生物活性植物化学物的制作方法

1.本发明涉及用于生产包含(2r,3r,4r,5s)-3,4,5-三羟基哌啶-2-羧酸(idobr1)的组合物的方法，以及基于所述组合物的各种产品、化合物、组合物、医学用途和方法，以及它们在制备用于药物的各种组合物中的用途，包括炎症、感染、皮肤病症、唾液酸酶活性体内抑制的治疗；以及从各种植物源分离和纯化出所述组合物的方法。
2.本发明还涉及用于监测葫芦科(cucurbitaceae)提取物(例如，黄瓜属(cucumis)提取物)的质量的方法、生产葫芦科提取物的方法以及可通过此类方法获得的葫芦科提取物(尤其是黄瓜属提取物)。


背景技术：

3.黄瓜(cucumis sativus)是包括西葫芦的葫芦科(cucurbitaceae)中广泛栽培的植物。黄瓜起源于印度，已在西亚被栽培至少3000年，可能由罗马人引入到欧洲其他地区。黄瓜栽培的记录在法国出现在9世纪，在英格兰出现在14世纪，在北美则出现在16世纪中期。
4.黄瓜和黄瓜提取物长期以来已被认为具有抗炎特性，并被局部用于各种类型的皮肤问题，包括眼部肿胀和晒伤。黄瓜在埃及、希腊和罗马的古代文明中非常受欢迎，在这些地方它不仅被用作食物，而且还因其皮肤愈合特性而被使用。
5.亚氨基糖酸(isa)构成更广泛分布的一类称为亚氨基糖的植物化学物质的亚类。许多已知的isa是作为次生代谢物存在于植物组织中的植物化学物(在植物组织中它们可发挥防御作用)。虽然亚氨基糖广泛分布于植物中(watson,a.等人，2001,phytochemistry 56,265)，但亚氨基糖酸的分布广泛性要低很多，并且更难分离和鉴定(martinez,r.等人，2019,amino acids 51,991)。
6.亚氨基糖酸idobr1存在于较老的黄瓜品种中，但在某些现代商业品种中不存在。它已被证明是某些黄瓜果实的主要成分，并且是黄瓜中唯一的亚氨基糖酸。它是某些南瓜和葫芦中的次要成分。
7.wo2013/054070将idobr1鉴定为基于黄瓜提取物的抗炎草药中的重要生物活性成分。
8.草药食品添加剂和药物
9.目前，人们对草药疗法和补充剂的使用非常感兴趣，食品生产商、医疗保健公司和医学专业人士越来越接受草药产品具有价值并且可以补充既定的制剂和治疗。草药食品添加剂和补充剂现在被广泛使用。
10.然而，由于植物材料的复杂性和固有的不均匀性，草药食品添加剂的质量控制很困难。基于草药和植物的食品添加剂中使用的材料通常是整株植物或其部分或提取物。由于植物材料含有许多不同的化学成分，因此这些材料是复杂的混合物。这使得很难标准化和控制该材料的质量。此外，许多草药食品添加剂是两种或多种基于植物的组分的混合物，并且是混合物的混合物，因此引入了进一步的复杂性水平。此外，所使用的配方和生产方法
通常不统一，且可能仍未公开。这些因素使得很难确保从不同来源获得且表面上同一的给定产品的两个样品实际上含有相同的成分混合物。这个问题导致难以控制此类材料的质量，甚至限制了草药从业者对某些草药提取物的使用。
11.其他问题来自这样一个事实，即用于草药实践或作为食品补充剂/营养品的植物通常在当地无法获得，因此需要从远离最终用户的来源获得。然而，从遥远地区供应此类植物可能是不稳定且不准确的，特别是因为许多此类植物没有包括身份和质量标准在内的详细专论。在药用植物中发现的复杂成分混合物在类型和浓度上变化很大，这取决于许多因素，包括植物源、该植物生长的地点、该植物附近生长的其他植物或微生物、该植物被收获的年度的时间、该材料被储存和加工的条件以及使用的提取程序。
12.因此，需要可以剖析含有idobr1的草药产品，并从而建立可能与活性有关的植物衍生产品的标准规范，因此允许在草药、食品添加剂、化妆品、营养品和食品添加剂的生产中进行质量控制，并理想地定量(结构上和/或功能上)生物活性成分的灵敏性方法。
13.本发明人现已发现idobr1表现出针对唾液酸酶和tnf-α的抑制活性，同时表现出il-10刺激活性。这一发现允许开发基于来自包括葫芦科植物的植物源的植物材料的提取物配制化妆品、营养品或药物组合物的改进方法，因为现在可以在植物材料分级后快速且容易地对相关的生物活性成分idobr1进行功能测定。
14.因此，符合标准规范的化妆品、营养品或药物组合物的供应得到极大促进：本发明允许快速测定提取物的功能质量。它还使耗时且昂贵的物理表征(例如通过gc-ms和/或hplc)成为可选的。此外，由于提取物的功能性已被测定，因此可以监测共同提取的部分的可能干扰/抑制的影响。这在其中提取物被配制用于局部施加的化妆品应用的情况下可能特别重要。


技术实现要素：

15.因此，根据本发明，提供了生产包含(2r,3r,4r,5s)-3,4,5-三羟基哌啶-2-羧酸(idobr1)的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
16.(a)提供来自包括葫芦科(cucurbitaceae)植物的植物源的植物材料；
17.(b)对所述植物材料进行分级以产生富含idobr1的提取物；
18.(c)测定所述提取物的以下活性：(i)针对唾液酸酶或tnf-α的抑制活性；或(ii)il-10刺激活性；以及
19.(d)将所述经测定的提取物与化妆品、营养品或药物上可接受的赋形剂或载体一起配制以生产化妆品、营养品或药物组合物。
20.植物源可包括黄瓜属或南瓜属植物。黄瓜属的优选物种是黄瓜(cucumis sativus)(黄瓜)物种的植物。南瓜属的优选物种是cucurbita melos或中国南瓜(cucurbita moschata)物种。
具体实施方式
