使用新型囊袋设计的不含洗涤剂的同时多组学样品制备方法与流程

使用新型囊袋设计的不含洗涤剂的同时多组学样品制备方法
1.相关申请
2.本技术要求2019年8月30日提交的美国临时申请序列号62/894,201的优先权。前述申请的全部内容以引用的方式并入本文。
技术领域
3.本技术涉及用于制备含有蛋白质和/或小分子和/或dna/rna的样品的方法和装置。


背景技术：

4.组学技术和技巧的组合越来越受欢迎，并且促进了我们对生物系统和人类病理学的理解。然而，跨组学平台整合分析带来了新的技术挑战。平行样品处理是一种潜在的解决方案，其中样品被分开并且部分针对不同的分子类别(例如蛋白质和代谢物)进行处理。然而，当样品量有限时，如临床材料经常出现的情况，或存在异质性时，例如在不同的组织切片中，对若干分子类别使用同时提取方法是必不可少的，然而，此类方法一直缺乏。仅仅可用的方法是基于相分离，例如氯仿-甲醇提取，并且受到它们的复杂性和费力的限制。它们对于小样品量或高通量分析的实施都不实用。
5.在化学、生物化学以及临床和研究环境中，通常需要对样品进行处理，例如包括但不限于化学或酶促反应，或者沉淀或凝结的步骤，然后再对所述样品进行后续步骤，这些步骤可以包括过滤、捕获、澄清、色谱或多个其他过程，所有这些过程都需要样品流过某种类型的基质，所述基质适用于所关注的过程，诸如但不限于过滤、捕获、澄清、富集或色谱。同时捕获(simultaneous trapping,sitrap)至少有助于直接测量同一样品提取物中的蛋白质组和代谢物组。sitrap代表一种在深度过滤器上进行样品制备和分离从而将生物分成两类或许多类生物部分的方法和系统。sitrap可以不含洗涤剂，并且可扩展到核酸聚合物(dna和rna)以及脂质、聚糖和其他分子类别。一种新型囊袋可实现最大sitrap功能并且提高处理速度和便利性。
6.每个处理步骤通常需要时间，即温育，并且这些步骤通常是连续的，诸如沉淀或消耗或酶促或化学反应，然后是某种类型的色谱或富集或亲和或酶促处理。此类处理最通常通过以下步骤来实现：在一个管或囊袋或容器中进行反应，将该反应的内容物(可能包括任何沉淀剂或固体材料(或者不包括沉淀剂或固体材料，依赖性))转移至某种基质中，诸如但不限于过滤器或多孔材料或者多种形式的色谱柱(管状柱式、吸头式、片式、膜式、离心柱或过滤器、重力流柱、固相提取[spe]柱等)，然后所述内容物流入第二管或囊袋或容器中。需要注意的是，根据现有系统的需要，这些基质可以是连续的，例如，可以在色谱管状柱之前放置过滤器以防止堵塞。
[0007]
在基质上或通过基质进行处理之后，(1)穿过基质的流过物、(2)未进入基质的滞留物、或者(3)结合在基质上或结合至基质或结合在基质内的材料的某种组合被用于进一步研究或分析；一种或多种所期望的和不期望的级分完全随现有的处理而变化。
[0008]
在样品的任何部分通过基质后，将基质和/或滞留物通常诸如通过洗涤、化学或酶促处理、亲和、洗脱等进一步处理。根据工作流程，需要时间进行的处理，即一次或多次温育，可以施加至基质或滞留物，或它们二者。这种温育可以在低于或高于环境温度的温度下进行。根据现有的任务，这种温育还可以涉及以光或微波或无线电波或超声能的形式引入电磁辐射。
[0009]
因为处理步骤(包括但不限于化学或酶促反应或者沉淀或其他引起相变的反应)需要温育时间，所以必须以某种方式堵塞或阻塞基质的输出侧，以防止液体流过基质，从而可以为发生在基质之上或之中或顶部的过程提供必要量的时间。在上述实例中，如果蛋白酶k溶液将滴过，则它不会作用于组织；如果hrp溶液将流过，则不会发生elisa反应；并且如果生物素洗脱溶液将流过，则不会发生洗脱。类似地，如果含有盐或其他溶解部分的溶液流过，则不会发生所期望的浓度降低，以及对于生物聚合物，如果需要温育来实现相变，则生物聚合物将通过基质进入样品，这被认为应该是清除生物聚合物，以防止以后造成堵塞。在可能的第二次(或多于第二次)温育中，如果所列出的酶流过，则它们将不会处理基质顶部或之中或之内或之上的任何生物分子，从而导致失败。因此，在这种处理中，堵塞基质的输出侧是必需的，以为处理提供足够的时间。
[0010]
这种堵塞或阻止流过基质的要求会导致多个负面问题。首先，堵塞不仅会带来麻烦，而且还会增加大量另外的实验时间，尤其是在处理大量样品时。基质与堵塞的使用通常按以下顺序进行：1)将样品施加于基质，可能在离心柱中(但其他形式当然也是可能的)；2)使流过物在基质的输入侧以正压或在输出侧以负压通过基质或者离心；3)提起含有基质的离心柱；4)堵塞柱或其他容纳基质的囊袋；5)关闭前一个容纳流过物的容器；6)将目前堵塞的柱放置于新管或容器中；7)打开离心柱，以便可以添加其他处理溶液，可能是(但不限于)酶溶液，所述酶溶液作用于基质之上和之中和顶部的材料；8)再次盖上柱；9)将柱与基质在必要的温度下温育必要的时间；10)从新管中取出离心柱；11)取下新管正上方的塞子，可能要非常小心；12)将离心柱放回新管或容器中；13)施加正压或负压或离心力以除去基质中的内容物和离心柱所容纳的任何内容物；14)可能地从基质中洗脱或洗涤基质，这取决于系统的需要和基质的性质；以及15)重复此过程，如果要进行另外的温育，则每次使用新管，例如首先回收核酸，然后用糖苷酶进行酶促处理，然后用还原和烷基化试剂进行化学处理，以及许多其他可能的处理(例如柠康酸酐或羟胺或nhs或异硫氰酸酯或很多其他化学物质和化学处理)，然后将这些试剂洗掉，其后用蛋白酶处理结合在基质之中和之上和之内和顶部的蛋白质。不用说，对于大量样品，这变得非常棘手。
[0011]
塞子除了繁琐性之外，它们还可能泄漏、丢失样品并导致失败。事实上，由于基质及其囊袋位于管内，因此无法直接看到，因此在处理或实验完成之前通常不会检测到泄漏的存在。塞子也可能在移除过程中脱落，也会因为无法从基质回收样品而丢失样品。
[0012]
堵塞会引入另外的实验误差，因为堵塞的时间可以是可变的并且会影响结果：一些样品可能会滴落更多，或者样品可能具有更长或更短的温育时间，具体取决于它们何时堵塞和去除堵塞。实际上，由于该过程的性质，在一个系列中要堵塞的第一个样品将被堵塞比最后一个接受堵塞的样品更长的时间，从而使样品经受另外的和不期望的实验变化。
[0013]
当需要捕获所有流入或流出或流近或流过基质的材料时，堵塞也会引起问题。实际上，特别是对于小体积，塞子本身可以保留大量希望通过工作获得的材料。如果塞子是母
塞并且盖住喷嘴或导流器或连接器或鲁尔锁的末端，情况尤其如此：移除塞子的动作会产生真空，用材料填充塞子，这取决于过程，可能是所期望的和昂贵的。在这种情况下，如果可能的话，必须将样品吸回到基质顶部的囊袋中。如果塞子是公塞，也会发生这种样品损失：当塞子插入基质后流动侧上的连接内部时，移除塞子的动作会产生相同的吸力，从而导致样品流出并可能丢失。为了解决这种情况，可以在从基质上脱落的连接器下方放置一个捕获管，小心地取下塞子并尝试捕获任何滴出的样品。总之，堵塞是一个需要大量时间的容易出错的过程。最后，塞子的使用需要对容纳基质的囊袋进行大量手动操作。这种操作很难转化为自动化。
[0014]
因此，需要一种设备、方法和过程，其：为一种或多种基质提供支撑，所述基质可以连续使用或堆叠；在基质之前提供可以添加样品的空间，在基质之后提供可以容纳已经通过基质的样品部分的空间；以最少的操作并且重要的是在不松动塞子的情况下，轻松地启动和停止流过基质的流过物；允许轻松地使用多个顺序处理，包括基质上或基质中的处理；允许轻松地引入热或电磁辐射，如光或声能，诸如超声处理；限制由于滴漏或缺乏密封而导致处理失败的可能性。


技术实现要素：

[0015]
在一个方面，本技术提供了一种制备包含所关注的分子的一个或多个级分的样品的方法，所述方法包括：将所述样品暴露于提取溶剂，其中所述提取溶剂可以是大致中性、或碱性或酸性的，并且其中所述提取溶剂可以不含洗涤剂或包含洗涤剂或是表面活性剂；将所述样品与所述提取溶剂组合暴露于物理破坏，诸如珠击、声处理或超声处理。优选地但非强制地，使用声处理和超声处理；在用碱性提取溶剂来提取样品的情况下，用酸中和所述碱性提取溶剂，以使ph值接近中性。
[0016]
在某些实施方案中，在用酸性提取溶剂来提取样品的情况下，用碱中和所述酸性提取溶剂，以使ph接近中性；将所述样品与所述提取溶剂组合暴露于分子凝结剂，所述分子凝结剂有助于尤其是较大的分子结合于基质上，优选地多孔基质，或者可以操纵和/或保留的小颗粒的集合，其中所述凝结剂可以由单相或多相溶液组成；在(大)分子凝结步骤期间，使所述样品与所述大分子凝结剂组合接触适用于在存在所述凝结剂的情况下捕获所述大分子的基质，并且最优选地防止凝结的大分子过度聚集的基质，以使得流过所述基质的流过物不受阻碍；将较小的未凝结和未结合的分子收集至可移除的囊袋中，其中所收集的较小的未凝结的分子的类别取决于大分子凝结剂的选择和使用；通常，虽然不是强制性的，洗涤所述基质和捕获的大分子以清洁它们；如果所述提取溶剂含有表面活性剂或洗涤剂，则这种步骤不是任选的，并且这种步骤通常总是在如还原和烷基化的化学操纵之后进行；最优选地，将不同类别的凝结的捕获分子从捕获基质洗脱到可移除的囊袋中，其中提取溶剂被选择为匹配所述捕获分子的溶解度。
[0017]
在某些实施方案中，核酸和多核酸，诸如dna和rna，或者游离的聚糖以及其他类型的分子是水溶性的，并且可以通过使水性缓冲液流过所述捕获基质进入新的可移除的囊袋来洗脱。类似地，一些脂质和一些疏水肽可溶于有机溶剂，如醇，这仅作为说明性实例。任选地，在该步骤期间，物理和/或热能可以诸如通过振荡或声处理或超声处理或加热或微波或本领域的技术人员显而易见的其他技术来添加。需要明确指出的是，洗脱可以使用不同的
洗脱溶剂连续进行。例如，捕获的dna和rna可以用水性缓冲液洗脱，然后捕获的脂质可以用有机提取溶剂洗脱，所述有机提取溶剂的选择取决于所关注的分子类别的溶解度性质；最优选地，在所述捕获基质上的捕获的凝结大分子类别的上述洗脱之前或之后，用酶或化学物质，诸如核酸酶、蛋白酶、糖苷酶、脂肪酶或蛋白质的溴化氰切割，以及改变凝结的大分子的状态以促进另外的下游处理的其他酶和化学物质来处理捕获的分子。
[0018]
在某些实施方案中，特定类别的分子可以从较大的分子释放和/或处理为通常具有不同溶解度性质的较小的分子。这种步骤可以在洗脱步骤之前或之后进行，并且对于本领域的技术人员显而易见的是，在样品处理中存在很大的灵活性，可以产生类似的结果。
[0019]
在本技术的实施方案中，可以分馏和/或制备的分子的示例性类别包括氨基酸、核苷、核苷酸、寡核苷酸、核酸、糖、碳水化合物、寡糖、多糖、脂肪酸、脂质、激素、代谢物、杂环芳族化合物、致癌物、诱变剂、暴露组的化合物诸如增塑剂、杀虫剂、脱模剂和/或阻燃剂等等、肽、代谢物、辅因子、抑制剂、药物、剂、营养物、维生素、多肽、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、抗体、生长因子、细胞因子、趋化因子、受体、神经递质、抗原、朊病毒、过敏原、抗体、底物、生物有害物质、传染性物质包括病毒、原生动物、细菌和真菌以及废物。
[0020]
在某些实施方案中，样品可以首先捕获在所述基质上，然后任选地用核酸酶处理以形成更小的dna和rna分子，它们可以通过添加水性缓冲液来洗脱和分馏，然后可以用单独或组合的有机溶剂诸如乙醇、己烷、甲醇、醚或氯仿来提取捕获的脂质，然后捕获的蛋白质可以在基质基质之中或之上处理，例如通过糖苷酶处理，并且释放的糖苷酶可以用另一种水性洗脱液来洗脱，然后所述蛋白质可以在捕获基质内原位还原和烷基化，随后它们可以用蛋白酶诸如胰蛋白酶处理，或者通过化学手段诸如溴化氰或酸性降解或者由强声力剪切处理，并且从捕获的蛋白质获得的肽可以在单独的级分中捕获。
[0021]
在某些实施方案中，在第一流过物级分、脂质级分、核酸级分、聚糖级分和肽级分中获得小分子诸如代谢物，所有这些都易于通过质谱或其他检测技术进行分析。此类酶促或化学反应或洗脱可以通过添加物理和/或热能来加速，可以诸如通过振荡或声处理或超声处理或加热或微波或本领域的技术人员显而易见的其他技术来添加。
[0022]
在某些实施方案中，阱可以允许分子或分子片段适当地通过一种或多种次要基质，其中所述一种或多种基质可以提供各种类别或子类的分子的色谱分离或富集。
[0023]
在某些方面，本技术是一种用于制备样品的方法、系统和装置，所述样品含有多种类别的生物分子，诸如(但不限于)dna、rna、蛋白质、聚糖、小分子、脂质和其他代谢物以及无需用表面活性剂增溶即可用于质谱分析例如lc-ms/ms的小分子。
[0024]
在某些方面，本技术是一种用于制备样品的方法、系统和装置，所述样品含有用于多组学分析的多种分子类别。迄今为止，此类尝试通常涉及细胞裂解和蛋白质提取，并且未能从一个样品产生多种分子类别。一种合适的裂解介质包括30mm乙酸铵。另一种合适的裂解介质是1.8％氢氧化铵。另一种是1m hcl。
[0025]
在某些实施方案中，所述方法包括在捕获基质上使蛋白质的二硫键原位还原和同时烷基化的步骤。这通过在60mm三乙基碳酸氢铵(teab)、10mm三(2-羧乙基)膦(tcep)、25mm氯乙酰胺(caa)中在80℃下加热所述样品来实现。可以使用其他合适的试剂。此类试剂的使用防止了半胱氨酸残基之间的二硫键的形成，尤其是不同肽的二硫键的形成。
[0026]
在某些实施方案中，进行离心以根据需要驱动各种介质、试剂、缓冲液等等通过所
述基质(多种基质)。
[0027]
在某些实施方案中，泵等可以用于移动各种介质、试剂、缓冲液等等通过本技术的所述基质(多种基质)。
[0028]
在某些方面，本技术提供一种用于在液体介质中提取的分子的样品制备装置，所述装置包括具有入口和出口的器皿、设置在所述入口和所述出口之间的基质，所述基质适用于随着从所述入口至所述出口的流动捕获和保留来自介质的所关注的分子的颗粒。
[0029]
在某些实施方案中，所述基质由深度过滤器材料形成。
[0030]
在某些实施方案中，所述基质延伸穿过所述器皿的整个腔，以使得从所述入口至所述出口的任何流动都必须通过所述基质的至少一部分。
[0031]
在一个方面，本技术提供了一种新的多部分囊袋，它可以加速完整蛋白质的消化或增溶，最大限度地减少转移步骤的数量，并且提供快速使用。这种新的囊袋首先提供了进行本文所述的流过的能力。它还提供了将内小瓶密封在外小瓶内的能力，并且声能和热可以从外部传递到内部。它还规定通过所述基质的流动最优选地是均匀的和单向的。所述内小瓶可以密封在所述外小瓶上，从而可以将溶液添加至所述内小瓶中，所述溶液可以作用于所述基质，并且此类溶液可以通过毛细管作用以及离心渗透到所述基质中。然后可以将所述内小瓶提起，以使得内小瓶和外小瓶之间存在空间，从而可以将最初添加的溶液离心到所述外小瓶中。然后，所述外小瓶成为容纳将被分析的组学样品的容器。
[0032]
在本技术的一个方面，提供了一种用于溶液和/或固体的连续通过基质处理的两件式组装件，所述组装件具有维持和容纳所述基质的内小瓶和被构造为在上部或下部停放位置接收所述内小瓶的外小瓶，以分别允许或阻止所述溶液通过上部小瓶的所述基质。所述外小瓶可逆地密封所述内小瓶的能力避免了对塞子的需要，并且消除了样品在所述塞子上的损失。所述内小瓶具有内室，所述内室接收可以含有固体和液体的样品，并且通过处理固体可以由液体形成。所述外小瓶具有内室，所述内室可以交替地在下部停放位置密封所述内小瓶，或者接收从所述内小瓶通过所述基质流入处于上部停放位置的所述外小瓶的接收空间的样品。所述内小瓶和所述外小瓶的顶部都有开口，并且都被提供了帽或盖，以保护所述样品并且密封样品空间。内小瓶盖另外具有排气口，以允许气体在加热的情况下逸出，并且所述内小瓶底部具有开口，以允许流过它所支撑的所述基质。在一个优选的实施方案中，所述内小瓶和所述外小瓶是基本上圆柱体。所述内小瓶和所述外小瓶具有锁定或停放或支撑系统，以使得所述内小瓶可以被支撑在下部或上部停放位置。在一个优选的实施方案中，所述支撑系统由脊和u形止动件组成；本领域的技术人员将认识到很多其他实施方案是可能的，只要能够保持上部和下部位置即可。所述内小瓶在其下部支撑所述基质。
[0033]
在某些实施方案中，在上部停放位置，所述外小瓶被构造为接收放置在上部小瓶的样品容纳空间中的样品，当上部小瓶处于上部停放位置时，所述样品从上部小瓶流过由所述内小瓶支撑的所述基质，通过在下部小瓶的底部的开口。
[0034]
在某些实施方案中，在下部停放位置，所述外小瓶被构造为密封所述内小瓶并且阻止通过所述基质的流过物，以允许温育所述内小瓶的内容物，同时还减少所述内小瓶中的溶液的死体积。在下部停放位置，可以使所述内小瓶和所述外小瓶离心，以排出所述基质中的任何空气，并且使溶液充分接触所述基质，诸如不限于含有酶或化学物质的溶液，以允许它们作用于保持在所述基质之内或顶部的材料和分子。
[0035]
在本技术的一个方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括所述内小瓶和所述外小瓶，所述内小瓶装有基质以满足所需样品处理的需要，以及任选地实施所述试剂盒的步骤的任何试剂或溶液或材料。
[0036]
在本技术的一个方面，提供了一种样品处理方法，所述方法包括使具有可以是所关注的溶剂、可溶性污染物和不溶性固体组分的溶液通过本技术的基质，以使得不具有对所述基质的亲和力的可溶性材料通过所述外小瓶，结合至所述基质的材料得以保留，并且任何不溶性材料保留在所述基质之中或之上。
[0037]
在本技术的一个方面，提供了一种样品处理方法，所述方法包括使样品的一些所期望的组分增溶，所述组分诸如生物分子，包括代谢物、脂质、蛋白质、核酸、聚糖和蛋白质；捕获或捕集或分离所关注的分子的一些级分，诸如生物聚合物，通常且不仅通过添加凝结剂，包括温和沉淀剂，诸如但不限于多种有机溶剂，可能通过诱导所述分子的相变或凝结或结合，以及在引起保留所关注的分子所有情况下，然后所述分子可以被捕集在所述基质之中或之上或顶部或之内，或者通过提供给所述基质的对所关注的分子的亲和力。在分离出未被所述基质捕集或保留的样品级分后，可以对保留的分子进行广泛的处理，包括化学和/或酶促和/或色谱处理，这些处理导致保留材料的所期望的组分的释放，然后所述组分可以被洗脱。样品可以通过所述基质的输入侧的正压或输出侧的负压或离心来驱动通过所述基质。
附图说明
[0038]
图1显示了从非离子洗涤剂裂解物中捕获和消化的蛋白质。图1a纤维素深度过滤器吸头中的蛋白质捕获。3％辛基葡萄糖苷(og)和3％泊洛沙姆407(p407)裂解物在30mm乙酸铵中通过冰上声处理从mda-mb-231细胞制备。将裂解物立即装载到吸头中或用等体积的30mm乙酸铵中的甲醇稀释(最终甲醇浓度
–
50％)。将捕获的蛋白质用2x laemmli缓冲液洗脱。图1b用3％辛基葡萄糖苷制备的mda-mb-231细胞裂解物的sitrap型内吸头(in-tip)消化。捕获吸头由石英或纤维素材料制成。根据sitrap方案进行消化。将消化产物用2x laemmli缓冲液洗脱。在nupage 4-12％bis-tris蛋白质凝胶上分析样品。使用活化的清洗液雾使生物化学试剂变性的一般方法的方框流程图。
[0039]
图2显示将mda mb 231细胞使用30mm乙酸铵(aa)、1.8％氢氧化铵(ah)或30mm乙酸铵(sds)中的3％sds通过冰上探针声处理来裂解。将裂解物以11,000xg离心2min以除去碎片。对于aa和sds裂解物，将4倍体积的30mm乙酸盐中的甲醇添加到样品中；对于ah裂解物，将等体积的1m乙酸添加到样品中，然后添加2体积的甲醇。然后将蛋白质捕获在纤维素深度过滤器中，然后用2xlaemmli缓冲液洗脱，然后在nupage 4-12％bis-tris蛋白质凝胶上运行。
