性黑素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是恶性雀斑样痣黑素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是肢端雀斑样痣黑素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是结缔组织增生性黑素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是眼部黑色素瘤。在某些实施方案中，黑素瘤是肛门直肠黑素瘤。在某些
实施方案中，黑素瘤是多于一种类型的黑素瘤的组合。
[0488]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗黑素瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗黑素瘤。
[0489]
治疗中枢神经系统癌症的方法
[0490]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗中枢神经系统癌症(cns癌症)。
[0491]
在某些实施方案中，cns癌症是脑肿瘤。在某些实施方案中，cns癌症是cns转移。在某些实施方案中，cns癌症是cns肿瘤。在某些实施方案中，cns癌症是多形性成胶质细胞瘤。在某些实施方案中，cns癌症是脑膜瘤。在某些实施方案中，cns癌症是颅底癌。在某些实施方案中，cns癌症是脊髓肿瘤。在某些实施方案中，cns癌症是神经胶质瘤。在某些实施方案中，cns癌症是星形细胞瘤。在某些实施方案中，cns癌症是脑干神经胶质瘤。在某些实施方案中，cns癌症是室管膜瘤。在某些实施方案中，cns癌症是生殖细胞肿瘤。在某些实施方案中，cns癌症是成神经管细胞瘤。在某些实施方案中，cns癌症是多于一种类型的cns癌症的组合。
[0492]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗cns癌症。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗cns癌症。
[0493]
治疗皮肤癌的方法
[0494]
除了上述黑素瘤的治疗外，在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗其他皮肤癌。
[0495]
在某些实施方案中，皮肤癌是皮肤黑素瘤。在某些实施方案中，皮肤癌是粘膜黑素瘤。在某些实施方案中，皮肤癌是肢端黑素瘤。在某些实施方案中，皮肤癌是基底细胞癌。在某些实施方案中，皮肤癌是默克尔细胞癌。在某些实施方案中，皮肤癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，皮肤癌是多于一种类型的皮肤癌的组合。
[0496]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗皮肤癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗皮肤癌。
[0497]
治疗头颈癌的方法
[0498]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗头颈癌。
[0499]
在某些实施方案中，头颈癌是唾液腺肿瘤。在某些实施方案中，头颈癌是头颈鳞状细胞癌。在某些实施方案中，头颈癌是鼻咽癌。在某些实施方案中，头颈癌是多于一种类型的头颈癌的组合。
[0500]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗头颈癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗头颈癌。
[0501]
治疗hpv 癌的方法
[0502]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗hpv 癌。
[0503]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗hpv 癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合
剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗hpv 癌。
[0504]
治疗食管癌的方法
[0505]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗食管癌。
[0506]
在某些实施方案中，食管癌是腺癌。在某些实施方案中，食管癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，食管癌是多于一种类型的食管癌的组合。
[0507]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗食管癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗食管癌。
[0508]
治疗甲状腺癌的方法
[0509]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗甲状腺癌。
[0510]
在某些实施方案中，甲状腺癌是乳突癌。在某些实施方案中，甲状腺癌是滤泡性的。在某些实施方案中，甲状腺癌是未分化癌。在某些实施方案中，甲状腺癌是髓质的。在某些实施方案中，甲状腺癌是多于一种类型的甲状腺癌的组合。
[0511]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗甲状腺癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗甲状腺癌。
[0512]
治疗胃癌的方法
[0513]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗胃癌。
[0514]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗胃癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗胃癌。