21.本文所提及的所有出版物、专利、专利申请和其他参考文献据此以引用方式整体并入用于所有目的，如同每篇单独的出版物、专利或专利申请被明确且单独地指出以引用方式并入并且其内容被完整叙述。
22.定义
23.当在本文中使用并且除非另外具体指明时，以下术语旨在具有除该术语在本领域中可具有的任何更广泛(或更狭窄)的含义之外的以下含义：
24.除非上下文另有要求，否则本文中单数的使用应理解为包括复数，反之亦然。针对实体使用的术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”应理解为指代一个/种或多个/种该实体。同样，术语“一个/种(a/an)”、术语“一个/种或多个/种”和“至少一个/种”在本文可以互换使用。
25.如本文所使用的，术语“包括”或其变化形式如“包含”或“含有”应被理解为指示包括任何所列举的整体(例如，特征、元素、特性、性质、方法/方法步骤或限制)或者整体(例如，特征、元素、特性、性质、方法/方法步骤或限制)的组，但是不排除任何其它整体或整体的组。因此，如本文所用，术语“包含(comprising)”是包含性的或开放性的，并且不排除额外的、未列举的整体或方法/方法步骤。
26.短语“基本上由
……
组成”在本文中被用来要求一个或多个指定的整体或步骤以及不会对要求保护的发明的特征或功能产生实质性影响的那些整体或步骤。
27.如本文所用，术语“由
……
组成”被用来指示仅存在所列举的整体(例如特征、元素、特性、性质、方法/方法步骤或限制)或整体(例如特征、元素、特性、性质、方法/方法步骤或限制)的组。
28.如本文所用，术语“疾病”被用于定义损害生理功能并与特定症状相关的任何异常情况。该术语被广泛地用来涵盖生理机能受到损害的任何病症、疾病、异常、病理、病、病况或综合征，而不管病原学性质如何(或者该疾病的病原学基础是否确实确立)。因此，它涵盖由感染、外伤、损伤、手术、放射消融、中毒或营养缺乏引起的病况。
29.如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指治愈、改善或减轻疾病症状或消除其一种或多种病因(例如，病理性多样化状态)(或减轻其一种或多种病因影响)的干预(例如，将剂施用于受试者)。在这种情况下，该术语与术语“疗法”同义使用。
30.另外，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指防止或延缓疾病发病或发展或者降低(或消除)其在受治疗群体中的发病率的干预(例如，将剂施用于受试者)。在这种情况下，术语治疗与术语“预防”同义使用。
31.术语“受试者”(在上下文允许的情况下，其将被理解为包括“个体”、“动物”、“患者”或“哺乳动物”)定义了需要治疗的任何受试者，特别是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括但不限于人类、家畜、农场动物、动物园动物、运动动物和宠物。在优选的实施方案中，受试者为人。
32.本文对糖尿病治疗的提及应被解释为包括1型和2型糖尿病本身以及前驱糖尿病(初期糖尿病)和胰岛素抵抗的治疗。术语“前驱糖尿病”或“初期糖尿病”定义了在不存在糖尿病的情况下存在葡萄糖或糖化血红蛋白水平升高的情况。
33.如本文所用，化合物或组合物的有效量定义了可以向受试者施用而没有过度毒性、刺激、过敏或其他问题或并发症，与合理的获益/风险比相称的量，但该量足以提供所需效果，例如通过受试者病况的永久或暂时改善所表现出的治疗或预防。该量将因受试者而异，取决于个体的年龄和一般状况、施用模式和其他因素。因此，虽然不可能指定精确的有效量，但本领域技术人员将能够使用常规实验和背景常识确定任何个别情况下的合适“有
效”量。在这方面的治疗结果包括症状的根除或减轻、疼痛或不适的减轻、生存期延长、活动能力提高和临床改善的其他标记物。治疗结果不需要是完全治愈。
34.术语植物化学物在本文中以广义使用以涵盖植物的任何化学成分，包括大分子和小分子。重要的实例包括生物碱(例如亚氨基糖和亚氨基糖酸，例如选自结构类别吡咯烷、哌啶、吡咯里西啶、吲哚里西啶、莨菪烷和去甲莨菪烷(nortropane))、碳水化合物类似物、酚类化合物、类萜、酶抑制剂、糖苷、核苷酸、氨基酸、脂质和糖。
35.如应用于本发明的化合物的术语“分离(的)”在本文中用于指示该化合物存在于与其在自然界中存在的物理环境不同的物理环境中。例如，分离的化合物相对于其天然存在的复杂细胞环境可以是基本上分离的(例如富集的或纯化的)。因此，分离的化合物可采用本文所述的任何植物源的富集级分或提取物的形式。
36.当分离的材料被富集或纯化时，富集或纯度的绝对水平并不重要，本领域技术人员可以很容易地根据需投入该材料的用途确定适当的水平。优选至少0.1％w/w、0.2％w/w、0.3％w/w、0.4％w/w、0.5％w/w、0.6％w/w、0.7％w/w、0.8％w/w、0.9％w/w、1.0％w/w、1.1％w/w、1.2％w/w、1.3％w/w、1.4％w/w、1.5％w/w、1.6％w/w、1.7％w/w、1.8％w/w、1.9％w/w或2.0％w/w的纯度水平。
37.特别优选至少0.5-2.0％w/w，例如至少0.8-1.5％w/w，例如至少约1.0％w/w的纯度水平。在材料是从天然来源分离的情况下，如有必要，通过采用适当的富集技术，诸如离子交换色谱法，可以很容易获得5-10％w/w的水平。
38.在一些情况下，分离的化合物形成可以例如含有其他组分的组合物(例如含有许多其他物质的不同程度的粗提取物)或缓冲体系的一部分。在其他情况下，例如如通过分光光度法、通过nmr或通过色谱法(例如三甲基甲硅烷基衍生物的gc-ms)来测定，分离的化合物可被纯化至基本同质。