[0040]
图3显示了细胞材料的sitrap处理。图3a基本方案。在过量的30mm乙酸铵(aa)或1.8％氢氧化铵(ah)的情况下，对细胞沉淀进行声处理或者以其他方式物理破坏和/或加热。对于aa提取，将30mm aa中的四倍体积的甲醇添加到裂解物中。对于ah提取，将等体积的1m乙酸添加到裂解物中，然后添加两倍体积的甲醇。将所得混合物加载到sitrap单元中(1)，蛋白质被捕获在深度过滤器阱中，并收集流过物(2、3)。在用50％甲醇洗涤后，通过在80℃下在60mm三乙基碳酸氢铵(teab)、10mm三(2-羧乙基)膦(tcep)、25mm氯乙酰胺(caa)溶
液中加热来使蛋白质原位变性、还原和烷基化(4)。在洗涤(5)后，将酶引入捕获的蛋白质(6)。在消化后，将肽从sitrap吸头中洗脱(7)。将肽由stage吸头浓缩，用于通过质谱进行下游分析。图3b-图3d mda-mb-231细胞的sitrap氢氧化铵(ah)、sitrap乙酸铵(aa)和标准基于sds的消化物的蛋白质组学比较。图3b所鉴定的蛋白质数量的箱线图(蛋白质鉴定需要至少两个肽)。图3c主要go细胞组分种类中的蛋白质分布。图3d显示对于三种样品制备方法中的每种，用至少两个肽鉴定的蛋白质数量的分布的维恩图。
[0041]
图4显示了使用纤维素吸头通过sitrap对细胞裂解物的消化。将mda-mb-231细胞用30mm乙酸铵(aa)图4a或1.8％氢氧化铵(ah)图4b通过冰上探针声处理来裂解。根据所述方案将30μg裂解物加载到sitrap吸头中，并收集流过物(ft1)。将捕获的蛋白质在80℃(ft2)的60mm teab中用10mm tcep和25mm氯乙酰胺原位还原和烷基化30min，在47℃下用胰蛋白酶消化45min并用2xlaemmli缓冲液洗脱。将样品在nupage 4-12％bis-tris蛋白质凝胶上运行。
[0042]
图5显示了正常与肿瘤肾切片的代谢物组学和蛋白质组学分析数据的火山图显著性分析。错误发现率(fdr)的显著性截止值设置为0.05。图5a代谢物组学分析的结果表明肿瘤样品中的短链酰基肉碱(c5、c5:1和c3)和多不饱和游离脂肪酸(c20:5、c20:4、c22:6)均减少。图5b蛋白质组学分析的结果表明肿瘤样品中的肉碱途径中的酶、肉碱o-乙酰转移酶(crat)、肉碱o-棕榈酰转移酶2(cpt2)和肉碱o-棕榈酰转移酶1(cpt1a)下调。在肿瘤样品中也观察到多不饱和脂肪酸途径中酶，即酰基辅酶a硫酯酶1(acot1)和长链脂肪酸辅酶a连接酶(acsl1)下调。
[0043]
图6显示肾肿瘤的sitrap蛋白质组学和代谢物组学分析确定了功能失调的酰基肉碱(ac)代谢。图6a代谢物组学分析确定了肿瘤样品中的短链酰基肉碱(c5、c5:1和c3)减少。y轴表示以平均值为中心的相对浓度。图6b蛋白质组学分析表明肿瘤样品中的肉碱o-乙酰转移酶(crat)、肉碱o-棕榈酰转移酶2(cpt2)和肉碱o-棕榈酰转移酶1(cpt1a)下调。y轴表示无标记定量(lfq)强度值。
[0044]
图7显示0.5μl来自健康志愿者的人血清通过sitrap技术直接消化(总共6个重复样品)或用20mm teab缓冲液稀释并使用sitrap石英吸头通过分馏处理。sitrap处理产生两个级分，捕获和流过物(每个级分分别3个重复，总共6个样品)。合并每种方法中的6个样品的胰蛋白酶消化的ms结果。
[0045]
图8显示将人肾ffpe组织通过标准二甲苯/乙醇处理来脱蜡，然后通过探针声处理在30mm乙酸铵中裂解。通过sitrap或sds方法处理约50μg所得的蛋白质裂解物。通过标准方案清除样品中的sds，并收集流过物(ft)。与sitrap类似，使蛋白质在48c下通过100mm碳酸氢铵中的1.25μg胰蛋白酶(promega)(胰蛋白酶浓度0.07μg/μl)连续两次消化1小时进行消化。用500mm碳酸氢铵和0.2％甲酸中的50％乙腈来连续洗脱消化产物。将其余材料用2x laemmli缓冲液洗脱。
[0046]
图9显示了组装件的使用示意图。在图9a中，基质117与溶液120接触，溶液首先施加到内小瓶的内样品容纳空间，可能用于需要温育的处理，内小瓶和外小瓶处于它们的下部停放位置。在图9b中，内小瓶已移动到上部停放位置，溶液124已通过基质117。取决于基质，它可以具有结合于其中的分子或可能不能穿过基质的材料123。在图9c中，处理溶液127已被施用以作用于结合或保留在基质117之中或之上或者通过基质结合或保留的材料以及
可能不会进入基质123中的任何材料。在图9c中，嵌套组装件被暴露，其下部273暴露于热或声能，诸如超声或光或电磁辐射，诸如微波，以加速或促进反应，其细节完全取决于实验系统。在该处理完成后，如图9d所示，小瓶移动到其上部停放位置；在该视图中，内小瓶止动件153和外小瓶支撑机构174不可见。已作用于基质及其滞留物125的溶液通过正压或负压或通过离心被推进通过基质117，以将现在处理的样品126转移到其样品收集区域中的外小瓶的底部。在该过程完成后，样品已准备好储存或进一步分析，如图9e所示。
[0047]
图10显示了内小瓶的完整组装件，其旋转以接合内小瓶和外小瓶的锁定机构，在该实施方案中，它们中的三个将内小瓶保持在外小瓶内的上部停放位置，以及内小瓶中的内空间的样品如何通过内小瓶支撑的基质流到外小瓶的接收空间。
[0048]
图11是内小瓶组装件和外小瓶组装件的另一个视图，它显示了组装件的另一侧，其中两个锁定机构接合以保持上部停放位置。
[0049]
图12显示了组装在下部停放位置的内小瓶和外小瓶，其中内小瓶相对于外小瓶密封以传输外部施加的处理并密封内小瓶，同时用销(pin)除去内小瓶的输出的死空间。
[0050]
图13显示了内小瓶的两侧。
[0051]
图14是嵌套的内小瓶和外小瓶的下部停放位置的剖视图，它展示了基质的位置、用于除去死体积的销和样品收集区，以及通过内小瓶和外小瓶的整个下部区域的内小瓶和外小瓶之间的紧密接口。
[0052]
图15显示了以96孔板形式排列的应用的实施方案，其中支承内小瓶的基质的内板与外板处于下部停放位置，并且通过可移动的铰接式舌片止动件保持在适当位置；阵列在内小瓶和外小瓶/板之间的密封和处理传输能力方面没有改变。
[0053]
图16显示了以96孔板形式排列的应用的实施方案，其中支承内小瓶的基质的内板通过可移动的铰接式舌片止动件被支撑在上部停放位置，以允许内板的内容物流过内板的孔的基质到达外板的样品收集区。
[0054]
图17显示了用于建立下部和上部停放位置的锁定机构的实施方案，所述锁定机构由具有提供这两个位置的相应凹口的柱组成。
[0055]
图18显示了用于建立两个位置的锁定机构的实施方案，这两个位置将允许或禁止经由侧释放设计流过基质，其中外小瓶根据旋转位置密封或不密封内小瓶。搭扣配合锁定机构可以提供密封。
[0056]
图19显示了用于建立下部和上部停放位置的锁定机构的实施方案，所述锁定机构由搭扣组成，所述搭扣将内小瓶保持在外小瓶内的各种垂直高度。
[0057]
图20显示了用于建立下部和上部停放位置的锁定机构的实施方案，所述锁定机构由多个细脊或粗脊组成，所述脊将内小瓶保持在外小瓶内的各种垂直高度。
[0058]
图21与图20相似，展示了锁定机构的可能实施方案，所述锁定机构用于建立由多个脊组成的下部和上部停放位置，以将内小瓶保持在外小瓶内的各种垂直高度，但具有释放的附加优点，其中脊通过旋转脱离到缺乏互锁脊的间隙。
[0059]
图22显示了用于建立由粗螺纹构成的下部和上部停放位置的锁定机构的可能实施方案，其中内小瓶被拧紧以密封或松开以允许从内小瓶到外小瓶的流动。
[0060]
图23显示了sars-cov-2核蛋白肽wyfyylgtgpeaglpygank的各种转变。
[0061]
图24显示了sars-cov-2核蛋白肽dgiiwvategalntpk的各种转变。
[0062]
图25展示了来自含有洗涤剂和不含洗涤剂的条件的可逆的sitrap捕获和释放rna。
[0063]
部件图例
[0064]
101内小瓶
[0065]
109外小瓶
[0066]
111内小瓶和外小瓶组装在下部停放位置，以保持和处理内小瓶122空间内的溶液和/或基质117之上或顶部或之中或之内的材料
[0067]
113内小瓶和外小瓶组装在上部停放位置，以使溶液从内小瓶122的空间通过基质117到达外小瓶222的样品容纳空间
[0068]
115内板和外板组装件，包括支撑上部停放位置和下部停放位置的装置。
[0069]
117基质由内小瓶保持在适当位置
[0070]
120样品在处理前首先添加到处于停放位置的内小瓶。
[0071]
122用于容纳样品的内小瓶内的空间，所述样品包括位于上部或下部停放位置的固体和/或液体样品和/或处理试剂
[0072]
123可能被基质保留的材料
[0073]
124可能缺乏凝结材料的初始流过级分，已经通过基质117的亲和力消耗了某些物质，可能不含不溶性物质等。
[0074]
125在通过内小瓶的基质时的处理后溶液，所述基质已作用于保留或结合在基质之中或之上或由基质保留或结合的材料
[0075]
126已经通过内小瓶基质的处理后溶液
[0076]
127被施加以作用于由基质117保留或在基质中的材料和/或其上的任何物质如123的处理溶液
[0077]
129内小瓶的开口，其表面与肋密封机构248交界
[0078]
137内小瓶盖的排气口
[0079]
145 d销，它被构造为堵塞内小瓶并除去内小瓶输出直至基质底部的死空间
[0080]
153内小瓶的锁定/止动/支撑机构，与外小瓶174的支撑机构接合以形成支撑的上部停放位置，以允许保持在内小瓶内部的内容物流过基质进入外小瓶的接收空间222
[0081]
168外小瓶的活动铰链，它连接外小瓶盖217与外小瓶主体
[0082]
174外小瓶的支撑机构，与内小瓶153的锁定机构或止动件交界
[0083]
185内小瓶的铰链
[0084]
195外小瓶的最低深度处的样品采集区
[0085]
203外小瓶的输出；如图所示，外部尺寸配合鲁尔锁容纳件
[0086]
217具有用于打开和关闭的舌片299的外小瓶的盖
[0087]
222外小瓶内的空间，可以接收和容纳通过基质的样品的流过物
[0088]
226外板内的空间，可以接收和容纳通过由内板支撑的基质的样品的流过物
[0089]
237具有用于打开和关闭的舌片281的内小瓶的盖
[0090]
248内小瓶盖的肋密封机构，其密封内小瓶的顶部
[0091]
256外小瓶盖的肋密封机构，其密封内小瓶的顶部
[0092]
269内小瓶底部开口，用于接收来自基质的流动并将其传输出内小瓶
[0093]
273外小瓶的区域，当内小瓶处于下部停放位置时，它可以紧密配合接收内小瓶，并将热和声能从外小瓶的外部传输到内小瓶、接收内小瓶的基质和内小瓶中的任何样品
[0094]
276内小瓶和外小瓶之间的紧密接口，它促进从外小瓶外部到内小瓶内部的流动，其内容物和处理基质诸如热或光或电磁辐射或声能(如超声处理)
[0095]
281内小瓶盖的舌片，用于手动或自动打开和关闭
[0096]
299外小瓶盖的舌片，用于手动或自动打开和关闭
[0097]
303板支承实施方案，支承相当于96个内小瓶
[0098]
308板支承实施方案，支承相当于96个外小瓶
[0099]
311外板的铰链区，允许内板在下部停放位置被压紧和密封，或者保持于上部停放位置，以促进通过基质至外板的流动。
[0100]
326外板的支撑件，其将内板向下压，使其在下部停放位置与外板密封
[0101]
331外板的支撑件，其将内板保持在上部停放位置以允许溶液流动
[0102]
在整个附图中，除非另外指明，否则相同的参考数字和字符用于表示所示实施方案的相似特征、元件、部件或部分。此外，虽然现在将参照附图详细描述本公开，但它是结合示例性实施方案进行的，并且不受附图和所附权利要求中所示的特定实施方案的限制。
具体实施方式
[0103]
将详细参考本技术的某些方面和示例性实施方案，在所附结构和附图中展示了实例。将结合示例性实施方案描述本技术的各个方面，包括方法、材料和实例，这种描述是非限制性的，并且本技术的范围旨在涵盖通常已知或并入本文的所有等同物、替代物和修改。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本技术所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本领域的技术人员将认识到许多与本文描述的技术和材料相似或等效的技术和材料，它们可以用于本技术的方面和实施方案的实践中。本技术的所描述的方面和实施方案不限于所描述的方法和材料。
[0104]
如在本说明书和所附编号的段落中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非内容另有明确规定。
[0105]
在本文中，范围可以表述为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示这类范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或到所述另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将数值表示为近似值时，应当理解，该特定值构成了另一个实施方案。应当进一步理解的是，每个范围的端点对于另一个端点很重要并且独立于另一个端点。还应理解，本文公开了许多值，并且除所述值自身外，本文还公开了每个值为“约”那个具体值。例如，如果公开了值“10”，那么“约10”也被公开。还应理解，当公开“小于或等于”该值、“大于或等于该值”的值时，还公开了这些值之间的可能范围，如本领域的技术人员适当理解的那样。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。
[0106]
本技术至少部分地涉及两件式“处理和容纳”组装件，该组装件包括保持和支撑基质的内小瓶，该基质可以是连续的多个基质，诸如多孔捕获表面，随后是色谱介质，如在spe诸如c4、c8、c18或离子交换树脂诸如scx、sax或金属结合表面诸如imac中常见的，它有助于将样品处理成多个级分；以及在温育过程和/或在下部停放位置的反应步骤中密封内小瓶的外小瓶，然后该外小瓶在上部停放位置用作容纳囊袋。上部和下部停放位置由处于下部
停放位置的内小瓶和外小瓶之间的锁定机构提供，允许内小瓶密封在外小瓶的最底部，而在上部停放位置，受最小旋转影响，允许内小瓶支撑在上部停放位置，使其内容物可以通过基质进入外小瓶的样品容纳空间。外小瓶中的密封囊袋和密封能力的组合，以及用于除去内小瓶输出死空间的销，最大限度地减少样品损失，最大限度地减少洗脱体积，并最大限度地提高通量。内小瓶在捕获和处理步骤中用作反应器皿。反应可以在内小瓶内发生，包括在内小瓶容纳的基质的顶部或之内或之上。在下部停放位置，可以离心内小瓶、外小瓶组装件，以确保由内小瓶容纳的基质的表面和孔已全部清除空气并暴露于处理试剂。组装件可以是一次性的。
[0107]
组装件可以以多重格式诸如96孔板制造；可以考虑许多其他多重样品。一些工作流程可以利用多个外小瓶首先捕获初始流过物，然后是由保留在内小瓶内部和其基质之上、顶部、之内或之中的材料接收的其他处理步骤的结果。在优选的实施方案中，通过添加试剂迫使分子结合到基质上或基质内，或使其凝结到自身或凝结到基质上或分子本身上，从而允许所有未凝结的分子通过基质。在目前包含通过基质保留的凝结材料的内小瓶已经放置在下部停放位置的新的外小瓶之后，将试剂添加到下部小瓶的密封内部以处理保持在基质的顶部或之中或之内或之上的材料。
[0108]
处理可以包括来自色谱介质的各种洗脱，诸如来自离子交换的盐馏分或来自反相的有机溶剂馏分，以及上述化学、酶促、热、声或其他种类的处理。本技术简化了样品处理并消除了手动处理塞子的需要。通过将凝结或沉淀步骤或化学处理步骤与基质处理(包括过滤和结合，包括与色谱表面结合(可以简单地通过堆叠基质连续))集成到两部分组装件中，本技术促进了高通量，包括通过自动化、稳健性和可重复性以及成本效益，这对于诸如在个性化或精准医疗中应用于大规模的处理至关重要。
[0109]
通过至少两个捕获机构的组合捕获蛋白质和dna和聚糖以及其他分子和生物聚合物。任何沉淀剂颗粒诸如蛋白质或生物聚合物沉淀剂被物理捕获在过滤器孔中，并且在存在凝结剂的情况下，溶液中的蛋白质材料通过有意调节溶剂(包含分析物分子)的离液性通过与基质表面的非共价相互作用而被吸附在基质上。重要的是，这次捕获后的流过物包含提取的生理小分子，不包括污染物，保存了挥发性或非干扰性缓冲液组分。因此，本技术规定流过物是分析代谢物和其他未结合分子的合适介质。重要和令人惊讶的是，捕获的蛋白质等生物分子在阱中仍可被还原和烷基化，从而促进下游的原位蛋白质消化和蛋白质组学分析。对蛋白质和其他捕获的分子的其他化学和酶促处理可以令人惊讶地在原位进行。本技术的一个显著出乎意料的优点是捕获的分子可以用酶和/或化学物质在基质中原位处理，而不需要使用强离液剂诸如尿素或洗涤剂如sds。
[0110]
本发明的方法和系统可以涉及使用虽然没有洗涤剂但具有强溶解性的提取溶剂。例如，本技术的优选缓冲液是1.8％氢氧化铵，蛋白质组学结果出人意料地显示出其与sds相似的回收蛋白质的能力。出乎意料的是，在不存在洗涤剂或离液剂的情况下，从补充有温和离液凝结剂(例如本文所述的含水甲醇组合物)的中性(或中和的)提取溶液中捕获分子，为本技术的方法提供了非常有利的条件，即捕获天然或接近天然状态的分子，并以高表面积与体积比捕获，这使得分子对捕获基质内的酶促或化学处理和/或操纵特别敏感，同时还允许选择性回收各类分子。例如，如此捕获的蛋白质对蛋白酶高度敏感。此外，在天然状态下的捕获允许使用需要生物分子的天然三级结构的酶。通过非限制性实例，酶fabricator
在铰链区下方的特定位点消化igg，产生f(ab')2和fc/2片段的同质集合。fabricator可用于在本技术的工作流程中对抗体进行酶促处理，相比之下，fabricator不能在其他样品制备技术诸如蛋白沉淀之后使用。
[0111]
本技术的另一个具体和优选的实施方案是向样品中加入两倍体积的甲醇，首先用1.8％氢氧化铵声处理(通过探针或其他方式)提取，然后通过添加等体积的1m乙酸中和。可以向该中和溶液另外添加凝结剂，特别是诸如两倍体积的甲醇，虽然其他比例可以是有利的。这种特殊的方法是独特的，并且完全令人惊讶，因为在中和时，生物分子立即形成酶敏感的聚集体，这些聚集体可以被捕获、与较小的非聚集分子分离、洗涤，并通过化学或酶促手段进一步提取和/或处理。
[0112]
定义
[0113]