[0515]
治疗肝细胞癌的方法
[0516]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗肝细胞癌。
[0517]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗肝细胞癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗肝细胞癌。
[0518]
治疗胆管癌的方法
[0519]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗胆管癌。
[0520]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗胆管癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗胆管癌。
[0521]
治疗肾细胞癌的方法
[0522]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗肾细胞癌。
[0523]
在某些实施方案中，肾细胞癌是透明细胞肾癌。在某些实施方案中，肾细胞癌是非透明细胞肾癌。在某些实施方案中，肾细胞癌是多于一种类型的肾细胞癌的组合。
[0524]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗肾细胞癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗肾细胞癌。
[0525]
治疗膀胱癌的方法
[0526]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗膀胱癌。
[0527]
在某些实施方案中，膀胱癌是尿路上皮癌。在某些实施方案中，膀胱癌是鳞状细胞癌。在某些实施方案中，膀胱癌是腺癌。在某些实施方案中，膀胱癌是多于一种类型的膀胱癌的组合。
[0528]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗膀胱癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗膀胱癌。
[0529]
治疗睾丸癌的方法
[0530]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗睾丸癌。
[0531]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗睾丸癌。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗睾丸癌。
[0532]
治疗肉瘤的方法
[0533]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗肉瘤。
[0534]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗肉瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗肉瘤。
[0535]
实施例5液体瘤适应证
[0536]
neotcr产品可用于治疗可以检测到一种或多种neotcr的任何癌症。在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗液体或血液肿瘤。
[0537]
滤泡性淋巴瘤的治疗方法
[0538]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于治疗滤泡性淋巴瘤。
[0539]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗滤泡性淋巴瘤。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗滤泡性淋巴瘤。
[0540]
治疗白血病的方法
[0541]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于白血病。
[0542]
在某些实施方案中，白血病是急性淋巴细胞白血病(all)。在某些实施方案中，白血病是急性髓性白血病(aml)。在某些实施方案中，白血病是慢性淋巴细胞白血病(cll)。在某些实施方案中，白血病是慢性髓性白血病(cml)。在某些实施方案中，白血病是毛细胞白血病(hcl)。在某些实施方案中，白血病是骨髓增生异常综合征白血病(mds)。在某些实施方案中，白血病是一种以上白血病类型的组合。
[0543]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗白血病。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗白血病。
[0544]
治疗多发性骨髓瘤的方法
[0545]
在某些实施方案中，neotcr产品可用于多发性骨髓瘤。
[0546]
在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是郁结惰性多发性骨髓瘤(smouldering indolent multiple myeloma)。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是超二倍体多发性骨髓
瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是非超二倍体(hypodiploid)多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是轻链骨髓瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是非分泌性骨髓瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是孤立性浆细胞瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是髓外浆细胞瘤。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是意义未定的单克隆丙种球蛋白病。在某些实施方案中，多发性骨髓瘤是多于一种类型的多发性骨髓瘤的组合。