39.术语草药在本文中被用于定义药物组合物，其中至少一种活性成分(例如所述化合物)不是化学合成的，并且是植物的植物化学成分。在大多数情况下，这种非合成活性成分是未经分离的(如本文所定义)，而是与源植物中与它相关的其他植物化学物一起存在。然而，在一些情况下，一种或多种植物来源的生物活性成分可能是经浓缩的级分或分离的(有时涉及高纯化度)。然而，在许多情况下，草药包含植物的不同程度的粗提物、浸液(infusion)或级分，或者甚至未经加工的整株植物(或其部分)，不过在此类情况下，植物(或植物部分)通常至少是经干燥的和/或经碾碎的。草药可以是食品补充剂、食品添加剂、营养品、饮料的形式，或以单一剂量作为草药药盒或包装提供。
40.术语草药食品在本文中被用于定义这样的组合物，其中至少一种组分不是化学合成的，而是植物的植物化学成分。在大多数情况下，这种非合成组分是未经纯化的，而是与源植物中与它相关的其他植物化学物一起存在。然而，在一些情况下，一种或多种植物来源的组分可能是经浓缩的级分或分离的(有时达到高纯度)。然而，在许多情况下，草药食品添加剂包含植物的不同程度的粗提物、浸液或级分，或者甚至未经加工的整株植物(或其部分)，不过在此类情况下，植物(或植物部分)通常至少是经干燥的和/或经碾碎的。因此，该术语包括呈与食品和饮料一起使用的添加剂和补充剂形式的草药食品。
41.术语生物活性成分在本文中被用于定义这样的植物化学物，其对于包含其的草药的药效是必要的或足够的。在本发明的情况下，生物活性成分包括idobr1。
42.术语营养品在本文中被用于定义提供生理益处或预防疾病的食品产品(或其分离物)。本发明的优选营养品是抗炎的。
43.术语标准规范在本文中被用于定义与草药、化妆品或营养品的可接受质量相关的特性或植物化学特征。在这种情况下，术语质量被用于定义产品对于其预期用途的总体适合性，并且包括适当浓度的idobr1的活性。
44.术语植物化学特征在本文中被用于定义与不同植物化学成分有关的一组特征。
45.功能测定
46.测定本发明的提取物的以下活性：(i)对唾液酸酶或tnf-α的抑制活性；或(ii)il-10刺激活性。功能测定可包括生物测定。生物测定可在体内或体外进行，并且可包括酶抑制测定(例如唾液酸酶抑制)。其他生物测定包括受体结合测定、细胞测定(包括细胞复制、细胞-病原体和细胞-细胞相互作用以及细胞分泌测定)、免疫测定、抗微生物活性(例如细菌和病毒细胞结合和/或复制)测定和毒性测定(例如ld
50
测定)。
47.功能表征也可通过允许鉴定一个或多个生物活性指标的表征的形式间接进行。
48.下面更详细地描述了示例性技术。
49.唾液酸酶
50.idobr1或含有它的提取物对唾液酸酶(神经氨酸酶)活性的抑制可通过其中使用例如来自产气荚膜梭菌(sigma-aldrich)的酶测量神经氨酸酶活性的酶促测定来确定。该测定基于切割2
′‑
(4-甲基伞形基)-α-d-n-乙酰神经氨酸(munana)底物从而使荧光产物4-甲基伞形酮(4-mu)释放的酶。因此，抑制作用是基于降低酶活性的50％所需要的idobr1或提取物的浓度(以得出ic
50
值)来确定的。
51.合适的方法可以如下：
52.1.制备反应混合物。磷酸钠缓冲液(ph 4.5)，10mmol munana4mu-neuac(100μl置缓冲液中)，100μl的0.1mg酶，0.1ml植物提取物或化合物100μl
53.2.在37℃下孵育10-30分钟。
54.3.通过加入1.25ml 0.25m甘氨酸-naoh(ph 10.4)终止反应。
55.4.用荧光法测量释放的4-甲基伞形酮(4-mu)(发射波长448nm，激发波长365nm)。
56.tnf-α和il-10
57.可以使用elisa法测量细胞培养物(例如thp-1单核细胞)或全血样本中提取物所致降低的tnf-α和增加的il-10。
58.thp-1细胞是可商购获得。可将培养的细胞置于微量滴定板中的rpmi完全培养基中(例如按每孔5个细胞置于96孔板中)，并在孵育24小时后，将pma(10ng/ml)添加至96孔板中以使thp-1细胞分化并确定对tnf-α和il-10产量的影响。该细胞应该用例如200μg/ml至25μg/ml的黄瓜提取物预处理，接着经受2hr lps(100ng/ml)刺激。孵育后，将细胞上清液从每个孔抽吸到无菌微量离心管中，并以1000rpm离心2-3分钟以使任何细胞(如果存在)沉淀。然后，细胞上清液被用于利用elisa对tnf-α或il-10的存在进行的评价。包被有合适抗体的夹心elisa板可广泛获取(例如r&d systems,usa)。
59.对于全血测量，可以将全血的等分试样(800μl)与溶解在rpmi 1640中的提取物一起孵育48小时的预孵育期，然后加入lps(10μg/ml)并在37℃、空气中5％co2的加湿(100％)气氛下继续孵育20小时。在孵育期结束时，通过在室温下以10,000g离心30秒收集由等离子
体组成的上清液，并使用人tnf-a和il-10elisa测定法(可从例如biosource europe s.a.,belgium获取的试剂盒)测量tnf-α和il-10水平。
60.物理表征
61.也可对本发明的提取物进行物理表征(尽管这不是必需的)。这可以采取以下的形式：任何给定级分中或方法中任何其他阶段处存在的一种或多种植物化学组分的定量、成分的纯度的测量、分子量(或分子量分布，或在包含多种不同植物化学成分的级分的情况下，分子量分布的各种统计函数)的确定、分子式(e)的确定(例如通过核磁共振)和各种光谱分析。
62.特别有用的光谱特性包括：
63.●
质谱(例如质荷比(m/z)值与丰度)，和/或
64.●