如本文所用，术语“病毒”可以包括但不限于流感病毒、疱疹病毒、脊髓灰质炎病毒、诺如病毒和逆转录病毒。病毒的实例包括但不限于人类免疫缺陷病毒1型和2型(hiv-1和hiv-2)、人类t细胞嗜淋巴细胞病毒i型和ii型(htlv-i和htlv-ii)、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(hbv)、丙型肝炎病毒(hcv)、丁型肝炎病毒(hdv)、戊型肝炎病毒(hev)、庚型肝炎病毒(hgv)、细小病毒b19病毒、甲型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、输血传播病毒(ttv)、爱泼斯坦-巴尔病毒、人类巨细胞病毒1型(hcmv-1)、人类疱疹病毒6型(hhv-6)、人类疱疹病毒7型(hhv-7)、人类疱疹病毒8型(hhv-8)、甲型流感病毒包括h1n1和h5n1亚型、人偏肺病毒、严重急性呼吸综合征(sars)冠状病毒、sars-cov-2、中东呼吸综合征(mers)、汉坦病毒和来自沙粒病毒科(例如，拉沙热病毒(lfv))、肺病毒科(例如，人偏肺病毒)、丝状病毒科(例如，埃博拉病毒(ebov)、马尔堡病毒(mbgv)和寨卡病毒)的rna病毒；布尼亚病毒科(例如，裂谷热病毒(rvfv)、克里米亚-刚果出血热病毒(cchfv)和汉坦病毒)；黄病毒科(西尼罗河病毒(wnv)、登革热病毒(denv)、黄热病病毒(yfv)、gb病毒c(gbv-c；以前称为庚型肝炎病毒(hgv))；轮状病毒科(例如，轮状病毒)以及它们的组合。在一个实施方案中，受试者感染了hiv-1或hiv-2。
[0114]
遗传多样的正冠状病毒亚科家族分为四个属(α、β、γ和δ冠状病毒)。人cov仅限于α和β亚组。示例性人cov包括严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(sars-cov-2)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、hcov-229e、hcov-oc43、hcov-nl63和hcov-hku1。
[0115]
亚组1aα冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括fcov.fipv.79.1146.vr.2202(nv_007025)、传染性胃肠炎病毒(tgev)(nc_002306；q811789.2；dq811786.2；dq811788.1；dq811785.1；x52157.1；aj011482.1；kc962433.1；aj271965.2；jq693060.1；kc609371.1；jq693060.1；jq693059.1；jq693058.1；jq693057.1；jq693052.1；jq693051.1；jq693050.1)；猪繁殖和呼吸综合征病毒(prrsv)(nc_001961.1；dq811787)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组1a冠状病毒。
[0116]
亚组1bα冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括hcov.nl63.amsterdam.i(nc_005831)、btcov.hku2.hk.298.2006(ef203066)、btcov.hku2.hk.33.2006(ef203067)、btcov.hku2.hk.46.2006(ef203065)、btcov.hku2.gd.430.2006(ef203064)、btcov.1a.afcd62(nc_010437)、btcov.1b.afcd307
(nc_010436)、btcov.hku8.afcd77(nc_010438)、btcov.512.2005(dq648858)；猪流行性腹泻病毒(nc_003436、dq355224.1、dq355223.1、dq355221.1、jn601062.1、jn601061.1、jn601060.1、jn601059.1、jn601058.1、jn601057.1、jn601056.1、jn601055.1、jn601054.1、jn601053.1、jn601052.1、jn400902.1、jn547395.1、fj687473.1、fj687472.1、fj687471.1、fj687470.1、fj687469.1、fj687468.1、fj687467.1、fj687466.1、fj687465.1、fj687464.1、fj687463.1、fj687462.1、fj687461.1、fj687460.1、fj687459.1、fj687458.1、fj687457.1、fj687456.1、fj687455.1、fj687454.1、fj687453、fj687452.1、fj687451.1、fj687450.1、fj687449.1、af500215.1、kf476061.1、kf476060.1、kf476059.1、kf476058.1、kf476057.1、kf476056.1、kf476055.1、kf476054.1、kf476053.1、kf476052.1、kf476051.1、kf476050.1、kf476049.1、kf476048.1、kf177258.1、kf177257.1、kf177256.1、kf177255.1)、hcov.229e(nc_002645)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组1b冠状病毒。
[0117]
亚组2aβ冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括hcov.hku1.c.n5(dq339101)、mhv.a59(nc_001846)、phev.vw572(nc_007732)、hcov.oc43.atcc.vr.759(nc_005147)、牛肠道冠状病毒(bcov.ent)(nc_003045)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于数据库)或随后在ge数据库中确定的任何其他亚组2a冠状病毒。
[0118]
亚组2bβ冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括人sars cov-2分离株，诸如wuhan-hu-1(nc_045512.2)和任何包含以下genbank登录号列出的基因组序列的cov-2分离株，诸如mt079851.1、mt470137.1、mt121215.1、mt438728.1、mt470115.1、mt358641.1、mt449678.1、mt438742.1、lc529905.1、mt438756.1、mt438751.1、mt460090.1、mt449643.1、mt385425.1、mt019529.1、mt449638.1、mt374105.1、mt449644.1、mt385421.1、mt365031.1、mt385424.1、mt334529.1、mt466071.1、mt461669.1、mt449639.1、mt415321.1、mt385430.1、mt135041.1、mt470179.1、mt470167.1、mt470143.1、mt365029.1、mt114413.1、mt192772.1、mt135043.1、mt049951.1；人sars cov-1分离株，诸如sars cov.a022(ay686863)、sarscov.cuhk-w1(ay278554)、sars cov.gd01(ay278489)、sarscov.hc.sz.61.03(ay515512)、sars cov.sz16(ay304488)、sarscov.urbani(ay278741)、sarscov.civet010(ay572035)、sarscov.ma.15(dq497008)；蝙蝠sars cov分离株，诸如btsars.hku3.1(dq022305)、btsars.hku3.2(dq084199)、btsars.hku3.3(dq084200)、btsars.rm1(dq412043)、btcov.279.2005(dq648857)、btsars.rf1(dq412042)、btcov.273.2005(dq648856)、btsars.rp3(dq071615)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组2b冠状病毒。
[0119]
亚组2cβ冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括中东呼吸综合征冠状病毒(mers)分离株，诸如riyadh 22012(kf600652.1)、al-hasa_18_2013(kf600651.1)、al-hasa_17_2013(kf600647.1)、al-hasa_152013(kf600645.1)、al-hasa_16_2013(kf600644.1)、al-hasa_21_2013(kf600634)、al-hasa 19_2013(kf600632)、buraidah_1_2013(kf600630.1)、hafr-al-batin_1_2013(kf600628.1)、al-hasa_122013(kf600627.1)、
bisha.ltoreq.1_2012(kf600620.1)、riyadh_3_2013(kf600613.1)、riyadh_1_2012(kf600612.1)、al-hasa_3_2013(kf186565.1)、al-hasa_1_2013(kf186567.1)、al-hasa_2_2013(kf186566.1)、al-hasa_4_2013(kf186564.1)；β冠状病毒england 1-n1(nc_019843)、sa-n1(kc667074)；人β冠状病毒2c jordan-n3/2012(kc776174.1)；人β冠状病毒2c emc/2012(jx869059.2)；任何蝙蝠冠状病毒亚组2c分离株，诸如蝙蝠冠状病毒taper/cii_ksa_287/bisha/saudi arabia(kf493885.1)、蝙蝠冠状病毒rhhar/cii_ksa 003/bisha/saudi arabia/2013(kf493888.1)、蝙蝠冠状病毒pikuh/cii_ksa_001/riyadh/saudi arabia/2013(kf493887.1)、蝙蝠冠状病毒rhhar/cii_ksa 002/bisha/saudi arabia/2013(kf493886.1)、蝙蝠冠状病毒rhhar/cii_ksa_004/bisha/saudi arabia/2013(kf493884.1)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku4.2(ef065506)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku4.1(nc_009019)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku4.3(ef065507)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku4.4(ef065508)、蝙蝠冠状病毒btcov133.2005(nc_008315)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku5.5(ef065512)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku5.1(nc_009020)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku5.2(ef065510)、蝙蝠冠状病毒btcov.hku5.3(ef065511)和蝙蝠冠状病毒hku5分离株(kc522089.1)；任何另外亚组2c，诸如kf192507.1、kf600656.1、kf600655.1、kf600654.1、kf600649.1、kf600648.1、kf600646.1、kf600643.1、kf600642.1、kf600640.1、kf600639.1、kf600638.1、kf600637.1、kf600636.1、kf600635.1、kf600631.1、kf600626.1、kf600625.1、kf600624.1、kf600623.1、kf600622.1、kf600621.1、kf600619.1、kf600618.1、kf600616.1、kf600615.1、kf600614.1、kf600641.1、kf600633.1、kf600629.1、kf600617.1、kc869678.2；kc522088.1、kc522087.1、kc522086.1、kc522085.1、kc522084.1、kc522083.1、kc522082.1、kc522081.1、kc522080.1、kc522079.1、kc522078.1、kc522077.1、kc522076.1、kc522075.1、kc522104.1、kc522104.1、kc522103.1、kc522102.1、kc522101.1、kc522100.1、kc522099.1、kc522098.1、kc522097.1、kc522096.1、kc522095.1、kc522094.1、kc522093.1、kc522092.1、kc522091.1、kc522090.1、kc522119.1、kc522118.1、kc522117.1、kc522116.1、kc522115.1、kc522114.1、kc522113.1、kc522112.1、kc522111.1、kc522110.1、kc522109.1、kc522108.1,、kc522107.1、kc522106.1、kc522105.1；伏翼蝠冠状病毒hku4分离株(kc522048.1、kc522047.1、kc522046,1、kc522045.1、kc522044.1、kc522043.1、kc522042.1、kc522041.1、kc522040.1、kc522039.1、kc522038.1,、kc522037.1,、kc522036.1,、kc522048.1、kc522047.1、kc522046.1、kc522045.1、kc522044.1、kc522043.1、kc522042.1、kc522041.1、kc522040、1、kc522039.1、kc522038.1、kc522037.1、kc522036.1、kc522061.1、kc522060.1、kc522059.1、kc522058.1、kc522057.1、kc522056.1、kc522055.1、kc522054.1、kc522053.1、kc522052.1、kc522051.1、kc522050.1、kc522049.1、kc522074.1、kc522073.1、kc522072.1、kc522071.1、kc522070.1、kc522069.1、kc522068.1、kc522067.1、kc522066.1、kc522065.1、kc522064.1、kc522063.1、kc522062.1)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组2c冠状病毒。
[0120]
亚组2dβ冠状病毒及其genbank登录号的非限制性实例包括btcov.hku9.2(ef065514)、btcov.hku9.1(nc_009021)、btcov.hku9.3(ef065515)、btcov.hku9.4(ef065516)以及它们的任何亚型、进化枝或亚进化枝，包括目前已知(例如，可见于
数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组2d冠状病毒。
[0121]
亚组3γ冠状病毒的非限制性实例包括ibv.beaudette.ibv.p65(dq001339)或目前已知(例如，可见于数据库)或随后在数据库中确定的任何其他亚组3冠状病毒。
[0122]
可以靶向由上述亚组1a、1b、2a、2b、2c、2d和3中的任何分离株或基因组序列定义的冠状病毒。
[0123]
如本文所用，术语“细菌”应指具有细胞壁但缺乏细胞器和有组织的细胞核的一大群单细胞微生物的成员。细菌的同义词可以包括术语“微生物(microorganism、microbe)”、“细菌”、“芽孢杆菌”和“原核生物”。示例性细菌包括但不限于分枝杆菌属(mycobacterium)物，包括结核分枝杆菌(m.tuberculosis)；金黄色葡萄球菌属(staphylococcus)种，包括表皮葡萄球菌(s.epidermidis)、金黄色葡萄球菌(s.aureus)和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌；链球菌属(streptococcus)种，包括肺炎链球菌(s.pneumoniae)、化脓链球菌(s.pyogenes)、变形链球菌(s.mutans)、无乳链球菌(s.agalactiae)、马链球菌(s.equi)、犬链球菌(s.canis)、牛链球菌(s.bovis)、马链球菌(s.equinus)、心绞痛链球菌(s.anginosus)、血链球菌(s.sanguis)、唾液链球菌(s.salivarius)和缓链球菌(s.mitis)；其他致病性链球菌属(streptococcal)种，包括肠球菌属(enterococcus)种，诸如粪肠球菌(e.faecalis)和屎肠球菌(e.faecium)；流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、假单胞菌属(pseudomonas)种，包括铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)、假马氏假单胞菌(p.pseudomallei)和马氏假单胞菌(p.mallei)；沙门氏菌属(salmonella)种，包括s.enterocolitis、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)、肠沙门氏菌(s.enteritidis)、邦戈沙门氏菌(s.bongori)和肠道沙门氏菌(s.choleraesuis)；志贺氏菌属(shigella)种，包括福氏志贺氏菌(s.flexneri)、宋内志贺氏菌(s.sonnei)、痢疾志贺氏菌(s.dysenteriae)和鲍氏志贺氏菌(s.boydii)；布鲁氏菌属(brucella)种，包括马耳他布鲁氏菌(b.melitensis)、猪布鲁氏菌(b.suis)、流产布鲁氏菌(b.abortus)和百日咳布鲁氏菌(b.pertussis)；奈瑟氏球菌(neisseria)，包括脑膜炎奈瑟菌(n.meningitidis)和淋病奈瑟菌(n.gonorrhoeae)；大肠杆菌(escherichia coli)，包括产肠毒素大肠杆菌(etec)；霍乱弧菌(vibrio cholerae)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、嗜热脂肪地芽孢杆菌(geobacillus stearothermophilus)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)、艰难梭菌(clostridium difficile)、新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、莫拉菌属(moraxella)种，包括卡他莫拉菌(m.catarrhalis)，弯曲杆菌属(campylobacter)种，包括空肠弯曲菌(c.jejuni)；棒状杆菌属(corynebacterium)种，包括白喉杆菌(c.diphtheriae)、溃疡杆菌(c.ulcerans)、假结核杆菌(c.pseudotuberculosis)、假白喉杆菌(c.pseudodiphtheriticum)、解脲棒状杆菌(c.urealyticum)、溶血杆菌(c.hemolyticum)、马杆菌(c.equi)；单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、星状诺卡氏菌(nocardia asteroides)、拟杆菌属(bacteroides)种、放线菌属(actinomycetes)种、梅毒螺旋体(treponema pallidum)、钩端螺旋体(leptospirosa)、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae)；变形杆菌属(proteus)种，包括普通变形杆菌(proteus vulgaris)；沙雷氏菌属(serratia)种、不动杆菌属(acinetobacter)、耶尔森氏菌属(yersinia)种，包括鼠疫耶尔森氏菌(y.pestis)和假结核耶尔森氏菌