[0547]
在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品组合使用以治疗白血病。在某些实施方案中，实施例3中描述的一种或多种组合剂可以与一种或多种neotcr产品和放射组合使用以治疗白血病。
[0548]
实施例6 neotcr产品的施用方法
[0549]
在某些实施方案中，neotcr产品可以静脉内施用至患者。在某些实施方案中，neotcr产品可以动脉内、腹膜内、颅内、关节内、胸膜内、玻璃体内或血管内施用至患者。在某些实施方案中，neotcr产品可以通过注射、通过输注、通过连续输注、通过直接局部灌注浸浴靶细胞、通过导管或通过灌洗施用于患者。
[0550]
由于neotcr产品包含“年轻的”细胞表型，因此neotcr细胞在施用至需要其的患者时应作为记忆t细胞保留在患者体内，并应能够响应同源新抗原而增殖。因此，在某些实施方案中，neotcr产品仅对患者施用一(1)次。在某些实施方案中，如果需要，neotcr产品可以施用至患者两(2)次或更多次。
[0551]
在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量约为100,000个neotcr细胞。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在100,000个neotcr细胞和500,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在500,000个neotcr细胞和1,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在1,00,000个neotcr细胞和2,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在2,00,000个neotcr细胞和5,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在5,00,000个neotcr细胞和10,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量多于10,000,000个neotcr细胞。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在50,000,000个和150,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在150,000,000个和300,000,000个neotcr细胞之间。在某些实施方案中，施用给需要其的患者的neotcr产品中的neotcr细胞数量在300,000,000个和500,000,000个neotcr细胞之间。
[0552]
在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以是用于患者的10,000,000个细胞的固定(flat)剂量。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以是用于患者的1,000,000个细胞的固定(flat)剂量。在某些实施方案中，针对这种固定剂量的患者的近似体重是50kg。
[0553]
在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以是用于患者的400,000,000个细胞的固定(flat)剂量。在某些实施方案中，针对这种固定剂量的患者的近似体重是50kg。
[0554]
在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克1,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克2,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克3,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克4,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克5,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克6,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克7,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克8,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克9,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克10,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克多于10,000,000个细胞给药。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr产品中neotcr细胞的数量可以按每千克少于1,000,000个细胞给药。
[0555]
在某些实施方案中，施用至本文所述患者的任何一种细胞总数可以作为单剂量、在两个剂量之间分配(即，在两个不同的时间点施用)、或在三个或更多个剂量之间分配(即，在三个或更多不同的时间点施用)。
[0556]
实施例7 neotcr产品的安全药理学
[0557]
使用neotcr分离技术，neoe特异性t细胞可以从受试者的外周血中捕获，因为它们能够特异性结合衍生自受试者的肿瘤专有突变蛋白(新抗原)的新表位肽，并与受试者的hla受体之一复合。此外，基于候选neoe特异性t细胞已响应与同源neoe肽-hla的相遇而被激活的前提，仅选择源自经历过抗原的t细胞的neotcr用于neotcr产品开发。neoe-hla靶点的肿瘤专有呈递导致了neoe特异性t细胞的激活和扩增，但并未引发患者的自身免疫应答。这些个性化元素去除了输注过继转移的neotcr细胞后潜在的安全性/耐受性风险。