色谱数据(例如光谱、柱保留时间、洗脱曲线等)，和/或
65.●
光电二极管阵列(pda)光谱(例如在紫外线和可见光范围内)，和/或
66.●
电化学检测(ed)或蒸发光散射(elsd)检测；和/或
67.●
核磁共振(nmr)波谱(包括通过1h和/或
13
c nmr获得的光谱数据集)。
68.光谱表征可与分级步骤相结合。例如，gc-ms和hplc-pda-ms-ed-elsd可被用于(如本文所述)将分级与质谱、紫外-可见光谱、电化学响应或级分质量数据和色谱光谱数据的获得相结合。
69.任何或所有上述特征都可用于限定任何给定样品(或其任何级分或植物化学成分)的“化学指纹”。
70.化学表征
71.也可对本发明的提取物进行化学表征(尽管这不是必需的)。这可以采取尤其是一种或多种植物化学成分的化学反应性、其溶解度、稳定性和熔点的测量的形式。
72.本发明的化合物的医学用途
73.瘤形成(neoplasia)
74.本发明的化合物是唾液酸酶抑制剂，因此可应用于由唾液酸酶活性和/或唾液酸介导的疾病和病症的治疗或预防。
75.唾液酸酶参与包括细菌和病毒感染以及瘤形成在内的多种病理过程，这使得这些酶成为有吸引力的治疗靶点。唾液酸酶neu1和neu3的表达似乎在糖尿病中被改变(例如natori,y.等人讨论的neu1活性，2013,biol.pharm.,bull.,36,1027)。唾液酸酶也参与了动脉粥样化形成(sukhorukov,v.n.等人，2017,curr.pharm.des.,23,4696)和骨关节炎(katoh,s.等人，1999,j immunol.,162,5058)。
76.因此，本发明的化合物可应用于如下文更详细的描述的瘤形成/增殖性病症的治疗或预防。
77.如本文所用，术语“瘤形成”在严格的意义上被用于定义涉及赘生细胞异常增殖的疾病。该术语包括良性、癌前期和恶性瘤形成(如上定义)，并且与术语“增殖性病症”同义使用。
78.瘤形成是由赘生细胞的不适当的高水平细胞分裂和/或低水平凋亡或衰老引起的，该赘生细胞已获得使它们免受正常生理控制的遗传性或表观遗传性变化(即该细胞已被“转化”)。瘤形成通常会产生称为赘生物的结构：组织的异常肿块，其生长超过正常组织
的生长且与正常组织的生长不协调，并且在中止引起该变化的刺激后仍以同样的过度方式持续。虽然大多数瘤形成大的组织肿块(实体瘤)，但一些赘生物不形成此类离散的组织肿块。这些包括宫颈上皮内瘤形成、肛门上皮内瘤形成和白血病。
79.瘤形成可为良性的、潜在恶性的或恶性的。良性瘤形成包括子宫肌瘤和黑色素痣(皮肤痣)，它们不是侵袭性的，并且不会转化或进展为恶性赘生物。潜在恶性(癌前期)的赘生物包括原位癌，它不是侵袭性的，但随着时间的推移会转化为恶性赘生物。
80.恶性瘤形成引起赘生物(肿瘤)，其侵袭并破坏周围组织，可形成转移并最终杀死宿主。术语“恶性瘤形成”和“癌症”在本文中被作为同义词使用。
81.术语“增殖性病症”和“瘤形成”在本文中被作为同义词使用，用于定义涉及体内细胞病理性生长的一类疾病。
82.因此，增殖性病症包括癌症、癌症转移、平滑肌细胞增生、系统性硬化症、肝硬变、成人呼吸窘迫综合征、特发性心肌病、红斑狼疮、视网膜病(例如糖尿病性视网膜病)、心脏增生、良性前列腺增生、卵巢囊肿、肺纤维化、子宫内膜异位症、纤维瘤病、错构瘤、淋巴管瘤病、结节病和硬纤维瘤。涉及平滑肌细胞增生的瘤形成包括脉管系统中细胞的过度增生(例如内膜平滑肌细胞增生、再狭窄和血管闭塞，特别包括在生物或机械介导的血管损伤(如血管成形术)之后的狭窄)。此外，内膜平滑肌细胞增生可以包括除脉管系统之外的平滑肌中的增生(例如胆管、支气管气道和肾间质纤维化患者的肾脏中的阻塞)。非癌性增殖性病症还包括皮肤中细胞的过度增殖，诸如银屑病及其变化的临床形式、reiter综合征、毛发红糠疹和角化病症的过度增殖变体(包括光化性角化病、老年性角化病和硬皮病)。
83.术语“瘤形成”在本文中也被广义地用于定义涉及细胞体内异常生长和/或分化的疾病，因此包括增生(hyperplasia)、化生(metaplasia)和发育不良(dysplasia)。
84.增生定义了器官或组织内的正常(未转化)细胞增殖到异常程度的病况。因此，它可能导致器官明显增大、良性肿瘤形成或者可能仅在显微镜下可见。增生是对特定刺激的生理反应，增生细胞仍受制于正常调节控制机制(与细胞以异常方式增殖的瘤形成生长(其对正常生理控制无反应)不同)。实例包括先天性肾上腺增生、子宫内膜增生、良性前列腺增生(前列腺肥大)、乳腺增生(包括导管增生)、局灶性上皮增生(heck疾病)、皮脂腺增生和肝脏增生。
85.化生定义了一种成熟分化类型的细胞被另一种成熟、分化类型的细胞取代的病况。实例包括唾液腺导管柱状上皮细胞的鳞状化生(当存在结石时)、膀胱移行上皮的鳞状化生(同样，当存在结石或与感染相关联时)、胃酸反流(巴氏食管)患者的食管腺化生和结缔组织中的骨化生。
86.发育不良定义了以组织内细胞异常成熟为特征的病况。这一般由未成熟细胞扩增伴随成熟细胞的数量和位置的相应减少组成。例如，宫颈上皮发育不良的特征在于局限于粘膜表面的未成熟细胞群增加。骨髓发育不良性综合征或造血细胞发育不良表现为骨髓中未成熟细胞数量增加以及血液中成熟功能细胞减少。其他实例包括神经纤维瘤病。
87.增生、化生和发育不良一般是可逆的病况，是刺激(例如损害或损伤)的结果。相反，瘤形成一般是不可逆的并且与细胞转化相关联。
88.本发明的化合物可广泛用于包括增殖性病症，良性、癌前期和恶性瘤形成，增生，化生和发育不良在内的任何瘤形成的治疗。