(y.pseudotuberculosis)；土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、肠杆菌属(enterobacter)种、拟杆菌属(bacteriodes)种、军团菌属(legionella)种、伯氏疏螺旋体(borrelia burgdorferi)等。如本文所用，术语“靶向生物恐怖剂”包括但不限于炭疽(bacillus antracis)、鼠疫(yersinia pestis)和土拉菌病(franciscella tularensis)。
[0124]
如本文所用，术语“真菌”应指产生腐生和寄生孢子的真核生物(通常为丝状生物)的组中的任何成员，这些生物以前被归类为缺乏叶绿素的植物并且包括霉菌、锈病、霉菌、黑穗病、蘑菇和酵母。示例性真菌包括但不限于曲霉属(aspergillus)种、皮肤癣菌属(dermatophytes)、德氏芽生菌(blastomyces derinatitidis)、念珠菌属(candida)种，包括白色念珠菌(c.albicans)和克氏念珠菌(c.krusei)；糠秕马拉色氏霉菌(malassezia furfur)、韦内斯基外瓶柄霉(exophiala werneckii)、霍塔氏毛孢子菌(piedraia hortai)、白吉利毛孢子菌(trichosporon beigeli)、波氏假阿利什霉(pseudallescheria boydii)、灰马杜拉分枝菌(madurella grisea)、夹膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、申克孢子丝菌(sporothrix schenckii)、夹膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、癣菌属(tinea)种，包括花斑癣(t.versicolor)、足癣(t.pedis)、甲癣(t.unguium)、股癣(t.cruris)、头癣(t.capitus)、体癣(t.corporis)、须癣(t.barbae)；毛癣菌属(trichophyton)种，包括红色毛癣菌(t.rubrum)、叉指毛癣菌(t.interdigitale)、断发癣菌(t.tonsurans)、紫罗兰毛癣菌(t.violaceum)、雅温黛毛癣菌(t.yaoundei)、许兰毛癣菌(t.schoenleinii)、麦格尼毛癣菌(t.megninii)、苏丹毛癣菌(t.soudanense)、马蹄毛癣菌(t.equinum)、意瑞奈斯发癣菌(t.erinaceid)和疣状毛癣菌(t.verrucosum)；生殖支原体(mycoplasma genitalia)；小孢子菌属(microsporum)种，包括奥杜盎小孢子菌(m.audouini)、铁锈色小孢子菌(m.ferrugineum)、犬小孢子菌(m.canis)、猪小孢子菌(m.nanum)、扭曲小孢子菌(m.distortum)、石膏样小孢子菌(m.gypseum)、粉小孢子菌(m.fulvum)等等。
[0125]
如本文所用，术语“原生动物”应指主要是单细胞的、单独存在或聚集成菌落、通常是非光合作用的并且通常根据它们的运动能力和方式进一步分门的多种真核生物的任何成员，如伪足、鞭毛或纤毛。示例性原生动物包括但不限于疟原虫(疟原虫)种，包括恶性疟原虫(p.falciparum)、间日疟原虫(p.vivax)、卵形疟原虫(p.ovale)和疟疾疟原虫(p.malariae)；利什曼原虫(leishmania)种，包括硕大利什曼原虫(l.major)、热带利什曼原虫(l.tropica)、多诺瓦利什曼原虫(l.donovani)、婴儿利什曼原虫(l.infantum)、恰加斯利什曼原虫(l.chagasi)、墨西哥利什曼原虫(l.mexicana)、巴拿马利什曼原虫(l.panamensis)、利什曼原虫(l.braziliensis)和圭亚那利什曼原虫(l.guyanensi)；隐孢子虫(cryptosporidium)、贝利等孢子虫(isospora belli)、刚地弓形虫(toxoplasma gondii)、阴道毛滴虫(trichomonas vaginalis)和环孢子虫(cyclospora)种。
[0126]
在基质和生物分子(包括大分子和大分子片段)的上下文中的“捕获”、“保留”和相关术语是指基质和分子相互作用，使得分子特别是大分子在分子暴露于凝结剂后被保留在基质之上和/或之中。该相互作用通常是非共价的，并且可以是分子间相互作用或基于大小的简单保留。相互作用的具体性质并不重要。然而，基质可以在加入凝结介质后保留分子，尤其是大分子，诸如(但不限于)dna、rna、蛋白质和聚糖，允许根据需要进行洗涤，防止过度聚集，允许在流过物中捕获较小的分子从而将小分子与大分子分离，基质允许诸如用(但不
限于)蛋白酶、核酸酶和糖苷酶进行化学和/或酶促处理，并且基质允许分子或分子部分最后被洗脱，最优选地在单独的洗脱步骤中。如果需要，可以用不溶解所捕获的分子的溶剂洗涤结合的分子；相应地，不同类别的分子是可洗脱的，因此可以用不同的溶剂进行分级。
[0127]
在下文中，“基质”是指“一种基质或多种基质的组合”。
[0128]
本文中的术语“分析物”是指需要分析的一个或多个分子，包括蛋白质、dna、rna、聚糖、脂质、小分子诸如代谢物、药物和维生素等。可用于分析分析物的分析技术是本领域的技术人员熟知的，并且包括质谱、nmr、抗体测定、纳米孔、核酸标记技术和许多其他技术。
[0129]
本文中的术语“污染物”是指干扰下游处理和/或分析的部分。污染物可以包括盐、缓冲液、离液剂、洗涤剂或样品中天然存在的组分，诸如磷脂或在其他样品处理步骤中由使用者添加到样品中的组分，诸如还原和烷基化试剂。
[0130]
本文中的术语“稳健性”是指在本技术的方法中使用系统、其组装件或部件产生高度可再现的结果。
[0131]
本文中的术语“通量”是指可以处理单个样品的速度，或通常通过自动化并行处理多个样品的速度和能力。
[0132]
本文中的术语“易于使用”是指只需最少的先前培训并且在产生失败处理的样品处理中干扰的可能性最小的情况下，保持样品处理和操作的所有所需方面的能力，所述方面包括分析物的回收和分离、稳健性和通量。
[0133]
如本文所提及的，“强离液剂”是导致生物分子完全变性并且通常防止捕获和与捕获基质结合的试剂。离液剂是多种化合物，其可导致生物大分子和超分子组装体发生紊乱，尤其是破坏氢键。它们倾向于破坏磷脂膜并削弱或展开蛋白质和核酸的三维结构。离液剂起作用的确切机制很复杂，并且取决于具体的物质；在相同浓度下，有些比其他更无序，因此我们认识到更强和更弱的离液剂。尿素和胍盐通常被认为是强离液剂，其在足够高的浓度下，会导致生物样品及其分子在高浓度诸如8m或6m时完全变性和通常溶解。在选择本发明的提取溶剂时应避免强离液剂，因为它们抑制凝结并因此防止结合。
[0134]
如本文所提及的，“温和的离液剂”是不会使生物分子完全变性并且有助于与捕获基质结合的离液剂。温和离液剂赋予分子结构自由度并促进蛋白质延伸和变性，同时不会使生物聚合物完全线性化以及使生物分子变性。这种温和离液剂减少了本体中和在疏水性氨基酸周围的水合壳中由水分子形成的蛋白质结构中的有序度，这使得分子之间以及与基质的结合表面可以呈现典型的疏水内部区域，导致结合。许多种类的分子是离液剂，可以影响生物分子中各种程度的无序，包括但不限于醇和其他有机溶剂，诸如苯、糖、甘油、两性离子，甚至是香兰素以及许多其他化合物(参见timson,dj(2020).the roles and applications of chaotropes and kosmotropes in industrial fermentation processes.world journal of microbiology and biotechnology,36(6).doi:10.1007/s11274-020-02865-8)。与一般离液剂科学一样，关于本发明，给定试剂的强度离液性的确定是经验性的，其取决于离液剂促进所关注的分析物分子凝结到现有的结合基质的能力。温和离液剂仅在提取溶剂和分子凝结剂组合的情况下起作用。
[0135]
如本文所提及的，“分子凝结剂”是指一种试剂或多种试剂组合，当与可以已经调节过ph的提取溶剂混合时，其通过特别是非共价机制诸如疏水或亲水相互作用或离子相互作用促进蛋白质阱中所关注的分析物的保留和结合。分子凝结剂的选择应使其不会导致凝
结的分析物分子过度聚集，这将阻碍通过结合或捕获基质的流过物，虽然它们可以促进分子间相互作用以使分析物分子更容易与捕获基质结合。在多个实施方案中，虽然凝结剂促进结合，但它们在生物分子的大部分天然状态下如此。一种可能的凝结剂可以很容易地被测试，方式是，首先确定它是否会阻碍样品处理，这表明它会导致过度聚集，其次是否促进结合(例如，分析流过的例如蛋白质的存在或不存在，如果该分子类别是所关注的)，以及第三它是否阻碍后续的处理步骤，(诸如用还原和烷基化试剂，然后是胰蛋白酶处理)。有效的分子凝结剂不得阻碍样品处理，必须促进结合，并且不得阻碍在基质上或基质内进行的后续处理。
[0136]
如本文所提及的，“提取溶剂”应指具有溶解或基本上溶解可能在搅拌诸如物理搅拌或热搅拌或声波或超声搅拌的条件下溶解或基本溶解的一类或多类所需分析物分子的溶剂。虽然原则上提取溶剂可以含有诸如尿素或洗涤剂等的组分，但此类非挥发性化合物的存在会干扰下游分析。提取溶剂的实例包括被选择用于溶解样品的疏水组分(如脂质和疏水蛋白质)的疏水有机物，然后通过添加极性更强的分子凝结剂使其疏水性降低，从而导致疏水组分与基质、挥发性酸和碱诸如盐酸或甲酸或乙酸或其他挥发性酸，或氢氧化铵或四甲基氢氧化铵结合，它们均可被中和，与质谱相容，可与分子凝结剂混合，引起分析物聚集基质上。
[0137]
提取溶剂和分子凝结剂应优选地为挥发性混合物，或不干扰下游分析的混合物，或者可容易且快速地将干扰组分除去至无干扰水平的混合物。提取溶剂和分子凝聚剂的选择必须如此，一旦组合，它们就会产生促进分析物与基质结合的条件。提取溶剂和分子凝结剂可以是混合物，可以溶解所关注的物质，易于处理或不干扰下游分析和处理，并且必须具有促进一类或多类所关注的分子与基质的结合或凝结或捕获的条件(温度、时间、ph、浓度等。所有这些都可以根据基质的种类不同)。
[0138]
捕获基质
[0139]
本文公开了一种具有集成基质的两件式样品处理组装件，其提高了需要温育步骤的样品处理的速度和简单性，这在以前需要重复应用和移除塞子，导致延迟、不可再现、无法自动化和样品丢失。该组装件可用于样品的一些级分必须通过基质的任何情况，并且保留在基质上或基质中或由基质保留的材料将用需要时间操作的试剂进一步处理，即需要在某些时间、温度等条件下温育。因此，该组装件可用于从环境分析到临床样品分析的许多分析领域。虽然确切的使用方案完全取决于基质的组成和样品接受的处理，但本文公开了产生代谢物、脂质、核酸、聚糖和蛋白质样品的步骤。在多个实施方案中，该组装件将通过塑料的注塑成型制造并且是一次性的以防止样品交叉和污染。尤其是在下部停放位置的组装系统被特别考虑暴露于有利于对结合或保留在基质上或基质中由基质结合或保留的样品提供处理的条件。这种处理可以特别包括温度和声能，但其他处理也是可能的。
[0140]
优选地，基质是能够被包含大分子的介质穿透的多孔或纤维材料。这种多孔或纤维材料也可以由粉末或片或珠形成。此外，基质应该是允许大分子被基质可逆地捕获的合适材料。基质通过其孔隙和粗糙表面提供超声成核促进特性，此降低空化阈值(超)声处理气泡成核、生长和塌陷，从而促进(超)声处理作用在基质之上和之内的作用。因此，本文的方法可以加速声处理或超声处理步骤。
[0141]
这种基质的存在允许大分子的聚集从已添加凝结剂的介质中缓和。如果不存在这
样的基质，大分子将倾向于以不受控制的方式聚集在一起。这是不期望的，因为它使大分子的进一步处理更加困难或不可能。例如，在没有首先被离液剂诸如浓缩尿素或洗涤剂破坏聚集体的情况下，用蛋白酶消化捕获的蛋白质会受到阻碍，然后所有这些都会干扰下游分析。类似地，核酸酶可能无法触及与蛋白质和其他共聚集分子聚集在一起的dna，或者糖苷酶可以无法触及聚糖，包括那些附着在蛋白质上的聚糖。
[0142]
本质上，基质中大分子的捕获还允许它们的顺序洗脱，这对于生成多类分析物进行多组学分析至关重要。此外，在基质中捕获大分子允许洗涤(漂洗)基质和大分子，以除去任何污染物和/或分离不同的分子类别，同时确保捕获的分子不会丢失或过度稀释，这将使进一步处理成为问题。
[0143]
有许多材料可能适合用作本技术中的基质，因此特定材料组的选择不受限制。下文将描述各种示例性合适的材料和这些材料的一般性质，但是对于技术人员来说显然可以使用其他材料，包括色谱中使用的小珠，或以其他方式产生用于样品处理的表面，诸如c18表面(在珠子上或在膜上)或混合床，其例如包含混合的反相和离子交换介质，或任何其他满足以下标准的材料，并且可以具有其他性质。
[0144]
虽然许多其他基质是可能的，但特别优选的基质包含深度过滤材料。
[0145]
本技术上下文中的关键考虑因素是，基质(通常为深度过滤器)能够结合并保留补充有凝结介质的(通常为大(更大)的)分子，并在随后的洗涤和处理步骤期间保留这些分子，将它们保持为一种形式，以便酶可用于改变保留分子的物理状态，特别是减少较大分子诸如蛋白质、dna和rna或聚糖的大小，或从捕获的分子中释放所关注的诸如聚糖或脂质或泛素化或其他分子特征的部分，这可以通过化学和/或酶促处理实现。任何推定基质的适用性都可以通过在以下实例中描述的方案中对其进行测试来评估。普通技术人员将能够识别替代的合适的基质材料。
[0146]
作为一般指导，基质通常：
[0147]-适用于捕获和保留细和非常细的颗粒，例如从几微米(例如，20μm或更小、10μm或更小、5μm或更小、或2μm或更小)到亚微米大小范围(例如，低至0.2μm甚至0.1μm大小)；
[0148]-对样品分子基本上是惰性的；
[0149]-当样品暴露于凝结介质时，能够从样品中可逆地捕获(即保留)分子诸如蛋白质和dna或rna或脂质或聚糖；
[0150]-允许对捕获的分子进行化学和/或酶促处理，例如蛋白酶可用于原位消化蛋白质，或核酸酶可用于产生更小大小的dna或rna，或糖苷酶可从蛋白质中释放聚糖或不与表面活性剂结合，并因此在任何显著程度上保留表面活性剂。
[0151]
捕获基质可以是深度过滤器，但不过必须是多孔的，在一些实施方案中可以用酶产生以用于样品处理，例如用蛋白酶或核酸酶或脂肪酶或糖苷酶产生。
[0152]
通过本领域的技术人员已知的多种技术将基质保持在内小瓶中，所述技术包括气密密封或塑料焊接或热焊接或超声波焊接，或者通过基质的物理大小和当它被迫进入内小瓶的变窄底部处时的摩擦力或使用粘合剂或玻璃料或支撑系统，诸如筛网或塑料脚手架，其中可以包括支撑件或保持环或筛网等等。
[0153]
基质可以是任何多孔的基质，诸如过滤材料、色谱材料、具有亲和力的材料、膜、玻璃料、spe材料、过滤器、深度过滤器等。在失去色谱珠的情况下，可以在底部和顶部提供玻
璃料，或者只在底部提供。用于本技术的基质的合适材料包括多孔基质，诸如烧结材料或多孔塑料或具有限定或近似限定孔隙率的膜。示例性材料包括多孔聚乙烯(pe)、聚丙烯(pp)、聚四氟乙烯(ptfe)和烧结聚四氟乙烯。合适的材料还可以包括通过烧结玻璃或其他材料制成的多孔材料、各种过滤器，包括纸或玻璃或深度过滤器、玻璃膜过滤器、具有特定分子量截止值的膜，或具有特定孔径诸如0.2微米、2微米、20微米等等的膜。除了膜和片材外，基质还可以包括散珠或粉末，具体取决于使用情况。如果失去粉末，颗粒的尺寸(颗粒直径)可以是与液相色谱相似的大小，或者可以稍大或稍小，以提供对移动溶剂通过所述基质材料所需的力的控制。类似地，可以修改包括膜在内的多孔基质的孔径以改变溶液通过基质的流速。基质可以是亲水的或疏水的，并且可以选择为水或有机溶剂可润湿的。
[0154]
本领域的技术人员将认识到，可以对一种或多种基质使用多种表面或介质，包括可用于spe材料的材料、反相材料诸如键合相二氧化硅并且包括例如c4、c8或c18填充材料，或螯合表面以捕获材料如金属，或呈现疏水表面的聚合物颗粒，或离子交换树脂诸如scx，sax，它们呈现带负电荷或正电荷的表面，或弱阳离子或离子交换，或具有给定大小的孔隙的颗粒的凝胶过滤材料，以促进保留某些给定半径或分子量的分析物，或基于亲和力的支撑件，包括用于金属亲和色谱的表面诸如imac，或其他亲和力，诸如不限于针对抗原或半抗原的抗体或肽的ptm，诸如磷酸化yst或泛素或乙酰化或甲基化或脂化或针对特定基序或二氧化钛的抗体，以捕获磷酸化残基或针对核酸(dna和rna)亲和力的碳化硅，或用于生物素化部分或氟化表面的链霉亲和素，以捕获卤化化合物，或基于抗体的捕获材料，诸如蛋白a或g、或螯合剂或用于色谱诸如高效液相色谱任何类似的基质材料。基质可以部分或完全由具有任何上述亲和力或其他亲和力的整体材料组成。
[0155]
该装置可以包括次要基质，可能是布置在主要基质和出口之间的疏水性基质，即主要基质的下游。本领域的技术人员将认识到许多其他基质是可能的。
[0156]
适当地，次要基质延伸穿过器皿的整个腔，以使得从入口至出口的任何流动都必须通过次要基质的至少一部分。
[0157]
出口可通向适用于收集通过基质的各种介质、试剂、缓冲液等，特别是具有不同溶解度的不同分子的不同级分的贮槽或储集器。
[0158]