[0558]
精密基因组工程过程涉及两种非天然蛋白质：cas9核糖核蛋白，其在分裂细胞中瞬时递送并随后降解；作为neotcr基因盒的一部分引入的p2a肽。尽管cas9是一种在改造过程中瞬时递送的非天然蛋白质，但没有证据表明最终产品中有残留cas9蛋白，因此去除了施用neotcr产品后抗cas9免疫原性的风险。虽然p2a序列是neotcr基因盒中唯一的非人类序列，但它们并不作为改造的t细胞表面上成熟neotcr多肽的一部分表达，因此不代表抗体依赖性t细胞-介导的细胞毒性的机会。
[0559]
已经进行了全面的体外和计算机分析，以分别使用cosmid和guide-seq调查crispr/cas9介导的基因组编辑的潜在脱靶位点。迄今为止，已通过深度测序评估了多个实验室规模或临床规模制造的neotcr产品对候选基因组脱靶位点的切割，证实了已发表的证据表明选定的crispr/cas9核糖核蛋白用于精密基因组工程制造过程是高度特异的。
[0560]
已经评估了精密基因组工程方法的其他方面，例如基因组不稳定性。在通过靶向基因座扩增(tla)或标准荧光原位杂交(fish)细胞遗传学评估多种neotcr产品时，未发现基因组不稳定性的证据。
[0561]
总之，通过精密基因组工程方法对crispr/cas9核糖核蛋白改造的分析显示出精
确的靶向编辑特异性。因此，通过精密基因组工程方法制造的自体neotcr产品在重新输注到患者体内后应具有良好的耐受性。
[0562]
实施例8药代动力学和产品代谢
[0563]
neotcr产品包括活的自体患者t细胞。转移细胞的体内生物分布和细胞命运取决于多个参数，例如输注时的适应度和细胞表型、输注后的抗原相遇以及在肿瘤微环境中接收到的信号。因此，neotcr产品中的neotcr细胞应通过记忆和增殖在施用它的患者中保持较长时间。
[0564]
在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续存在少于一(1)年。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续一(1)年至少于两(2)年之间。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续两(2)年至少于五(5)年之间的间隔。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续五(5)年至少于七(7)年之间的间隔。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续七(7)年至少于十(10)年之间的间隔。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续存在十(10)年至少于十五(15)年之间的间隔。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者体内持续十五(15)年至少于二十(20)年之间的间隔。在某些实施方案中，施用至患者的neotcr细胞将在患者的整个生命周期内持续存在于患者体内。
[0565]
实施例9致瘤性
[0566]
neotcr产品包括精密基因组改造的t细胞，其中一种或多种neotcr在天然tcr基因组位点整合到t细胞的基因组中，无需任何人工启动子。结果，neotcr在t细胞中表达，无需人工启动子。
[0567]
已知人工序列(例如，不是内源性地存在于特定t细胞中的启动子)会引起致瘤性。因此，由于neotcr产品不含人工启动子，因此降低了致瘤性的风险。
[0568]
在某些实施方案中，不存在与neotcr产品相关的致瘤性。
[0569]
实施例10预调理方案
[0570]
neotcr产品可以例如通过静脉输注作为单剂量或与一种或多种药剂组合施用。neotcr产品可以在非清髓性(nma)调理方案或不存在nma调理方案后施用于患者。
[0571]
实施例11降低接受neotcr产品治疗的患者的发热反应或发热性中性粒细胞减少症的风险和/或治疗接受neotcr产品治疗的患者的发热反应或发热性中性粒细胞减少症的方法
[0572]
在某些实施方案中，为了防止对neotcr的发热反应，可以在施用neotcr产品之前向患者施用对乙酰氨基酚和苯海拉明。在某些实施方案中，此类对乙酰氨基酚和苯海拉明的剂量应基于每种相应药物的护理标准。
[0573]
在某些实施方案中，如果施用neotcr产品的患者出现发烧，则可基于患者的年龄、体重和任何其他相关因素基于对乙酰氨基酚给药的护理标准，进一步施用至所述患者一剂或更多剂对乙酰氨基酚。在某些实施方案中，如果施用neotcr产品的患者出现发烧，则除了对乙酰氨基酚外，还可以施用额外的护理标准支持措施。
[0574]
在某些实施方案中，不应向施用neotcr产品的患者施用皮质类固醇或非甾体抗炎药(nsaid)。因此，在一个实施方案中，可以给患者施用neotcr产品，其中不给该患者施用皮质类固醇或nsaid。
[0575]
在某些实施方案中，观察施用neotcr产品的患者是否有脓毒症输注反应和细菌感染的迹象。如果施用neotcr产品的患者在施用期间或施用后立即出现体温升高超过1℃的发热，则可以监测患者的脓毒性输注反应和细菌感染。在某些实施方案中，如果怀疑脓毒症输注反应或细菌感染，则可以基于护理方法标准评估患者的感染源。
[0576]
在某些实施方案中，施用neotcr产品并且中性粒细胞减少症和发热的患者可以基于护理标准施用广谱抗生素和任选的静脉输液。
[0577]
实施例12降低接受neotcr产品治疗的患者急性输液反应和超敏反应风险和/或治疗接受neotcr产品治疗的患者急性输液反应和超敏反应的方法
[0578]
在某些实施方案中，输液反应可能是对施用neotcr产品的一种可能反应，并且可能表现为急性输液反应，伴有短暂的发热、寒战、寒颤和恶心，至更严重的超敏反应。此外，可能与超敏反应重叠。
[0579]
neotcr产品在dmso中冷冻保存。dmso毒性是冷冻保存产品施用的常见并发症。与dmso毒性相关的副作用通常与组胺释放有关。体征和症状包括咳嗽、潮红、皮疹、胸闷和喘息、恶心和呕吐，以及在更极端的情况下心血管不稳定。