89.因此，本发明可应用于治疗增殖性病症，其包括但不限于癌症、癌症转移、平滑肌细胞增殖、系统性硬化症、肝硬变、成人呼吸窘迫综合征、特发性心肌病、红斑狼疮、视网膜病(例如糖尿病性视网膜病)、心脏增生、良性前列腺增生、卵巢囊肿、肺纤维化、子宫内膜异位症、纤维瘤病、错构瘤、淋巴管瘤病、结节病和硬纤维瘤。涉及平滑肌细胞增殖的瘤形成包括脉管系统中细胞的过度增殖(例如内膜平滑肌细胞增生、再狭窄和血管闭塞，特别包括在生物或机械介导的血管损伤(如血管成形术)之后的狭窄)。此外，内膜平滑肌细胞增生可以包括除脉管系统之外的平滑肌中的增生(例如胆管、支气管气道和肾间质纤维化患者的肾脏中的阻塞)。非癌性增殖性病症还包括皮肤中细胞的过度增殖，诸如银屑病及其变化的临床形式、reiter综合征、毛发红糠疹和角化病症的过度增殖变体(包括光化性角化病、老年性角化病和硬皮病)。
90.特别优选的是恶性瘤形成(癌症)的治疗。本发明可应用于治疗任何癌症，包括选自以下主要类别的癌症：(a)癌；(b)母细胞瘤；(c)白血病；(d)淋巴瘤；(e)骨髓瘤；(f)肉瘤以及(g)混合型癌症。
91.癌是指上皮来源的恶性赘生物或者身体内部或外部衬里的癌症。癌，上皮组织的恶性肿瘤，占所有癌症病例的80％至90％。上皮组织遍布全身。它存在于皮肤以及器官和内部通道(诸如胃肠道)的覆盖层和内层中。在优选的实施方案中，根据本发明治疗的癌选自由以下癌：唾液腺癌、结肠癌、直肠癌、阑尾癌、肺癌、胸腺癌、乳腺癌、宫颈癌、膀胱癌和眼癌。
92.本发明可应用于治疗所有母细胞瘤，包括肝母细胞瘤(例如肾母细胞瘤、非上皮肾肿瘤、横纹肌样肾肿瘤、肾肉瘤和肾脏ppnet)、髓母细胞瘤、胰腺母细胞瘤、肺母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、神经母细胞瘤(包括一般的外周神经细胞肿瘤以及节细胞性神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。
93.本发明可应用于治疗所有白血病、骨髓增殖性疾病和骨髓发育不良性疾病，包括：淋巴样白血病(例如前体细胞白血病、成熟b细胞白血病、成熟t细胞白血病和nk细胞白血病)；急性髓性白血病；慢性骨髓增殖性疾病；骨髓发育不良性综合征和其他骨髓增殖性疾病。因此，本发明可应用于各种白血病的治疗，包括淋巴性白血病、淋巴细胞白血病或淋巴母细胞白血病(淋巴样和淋巴细胞血细胞系列的恶性肿瘤)和真性红细胞增多症或红细胞增多症(各种血细胞产品但以红细胞为主的恶性肿瘤)。
94.淋巴瘤发生在淋巴系统的腺体或淋巴结中，淋巴系统是血管、淋巴结以及净化体液并产生抗感染的白细胞或淋巴细胞的器官(特别是脾脏、扁桃体和胸腺)的网络。与有时被称为“液体癌”的白血病不同，淋巴瘤是“实体癌”。淋巴瘤也可能发生在特定器官，诸如胃、乳房或大脑中。这些淋巴瘤被称为结外淋巴瘤。淋巴瘤被再分为两类：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。霍奇金淋巴瘤中reed-sternberg细胞的存在从诊断上将霍奇金淋巴瘤与非霍奇金淋巴瘤区分开。本发明可应用于治疗所有此类淋巴瘤和网状内皮赘生物，包括：(a)霍奇金淋巴瘤；(b)非霍奇金淋巴瘤(例如前体细胞淋巴瘤、成熟b细胞淋巴瘤、成熟t细胞淋巴瘤和nk细胞淋巴瘤；(c)伯基特淋巴瘤以及(d)其他淋巴网状赘生物，包括套细胞淋巴瘤。
95.因此，本发明可应用于治疗广泛范围的淋巴瘤，包括例如淋巴系统(包括脾、扁桃体和胸腺)的腺体或淋巴结的肿瘤以及胃、乳腺和脑的结外淋巴瘤。
96.骨髓瘤是起源于骨髓浆细胞的癌症。因此，本发明可应用于治疗造血肿瘤和血液学恶性肿瘤，包括淋巴样谱系的造血肿瘤和血液学恶性肿瘤(例如白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、b细胞淋巴瘤(诸如弥漫性大b细胞淋巴瘤)、t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤)，以及髓样谱系的造血肿瘤(例如急性髓样白血病、慢性髓样白血病、髓性白血病和伊马替尼敏感和难治性慢性髓性白血病、骨髓发育不良性综合征、硼替佐米敏感和难治性多发性骨髓瘤、骨髓增殖性疾病或早幼粒细胞白血病和甲状腺滤泡癌)。
97.本发明可应用于治疗所有肉瘤。肉瘤是指起源于支持性和结缔组织(诸如骨骼、肌腱、软骨、肌肉和脂肪)的癌症。最常见的肉瘤一般发生在年轻成人中，往往表现为骨骼上的痛性肿块。肉瘤肿瘤通常类似于它们生长在其中的组织。用于根据本发明的治疗的示例性肉瘤包括骨肉瘤(或成骨肉瘤)、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤(平滑肌)、横纹肌肉瘤(骨骼肌)、间皮肉瘤或间皮瘤(体腔的膜衬里)、纤维肉瘤(纤维组织)、血管肉瘤或血管内皮瘤(血管)；脂肪肉瘤、胶质瘤、星形细胞瘤、粘液肉瘤(原始胚胎结缔组织)和间充质或混合中胚层肿瘤(混合结缔组织型)。纤维肉瘤包括周围神经鞘肿瘤和其他纤维性赘生物，例如纤维母细胞和肌纤维母细胞肿瘤、神经鞘肿瘤和其他纤维瘤性赘生物。还包括了卡波西肉瘤。还包括了软组织肉瘤，例如软组织的尤文(ewing)瘤和阿斯金(askin)瘤、软组织的ppnet、肾外横纹肌瘤；纤维组织细胞肿瘤；滑膜肉瘤；软组织的骨性和软骨瘤性赘生物以及肺泡软组织肉瘤。骨肉瘤(恶性骨肿瘤)包括：骨骼的恶性纤维性赘生物；恶性脊索瘤和牙源性恶性肿瘤。胶质瘤包括少突胶质瘤、混合性和未特指的胶质瘤和神经上皮胶质肿瘤。