洗脱的分子或片段可以适当地传递到次要基质。适当地，次要基质可以是疏水基质，例如适合反相色谱法(rpc)的固定疏水相。大多数柱rpc基质基于二氧化硅基质，例如，具有键合烷基链的二氧化硅，但理论上可以使用任何惰性疏水固相。特别优选的疏水基质包括十八烷基碳链(c18)键合的二氧化硅、c8键合的二氧化硅或它们二者的组合，但其他合适的基质包括氰基键合的二氧化硅和苯基键合的二氧化硅。替代的次要基质可以是离子交换色谱、疏水相互作用色谱或基于大分子亲和试剂诸如适配体或抗体的亲和色谱，或用于磷酸化的imac或二氧化钛等化学物质。类似地，rna可以用寡胸苷富集，或聚糖可以用硼亲和色谱法或凝集素富集。本领域的技术人员将理解，在许多不同的实施方案中，诸如可以与本技术结合，其中松散的珠粒由玻璃料保持，或衍生的膜，诸如empore c18。次要基质可以有多种作用，例如：它作为主要基质的机械支撑件，它作为保护过滤器，从主要基质中捕获杂散颗粒和脱落的纤维材料，它有助于最终清理捕获和处理的分子和分子片段；并且它可以对捕获和处理的分子和分子片段进行色谱分离。
[0159]
在包括反相次要基质的本技术的一些优选的实施方案中，本技术包括以下步骤：
使用一系列疏水性增加的洗脱液或洗脱液梯度洗脱从疏水次要基质捕获和处理的分子和分子片段。因此，该方法可以提供基于其疏水性捕获和处理的分子和分子片段的一定程度的色谱分离。这允许基于疏水性解析捕获的分子或其片段的群体，这有助于后期分析。为此目的，包含c8键合二氧化硅的次要基质非常有用。合适的洗脱液系列依次包括5％acn水溶液、10％acn水溶液、15％acn水溶液，然后是60％乙腈的0.5％甲酸(fa)溶液；这种系列允许从捕获的分子获得四个级分。
[0160]
该装置可以是改进的移液器吸头。考虑了其他类型的器皿，例如适用于自动化和/或高通量样品制备和/或离心柱的器皿
[0161]
捕获
[0162]
特别是大分子的捕获，在添加凝结介质后，通过两种捕获机制的组合来实现。任何沉淀的颗粒都被物理捕获在过滤器孔中，而其他溶液中的材料通过与过滤器表面的非共价相互作用吸附在过滤器上。本领域的技术人员将认识到，存在许多不同的溶液可以特异性地引起特定种类或种类组合的生物分子诸如脂质、聚糖、蛋白质、肽、核酸的凝结。例如，通过添加有机溶剂诸如甲醇、其他醇或许多其他有机溶剂来促进蛋白质的凝结和捕获。
[0163]
或者，通过使用水性溶剂促进脂质的捕获，并且可以通过使用双相有机溶液诸如甲醇、水和甲基叔丁基醚(mtbe)的混合物在流过物中分离脂质和其他小分子，溶液也会导致蛋白质和dna和rna和聚糖沉淀和/或结合在捕获基质中。
[0164]
在基于大小的保留的情况下，即在颗粒由于它们的大小或聚集颗粒或微粒的大小而被捕获在孔中的情况下，可以在化学和/或酶促处理以将大分子减小到更小的大小之后实现洗脱。通过非限制性实例，捕获的蛋白质可以通过蛋白酶或化学处理或通过声能剪切而破碎成较小尺寸的蛋白质片段(肽)。类似地，聚糖可以通过用糖苷酶处理从捕获的蛋白质中释放出来，或者较大的聚糖可以通过糖苷酶处理成更小的片段，脂质可以从捕获的材料中释放出来，所述材料包括蛋白质(对于脂化蛋白质)或被分解成更小的片段的更大的脂质，作为用于文库生成的非限制性实例，核酸酶或声波剪切可以产生更短长度的dna和rna。该方法依赖于捕获一类或多类分子，而另一种或其他分子保持可溶性，因此通过孔进行后续分析。
[0165]
基质的容量(以及因此的体积)通常应该足以捕获样品中基本上所有(大)分子而不会被堵塞，而不管(大)分子是通过何种机制保留的。然而，很明显，所需的基质容量尤其取决于样品中的分子的浓度。合适的基质体积可以通过反复试验来确定，并且如果提供的基质体积大于严格要求的体积，通常不会遇到问题，除了可能需要更多试剂来润湿、洗涤和酶促或化学处理样品并洗脱所得的处理分子之外。
[0166]
凝结剂使一些部分或级分的生物分子以可逆的方式粘附或被捕获或保留在基质上或基质内。通常，虽然不是排他性的，这将包括蛋白质、dna、rna和聚糖。最典型的小分子诸如(但不限于)代谢物将会通过。然而通过改变使用的一种或多种提取溶剂，可以捕获和保留其他类别的分子，诸如(且不限于)脂质。如果时间足够长，特别是蛋白质和dna/rna可以沉淀并形成细颗粒的悬浮液；这种沉淀不是强制性的。必须的是，凝结剂不会引起严重的沉淀，从而使沉淀剂对酶促处理(例如使用消化胰蛋白酶或lysc或png酶f或核酸酶)不敏感，尤其是在水性条件下。值得注意的是，虽然样品可以通过例如在暴露于提取溶剂后通过离心来澄清，但也可以装载整个样品，包括碎屑；然后将对其进行任何进一步提取和/或化
学和/或酶促处理步骤。
[0167]
深度过滤器
[0168]
深度过滤器是一种使用多孔过滤介质将颗粒保留在整个介质中，而不仅仅是在介质表面(如膜/表面过滤器的情况)的过滤器。当要过滤的流体含有大量颗粒时，通常使用深度过滤器，因为相对于其他类型的过滤器，它们可以在堵塞之前保留大量颗粒(有关深度过滤器和其他过滤器的更多信息，参见derek b purchas和ken sutherland,handbook of filter media(第2版),elsevier advanced technology(2002))。
[0169]
深度过滤器通常具有大小和几何形状不同的孔隙通道的随机网络。它们由多种固体材料制成。构造材料包括单独或组合的各种形式的石英、聚合物、纤维素和玻璃。用于制造深度过滤器的过程不会导致固体基质的规则排列。相反，在给定结构中存在一定范围的孔径，其中包括比标称孔径等级大得多和小得多的孔。
[0170]
深度过滤器通常由以下一种或多种材料制成：
[0171]
·
石英；
[0172]
·
玻璃纤维；
[0173]
·
聚合物；
[0174]
·
纤维素；和
[0175]
·
纤维素与其他添加剂，诸如硅藻土。
[0176]
用于本技术的优选的深度过滤器由纤维素、填充纤维素、石英、玻璃纤维或聚合物形成。过滤材料通常对于正在处理的分子和方法中所用的试剂应该是惰性的，从而避免不期望的反应。
[0177]
深度过滤器通常不像膜过滤器(表面过滤器)那样以限定的孔径为特征，并且孔径通常是高度可变的。因此，为基于深度过滤器的基质限定特定的孔径是不精确的。深度过滤器通常根据目标粒度保留，例如5μm、1μm等来提及。深度过滤器的形式多种多样，从片式到管状柱再到褶皱式过滤器，物理形式多种多样。
[0178]
用于本技术的特别优选的深度过滤器包括石英、硼硅酸盐深度过滤器、纤维素和/或纤维素加硅藻土或矿物或碳或其他材料，它们的许多形式可从许多供应商诸如ahlstrom、eaton、emd millipore、ertelalsop、filtrox、hobra-pall、sartorius、whatman或专有组成和结构的替代品获得，只要材料基本上符合深度过滤器的性质即可。
[0179]
深度过滤器具有大小和几何形状不同的孔隙通道的随机网络。它们由多种固体材料制成。构造材料包括单独或组合的各种形式的塑料、纤维素和玻璃。用于制造深度过滤器的过程不会导致固体基质的规则排列。而是，在给定结构中存在一定范围的孔径，其中包括比孔径等级大得多和小得多的孔。
[0180]
结构的随机性不允许指定可以通过过滤器的颗粒大小的明确上限。滤液中的一部分颗粒将超过孔径等级。深度过滤器还可以截留大部分小于孔径等级的颗粒。因为深度过滤器在整个结构中捕获颗粒，它们通常表现出很高的颗粒处理能力。这使得它们在被过滤的溶液具有高颗粒装载的应用中特别有用。深度过滤器不被视为消毒级。
[0181]
不同等级的深度过滤器可以具有不同的孔径，即可以使用4级(20-25μm孔)、598级(8-10μm孔)和3级(6μm孔)，并且会达到一定程度的截留，但是更细或更粗的过滤器可以提供改进的性能，这取决于允许通过的分子和希望保留在过滤器上的分子的性质。因此，所指
示是捕获范围从15μm至0.1μm(或甚至更小)的深度过滤器是优选的，例如约15μm或更细、约5μm或更细、约1μm或更细、约0.5μm或更细是合适的。
[0182]
深度过滤器通常用作预过滤器，因为它们是除去≥98％的悬浮固体并保护下游元件免受污染或堵塞的经济方法。它们的高容量归因于污染物被捕获并保留在整个过滤器深度内的事实。
[0183]
常规深度过滤器可以由以下材料制成：
[0184]
·
石英
[0185]
·
玻璃纤维
[0186]
·
聚合物
[0187]
·
纤维素
[0188]
·
纤维素与填充剂，诸如硅藻土
[0189]
石英.过滤介质由纯微石英纤维制成。这种介质可以在含有或不含有玻璃纤维和粘合剂的情况下产生。不含玻璃纤维和粘合剂的介质特别适用于900-950℃高温下的排放控制以及需要过滤介质绝对纯度的任何地方。极好的过滤性能、最少的金属含量、出色的重量和尺寸稳定性。
[0190]
玻璃纤维.顾名思义，玻璃纤维深度过滤器由玻璃纤维制成。在片材形式中，纤维最初仅由于机械相互作用而保持在一起。为了提高处理特征，有时会用聚合物粘合剂诸如聚乙烯醇处理过滤器，该粘合剂用于将基质保持在一起。玻璃纤维过滤器也容易发生纤维脱落。如果需要，可以在下游放置膜过滤器以保留任何纤维。实例包括gf/d(whatman)，即在上述实例中使用的过滤材料。
[0191]
聚合物.聚合物深度过滤器由各种长度、形态和直径的塑料纤维制成。为了提高这些过滤器的强度并降低纤维脱落的程度，可以对过滤器进行压延，在圆柱辊之间运行材料以施加压力和/或热的过程。大多数聚合物深度过滤器本质上是疏水的。对于低压水过滤，过滤器可以需要进行表面处理以使其可润湿。聚合物深度过滤器通常非常坚固且易于操作。
[0192]
纤维素.顾名思义，纤维素深度过滤器由纤维素纤维制成。纤维可以来源于相对粗的来源，诸如木浆，或高度纯化的来源，诸如棉花。过滤器采用与造纸非常相似的技术制造，并且非常经济。虽然它们在干燥时通常很容易处理，但在潮湿时它们的机械性能非常弱。纤维素过滤器在制造成装置期间和用于过滤时容易脱落纤维。如果需要，可以在下游放置膜过滤器以保留任何纤维。纤维素纤维也可以是污染物的来源，然而将纤维素过滤器嵌入其他材料诸如硅藻土的能力提供了独特的机会。各种此类高度纯化的形式可以是有用的。
[0193]
缓冲液
[0194]
用于质谱分析准备的常规沉淀方法是苛刻的并且会导致剧烈的沉淀和聚集，这使得它们对酶活性相当不敏感。以蛋白质为例，现有技术方法中的示例性沉淀剂包括三氯乙酸(tca)，通常为100％w/v溶液(在350ml dh2o中的500g tca)。参见，例如curr protoc protein sci.2010年2月；章节:单元
–
16.12。这种沉淀的蛋白质必须用强离液剂处理，以使其对蛋白酶作用敏感。用于此类目的的示例性离液剂包括尿素(例如，8m浓度)等，或使用洗涤剂等。
[0195]
本技术可以涉及使用可以被认为是温和离液的缓冲液等。例如，本技术的优选缓
冲液基于甲醇和乙酸铵。一个具体的实施方案是50％甲醇和50％30mm乙酸铵作为凝结剂，含有3％非离子洗涤剂。另一个具体和优选的实施方案是四倍体积的甲醇作为含有30mm乙酸铵(在无水甲醇中从1m乙酸铵水溶液储液制备)的凝结剂，其添加到在30mm乙酸铵中用探针声处理提取的样品中。另一个具体的实施方案是50％甲醇和30mm乙酸铵作为洗涤溶液。这些组成对生物分子的离液作用要小得多，包括那些沉淀和聚集的分子，包括(但不限于)dna和蛋白质，这与尿素或盐酸胍完全不同。
[0196]
合适地，凝结剂包含水溶液和有机溶剂的混合物，最典型地在两份甲醇对一份水性提取溶液至十份甲醇对一份水性提取溶液的范围内。对本领域的技术人员显而易见的是，甲醇只是一种代表性有机溶剂，许多其他溶剂也可用于相同目的。
[0197]
水性提取溶液可以是中性的，诸如在具体实施方案中为接近ph7的30mm乙酸铵，或碱性的，诸如1.8％氢氧化铵，或酸性的，诸如1m hcl或甲酸。
[0198]
当蛋白质以其天然状态被捕获时，例如用于随后的酶促处理，接近中性的水性提取溶剂是优选的实施方案。提取溶液可以含有洗涤剂，而洗涤剂通常不理想，因为它们会干扰未与捕获基质结合的分子类别的下游分析。根据所需分子的种类和类别，中性水提取液中缓冲剂诸如乙酸铵的浓度可以从1mm至高达多倍摩尔不等。类似地，碱的浓度可以从小于1％至最大溶解度变化，例如氢氧化铵最大为35.6％w/w；通常1％
–
5％的碱是最合适的，虽然其他实施方案也是可能的。
[0199]
在碱性提取中，氢氧化铵是优选的，因为它具有挥发性。酸性提取水溶液中的酸浓度在10mm和多倍摩尔之间，再次根据所需的分子类别进行优化。应该注意的是，在优选的实施方案中，挥发性酸、碱和缓冲剂是需要的，因为它们可以通过快速真空除去。还应该注意的是，在中性ph附近捕获是最好的，并且还注意到，虽然提取溶液通常是水性的，但没有理由它必须是水性的，只要它能够实现下面描述的捕获和分馏机制即可。对本领域的技术人员显而易见的是，存在许多缓冲剂、酸和碱以及凝结剂，并且本段中描述的物质仅用作示例性实例而不是限制性的。
[0200]
通常酸性或碱性提取是有利的，因为在非生理ph值下，可降解样品的酶，诸如但不限于蛋白酶、磷酸酶、脂肪酶、糖苷酶、核酸酶等是无活性的或低活性的。
[0201]
为了确定所需的凝结剂浓度，通常将用提取溶剂提取的样品溶液暴露于不同浓度的凝结剂中，让其流过捕集基质(通常是深度过滤器)，然后首先浓缩流过物，然后分析将被捕获的分子类别。例如，在包含小分子诸如代谢物和蛋白质以及dna和rna以及聚糖的流过物被保留在阱上的实施方案中，将通过例如sds page分析蛋白质和通过例如聚丙烯酰胺凝胶分析dna，每种凝胶通过它们各自的染色剂(例如胶体考马斯、凝集素和溴化乙锭，以及用于蛋白质、核酸和聚糖的许多其他染色剂)显示。如果未捕获所需的蛋白质类别，则必须尝试不同的凝结剂或不同的浓度，直到实现分子类别的可逆捕获。在一项测试中，发现对于含有抗体的水溶液，六比一体积过量的甲醇可以提供良好的捕获。
[0202]
将分子凝结到基质上的其他方法也适用于本技术。例如，盐可用于驱动“盐析”沉淀。在这些实施方案中，必须考虑此类凝结方法的下游影响。例如，peg可用于将物质排除在溶液之外，然而peg将使下游分析几乎不可能。
[0203]
可使用下述方法测试用于本技术的任何凝结剂的适用性。具体而言，任何凝结剂都应该能够使已经用提取溶液溶解的生物分子或分子(如果它不接近中性，则在捕获前中
和至中性附近)捕获在捕获基质上，并且如此保留的分子应该能够在装置中和/或在捕获基质上用酶诸如(但不限于)核酸酶、蛋白酶(通常是胰蛋白酶)、糖苷酶以及许多其他酶或替代地各种化学物质进行处理，而不需要对于用强试剂诸如离液剂(如尿素或表面活性剂或洗涤剂)增溶。如上所述，如果时间过长，分子会聚集和沉淀，这可能导致酶诸如蛋白酶不再有效。因此，应在捕获基质上的分子被捕获之后，或者理想地，在如上所述的深度过滤器捕获基质中捕获分子之后立即评估对酶促和/或化学处理的敏感性。还可以进行样品暴露于凝结剂的时间过程。此外，凝结剂不应阻止使用质谱法对提取和可能处理的分子进行下游分析。
[0204]
包含样品提取溶剂和凝结剂的样品通常与捕获基质接触，虽然基质也可以处理来自样品的任何沉淀或碎片，并且容纳捕获基质的器皿可以容纳凝结剂并且提取溶剂可以直接添加至凝结剂中。
[0205]
在将提取溶剂/凝结剂混合物添加到基质中的情况下，基质可以已经被流体介质(相)渗透，即溶液并且通常是与提取溶剂/凝结剂混合物的组成相匹配的流体。优选地，渗透基质的流体介质是轻度离液的。例如，它可以包含短链醇，例如甲醇、乙醇或丙醇的水溶液，或其他有机溶剂。最优选的是甲醇水溶液，例如通常包含60％或更高。
[0206]
示例性和通常优选的提取溶剂/凝结剂混合物是用与四倍体积的凝结剂混合的一倍体积的30mm乙酸铵进行样品提取，特别是对于该实例而言，是含有30mm乙酸铵的甲醇，由此将无水甲醇由1m乙酸铵水溶液储液补充至30mm乙酸铵。
[0207]
洗涤具有捕获的分子的捕获基质的步骤对于捕获的内源分子不是强制性的，然而如果蛋白质在捕获基质上被还原和烷基化或者以其它方式被化学操纵，则是强制性的；这通常发生在回收小分子诸如脂质和代谢物之后。洗涤还除去了污染物，并且可以使用使污染物增溶的任何合适的洗涤液或者不使所关注的分子增溶的还原/烷基化试剂(或任何其他化学处理，诸如切割或脱酰胺或氧化的试剂)。合适的液体是含有上述乙酸铵的各种甲醇水溶液。然而，其他液体将是合适的，并且任何推定的洗涤液的适用性都可以很容易地测试。通常温和离液剂可用于此目的。在理想情况下，它们应该与质谱相容。
[0208]
在某些情况下，可能需要除去洗涤液，例如在该液体的存在可能对随后施用的加工酶诸如蛋白酶或核酸酶或糖苷酶的活性产生不利影响的情况下，并且用另一种缓冲液替代它。这很容易通过使用甲醇水溶液的第一洗涤步骤除去还原和烷基化试剂(可以使用其他有机溶剂组合物)和例如使用水或碳酸氢铵水溶液的第二冲洗步骤除去残留的甲醇溶液来完成。然后可以将含有试剂诸如碳酸氢铵或乙酸盐以及本领域的技术人员已知的许多其他试剂以及任何必要的辅因子的水性缓冲液用于下游处理目的。
[0209]
处理
[0210]
在本技术中，在小分子已经在溶剂提取溶液与凝结溶液组合的流过物中被分离和捕获之后，施用用于处理捕获的分子的酶(诸如蛋白酶或核酸酶或糖苷酶)。用蛋白酶消化蛋白质是制备用于质谱分析的蛋白质的常规步骤。典型的蛋白酶包括胰蛋白酶或lysc，但它可以是任何其他合适的蛋白酶，例如胰凝乳蛋白酶和许多其他蛋白酶。例如，在50mm碳酸氢铵中的0.07μg/μl胰蛋白酶(03708985001,roche或v5111,promega)可用于本技术的实施方案中。聚糖可以通过酶促方式切割或处理或释放。n-连接聚糖可以与肽-n-葡萄糖苷酶f(png酶f)一起释放。png酶f释放大多数聚糖，除了那些还原末端glcnac含有1-3连接岩藻糖
的聚糖。在这种情况下，使用酶肽-n-葡萄糖苷酶a(png酶a)。对于o-连接聚糖释放和后续分析，与png酶f相当的酶较少。通常，o-连接聚糖的释放是通过化学方法诸如β-消除来实现的。然而，genovis提供了用于糖蛋白的o-聚糖特异性消化的o-蛋白酶(operator)、用于核心1和核心3的o-聚糖(oglyzor)的内切糖苷酶(o-糖苷酶)和作用于唾液酸的外切糖苷酶(sialexo)；所有这些酶均可用于本技术的实施方案中，最优选地应用于捕获基质。
[0211]
用于处理捕获的分子的酶(诸如蛋白酶或核酸酶或糖苷酶或脂肪酶或其他酶)通常被添加到渗透基质的介质中。多种酶可以连续或平行使用。例如，大分子可以在如上所述的捕获基质中分离和捕获，同时捕获小分子。聚糖可以用png酶f释放或切割，因为它们是高度水溶性的，所以可以通过水洗涤来回收。留下蛋白质，然后可以使蛋白质原位还原和烷基化，然后如上所述用蛋白酶消化。在另一个实例中，在样品的核酸不是所关注的情况下，可以同时添加核酸酶和蛋白酶，只要蛋白酶不立即消化核酸酶即可。
[0212]
合适地，该方法包括使捕获的分子和/或其片段脱盐的步骤。脱盐可以通过用无盐缓冲液和/或水和/或水与有机溶剂诸如甲醇的混合物冲洗分子来实现。脱盐可以在捕获基质内进行，在这种情况下分子仅仅被洗涤，或者在一些实施方案中，本技术具有其他亲和力，诸如c8或c18(参见下文)。
[0213]
洗脱
[0214]
可以使用任何合适的剂洗脱分子及其片段。水可用于溶解聚糖，并且可使dna和rna增溶。dna和rna可以在te缓冲液(1mm edta 10mm tris ph8.0)中增溶。碱性溶液(例如碳酸氢铵)或酸性溶液(例如三氟乙酸)或盐溶液(例如氯化钠)和补充有有机物诸如10％乙腈的水溶液适用于从基质中洗脱蛋白质/片段。值得注意的是，独立于其他分子类别的任何其他处理，可以使用高浓度的甲酸(60％或80％或更多，保持溶液低温以避免甲酰化)或8m尿素或6m guhcl或碱诸如1.8％氢氧化铵从深度过滤器洗脱捕获蛋白质。应该注意的是，声处理有助于这些试剂中的任一种，并且可以通过使用含胺缓冲液来限制由尿素造成的氨甲酰化。
[0215]
该方法可以另外包括使用合适的洗脱溶液从次要基质中洗脱捕获和处理的分子和分子片段，例如对于使用反相捕获的实施方案，合适的洗脱溶液是70％乙腈、0.5％甲酸的h2o溶液。