[0580]
对乙酰氨基酚/扑热息痛和苯海拉明/h1抗组胺药可在输注前施用，并可根据需要每6小时重复一次。如果患者出现输液反应，则可以减慢输注速度或停止。皮质类固醇应该只给予那些已经接受生理替代治疗的患者，或者在危及生命的紧急情况下，因为这会对neotcr细胞产生不利影响。
[0581]
实施例13降低使用neotcr产品治疗的患者的神经毒性风险和/或治疗使用neotcr产品治疗的患者的神经毒性的方法
[0582]
在接受car-t细胞疗法的患者中观察到神经毒性，其范围从头痛、精神错乱、意识水平改变、找词困难、构音障碍、脑病，很少到癫痫发作。神经系统变化的发生时间可能与细胞因子释放综合征(crs)同时发生，随后消退，或者在某些患者中可以单独发生而没有crs症状。
[0583]
如果在向患者施用neotcr产品时出现crs的体征和症状，则可以根据指南向患者施用抗il6靶向治疗或类固醇。
[0584]
实施例14降低用neotcr产品治疗的患者中肿瘤溶解综合征的风险和/或治疗用neotcr产品治疗的患者中肿瘤溶解综合征的方法
[0585]
肿瘤溶解综合征(tls)在大多数实体瘤中相对罕见，因此固体瘤的患者处于低风险。
[0586]
tls是由大量肿瘤细胞溶解引起的，大量钾、磷酸盐和核酸释放到全身循环中，并已在用car-t细胞疗法治疗的血液学恶性肿瘤患者中描述。
[0587]
实验室tls定义为在neotcr产品输注后的几天内出现以下值的2种或更多种：1)尿酸≥8mg/dl或从基线增加25％，2)钾≥6meq/l或从基线增加25％，3)磷≥4.5mg/dl或从基线增加25％，4)钙≤7mg/dl或从基线减少25％。
[0588]
可以给予患有肾功能障碍和/或肾损害或尿酸、钾或磷酸盐水平高于正常(uln)上限的具有大体积的固体肿瘤患者以预防。没有禁忌症的患者可以在neotcr产品输注之前根据机构指南开始预防(例如，别嘌醇(allopurinol))上。当肿瘤溶解的风险已过时，应停止预防。
[0589]
如果上述零或一个实验室值异常，则患者应继续施用别嘌醇或非别嘌醇替代和水合。除了别嘌醇或非别嘌醇替代之外，可以施用iv水合。此外，如果尿酸水平仍然升高，则可以向患者施用拉布立酶(rasburicase)。
[0590]
实施例15降低使用neotcr产品治疗的患者移植物抗宿主病和自身免疫的风险和/或移植物抗宿主病和自身免疫的方法
[0591]
移植物抗宿主病样毒性是neotcr产品的潜在毒性，这可能是由极少数量的改造的neotcr-t细胞引起的，这些细胞可能具有双重tcr物种，即除了表达neotcrα和β链多肽外，还有内源性tcr链之一。来自内源性tcr和neotcr的多肽链的异源配对可导致意想不到的细胞靶向能力。预计这些事件的可能性非常罕见，但它们的影响将是不可预测的，因为这些t细胞没有经历胸腺选择过程，有可能触发对健康细胞的自身反应。
[0592]
如果出现自身免疫的证据，可以根据症状的严重程度，使用皮质类固醇、环孢菌素-a、霉酚酸酯、mofetil、抗tnfα抗体或抗胸腺细胞球蛋白等药物，根据临床指征对患者进行免疫抑制治疗。
[0593]
实施例16包含野生型t细胞的neotcr产品
[0594]
在某些实施方案中，neotcr产品包含neotcr细胞和野生型(wt)t细胞的组合，所述野生型(wt)t细胞未经精密改造以表达一种或多种neotcr。在这样的neotcr产品中，精密改造的neotcr细胞与wt t细胞的混合物可导致表位扩散。在某些实施方案中，neotcr细胞和wt t细胞的这种组合可导致neotcr产品的肿瘤杀伤和疗效增加。在某些实施方案中，neotcr产品包含至少5％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约5％至10％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约10％至15％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约15％至20％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约20％至25％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约25％至30％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约30％至40％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含约40％至50％的neotcr细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含大于50％的neotcr细胞。
[0595]
实施例17与遗传电路组合的neotcr产品
[0596]
在某些实施方案中，neotcr产品可以与基因电路组合。例如，基因电路可用于提供本文所述的一种或多种组合剂或化疗剂的靶向和局部表达。在某些实施方案中，基因电路可用于例如提供本文所述的一种或多种细胞因子(或其修饰物或衍生物)的靶向和局部表达。例如，基因电路可用于提供本文所述的一种或多种肽或蛋白质的靶向和局部表达。例如，基因电路可用于提供本文所述的一种或多种抗体的靶向和局部表达。在某些实施方案中，基因电路可用于例如提供本文所述的一种或多种组合剂或化疗剂的受控表达。在某些实施方案中，基因电路可用于例如提供本文所述的一种或多种细胞因子(或其修饰物或衍生物)的受控表达。在某些实施方案中，基因电路可用于例如提供本文所述的一种或多种肽或蛋白质的受控表达。例如，基因电路可用于提供本文所述的一种或多种抗体的受控表达。在某些实施方案中，基因电路可用于例如在细胞中提供多种作用机制。
[0597]
实施例18 neotcr产品概述
[0598]
neotcr产品的药理学评估表明，使用无人工启动子的离体制造工艺生产的neotcr产品在与表达同源新抗原的肿瘤细胞接触时具有有效的抗原特异性杀伤、效应细胞因子分