98.本发明可应用于治疗混合型癌症，包括例如腺鳞癌、混合中胚层肿瘤、癌肉瘤和畸胎癌。因此，本发明可应用于治疗各种cns、pns和混杂的颅内和椎管内赘生物，包括：星形细胞瘤、神经母细胞瘤、胶质瘤、施旺氏细胞瘤、室管膜细胞瘤和脉络丛肿瘤(例如室管膜细胞瘤和脉络丛肿瘤)；颅内和椎管内胚胎性肿瘤(例如髓母细胞瘤、原始神经外胚层肿瘤(pnet)、髓上皮瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤和其他颅内和椎管内赘生物(例如垂体腺瘤和癌、鞍区肿瘤(颅咽管瘤)、松果体实质肿瘤、神经元和混合神经元-胶质肿瘤、脑膜瘤和一般的颅内和椎管内赘生物)。
99.因此，本发明可特别应用于治疗：颅内和椎管内生殖细胞肿瘤；颅内和椎管内生殖细胞瘤；颅内和椎管内畸胎瘤；颅内和椎管内胚胎癌；颅内和椎管内卵黄囊肿瘤；颅内和椎管内绒毛膜癌以及混合形式的颅内和椎管内肿瘤。
100.本发明还可应用于治疗各种生殖细胞肿瘤、滋养细胞肿瘤和性腺赘生物。因此，本发明可应用于治疗恶性颅外和性腺外生殖细胞肿瘤，其包括例如颅外和性腺外部位的恶性生殖细胞瘤、颅外和性腺外部位的恶性畸胎瘤、颅外和性腺外部位的胚胎癌、颅外和性腺部位的卵黄囊瘤；颅外和性腺外部位的绒毛膜癌以及一般的颅外和性腺外部位的恶性混合生殖细胞肿瘤。本发明还可应用于治疗恶性性腺生殖细胞肿瘤，包括例如恶性性腺生殖细胞瘤、精原细胞瘤、恶性性腺畸胎瘤、性腺胚胎癌、性腺卵黄囊肿瘤、性腺绒毛膜癌、混合形式的恶性性腺肿瘤和恶性性腺性腺母细胞瘤。
101.感染性疾病
102.本发明的化合物是唾液酸酶抑制剂，因此可应用于治疗或预防由唾液酸酶活性和/或唾液酸介导的疾病和病症。此类疾病和病症包括感染性疾病(包括细菌和病毒感染)。
103.本发明的化合物可具有针对任何感染因子(infective agent)的抗感染(例如病原抑制或病原杀伤)活性。因此，本发明的化合物可靶向广泛范围的不同的感染因子(即具有抵抗广泛范围的不同的感染因子的活性)。因此，本发明可广泛应用于治疗或预防任何感染或感染性疾病，包括涉及病毒、细菌、真菌、原生动物、朊病毒或后生动物因子的感染性疾病。
104.因此，本发明可广泛应用于治疗或预防病毒感染；治疗或预防细菌感染；治疗或预防原生动物感染；治疗或预防真菌感染；治疗或预防朊病毒感染；以及/或者治疗或预防后生动物(例如蠕虫)感染或侵染。本发明的化合物还可应用于治疗或预防慢性、休眠或潜伏病毒、细菌、原生动物、真菌、朊病毒或后生动物(例如蠕虫)感染或侵染。
105.●
病毒靶标包括但不限于以下病毒(或病毒类别)：逆转录病毒科(retroviridae)(例如，人类免疫缺陷病毒，包括hiv-1)；细小rna病毒科(picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠道病毒、人类柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(calciviridae)(例如，引起胃肠炎的毒株)；披膜病毒科(togaviridae)(如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(flaviridae)(例如登革病毒、脑炎病毒、黄热病病毒)；冠状病毒科(coronoviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(rhabdoviradae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(bungaviridae)(例如汉坦病毒、bunga病毒、白蛉病毒和纳罗病毒)；沙粒病毒科(arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双rna病毒科(birnaviridae)；嗜肝病毒科(hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(herpesviridae)(单纯疱疹病毒(hsv)1型和2型、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)、疱疹病毒；痘病毒科(poxviridae)(天花病毒、牛痘病毒、痘病毒)；虹膜病毒科(iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；以及未分类的病毒(例如海绵状脑病的病原因子(etiological agent)、丁型肝炎的病原因子(被认为是乙型肝炎病毒的有缺陷的卫星)、hcv病毒(引起非甲非乙型肝炎)；诺瓦克和相关病毒以及星状病毒)。在前述病毒中，特别优选的是hiv、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒、流感病毒、脑膜炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹、百日咳、脑炎病毒、乳头状瘤病毒、黄热病病毒、呼吸道合胞病毒、细小病毒、基孔肯雅病毒、出血热病毒和疱疹病毒，特别是水痘、巨细胞病毒和eb病毒。
106.●
细菌靶标包括但不限于革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌。本发明的化合物可以靶向的细菌的实例包括但不限于：幽门螺杆菌(helicobacter pylori)、伯氏疏螺旋体(borelia burgdorferi)、嗜肺军团菌(legionella pneumophilia)、分枝杆菌(mycobacterium)属(例如结核分枝杆菌(m.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(m.leprae)、鸟分枝杆菌(m.avium)、胞内分枝杆菌(m.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌(m.kansaii)和戈登分枝杆菌(m.gordonae))、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitidis)、单核细胞增生李斯特菌(listeria monocytogenes)、化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)(a群链球菌)、