[0216]
优选地，本技术至少部分使用基本上包含甲醇或另一种醇或有机溶剂的凝结介质。这种介质不仅可用于捕获基质中的捕获，还可用于洗涤。特别优选的介质是大致中性ph(例如6.5至7.5)的缓冲液，包括甲醇或另一种醇(通常为60％或更高v/v的甲醇)和乙酸铵或pka为约中性的其他缓冲液，例如具体地为含有30mm乙酸铵的80％甲醇。只有在提取溶剂与凝结介质组合后才能达到这种配方和组成。其他用于本技术的适合介质将是本领域的技术人员显而易见的。
[0217]
所提供的方法适用于处理包含许多常规表面活性剂的样品。sds通常用作表面活性剂，用于从细胞中增溶和提取膜结合蛋白，但还使用其他表面活性剂，包括胆酸钠、脱氧胆酸钠、正十二烷基-β-d-麦芽糖苷、triton x-114、np-40(thermo scientific)和brij35(thermo scientific)。然而，表面活性剂妨碍下游分析。
[0218]
在装置是移液器吸头或离心柱的情况下，它优选地包括一层主要基质和一层次要基质，这些层被布置成使得主要基质相对于流经装置的净方向位于次要基质的上游。通常，
主要和次要基质设置在装置的锥形部分中，次要基质更靠近窄吸头末端(喷嘴)，主要基质更靠近宽末端。
[0219]
主要和/或次要基质可各自包括相关材料(例如深度过滤器或疏水二氧化硅)的一个或多个平坦层(例如用于横截面为圆形的器皿的圆盘)。可以堆叠两层或更多层相关材料以提供所需的总深度，从而提供所需的基质的体积和容量。或者，可以使用更厚并因此容量更大的材料。
[0220]
可以以任何合适的方式将基质保持在装置中，例如机械方式(例如通过与装置的壁摩擦，或使用夹子、框架或其他支撑装置)或通过粘合剂等(提供的这种粘合剂等与方法相容)。
[0221]
装置适合于安装在离心机中以促进驱动各种介质、试剂、缓冲液等通过基质。
[0222]
或者，装置适于连接到一个或多个泵，以驱动各种介质、试剂、缓冲液等通过基质。
[0223]
装置可以适当地是微流体装置。
[0224]
装置可以与保持器结合提供，例如允许将装置安装在离心机中的支撑件或实验室装备中的其他零件。
[0225]
本技术提供了一种包括装置和相关的样品处理设备的系统。
[0226]
在某些实施方案中，阱可以与计算机控制系统或与微流体和/或下文描述的允许自动化样品处理的其他设备组合。在一个示例性实施方案中，计算机系统包括存储器、处理器和任选地辅助存储装置。在一些实施方案中，计算机系统包括多个处理器并且被构造为多个例如刀片服务器或其他已知的服务器构型。在特定实施方案中，计算机系统还包括输入装置、显示装置和输出装置。在一些实施方案中，存储器包括ram或类似类型的存储器。在特定实施方案中，存储器存储一个或多个应用程序以供处理器执行。在一些实施方案中，辅助存储装置包括硬盘驱动器、软盘驱动器、cd-rom或dvd驱动器或其他类型的非易失性数据存储器。在特定实施方案中，处理器执行存储在存储器或辅助存储器中或从互联网或其他网络接收的一个或多个应用程序。在一些实施方案中，处理器的处理可以在软件、诸如软件模块中实现，以供计算机或其他机器执行。这些应用程序优选地包括可执行的指令，以执行上文描述和在本文的图中显示的功能和方法。应用程序优选地提供gui，使用者可以通过其查看一个或多个应用程序并与一个或多个应用程序交互。在其他实施方案中，系统包括远程访问，以控制和/或查看系统。
[0227]
系统可以适于执行本技术的方法的几个步骤，例如至少分子捕获、分子转移至基质、分馏和根据需要洗涤、随后用酶处理和随后分馏的步骤。
[0228]
此外，系统还可以适用于执行细胞裂解、生物分子提取和从基质洗脱生物分子片段中的一者或多者。
[0229]
本技术提供了一种试剂盒，其包括装置和一个或多个容器，所述容器包括以下中的至少一者：用于装置的缓冲介质；用于细胞裂解和膜结合蛋白增溶的试剂；酶，包括(例如)蛋白酶、核酸酶、糖苷酶、脂肪酶等；根据需要的洗涤剂/冲洗剂；以及多种洗脱试剂，其根据如本文所述的生物分子类别性质进行选择。本文讨论了各种合适的介质、试剂等。
[0230]
离心柱组装件
[0231]
仍然需要一种简单、高效和可重复，与少量样品相容的样品制备工具，该工具从相同的生物样品中产生来自样品的不同类别分子的分离级分，通常(但不一定)是诸如活检或
血液样品或其他生物学片段的生物样品。本技术提供了一种精致且易于使用的内小瓶和外小瓶的两部分嵌套系统，以满足这些实验需要。内小瓶具有用以保留和支撑一种或多种基质和本领域熟悉的其他组件，诸如玻璃料和膜的空间。内小瓶和外小瓶在两个位置，即“下部”和“上部”停放位置交界。在下部停放位置，外柱密封内小瓶，防止流出内小瓶，并允许在基质之内和顶部以及内小瓶体积内所需的任何温育条件下发生反应。然后可以将内小瓶提升到上部停放位置，在该位置溶液可以从内小瓶的内部通过基质流到外小瓶的内部。然后，外小瓶成为任何温育步骤的流过物的容纳件，并且不存在塞子损失的问题，因为外小瓶代替了塞子。
[0232]
两件式系统不需要任何堵塞来影响温育或反应，从而最大限度地减少处理并最大限度地提高样品处理速度以及样品回收。该系统具有上部停放位置和下部停放位置，通过接合或分离内小瓶和外小瓶之间的锁定机构来实现，该锁定机构阻止或允许基质流出。在一个优选的实施方案中，锁定机构包括内小瓶外部的倒置u形止动件和外小瓶内侧的支撑柱，该支撑柱可以接合u的中部以将其支撑在上部停放位置或从支撑柱上脱离，以使内小瓶就位到外小瓶的最底部。在上部停放位置，内小瓶的内容物和基质可以通过多孔基质输送到外小瓶，例如通过正压或离心，或通过适当施加负压。在下部停放位置，内小瓶被外小瓶密封，允许进行需要温育的处理，诸如凝结步骤。内小瓶与外小瓶紧密交界并密封，允许内小瓶及其基质和内容物接收热、光、电磁辐射(如微波)、声能(如超声处理)、压力或施加于外小瓶外部的任何其他多种处理。使用此类外部处理，尤其是声处理和热和压力，可以显著减少化学和酶促反应的反应时间，或增溶材料所需的时间。
[0233]
本技术方便地提供了一种通过浸入溶液对样品进行此类处理(包括但不限于例如超声处理和温育)同时防止污染的方法；在这种处理过程中，不能依靠具有塞子的装置来保持密封。在下部停放位置，死体积通过销来最小化，所述销填充基质下方输出中的大部分空隙空间。这允许最小反应体积和最大洗脱浓度的反应，诸如但不限于在基质之上、之中、之内或顶部的酶促反应，或尤其从c18或scx等色谱介质中洗脱。在后续处理步骤之后，一旦外小瓶接受了基质或样品的流过物，外小瓶即可关闭并用其集成的帽密封，成为洗脱或处理材料的储存容器；多个外小瓶可用于产生多个级分的多个处理步骤，并且外小瓶避免了样品转移和基质堵塞。因此，在频繁的样品转移过程中加剧的吸附损失被降至最低。外小瓶具有面向d形销的平坦表面的倾斜下表面，从而首先形成区域，样品由于重力和/或离心力流入该区域，第二区域提供足够的空间，以便样品可以被移除或通过标准手段抽取或取样，所述标准手段诸如移液器吸头或抽吸针，以及许多其他样品运输和处理技术。内小瓶和外小瓶的设计可以保持相同，但可以很容易地使用许多不同的基质进行更改，从而允许将该系统应用于许多处理工作流程。最后，内小瓶的鲁尔锁定输出是标准的，可轻松将内小瓶连接到许多其他消耗品和装置，诸如sep-pakc18一次性spe单元或真空歧管，从而使系统能够灵活地适应最大的工作流程数量。
[0234]
离心柱组装件113的代表性实施方案详述于图10-14中，并且96孔板形式115的代表性实施方案详述于图15和16中。对于本领域的技术人员来说显而易见的是，这些仅仅是代表性实施方案，并且它们不是限制性的。
[0235]
内小瓶101包括开口129，液体和/或固体样品可以沉积在所述开口中；用于容纳样品的空间122；连接到盖237的铰链185，所述盖具有用于打开和关闭的舌片281；以及用于在
温育期间密封内小瓶的肋状密封机构248，并且所述密封机构具有排气口127，它允许气压在内小瓶的内部和外部之间平衡。样品容纳空间122连接并暴露于多孔基质117，所述多孔基质位于内小瓶底部的锥形截面中，从而通过离心或正压或负压在制造和操作期间提供更好的密封，虽然锥形只是代表性形状并且不是限制性的，并且所述基质117在底部到内小瓶底部开口269开放，在所呈现的具体实施方案中，具有鲁尔锁203的外部尺寸，但可以具有其他尺寸。在所提出的实施方案中，内小瓶具有三个倒置u形止动件153(参见图13)，如果旋转到内小瓶盖和外小瓶盖之间的正确角度偏移，所述止动件则可以与外小瓶174的内部上的支撑件交界，以将内小瓶101支撑在上部停放位置，如图10和11所示。在该上部停放位置，样品可以从空间122穿过基质117，穿过内小瓶的底部开口269并进入外小瓶222的样品容纳空间。然而，如果内小瓶定位成使得内小瓶盖237和外小瓶盖217直接在彼此上方，如图12和14所示，内小瓶即可通过由与外小瓶的紧密接口276和外小瓶的d销145密封的外小瓶的底部；这是下部停放位置(参见图12和14)。通过这种方式，内小瓶和外小瓶的组合消除了在通过基质进行处理时对塞子的需要，尤其是在需要温育时。内小瓶101的输出通道269被设计为精确地配合外小瓶109底部的空间，尤其是提供样品收集空间195的外小瓶的斜率。
[0236]
外小瓶109包括具有开口的小瓶，所述开口被构造为在上部停放位置(图10和11)接收内小瓶101，其中支撑杆174接合在内小瓶的止动件153中，或者在下部停放位置(图12和14)，其中外小瓶通过紧密接口276和d销145密封内小瓶。在最优选的实施方案中，d销145几乎接触到基质117，因此占据了内小瓶输出通道或开口269的大部分或全部死空间。外小瓶具有通过铰链168附接的盖217，所述盖具有用于打开和关闭它的舌片299以及与盖217交界的肋密封机构256。当内小瓶的盖子对齐时，支撑杆174不接合内小瓶并且内小瓶通过图12和14所示的下部停放位置。紧密接口276有意紧密以最有效地传递处理，诸如但不限于将施加到组装件273底部区域处的外小瓶外部的热、光、超声能或电磁能传递到内小瓶的内部，包括传递到基质117和结合在基质之上、之中或顶部的任何材料，以及保持在内小瓶样品容纳空间122内的任何溶液。外小瓶的底部倾斜以形成样品收集区195，该样品收集区与d销的平坦侧直接相对；d销形状为正常尺寸的移液器吸头提供足够的空间以通过样品收集区195的底部。该样品收集区195的低性质允许保持在外小瓶的样品容纳区域222中的溶液通过重力或离心向下流动并且通过标准装置，诸如几乎定量的移液进行回收。内小瓶和外小瓶之间的d销145和形状配合的紧密接口176消除了在通过基质进行处理时对塞子需要。
[0237]
样品处理在内小瓶101中开始。当内小瓶101和外小瓶109处于通过使用提供给内小瓶153和外小瓶174的锁定/止动/支撑机构保持的上部停放定位时，不需要初始温育的样品或已经在单独囊袋中与必要试剂一起温育的样品可以立即通过上开口129施加到内小瓶的内部样品容纳空间112中(参见图10和11)。样品可以包含固体或凝结或沉淀或絮状材料，或珠粒或其他不溶性组分，根据实验要求，所有这些都可以与任何液体一起装载，也可以不装载。在未进行初始温育的情况下，内小瓶和外小瓶组装件113然后通常用盖237封闭，所述盖与具有肋密封机构248的内小瓶129的开口交界。
[0238]
可替代地并且根据情况，内小瓶可以放置在下部停放位置(图12和14)并且内部空间122可以预加载试剂，诸如凝结试剂或沉淀或增溶试剂。然后可以将样品直接引入液体试剂中，在内小瓶中在所需条件下温育所需的时间。
[0239]
在温育期间，内小瓶101可以用其盖237密封以进行温育，盖在其铰链185处弯曲，
铰链被手动操作或通过操作舌片281自动操作以打开或关闭。需要热量的温育使也包含在内部空间122中的气体膨胀；因此，内小瓶盖237具有排气口137以允许内部压力与内小瓶101外部的大气平衡。该相同的排气口137提供，在样品从内小瓶的内部空间122传递到外小瓶222的内部空间的过程中不建立真空；此步骤发生在两个零件接合在上部停放位置时。
[0240]
在下部停放位置(图12和14)，内小瓶101和外小瓶109的底部部分273非常紧密地嵌套，因为外小瓶的内部尺寸被确定为与接口276处内小瓶的外部尺寸精确匹配。这种紧密接口有利于从外小瓶的外部流到内小瓶的内部，其内容物和基质处理，诸如热或光或电磁辐射或声能，如超声处理；通过处理处于下部停放位置的接合嵌套组装件113的下部273，例如通过将至少部分273放置于超声浴中，或通过将其放置于培养箱中，或将其暴露在光或微波下，或其他处理方法，将此类处理提供给内小瓶101及其内容物。暴露于此类处理可以加速和促进化学和酶促反应，以及增溶或物理破坏组装件内的材料。
[0241]
在下部停放位置，外小瓶销145主要占据内小瓶203的输出的死空间内部。这对于最小化反应或洗脱体积、保持分析物的最大浓度以及最大程度地减少可能昂贵的试剂诸如质谱级酶(如蛋白酶)的浪费非常重要。
[0242]
当处于下部停放位置时，紧密配合在区域273中将内小瓶101密封在外小瓶109上，密封内小瓶并防止从其内部122或基质117的流出，从而消除了对塞子的需要。接口276的密封性也很重要，因为它的体积可以忽略不计，通常《10μl并且通常《2μl，这取决于制造的一致性，从而来自内小瓶101的内部空间122的任何泄漏都被限制在小空间，因为接口276中的溶液水平面与内柱122的内部空间上的溶液水平相等；如果发生这种体积的泄漏，则可以忽略不计且可以接受。实际上，通过离心用溶液填充接口276处剩余的任何空间是有利的，以促进外部处理(如热或超声处理)从外小瓶的外部流向内小瓶的内部，包括其基质和内容物。本领域的技术人员将认识到，本技术可以缩放到比所提供的实例大得多或小得多，并且本文提供的这些实例不是限制性的，并且本文列出的示例性死体积将随着进行特定实施方案的规模而变化。如前所述，本技术被缩放以适合标准台式离心机。具体考虑的形式包括用于实验室和分析设置的标准尺寸，诸如管从0.2ml到2ml，包括0.5和1.7ml尺寸，以及锥形管，诸如15和50ml锥形管(falcon管)。
[0243]
无论样品是否需要初始温育，在温育完成后，在如图12和14所示的下部停放位置施加任何潜在的处理，诸如时间或热或超声处理后，内小瓶101可返回至外小瓶109内的上部停放位置，如图10和11所示。然后可以通过离心、重力流或者正压或负压使内小瓶的样品容纳空间122内的样品通过基质117。施加正压需要盖237保持打开。可离心组装件的典型力为4,000g；它可以更高或更低，具体取决于使用情况和基质117的强度。
[0244]
如果基质具有亲和或色谱或过滤功能，则第一级分将是通过基质117的部分的流过级分；该级分将进入外小瓶222的样品容纳空间。如果需要，随后可以通过将内小瓶101移动到新的外小瓶109来进行洗涤，如果需要，外小瓶可以捕获洗涤液。或者，根据实验的需要，洗涤液可以直接进入流过物中。
[0245]
无论是否进行洗涤，结合或保留在基质117之中、之上或由基质结合或保留的材料已准备好进一步处理。内柱101被拉起以脱离锁定/支撑机构153，并且可能在新的外小瓶中的内小瓶被放置在下部停放位置，以将内小瓶与外小瓶密封。然后通过开口129将处理试剂添加到内小瓶的内部，进入样品保持和处理空间122。最典型地，组装的内小瓶和外小瓶将
经受离心以置换来自基质117的所有空气并用处理试剂填充任何死空间。最常见的处理试剂包括：洗脱溶液，诸如用于洗脱核酸的水性缓冲液或用于溶解脂质或其他疏水性化合物的疏水性溶剂，在这两种情况和其他情况下，可以应用热和/或声处理来帮助溶解和洗脱所关注的级分；酶，诸如蛋白酶，如胰蛋白酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、lys-c、lys-n、asp-n、glu-c、arg-c和tryp-n，其中存在数百至数千种酶的核酸酶，糖苷酶，如png酶f，和其他酶或蛋白质，如hrp缀合酶或抗体或蛋白质；化学处理，诸如利用反应化学物质的衍生化，所述反应化学物质如异硫氰酸酯，如fitc或nhs酯或等压标记或半胱氨酸标记，以及许多其他反应，或还原和烷基化；或者其他处理。然后为这些处理提供必要的时间、温度、能量添加，无论是来自热还是声处理等，以完成处理。在处理完成后，内小瓶101再次移动到上部停放位置，如图10和11所示，从基质释放的样品部分再次通过压力或离心被推进通过基质117。
[0246]
此类处理可以是连续的，每次都可能发生在新的外小瓶中，并且每次都释放样品的新级分，该样品保留或结合在基质之上、之中或由基质保留或结合。例如，在凝结剂诸如有机溶剂的情况下，首先将有机溶剂添加到处于下部停放位置的内小瓶中，然后将样品(例如含有乙酸铵的血清)添加到凝结剂中，并使样品通过基质117，所述基质适用于在内小瓶提升到上部停放位置后捕获样品的生物聚合物，所得的第一级分将是小分子。如果然后将内小瓶返回到新的外小瓶中的下部停放位置，并施加水溶液，特别是在热和/或声处理的帮助下，一旦内小瓶再次处于上部停放位置，核酸就可以溶解和洗脱。将内小瓶返回下部停放位置的新的外小瓶，保留和结合的生物聚合物可以用png酶f处理以释放聚糖。内小瓶再次放置在上部停放位置，并且聚糖被洗脱。将内小瓶放入新的外小瓶中，可以使蛋白质暴露于使用例如tcep的还原和使用例如mmts的烷基化。在还原和烷基化后，可以将蛋白质从试剂中洗掉，很可能进入废液管，作为最后一步，可以施用蛋白酶诸如胰蛋白酶将结合或保留在基质之上或之中或由基质结合或保留的蛋白质处理成肽。这种反应可以通过施加到组装的内小瓶和外小瓶273的下部区域的热和声处理来加速，所述热和声处理由内小瓶和外小瓶276之间的紧密接口提供。
[0247]
图10-14中所示的实施方案需要旋转以使倒置的u形止动件153与外小瓶的相应支撑机构174啮合。本领域的技术人员将理解许多这样的锁定机构是可能的，包括支撑柱，其保持内小瓶，或者当放置在凹部中时，允许内小瓶密封外小瓶(参见图18)；推上凸块或搭扣或脊，用于在外小瓶内的不同垂直高度处支撑内小瓶(图21-22)，其可以在外小瓶内和外小瓶外具有径向断裂，以允许凸块或搭扣或脊通过旋转(图21)或螺纹(图22)来脱离。或者，存在这样的实施方案，其中锁定机构通过侧释放设计允许或禁止流过基质，其中外小瓶根据旋转位置密封或不密封内小瓶，并且其中可以考虑搭扣配合锁定机构提供密封(图19)。
[0248]
值得注意的是，鲁尔锁203允许管状柱诸如spe管状柱如c18sep-paks可逆地直接连接到内小瓶。此类管状柱可以具有针对基质117列出的任何亲和力，并且使组装件特别灵活并且能够使用目前存在的样品制备和色谱产品。
[0249]
上述步骤和方法以及组装件很容易通过制备单柱的阵列来平行化，如图15和16的示例性96孔板实施方案所示。此类实施方案保持完全相同的紧密密封和接口机构276、d销145、基质117、样品收集区195以及内小瓶(122)和外小瓶(222)的样品容纳空间。不同之处在于用于支撑上部和下部停放位置的机构。在图15和16中，两个支撑件326和331存在于由铰链311支撑的侧舌片上，铰链允许侧舌片通过向外摆动而在上部和下部停放位置接合或