泌和增殖活性。此外，如大量t细胞和单细胞分泌组分析所证明的，neotcr产品已被证明对靶肿瘤细胞作出反应，具有强烈多功能效应蛋白分泌反应。预计观察到的多功能t细胞效应表型有助于在将neotcr产品输注到癌症患者中后产生临床益处的潜力，其方式类似于将改造的、多功能、自体car-t细胞重新输注到患有血液系统恶性肿瘤的患者体内所观察到的。
[0599]
neotcr产品包括t记忆干细胞(t
msc
)和中枢记忆(t
cm
)表型，它们代表了显著的t细胞表型，这些表型是在没有人工启动子的情况下使用离体制造过程实现的。t
msc
和t
cm
被认为是“更年轻的”细胞。与患者体内的改造的car-t细胞相比，这些“更年轻的”或分化程度较低的t细胞表型赋予了输注后更高的植入潜力和更长的持久性。因此，包含“更年轻的”t细胞表型的neotcr产品的施用可以通过提高植入潜力、延长输注后的持久性以及快速分化为效应t细胞以根除全身的肿瘤细胞，从而使癌症患者受益。
[0600]
还用来自癌症患者的t细胞生产的neotcr产品进行了离体作用机制研究。观察到通过t细胞杀伤活性、增殖和细胞因子产生的抗原特异性测量的可比较的基因编辑效率和功能活性，证明没有人工启动子的离体制造方法成功地用来自癌症患者的t细胞作为起始材料产生了产品。
[0601]
询问体外制造工艺中使用的cas9核糖核蛋白核酸酶的基因组切割特异性谱(没有人工启动子)至关重要。没有人工启动子的neotcr产品制造方法涉及对与向导rna序列结合的crispr-cas9核酸酶的双核糖核蛋白种类进行电穿孔，每种核酸酶都靶向基因组tcrα和基因组tcrβ基因座。将cas9核酸酶靶向每个基因组的特异性先前已在文献中描述为高度特异的。使用neotcr产品进行了全面的体外和计算机分析，以分别使用cosmid和guide-seq调查可能的脱靶基因组切割位点。通过深度测序评估了来自健康供体的多种neotcr产品和可比较的细胞产品对候选脱靶位点的切割，支持已发表的证据表明所选核酸酶具有高度特异性。结果显示，cas9脱靶活性的可能性非常低，预计不会损害施用于癌症患者的neotcr产品的安全性、耐受性或有效性。
[0602]
精密基因组遗传改造过程的其他方面已经过安全性评估。在通过靶向基因座扩增(tla)或标准fish细胞遗传学评估多个neotcr产品时，没有发现精密基因组遗传改造后基因组不稳定性的证据。没有检测到neotcr序列基因组中任何地方的脱靶整合。在细胞产品中没有发现残留cas9的证据。
[0603]
因此，在某些实施方案中，neotcr产品包含经改造以表达一种或多种在基因组上稳定的neotcr的t细胞。在某些实施方案中，neotcr产品包含经改造以表达一种或多种neotcr的t细胞，其没有脱靶整合到neotcr序列的基因组中。在某些实施方案中，neotcr产品不包含残留的cas9。在某些实施方案中，neotcr产品包含经改造以表达一种或多种neotcr的t细胞，其没有脱靶整合到neotcr序列的基因组中并且没有残留的cas9。在某些实施方案中，neotcr产品包含经改造以表达一种或多种neotcr的t细胞，其没有脱靶整合到neotcr序列的基因组中并且没有残留的cas9，并且其中neotcr产品中的neotcr细胞在基因组上是稳定的。
[0604]
使用本文所述的任何方法和/或组合物，neotcr产品的施用可以根除为其设计和制造的neotcr产品的患者体内的肿瘤细胞，从而为癌症患者提供有意义的临床益处。此外，与目前可用的细胞疗法不同，neotcr产品可以根除为其设计和制造的neotcr产品的患者体内的肿瘤细胞，从而为实体瘤患者提供有意义的临床益处。
[0605]
实施例19 neotcr产品中两种或多种neotcr的协同作用。
[0606]
本实施例说明了使用neotcr产品治疗癌症的疗效。
[0607]
如本文所述，neotcr产品的设计是通过鉴定患者的neotcr并改造同一患者自身的t细胞来表达neotcr以治疗癌症。图4a和4b显示了如pct/us2020/17887中所述执行的impact分离技术分析，该文件在此整体纳入。impact分离技术用于从患者收集的黑素瘤肿瘤细胞中鉴定neotcr，如图3所示。如图4a和4b所示，已鉴定出多种neotcr，它们对同一基因上的不同新表位具有特异性。具体而言，鉴定出9种不同的neotcr对nat10基因具有特异性，2种不同的neotcr被鉴定出对prpsap2基因具有特异性，4种不同的neotcr被鉴定出对atp11a基因具有特异性，5种不同的neotcr被鉴定出对hp1bp3基因具有特异性(图4a)。还有一种neotcr被鉴定出对uvssa基因具有特异性(图4a)。
[0608]
基于对不同neotcr的鉴定，neotcr产品的制造如图5所述。如图所示，neotcr细胞与自体肿瘤细胞系以10∶1的产品与靶标比(p∶t)共培养。neotcr细胞作为单个neotcr产品或作为3 neotcr产品进行测试，3 neotcr产品由1/3的3种neotcr中的每一种组成。组合测试的neotcr靶向不同的新表位和/或hla(参见例如图6a、6b、7a-7d、8a-8e、11a和11b)。将自体肿瘤细胞转导以表达红色荧光蛋白，然后在incucyte系统中随时间测量红色汇合度(confluency)。红色荧光蛋白阳性细胞百分比的降低被用来衡量neotcr产品的细胞毒活性。本实验的阴性对照是：(1)仅用培养基的肿瘤细胞；(2)与来自不同患者的肿瘤细胞系共培养的neotcr细胞(即与表达非同源抗原的细胞培养的neotcr细胞)；(3)不相关的neotcr(neo12)与自体肿瘤细胞系(即neotcr细胞与表达非同源抗原的细胞一起培养)的共培养物。本实验的目的是确定是否包含多于一种的neotcr细胞群的neotcr产品具有协同作用，其中不同群体对相同基因表达不同的neotcr，对不同基因表达不同的neotcr，并且neotcr对不同的hla是特异的。
[0609]
首先，测试了包含单个neotcr细胞群(即neotcr产品仅包含单种neotcr)的不同neotcr产品的杀伤能力。如图6a所示，包含单个neotcr细胞群的neotcr产品具有不同的控制肿瘤细胞生长的能力。然而，令人惊讶的是，包含三个neotcr细胞群的neotcr产品(即，neotcr产品包含三个不同的neotcr细胞群，每个群表达不同的neotcr)不仅具有增强的控制肿瘤细胞生长的能力，而且实际上三个不同的neotcr细胞群共同作用以引发协同作用以控制肿瘤细胞的生长(图6b；在该图中看到的唯一细胞生长是肿瘤细胞在仅存在培养基而没有neotcr产品下的生长)。