无乳链球菌(streptococcus agalactiae)(b群链球菌)、草绿色链球菌(streptococcus viridans)、粪链球菌(streptococcus faecalis)、牛链球菌(streptococcus bovis)、链球菌属(streptococcus)的任何厌氧物种、肺炎链球菌(streptococcus pneumoniae)、弯曲杆菌属某些种(campylobacter spp.)、肠球菌属某些种(enterococcus spp.)、流感嗜血杆菌(haemophilus influenzae)、炭疽芽孢杆菌(bacillus anthracis)、棒杆菌属某些种(corynebacterium spp.)(包括白喉杆菌(c.diphtheriae))、红斑丹毒丝菌(erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌(clostridium perfringens)、破伤风梭菌(clostridium tetani)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、克雷伯菌属某些种(klebsiella spp.)(包括肺炎克雷伯菌(k.pneumoniae))、多杀性巴氏杆菌(pasturella multocida)、拟杆菌属某些种(bacteroides spp.)、具核梭杆菌(fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(streptobacillus monilijormis)、苍白密螺旋体(treponema pallidium)、雅司密螺旋体(treponema pertenue)、钩端螺旋体属某些种(leptospira spp.)、立克次体属某些种(rickettsia spp.)和放线菌属某些种(actinomyces spp.)(包括以色列放线菌(a.israelii))。在体内形成生物膜的细菌是本发明的化合物的特定靶标，并且这些细菌包括福赛坦氏菌(tannerella forsythia)、齿垢坦氏菌(tannerella denticola)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和阴道加德纳氏菌(gardnerella vaginalis)。
107.●
真菌靶标包括但不限于新型隐球菌(cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(histoplasma capsulatum)、粗球孢子菌(coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(blastomyces dermatitidis)、沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)和白色念珠菌(candida albicans)。
108.●
原生动物靶标包括但不限于疟原虫属某些种(plasmodium spp.)(包括恶性疟原虫(plasmodium falciparum)、三日疟原虫(plasmodium malariae)、卵形疟原虫(plasmodium ovale)和间日疟原虫(plasmodium vivax))、弓形虫属某些种(toxoplasma spp.)(包括刚地弓形虫(t.gondii)和克氏弓形虫(t.cruzii))、利什曼原虫属某些种(leishmania spp.)、隐孢子虫属某些种(cryptosporidium spp.)(包括牛隐孢子虫(c.parvum))、环孢子虫属某些种(cyclospora spp.)(包括圆孢子虫(c.cayetanensis))、内阿米巴属(entamoeba)(包括溶组织内阿米巴(e.histolytica))和贾第虫属某些种(giardia spp.)(包括兰伯贾第虫)。
109.●
后生动物靶标包括寄生虫或病原体，诸如蠕虫(例如血吸虫属某些种(schistosoma spp.))。
110.体内细菌生长的抑制
111.唾液酸酶活性是唾液酸缀合糖利用的关键，并参与宿主-病原体与细菌的相互作用。当福赛坦氏菌(tannerella forsythia)以生物膜的形式生长时，糖蛋白相关唾液酸被认为是它的关键体内营养源(roy,s.,2011,microbiology,157,3195)。本发明的化合物的唾液酸酶抑制特性还可应用于抑制体内共生和/或致病性细菌生长，特别是破坏宿主-细菌细胞相互作用，包括抑制或消除哺乳动物(例如人类)宿主中的细菌生物膜。
112.因此，所述化合物可应用于治疗或预防由细菌生物膜(例如，龈下菌斑生物膜和粘膜生物膜)的存在介导或者以细菌生物膜(例如，龈下菌斑生物膜和粘膜生物膜)的存在为
特征的疾病和病症。