脱离。在图15中，内板303与外板308密封的下部停放位置由两侧的支撑舌片326保持，所述支撑舌片将内板303向下压靠在外板308上。在图16中，两侧的支撑舌片331将内部空间303向上托起，使得样品容纳空间122中的内板的内容物可以流过基质117，通过内板269的底部开口进入外板226的样品容纳空间。单独的离心柱和板之间的使用或处理步骤没有区别，唯一的例外是板或其他阵列必须以稍微不同的方式支撑。本领域的技术人员可以设想多种机构来将内板支撑在外板的样品容纳空间226内，所述机构包括例如夹子或支撑环或轴环或舌片，它们可以集成到内板或外板，或它们二者中，或者它可以是第三零件，或向上或折叠以提供上部和下部停放位置的柱或支撑件。
[0250]
本技术通过以下不应被解释为限制的实施例进一步展示。本技术全文引用的所有参考文献、专利和公开专利申请以及附图和表格的内容以引用的方式并入本文。
[0251]
实施例
[0252]
这项工作概述和展示了同时捕获技术sitrap的概念，该技术用于无洗涤剂蛋白质组学和代谢物组学样品制备，可扩展到许多其他类别的分子，诸如dna、rna和聚糖，包括与蛋白质共价连接的聚糖。sitrap方法提供了对同一样品进行简单而稳健的多组学分析的机会，这对组学数据中的比较生物学推断、高通量组学分析具有重大影响，并且在转化医学研究中使用有限的样品量时至关重要。
[0253]
方法
[0254]
sitrap吸头
[0255]
sitrap吸头使用纤维素或石英深度过滤材料制成。将1.6mm直径塞子插入移液器吸头(d200,gilson)。sitrap纤维素吸头用于细胞和组织分析。对于涉及离心(加载、洗涤和洗脱)的样品处理步骤，在管连接头的帮助下将吸头放置于2.0或1.5ml样品管中。
[0256]
样品处理
[0257]
细胞沉淀
[0258]
将mda-mb-231细胞沉淀(每个沉淀1,000,000个细胞)在250μl用于sitrap的裂解溶液(30mm乙酸铵、1.8％氢氧化铵(通过稀释28％氢氧化铵储液(sigma)制备)、在30mm乙酸铵溶液中的3％sds、在30mm乙酸铵溶液中的3％p407)以及用于基于sds的方法的在50mm tris-hcl ph7.6中的3％sds中通过探针声处理裂解。通过在18℃下以11,000g离心2min使提取物澄清。通过pierce bca蛋白质测定试剂盒(thermo)测量蛋白质浓度。在每种情况下，处理30μg蛋白质，重复六次。对于乙酸铵(aa)提取sitrap处理，将四倍体积的含有30mm aa的甲醇添加到裂解物中，由此将来自1m乙酸铵储液水溶液的无水甲醇补充至30mm aa。对于氢氧化铵(ah)提取sitrap，将等体积的1m乙酸添加到裂解物中，然后添加两倍体积的甲醇。将样品装载到sitrap纤维素吸头。将吸头插入2.0-ml样品管并以2000g离心以捕获蛋白质。通过将80μl在30mm aa中的50％甲醇溶液添加到吸头中，然后以2500g离心30秒来洗涤捕获的蛋白质。取出吸头并放入1.5-ml样品管中。通过向吸头添加60mm三乙基碳酸氢铵(teab)、10mm三(2-羧乙基)膦(tcep)、25mm氯乙酰胺(caa)溶液，然后在80℃下加热30min来使捕获的蛋白质进一步原位变性、还原和烷基化(还原/烷基化溶液应在实验开始前制备，并在使用前充分涡旋)。在用80μl 20mm teab以2500g洗涤30秒后，取出吸头并放入新的1.5-ml样品管中。将浓度为0.07μg/μl的100mm碳酸氢铵中的20μl测序级胰蛋白酶(promega)添加到吸头中。使用具有前述定制吸头连接头的注射器将胰蛋白酶溶液向下推，直到溶液弯液面
proteome-wide protein quantification.nature biotechnology 2008,26,1367-1372)。半胱氨酸的氨基甲酰甲基化被设置为固定修饰，蛋白质n-端乙酰化和甲硫氨酸的氧化作为可变修饰。选择最多三个遗漏的切割和至少一个用于有效蛋白质鉴定的独特肽。最大蛋白质和肽错误发现率设置为0.01。使用panther 14.0进行基因本体(go)特征分析(www.pantherdb.org)(thomas,p.d.,campbell,m.j.,kejariwal,a.,mi,h.等人,panther:a library of protein families and subfamilies indexed by function.genome res 2003,13,2129-2141.)。将perseus软件包1.6.2.3(https://maxquant.net/perseus/)(tyanova,s.,temu,t.,sinitcyn,p.,carlson,a.等人,the perseus computational platform for comprehensive analysis of(prote)omics data.nat methods2016,13,731-740.)用于火山图显著性分析——对蛋白质的平均lfq强度进行log2转换，并将它们的差异针对t检验的相应p值作图，fdr的显著性截止值设置为0.05，s0的显著性截止值设置为0.01。为了进行数据比较，仅使用通过至少两种肽和一种独特肽鉴定的蛋白质。
[0266]
代谢物组学
[0267]
酰基肉碱、游离脂肪酸和胆汁酸的靶向代谢物组lc-ms分析
[0268]
将10μm棕榈酰-l-肉碱-(n-甲基-d3)(sigma)、10μm棕榈酸-d31(sigma)和10μm脱氧胆酸-d6(sigma)在lc-ms级甲醇中的溶液制备为内标加标溶液(isss)。将样品在100μl lc-ms级水和100μl isss中复原，涡旋混合并声处理30min，然后转移到lc小瓶中。色谱使用配备有cortecs t3 2.7μm(2.1x30mm)柱的acquity uplc系统(waters)进行，柱保持在60℃下。将acquity uplc系统与xevo tq-xs质谱仪(waters corporation)耦合。使用的二元溶剂系统是溶剂a，它包含lc-ms级水、0.2mm甲酸铵和0.01％甲酸；和溶剂b，它包含分析级乙腈/异丙醇1:1、0.2mm甲酸铵和0.01％甲酸。对于所有分析，使用10μl进样，流动相设置为1.3ml/min流速。对于酰基肉碱分析，柱流动相在2％溶剂b下保持0.1min，然后在1.2min内从2％增加到98％溶剂b。然后将流动相在98％溶剂b下保持0.9min。然后将流动相恢复为2％溶剂b，保持0.1min以重新平衡柱。对于游离脂肪酸分析，柱流动相在0.7min内从50％增加到98％溶剂b。然后将流动相在98％溶剂b下保持0.5min。然后将流动相恢复为50％溶剂b，保持0.1min以重新平衡柱。对于胆汁酸分析，柱流动相在20％溶剂b下保持0.1min，然后在0.7min内从20％增加到55％溶剂b。将流动相增加到98％溶剂b并保持0.9min。然后将流动相恢复为20％溶剂b，保持0.1min以重新平衡柱。使用多反应监测(mrm)进行分析。转换和电离条件在表1、2和3中给出。对于酰基肉碱分析，使xevo tq-xs在正电喷雾电离(esi)模式下运行。对于游离脂肪酸和胆汁酸分析，使xevo tq-xs在负esi模式下运行。使用50ml/h的锥形气体流速和650℃的去溶剂化温度。
[0269]
代谢物组学数据分析
[0270]
使用waters targetlynx应用程序(waters corporation)处理数据并进行峰积分。将积分的酰基肉碱、游离脂肪酸和胆汁酸峰面积分别针对棕榈酰-l-肉碱-(n-甲基-d3)、棕榈酸-d31或脱氧胆酸-d6内标作归一化。
[0271]
使用metaboanalyst4.0版进行多变量数据分析(chong,j.,soufan,o.,li,c.,caraus,i.等人,metaboanalyst 4.0:towards more transparent and integrative metabolomics analysis.nucleic acids res 2018,46,w486-w494.)。数据集以平均值为中心，并使用主要组分分析(pca)和偏最小二乘判别分析(pls-da)进行分析。通过查询相应
的装载图来鉴定导致模式识别模型内的聚类或回归趋势的代谢物变化。如果在预测/系数图中的变量重要性中确定的代谢物在模型中以95％的置信限促进分离，则它们被认为已发生全局变化。这些使用单变量火山图进行了验证，其倍数变化截止值为1.2，并且p值截止值为0.05。
[0272]
表1酰基肉碱种类的多反应监测参数。酰基肉碱由酰基链的碳长度和不饱和双键的程度指定。内标(is)。
[0273][0274]
表2游离脂肪酸种类的多反应监测参数。游离脂肪酸由酰基链的碳长度和不饱和双键的程度指定。内标(is)。
[0275]
[0276][0277]
表3胆汁酸种类的多反应监测参数。内标(is)。
[0278]
[0279][0280]
根据本技术的公开内容制备吸头形式sitrap，并根据本公开添加一部分样品，使得50μg的蛋白质被捕获在总体积为150μl的乙酸铵和甲醇的捕获基质中；将存在超过50μg的总捕获分子，因为dna、rna和聚糖以及其他分子将被捕获。保留包含小分子和脂质的流过物，将用于脂质组学和代谢物组学分析。可以保留一些脂质和小分子。首先通过加入分子生物学常用的3x50μl te缓冲液来洗脱dna和rna；该级分可以通过转录物组学、rnaseq和基因组学技术进行分析。将样品接下来在50μl磷酸盐缓冲液中用2μg png酶f在37c下处理至少一小时并直至过夜。聚糖被离心并回收用于糖组学分析。如下所述，蛋白质被还原和烷基化。将2μg胰蛋白酶添加至40μl50mm teab(ph8.5)中，并将蛋白质在47c下消化1小时；可以添加其他温育时间和温度。可以对捕获基质进行声处理或超声处理以加速消化。将所得肽用于蛋白质组学分析。或者，可通过在例如40μl60％甲酸、8m尿素或6m guhcl中的声处理来洗脱蛋白质用于自上而下蛋白质组学；这些试剂最适合声处理。
[0281]
为了解决多组学分析的需要，在洗涤剂或离液剂或其他增溶剂阻止对未结合在捕获基质上的分子进行下游分析的情况下，本文设计的系统、装置、过程和方法与蛋白质处理能力和基于洗涤剂的方法的简单性相匹配，但使用不含洗涤剂的组合物用于裂解，允许捕获后对捕获的蛋白质进行原位还原/烷基化，从而为互补“组学”分析提供了无污染物的流过物级分。该过程可以自动化用以制造样品处理机。
[0282]
实施例1
[0283]
在使用细胞裂解物和非离子洗涤剂(诸如辛基葡萄糖苷和泊洛沙姆407)时，出乎意料的是，在使用或不使用洗涤剂的情况下，纤维素或石英深度过滤器可以在接近中性ph值(图1)下捕获天然状态的蛋白质。这是令人惊讶的，并且代表了使该方法成为可能的重大新进展。捕获是稳健的。本领域的技术人员将认识到还有许多其他表面活性剂和洗涤剂。出乎意料的是，另外的原位变性、还原、烷基化和洗涤步骤是可能的，随后在装置和捕获基质中进行消化。本领域的技术人员将认识到可以使用很多还原和烷基化试剂。本技术提供了这样的最佳组合物和方法：它们无需洗涤剂即可裂解细胞和样品以及生物体，原位捕获提取的蛋白质和其他分子类别诸如dna和聚糖，同时将代谢物和脂质和小分子分离并保持在流过物中，以及进一步允许例如通过酶促消化例如用蛋白酶或核酸酶或糖苷酶来处理保留的分子。本技术表明，在接近中性或碱性ph值下对细胞沉淀进行声处理可有效地将蛋白质释放到溶液中，其提取效率与sds相似(图2)；本技术表明蛋白质可以被纤维素或石英深度
过滤器阱捕获。本领域的技术人员将认识到，如上所述，可以使用许多其他过滤材料或多孔材料，只要蛋白质被捕获即可。
[0284]
为了概述sitrap细胞处理，首先将细胞沉淀在过量的30mm乙酸铵(aa)或1.8％氢氧化铵(ah)中进行声处理，然后进行离心以除去碎片。使用ah进行裂解，并在微量分光光度计中分析280nm处的uv吸光度，可以粗略地直接估计细胞裂解物中的蛋白质浓度
10
。如果使用aa提取，则将四倍体积的含有30mm aa的甲醇添加到裂解物中。样品被装载到含有深度过滤隔室的sitrap吸头中，在其中蛋白质立即被捕获。如果使用ah提取，则首先将等体积的1m乙酸添加到裂解物中以使ph值接近中性，然后在装载至sitrap吸头之前添加两倍体积的甲醇。收集所得的流过物用于另外的“组学”处理。通过在60mm三乙基碳酸氢铵(teab)、10mm三(2-羧乙基)膦(tcep)、25mm氯乙酰胺(caa)溶液中在80℃下加热对捕获的蛋白质进行原位变性、还原和烷基化。在洗涤后，添加胰蛋白酶并将样品在47℃下温育一小时以消化蛋白质。将肽洗脱，然后使用c8或c
18 stage吸头浓缩，以用于质谱(ms)分析(图3a)。值得注意的是，dna也被共同捕获，可以使用其他酶诸如糖苷酶，以将本技术扩展到其他分子类别。
[0285]
为了测试新的sitrap方法的蛋白质组学性能，将其与基于sds的样品制备进行比较。将mda-mb-231细胞使用aa或ah通过细胞裂解和冰上探针声处理提取，然后在纤维素sitrap吸头中进行sitrap胰蛋白酶处理(图4)或者用sds进行细胞裂解和探针声处理，然后消化。在每种情况下，处理30μg蛋白质，重复六次。两种样品均在47℃下进行胰蛋白酶消化一小时。该测试鉴定了1293(
±
12sd)个蛋白质，并且使用sds鉴定了平均1278(
±
44sd)个蛋白质，其中至少两个肽分别使用aa或ah sitrap裂解鉴定。这与针对sds裂解鉴定的1230(
±
27sd)个蛋白质平均数量相当(图3b)。在所有情况下，主要go细胞组分类别中的蛋白质分布都非常相似(图3c)，并且大多数蛋白质通过所有三种方法鉴定，表明不存在偏差(图3d)。
[0286]
实施例2
[0287]
使用透明细胞肾癌和相应的相邻非癌组织切片的比较原理验证蛋白质组学/代谢物组学分析研究，探索了sitrap方法和装置提供同时多组学分析平台的能力。本领域的技术人员将认识到这仅仅是示例性实施例，而非限制性的。将组织切片(三个正常/肿瘤对)通过用ah超声处理裂解，将裂解物装载到sitrap纤维素吸头中，收集流过级分用于靶向代谢物组学分析，而消化捕获的蛋白质以用于蛋白质组学分析。蛋白质组学分析产生了2655个蛋白质的蛋白质组数据集。靶向代谢物组学筛选包括三种代谢物类别的62个种类
–
26种游离脂肪酸、20种酰基肉碱和16种胆汁酸。对这59种代谢物进行观察和定量
–
25种游离脂肪酸、19种酰基肉碱和15种胆汁酸。代谢物组学分析表明肿瘤样品中的短链酰基肉碱(c5、c5:1和c3)和多不饱和游离脂肪酸(c20:5、c20:4、c22:6)均减少(图5a、图6a)。鉴定、定量在酰基肉碱代谢中起关键作用的酶，即肉碱o-乙酰转移酶(crat)、肉碱o-棕榈酰转移酶2(cpt2)和肉碱o-棕榈酰转移酶1(cpt1a)，并且发现它们在肿瘤样品中显著降低，与代谢物组学结果一致(图5b、图6b)。检测到与多不饱和脂肪酸代谢相关的其他酶的肿瘤样品显著减少，与代谢物组学结果一致：酰基辅酶a硫酯酶1(acot1)(它从辅酶a等效物中释放c20:4、c20:5和c22:6)和长链脂肪酸辅酶a连接酶(acsl1)(它活化长链脂肪酸以形成酰基辅酶a)(图5b)。
[0288]
实施例3
[0289]
在处理血清样品时，观察到在碱性ph值下，例如在20mm teab中稀释，血清白蛋白不被深度过滤器捕获。然而，许多其他血清蛋白被捕获(图7)。这种简单的血清分馏产生两
个级分
–
捕获的级分，不含白蛋白，它可以直接由sitrap进行吸头处理。然后可以用六倍体积的30mm乙酸铵的甲醇溶液稀释替代的流过“白蛋白”级分，然后在另一个sitrap单元中捕获和消化。为了测试这种方法，将0.5μl来自健康志愿者的人血清通过strap技术直接消化(总共6个重复样品)或用20mm teab缓冲液稀释并使用sitrap石英吸头通过分馏处理。sitrap处理产生两个级分，捕获和流过物(每个级分分别3个重复，总共6个样品)。合并每种方法中的6个样品的胰蛋白酶消化的ms结果。与直接方法相比，sitrap分馏引起蛋白质鉴定增加约30％(图7b、c)。本实施例展示了将血清分馏成两个或更多个级分。
[0290]
实施例4
[0291]
sitrap样品处理也适用于ffpe样品，因为它们在病理中的遍在性、在室温下的稳定性以及ffpe样品的绝对数量。这些样品虽然代表了丰富的资源，然而由于它们的福尔马林交联性质并嵌入蜡中，因此很难进行。令人惊讶的是，sitrap运行良好。将人肾ffpe组织通过标准二甲苯/乙醇处理来脱蜡，然后通过探针声处理在30mm乙酸铵中裂解。通过sitrap或sds方法处理约50μg所得的蛋白质裂解物。对于sitrap
–
将30mm乙酸铵中的4倍体积甲醇添加到裂解物中，然后在sitrap纤维素吸头中捕获蛋白质，将吸头用30mm乙酸铵中的60％甲醇进一步洗涤，收集流过物(ft1)。然后添加10mm tcep/30mm氯乙酰胺/60mm teab溶液，并将吸头在95c下加热1小时。然后用20mm teab洗涤吸头，收集流过物(ft2)。将捕获的蛋白质在48c下通过100mm碳酸氢铵中的1.25μg胰蛋白酶(promega)(胰蛋白酶浓度0.07μg/μl)连续两次消化1小时进行消化。用500mm碳酸氢铵和0.2％甲酸中的50％乙腈来连续洗脱消化产物。将其余材料用2xlaemmli缓冲液洗脱。对于sds处理，将裂解物与等体积的tris-hcl ph7.6中的5％sds混合，将dtt添加至20mm最终浓度，将样品在95c下加热1小时。将氯乙酰胺添加至120mm最终浓度，随后温育30min。通过标准方案清除样品中的sds，并收集流过物(ft)。与sitrap类似，使蛋白质在48c下通过100mm碳酸氢铵中的1.25μg胰蛋白酶(promega)(胰蛋白酶浓度0.07μg/μl)连续两次消化1小时进行消化。用500mm碳酸氢铵和0.2％甲酸中的50％乙腈来连续洗脱消化产物。将其余材料用2x laemmli缓冲液洗脱。本实施例展示了sitrap技术在ffpe组织中的应用(图8)。
[0292]
实施例5
[0293]
本技术的一个示例性实施方案包括从一倍体积的样品捕获如本文所述的蛋白质和小分子，其中将所述样品在30mm乙酸铵提取溶剂中进行声处理以物理破坏样品，与四倍体积的含有30mm乙酸铵的甲醇混合，由此将来自1m乙酸铵储液水溶液的无水甲醇补充至30mm乙酸铵。然后将混合物施加于用作捕获基质的纤维素深度过滤器，并且保留包含具体而言细胞的小分子且不限于代谢物和脂质的流过物用于代谢物组学和脂质组学分析。然后通过在80℃下在60mm三乙基碳酸氢铵(teab)、10mm三(2-羧乙基)膦(tcep)、25mm氯乙酰胺(caa)中加热来使蛋白质原位还原和烷基化，并用30mm乙酸铵或20mm teab中的50％甲醇洗涤深度过滤材料，并以2500g离心30秒。将1.4ug胰蛋白酶(promega)添加到20ul 100mm碳酸氢铵中，并通过在47c下温育1小时将捕获的蛋白质消化成肽。用70μl 300mm碳酸氢铵和70μl 3％甲酸连续进行消化后洗脱。使用c8 stage吸头浓缩肽，以通过质谱进行下游分析；这种c8处理可以集成在捕获基质之下。本实施例展示了sitrap的多组学性质。
[0294]
实施例6
[0295]
除非另外指明，否则使用以下肽分析设置在agilent 6546 qtof上分析一些实验：
300
–