[0610]
为了证明三个neotcr细胞群的组合(即，neotcr产品包含三个不同的neotcr细胞群，每个群表达不同的neotcr)比两个neotcr细胞群具有更高的功效，对neotcr408、409和429的每个组合进行了实验(图7a-7d)。图7a示出了每个单种neotcr产品与三种neotcr产品的比较。图7b-7d示出了单种neotcr产品与两种neotcr产品的比较。如图所示，虽然这两种neotcr产品能够控制肿瘤细胞的生长，但控制是有限的，并且随着时间的推移会发生一些细胞生长。相比之下，图7a中示出(sown)的三种neotcr产品表现出对肿瘤生长的显著更多的控制。
[0611]
对图6b中所示的三种neotcr产品中的每一种都进行了与图7a-7d中所述的相同的实验。该实验的另一个实施例如图8a-8d所示，具有neotcr 409、429和421。
[0612]
此外，测试图6b中所示的三种neotcr产品中的每一种的另一个原因是探索三种
neotcr产品中每种neotcr的特异性的相关性。neotcr408、409和429的组合(图7a-7d)由对nat10基因和hla-a01：01特异的两种neotcr和对uvssa基因和hla-b57：01特异的一种neotcr组成(图8e)。neotcr 409、429和421的组合(图8a-8d)由对nat10基因和hla-a01：01特异的一种neotcr、对uvssa基因和hla-b57：01特异的一种neotcr和对prpsap2基因和hla-c03：04特异的一种neotcr组成(图8e)。正如所证明的，neotcr产品控制肿瘤细胞生长的能力不依赖于基因和hla的多样性。相反，它表明正是新表位的多样性产生了用三种neotcr产品控制肿瘤细胞生长的协同作用。
[0613]
为了排除hla表达水平是neotcr产品能够控制肿瘤细胞生长的唯一原因，在m490肿瘤细胞(从中鉴定和分离neotcr的肿瘤细胞系)中测量了hla表达(图9a)。由于m490肿瘤细胞中hla类别之间存在不同的表达水平，因此用ifnγ预处理细胞24小时以确定是否有可能增加hla类别的表达(图9b)。如图9c所示，用ifnγ预处理不仅导致hla上调，而且还导致m490细胞上的新抗原呈递上调。为了确认增加的表达不限于m490细胞，还使用了m486细胞并观察到类似的上调(图9c)。
[0614]
观察到ifnγ似乎减缓了m490细胞的生长。为了更好地了解ifnγ是杀死细胞还是仅仅具有细胞抑制作用，在用ifnγ预处理后测量细胞汇合度(图10a)，同时测量细胞成活力(图10b)。正如所证明的，ifnγ预处理仅对m490细胞具有细胞抑制作用，并且不影响细胞成活力。
[0615]
因为已证明ifnγ预处理增加hla和新抗原呈递而不影响细胞成活力，所以设计实验以确定上调m490细胞上的hla和新抗原表达是否可以增加neotcr产品控制肿瘤细胞生长的能力。如图11a和11b所示，增加肿瘤细胞上的hla和新抗原表达能够增加一种neotcr产品控制肿瘤细胞生长的能力。该数据引出了一个问题，即在不添加ifnγ的情况下，两种和三种neotcr产品如何能够更好地控制肿瘤细胞生长。
[0616]
为了探索这个问题，通过将这些结果与肽脉冲实验进行比较来确认ifnγ预处理结果。图12描述了肽脉冲实验。如图所示，在存在或不存在ifnγ预处理的情况下，用新肽脉冲表达单种neotcr的neotcr产品以增加肿瘤细胞呈递的新抗原的量。显示了neotcr 409(图13a)和neotcr 422(图13b)的这些实验的结果，它们都是针对nat10基因的。随着不同量的nat10肽脉冲进入neotcr细胞以增加nat10新表位的表达，单种neotcr产品能够增加其在有和没有ifnγ预处理的情况下控制肿瘤细胞生长的能力。下表7中提供了neotcr的描述。
[0617]
表7：neotcr 409和neotcr 422
[0618][0619]
值得注意的是，hla-a是在m490肿瘤细胞上具有最高表达的hla，如图9a所示。因
此，预计对hla-a特异性的neotcr在m490肿瘤细胞中优于hla-b和hla-c。因此，对hla-b限制性的neotcr产品进行了上述相同的实验。如图14a-14c所示，与图13a和13b所示的hla-a限制性的neotcr产品相比，ifnγ预处理对hla-b限制性的neotcr产品具有更大的影响。图14a＝表达neotcr 418的neotcr产品；图14b＝表达neotcr 433的neotcr产品；图14c＝表达neotcr 423的neotcr产品。下表8中提供了neotcr的描述。
[0620]
表8：neotcr 418、neotcr 433和neotcr 423
[0621][0622]
为了理解为什么在neotcr产品中两种或多种neotcr的表达会引起与肽脉冲和ifnγ预处理相同的效果，设计了引发实验(图15)。引发实验由在第一neotcr产品(表达单种neotcr)的存在下培养m490肿瘤细胞20小时，然后去除第一neotcr产品并用普通培养基或培养基加第二neotcr产品替换它(表达单种neotcr)组成的。要回答的问题是，用一种neotcr引发的肿瘤细胞是否会诱导凋亡信号，这将使它们更容易被neotcr产品随后杀死。在图16所示的实验中，肿瘤细胞用表达neotcr 422或neotcr 421的neotcr产品引发20小时。在20小时后，将引发的neotcr产品移除并替换为普通培养基或表达其他neotcr的neotcr产品(例如，如果neotcr 422用于引发，则neotcr 421用作引发后的替代产品)。如图所示，在这两种情况下，引发导致更好的细胞杀伤和增加对m490肿瘤细胞生长的控制。下表9中提供了neotcr的描述。
[0623]
表9：neotcr 418、neotcr 433和neotcr 423
[0624][0625]
进行了类似的实验，数据如图17a(neotcr 422作为引发剂(primer)，neotcr 429在neotcr产品中用于治疗)和17b(neotcr 421作为引发剂和neotcr 429在neotcr产品中用于治疗)中所示。下表10中提供了本实验中使用的neotcr的描述。