1700m/z，在automs2正模式下，使用双ajs esi源，在13l/min下325c气体温度，275c保护气体温度获取。msms使用5000ms绝对前体阈值和0.01％相对阈值获得中等分离宽度，目标是每个光谱50,000个计数，并且启用主动排除；vcap设置为3500，碎裂器设置为175v。使用agilent 1290 infinity lc系统，在2.1mm x 150mm c18柱上以0.3ml/min运行，梯度在缓冲液a(含0.1％甲酸的水)和缓冲液b(100％lcms级乙腈)之间，在5％b下保持2分钟，然后在50分钟内跃升到40％b，在90％b下保持5min，然后逐渐下降到5％b。柱是2.1x150mm agilent advancebio肽作图2.7μm柱(目录号#653750-902)，温度保持在60c。
[0296]
除非另外指明，否则使用以下肽分析设置在agilent 6546 qtof上分析代谢物：在automs2正模式下，使用双ajs esi源，在5l/min下350c气体温度和在10l/min下350c保护气体温度在300
–
1700m/z获取数据。msms使用5000ms绝对前体阈值和0.01％相对阈值获得中等分离宽度，目标是每个光谱50,000个计数，禁用主动排除，同位素模型设置为常见有机分子；vcap设置为3500，碎裂器设置为175v。使用agilent 1290 infinity lc系统，在2.1mm x 50mm agilent eclipseplus c18柱(rrhd 1.8μm)上以0.8ml/min运行，梯度在缓冲液a(含0.1％甲酸的水)和缓冲液b(100％lcms级乙腈)之间(梯度参见下表)。柱保持在40c下。梯度如下：
[0297]
事件时间(min)a(％)b(％)流量(ml/min)压力(巴)129550.86002460400.86003550500.860041050500.860051530700.860061920800.860072020800.86008219550.8600
[0298]
图10
–
14的sitrap柱使用塑料注塑成型由tpx塑料制成。使用气动冲压和压制系统，内柱装载有由石英、玻璃纤维、聚合物、纤维素或具有填充剂诸如硅藻土的纤维素制成的多孔基质。在一些实验中，通过衍生化为基质提供官能团。在其他实验中，基质在c18或scx等色谱介质上分层。在其他实验中，内小瓶接收底部和顶部玻璃料，用于容纳色谱介质。
[0299]
实施例7
[0300]
使用公开的方法和公开的物理实施方案检测sars-cov-2
[0301]
以下实施例展示了使用该系统检测sars-cov-2核衣壳蛋白(sars-cov-2病毒中更丰富的蛋白质之一)的用途。由于进行实验的实验室的bsl水平，未直接分析感染性病毒。相反，核衣壳蛋白是重组制备的并加标至痰液中。本领域的技术人员将认识到该实施例不是限制性的，在检测灵敏度范围内适用于活病毒和感染性病毒，并且用于展示该方法对诊断的适用性。本领域的技术人员还将认识到，本实施例可以通过仅改变检测参数而扩展到具有不同基因序列并因此具有不同蛋白质序列的其他病毒和病原体。将本实施例的步骤在其他实施例中重复。
[0302]
使用lipofectamine 2000用质粒pci-sars-cov-2-核蛋白(每孔2ug质粒)转染人胚肾细胞hek293(约1.5e6个细胞/孔，6孔板)。使sars-cov-2核蛋白的orf从合成dna克隆进
行pcr扩增。pci-sars-cov-2-核蛋白质粒所含的核蛋白orf序列如下：
[0303]
atgtctgataatggaccccaaaatcagcgaaatgcaccccgcattacgtttggtggaccctcagattcaactggcagtaaccagaatggagaacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgtcttggttcaccgctctcactcaacatggcaaggaagaccttaaattccctcgaggacaaggcgttccaattaacaccaatagcagtccagatgaccaaattggctactaccgaagagctaccagacgaattcgtggtggtgacggtaaaatgaaagatctcagtccaagatggtatttctactacctaggaactgggccagaagctggacttccctatggtgctaacaaagacggcatcatatgggttgcaactgagggagccttgaatacaccaaaagatcacattggcacccgcaatcctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggcttctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtcgcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatggctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttgagagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctgctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaacacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaactaatcagacaaggaactgattacaaacattggccgcaaattgcacaatttgcccccagcgcttcagcgttcttcggaatgtcgcgcattggcatggaagtcacaccttcgggaacgtggttgacctacacaggtgccatcaaattggatgacaaagatccaaatttcaaagatcaagtcattttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaaggacaaaaagaagaaggctgatgaaactcaagccttaccgcagagacagaagaaacagcaaactgtgactcttcttcctgctgcagatttggatgatttctccaaacaattgcaacaatccatgagcagtgctgactcaactcaggcctaa
[0304]
表达的核蛋白氨基酸序列如下：
[0305]
msdngpqnqrnapritfggpsdstgsnqngersgarskqrrpqglpnntaswftaltqhgkedlkfprgqgvpintnsspddqigyyrratrrirggdgkmkdlsprwyfyylgtgpeaglpygankdgiiwvategalntpkdhigtrnpannaaivlqlpqgttlpkgfyaegsrggsqassrsssrsrnssrnstpgssrgtsparmagnggdaalalllldrlnqleskmsgkgqqqqgqtvtkksaaeaskkprqkrtatkaynvtqafgrrgpeqtqgnfgdqelirqgtdykhwpqiaqfapsasaffgmsrigmevtpsgtwltytgaiklddkdpnfkdqvillnkhidayktfpptepkkdkkkkadetqalpqrqkkqqtvtllpaadlddfskqlqqsmssadstqa
[0306]
用1ug pci-sars-cov-2-核衣壳蛋白 1ug质粒ptm2-gfp转染一个孔。用2ug质粒ptm2-gfp转染一个孔。在转染40小时后，将细胞用pbs洗涤，刮入pbs，以300xg离心2分钟收集，并储存在-80c下。在转染40小时后，将细胞用pbs洗涤，刮入pbs，并以300xg离心2分钟收集。用gfp和核衣壳蛋白共转染与单独使用gfp没有任何差异，表明核衣壳蛋白的表达不影响hek293细胞的生长。
[0307]
处理细胞沉淀如下：向细胞中加入1.8％氢氧化铵，比率约为1:20v/v。样品在超声处理水浴或covaris超声仪上进行声处理。样品被处理为悬浮液，并在任何样品移除之前进行声处理和涡旋。通过bca测定蛋白质浓度，并通过用1.8％氢氧化铵稀释将其设置为约2mg/ml。获得痰液，从32％储液添加氢氧化铵至终浓度为1.8％；痰液浓度为约3mg/ml。对痰液样品进行类似的(超声)声处理，将1ul核衣壳蛋白溶液添加到99ul痰液溶液中，使得100ul中的总蛋白载量为约300ug；制备多个重复混合物。向样品添加100ul 1m乙酸和2或4倍体积的甲醇，并将其添加至不同的sitrap管中，该管在其下部停放位置装载有纤维素基质。
[0308]
将sitrap组装件提升到其上部停放位置，并通过以4,000g离心5min推动样品通过
基质，并将含有代谢物和小分子的流过物保持在外小瓶中。将sitrap内小瓶放置于处于下部停放位置的新鲜外小瓶管中。此时，将五个重复在室温下放置4天，并另外五个重复保持在-80c下。在4天结束时，使所有样品都恢复到室温。将蛋白质在80c下用10mm tcep和25mm氯乙酰胺在ph8的50mm tris缓冲液中在下部停放位置还原和烷基化10min。通过在上层溶液中离心除去还原和烷基化试剂，用75％meoh洗涤蛋白质，弃去洗涤液和流过物。内小瓶放置在外小瓶的下部停放位置。四个样品，两个在室温下储存，两个在-80c下储存，通过超声处理进行加速消化。因为超声处理是连续的，首先向四个样品中的每个添加30ug胰蛋白酶，然后立即将样品置于covaris m220中，并通过由拉直的回形针线制成的临时线架悬挂并用实验室胶带固定到位。每个样品接受20分钟的超声处理，设置为峰值功率50、占空因数20和300个突发/周期。将样品置于冰上以限制胰蛋白酶的活性。其他两个样品接受30ug胰蛋白酶，四个样品接受30ug胰蛋白酶，然后在47c下温育1小时。将两个样品与15ug胰蛋白酶在37c下温育过夜。使用worthington胰蛋白酶在50mm teab中进行消化。
[0309]
将所有样品均在agilent 6546装置上以靶向ms模式进行分析，以针对sars-cov-2蛋白的预期胰蛋白酶肽的 2电荷对以下m/z进行靶向msms：375.180466、403.193573、443.706317、458.742368、471.784567、563.78563、564.785827、573.751461、601.809833、741.330469、835.948346、842.948869、894.929196、912.411368、931.48073、1013.021708、1030.578571、1091.013989、1118.541465、1134.044029、1162.598357、573.751461、912.411368、1162.598357、1091.013989、1134.044029、842.948869、1030.578571、443.706317、375.180466、403.193573、835.948346、601.809833、563.78563、894.929196、1118.541465、1013.021708、471.784567、458.742368、564.785827、931.48073、741.330469。随后使用其内部解卷积和数据搜索算法将数据文件导出并加载到支架。在所包括的列表中，检测到以下的肽：itfggpsdstgsnqnger在912.411368处、wyfyylgtgpeaglpygank在1134.044029处、dgiiwvategalntpk在842.948869处、npannaaivlqlpqgttlpk在1030.578571处、magnggdaalalllldr在835.948346处、aynvtqafgr在563.78563处、gpeqtqgnfgdqelir在894.929196处、igmevtpsgtwltytgaik在1013.021708处、adetqalpqr在564.785827处、qqtvtllpaadlddfsk在931.48073处、以及qlqqsmssadstqa在741.330469处；将观察到的碎片离子列于下表中，并且代表性迹线显示在图23-24中。
[0310][0311]
在2和4x甲醇添加之间，在室温下储存四天和在室温下储存之间，或者在37c下过夜、在47c下1小时或20min室温超声加速消化之间，检测sars-cov-2蛋白质的能力无显著差异。这些结果表明sitrap方法适用于检测病毒和病原体；内小瓶和外小瓶组装件与超声处理相容，超声处理加速酶促处理，重要的是，样品一旦结合，即可在氧气存在下在室温下不干燥的情况下稳定至少四天。
[0312]
实施例8
[0313]
加速血清处理
[0314]
将50ul中的100ug血清变性并溶解在1.8％氢氧化铵中，与50ul1m乙酸混合并提供2倍体积的甲醇。将该溶液施加于处于上部停放位置的内小瓶和外小瓶组装件，并在以4,000g离心5min后回收流过物。在代谢物分析模式下通过msms对流过物级分进行分析。如核衣壳蛋白所述，在covaris m220中通过声处理使血清还原、烷基化和消化。将小分子级分通过agilent masshunter定性分析10.0版对所有metlin和代谢物数据库进行搜索来分析。以代谢物模式检测到231种化合物。使用spectrummill针对人类uniprot数据库分析和搜索来自消化的肽。检测到344个蛋白质组，总共包括1207个蛋白质。在一些实验重复中，将流过物级分干燥并暴露于含有7.5mm乙酸铵的2-丙醇/甲醇/氯仿的4:2:1v/v/v混合物中，以产生脂质级分。然后将具有0.1％甲酸和5％乙腈和95％水添加到外小瓶中并进行声处理。在其他实验重复中，向中和样品中添加100ul氯仿，然后添加300ul水和400μl甲醇并混合。将内小瓶放入新的小瓶中并离心溶液。使混合物相分离，上层含有更多亲水部分，下层含有更多疏水部分，如脂质。这些方法针对更高的id率生成了单独的脂质组学和代谢物组学级分。该
样品展示了sitrap方法和组装件可以快速生成用于代谢物组学、脂质组学和蛋白质组学分析的样品。许多代谢物是亲水性的，使用另外的色谱诸如hilic将提供更多的鉴定，并且本文描述的溶剂不是限制性的，但可以选择与分析物的溶解度性质或所关注的分析物类别相匹配。需要特别指出的是，相分配的溶剂组合具有特殊用途，因为它们的相对疏水性可以改变，从而可以调整到分析或处理或加工的特定需求。
[0315]
实施例9
[0316]
捕获细胞和组织处理
[0317]
在处于下部停放位置的组装件中，将约10ul红细胞(rbc)或约10mg小鼠肝脏直接添加到50ul 1.8％氢氧化铵中。将组装件在m220上进行5-10分钟超声处理，以裂解细胞或组织。rbc似乎完全溶解，并且肝脏似乎完全分解。然后添加50ul的1m乙酸，然后添加250ul的hplc级甲醇。将内小瓶移至上部停放位置，并通过离心回收小分子级分。在其他实验变型中，还给处理的rbc或小鼠肝脏提供氯仿，以产生用于脂质组学(底层)和代谢物组学(顶层)的相分离级分。将肝脏样品内小瓶放入干净的新的外小瓶中，添加50ul te并温育30min。将含有存活的rna以及通过超声处理剪切的dna的该级分在上部停放位置洗脱，用100ul te洗涤基质，并将样品置于新的外小瓶中。sds-page分析显示蛋白质非常少。将内小瓶放入新的外小瓶中，并将500单位/ml的10ul png酶f添加到ph8.6的50mm磷酸钠中，总体积为50ul。将样品在37c下处理5小时，并通过将内小瓶移动到上部停放位置并离心来洗脱含有聚糖的该级分。sds-page分析显示该级分中无蛋白质，并且通过高碘酸和阿新蓝测试它是聚糖阳性的。最后，在新的外小瓶中，将样品按照上述方法进行还原、消化和烷基化，但需在37c下温育过夜。在用50mm teab和50％acn进一步洗脱肽后，在柱上未观察到任何材料，表明该程序足以完全处理组织。在组织被血液污染的情况下，适当设计的组装件具有足够大的孔径以允许rbc通过，这为手动或自动清洁系统提供了一种机制。
[0318]
实施例10
[0319]
ffpe
[0320]
将在室温下储存的1mm福尔马林固定石蜡包埋的小鼠肝脏核心冲孔并在捕集氢氧化物中匀浆，与捕集细胞和组织一起在m220上处理10min，然后在1.8％铵中过夜温育以使样品再水化。进行对血清使用的甲醇和氯仿提取方案，得到不含石蜡的上层，将其用于另外的代谢物组学分析。用胰蛋白酶进行蛋白质处理与用血清进行一样，产生可立即进行msms的肽。
[0321]
实施例11
[0322]
rna捕获可视化
[0323]
将sitrap系统捕获和释放rna的能力通过rna进行可视化。将酵母trna(roche 10109495001)每隔十分之一胺用异硫氰酸荧光素(fitc,sigma目录号46951)进行标记；用乙醇沉淀得到的标记rna，并且洗涤样品直至上清液无色，表明除去非共价结合的fitc。在存在或不存在5％sds的情况下，将标记的rna重悬在50ul的最终体积中(参见图25中的表格)。正如预期的那样，fitc标记的trna在紫外光下发光(图25a)，可以立即可视化。重要的是，sitrap离心柱在此处位于与本文提供的组装件不同的囊袋中，但在其结合基质中相同，不发光(图25b)。向每个样品中添加5ul的10m乙酸铵和350ul的90％甲醇(图25中的“m”)和100mm teab或纯乙醇(图25中的“e”)。将样品混合并立即通过sitrap柱。所有条件都捕获了
rna(图25c)。用350ul指定的有机溶液洗涤柱。纯乙醇在将rna保留在柱上方面更有效(图25d)。将rna用50mm teab洗脱，并且乙醇结合的rna被定量释放(图25e，条件3和4；注意sitrap结合基质中不发光)。该实验展示了用于下游处理的可逆捕获和释放rna。
[0324]
实施例12
[0325]
使用组合基质进行多级分分析
[0326]
组装件具有相同的结合基质，在其下方是scx或c18柔性捕获介质层(affinisep)。如针对血清所述处理样品。对于scx sitrap，将样品用2:1甲醇/水稀释10x，以实现更好的结合并保持初始流过物。然后在新的外小瓶中用250mm乙酸铵洗脱scx基质。随后，在新的外小瓶中使用1小时47c消化将蛋白质与血清一样消化。从50mm的流过物除去250mm乙酸铵，提供给处于停放位置的内小瓶。在短暂声处理后，将内小瓶置于上部停放位置以回收结合的肽。这样生成的scx级分高度互补，代谢物或肽的流过物和洗脱级分之间共有的id相对较少。对于c18，重复相同的方案并进行以下更改：最初不对样品进行稀释，并且使用75％acn而不是乙酸铵进行洗脱。肽级分c18流过物的样品非常少，代谢物流过物也如此。这些结果是预期的，然而，因为c18色谱是在sitrap处理之后使用的。因此，c18作为清洁步骤。或者，施加20％acn的洗脱“馏分(cut)”。这些具有大量肽和代谢物和脂质。
[0327]
虽然上文已经描述了各种实施方案，但应当理解，这些公开内容仅作为示例而不是限制性的。因此，主题组合物和方法的广度和范围不应受到任何上述示例性实施方案的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。
[0328]
以上描述的目的是教导本领域的普通技术人员如何实践本发明，而不是旨在详细说明本领域的技术人员在阅读本说明书后将变得显而易见的所有那些明显的修改和变化。然而旨在将所有这些明显的修改和变化包括在本发明的范围内，本发明的范围由以下权利要求限定。权利要求旨在涵盖有效满足其预期目标的任何顺序的组件和步骤，除非上下文明确指出相反的情况。