[0626]
表10：neotcr 422、neotcr 429和neotcr 421
[0627][0628]
最后，为了确定neotcr产品中三种不同neotcr的组合是否产生协同作用，使用来自图17a和17b所示实验的neotcr进行组合研究(图17a-18d)。图17a显示了单种neotcr产品与三种neotcr产品在控制肿瘤细胞生长的能力方面的比较。图18b-18d显示了neotcr产品中三种neotcr中的两种的组合控制肿瘤细胞生长的能力。如图所示，在单种neotcr产品中两种或多种neotcr的组合引起了引发实验的相同结果，证明neotcr能够协同工作以增加neotcr产品控制肿瘤细胞生长的疗效。
[0629]
实施例20 neotcr产品的示例性生成。
[0630]
本文所述的neotcr产品可根据本实施例中所述的方法制造。
[0631]
通过pct/us2020/17887(其全文通过引用纳入本文)中描述的impact分离技术鉴定的新表位特异性tcr用于产生同源重组(hr)dna模板。这些hr模板与位点特异性核酸酶串联一起转染到原代人t细胞中。单步非病毒精密基因组遗传改造导致内源性tcr无缝替换为患者的新表位特异性tcr，由内源性启动子表达。在表面表达的tcr在序列上完全是天然的。
[0632]
neotcr-t细胞基因组改造的精密度通过靶向基因座扩增(tla)对脱靶整合热点或易位评估，并通过基于基于下一代测序的脱靶切割测定进行评估，但发现缺乏意外结果的证据。
[0633]
将含有目标基因的构建体插入内源基因座。这是通过使用同源修复模板来完成的，该模板包含侧翼为左右hr臂的目标基因的编码序列。除了hr臂之外，目标基因还夹在2a肽、从上游翻译的目标基因中去除2a肽的2a肽上游的蛋白酶切割位点，和信号序列之间。一旦整合到基因组中，目标表达基因盒的基因就被转录为单信使rna。在该目标基因在信使rna中的翻译过程中，侧翼区域通过自切割2a肽与目标基因断开连接，蛋白酶切割位点被切割以去除目标翻译基因上游的2a肽。除了2a肽和蛋白酶切割位点之外，还在每个2a肽之前插入了gly-ser-gly(gsg)接头，以进一步增强目标基因与表达盒中其他元件的分离。
[0634]
已确定p2a肽因其高效切割而优于其他用于细胞产品的2a肽。因此，使用两(2)个p2a肽和密码子散度来表达目标基因，而不从p2a肽在目标基因的任一端的剩余氨基酸引入任何外源表位。基因编辑的细胞没有外源性表位(即在目标基因的两侧没有侧翼的p2a肽氨基酸)的好处是免疫原性显著降低，并且输注含有该基因编辑细胞的细胞产品的患者对基因编辑细胞产生免疫反应的可能性较小。
[0635]
如pct/us/2018/058230所述，neotcr被整合到t细胞的tcrα基因座中。具体而言，使用了同源修复模板，该模板包含侧翼为左右hr臂的neotcr编码序列。此外，内源性tcrβ基因座被破坏，导致仅由neotcr构建体编码的tcr序列表达。大体策略使用环状hr模板以及线性模板进行应用。
[0636]
一旦整合到基因组中，neotcr表达基因盒就被转录为来自内源性tcrα启动子的单个信使rna，其中仍包括来自该个体t细胞的内源性tcrα多肽的一部分。在此单个neotcr信使rna的核糖体多肽翻译过程中，neotcr序列通过p2a肽处的自切割与内源性、crispr破坏的tcrα多肽断开连接。编码的neotcra和neotcrβ多肽也通过内源性细胞人弗林蛋白酶和neotcr表达基因盒中包含的第二自切割p2a序列基序的切割而彼此断开连接。neotcrα和neotcrβ多肽分别被信号前导序列(源自人类生长激素，hgh)靶向内质网，用于多聚体组装并将neotcr蛋白复合体运输到t细胞表面。包含弗林蛋白酶切割位点有助于从上游tcrβ链中去除2a序列，以减少对tcrβ功能的潜在干扰。在每个2a之前包含gly-ser-gly接头进一步增强了三种多肽的分离。
[0637]
此外，三个重复的蛋白质序列在hr模板内进行密码子分散以促进基因组稳定性。tcr基因盒内的两个p2a相对于彼此密码子分散以及两个hgh信号序列相对于彼此密码子分散，以促进引入的neotcr盒序列在离体改造的t细胞基因组内的稳定性。同样，重新引入的trac外显子1的5
′
末端通过去除两个直接重复的间插序列，降低了整个盒随时间丢失的可能性。
[0638]
in-out pcr用于确认neoe tcr盒的精密靶整合。琼脂糖凝胶显示使用特异于整合盒的引物进行pcr的结果，位点仅针对用核酸酶和dna模板(koki和kokiko)处理的细胞产生预期大小的产物，证明位点特异性和精密整合。
[0639]
此外，靶向基因座扩增(tla)用于确认靶向整合的特异性。交联、连接和使用对neotcr插入物特异的引物来获得整合位点周围的序列。定位到基因组的读数以10kb的间隔进行分箱(bin)。仅在预期位点(即14号染色体上的整合位点)周围获得了显著的读取深度，没有证据表明存在常见的脱靶插入位点。
[0640]
内源性tcr的抗体染色和neotcr的肽-hla染色表明，该改造导致neotcr的高频敲入，剩余一些tcr-细胞和少量wt t细胞。在没有外源启动子的情况下，neotcr表达证明了敲入。使用相同的neotcr多次进行改造，结果相似。因此，在改造的t细胞中实现了neotcr的高效一致表达以及内源性tcr的敲除。
[0641]
***
[0642]
虽然本发明已经针对几个所描述的实施方案以某种长度和一些特殊性进行了描述，但并不意在将其限制于任何这样的细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应通过参考所附权利要求来解释，以便根据现有技术提供对这些权利要求的最广泛可能的解释，并因此有效地涵盖本发明的预期范围。
[0643]
在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献均通过引用全部纳入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。此外，章节标题、材料、方法和实施例仅是说明性的而不是限制性的。
再多了解一些
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