113.此类疾病包括牙周病、细菌性阴道病和由福赛坦氏菌(tannerella forsythia)、齿垢坦氏菌(tannerella denticola)、牙龈卟啉单胞菌(porphyromonas gingivalis)和阴道加德纳氏菌(gardnerella vaginalis)(后者物种与细菌性阴道病和早产有关)感染引起的疾病。
114.共生细菌生长的调节
115.本发明的化合物的唾液酸酶抑制特性还可应用于调节宿主中微生物群(以及尤其是共生细菌)的组成，例如调节哺乳动物(例如人)宿主中共生细菌的组成。特别优选的是肠道微生物群的调节。
116.动脉粥样化形成
117.本发明的化合物是唾液酸酶抑制剂，因此可应用于治疗或预防动脉粥样化形成，因为唾液酸酶参与这个过程(sukhorukov,vn等人，2017,curr.pharm.des.,23,4696)和骨关节炎(katoh,s.等人，1999,jimmunol.,162,5058)。因此，本发明的化合物可应用于治疗和预防动脉粥样硬化。
118.炎症
119.本发明的化合物抑制唾液酸酶，该酶被认为参与骨关节炎中tnf-α诱导的炎症过程(gee，k.等人，2003，j biol chem.278,37275)。此外，本发明的化合物可以遏抑或抑制tnf-α活性。因此，它们可应用于其中炎症在生理功能受损和/或症状和/或疼痛中起作用的任何病症。例如，本发明的化合物可被用作例如用于减少或消除急性、慢性、局部或全身炎症的抗炎药。
120.当组织因微生物、外伤、化学品、热、冷、晒伤或任何其他有害事件受到损伤时会发生炎症。内源性化学物质(例如缓激肽、组胺和血清素)在损伤或损害时释放，并且此类化学物质会激活并吸引组织巨噬细胞和其他白细胞。在这个过程中，化学介质诸如tnf-α释放，从而引起炎症。
121.炎症性病症是其中炎症是持续或慢性的病症。在此类情况下，长时间的炎症会导致组织破坏并导致受影响组织和/或器官的广泛损坏和最终衰竭。
122.因此，本发明的化合物可应用于治疗非局部炎症性病症，例如影响超过一个器官的炎症性病症。此类病症包括由免疫功能障碍引起的病症(并且因此可具有自身免疫成分)。此类病况包括系统性红斑狼疮(sle)、硬皮病和超敏反应。
123.越来越多的证据表明炎症与2型糖尿病的发生有关。
124.本发明的化合物还可应用于治疗局部炎症性病症，包括：皮肤炎症和慢性前列腺炎，肾小球肾炎，炎症性肠病，盆腔炎症性疾病，再灌注损伤，类风湿性关节炎，移植排斥，血管炎，哮喘，痤疮，骨关节炎，口腔黏膜，胃肠炎症，眼、鼻和耳部炎症，以及其他类固醇反应性炎症性病症。
125.特别地，本发明的化合物可应用于治疗皮肤炎症性疾病。这些皮肤炎症性疾病包括例如光化性角化病，痤疮(包括寻常痤疮、粉刺、红斑痤疮和结节囊肿性痤疮)，变应性接触性皮炎，血管性水肿，大疱性类天疱疮，皮肤药物反应，多形性红斑，红斑狼疮，光照性皮炎，银屑病关节炎，硬皮病和荨麻疹，银屑病，皮炎(例如特应性皮炎)，硬皮病，类固醇反应性皮肤炎症性病症(例如尿毒症性瘙痒)以及与暴露于阳光、辐射、化学疗法和环境刺激物
相关的皮肤病况。
126.本发明的化合物也可应用于治疗炎症性自身免疫疾病。此类疾病可涉及特定组织或器官(诸如肌肉骨骼组织，如在类风湿性关节炎和强直性脊柱炎中)、胃肠道(如例如在克罗恩病和溃疡性结肠炎中)、中枢神经系统(如例如在阿尔茨海默病、多发性硬化、运动神经元病、帕金森病和慢性疲劳综合征)、胰腺β细胞(例如胰岛素依赖型糖尿病)、肾上腺(例如艾迪生病)、肾脏(例如古德帕斯彻氏综合征、iga肾病和间质性肾炎)、外分泌腺(例如舍格林综合征和自身免疫胰腺炎)和皮肤(例如银屑病和特应性皮炎)。
127.可根据本发明治疗的其他炎症性病症包括诸如骨关节炎、牙周病、糖尿病(包括2型糖尿病和糖尿病肾病)、慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化、移植物抗宿主病、慢性盆腔炎症性疾病、子宫内膜异位症、慢性肝炎和肺结核等病况。
128.剂量学
129.本发明的组合物和化合物可以局部或通过口服或肠胃外途径施用，包括静脉内、肌内、腹膜内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、直肠、阴道和局部(包括颊部和舌下)施用。
130.施用量可根据所采用的特定剂量单位、治疗时间、被治疗患者的年龄和性别、所治疗病症的性质和程度以及所选择的特定化合物而广泛变化。
131.一般而言，施用的化合物的有效量一般将在每日约0.01mg/kg至500mg/kg范围内。单位剂量可含有从0.05mg至500mg的所述化合物，并且可以每天服用一次或多次。如下所述，该化合物可与药物载体一起使用常规剂量单位形式通过口服、肠胃外或局部施用。
132.优选的施用途径是口服施用。一般而言，合适的剂量将在每天每公斤接受者体重0.01mg至500mg范围内，优选在每天每公斤体重0.1mg至50mg的范围内，最优选在每天每千克体重1mg至5mg的范围内。
133.期望的剂量优选地呈现为用于每日施用的单一剂量。然而，也可以采用在整天中以适当间隔施用的两个、三个、四个、五个、六个或更多个子剂量。这些子剂量可以单位剂型，例如，每单位剂型含有0.001mg至100mg活性成分，优选0.01mg至10mg活性成分，最优选0.5mg至1.0mg活性成分的单位剂型施用。
134.制剂
135.当idobr1是分离自天然来源时，其可被纯化。然而，本发明的组合物可采用草药、食品补充剂、食品添加剂、营养品、饮料或作为如上所限定的草药药盒或包装的单一剂量的形式。优选在使用前对此类草药进行分析以确定它们是否满足标准规范。
136.用于根据本发明使用的草药可为经干燥的植物材料。替代地，草药可为经加工的植物材料，所述加工涉及物理或化学预加工，例如粉碎、研磨、冷冻、蒸发、过滤、压制、喷雾干燥、挤出、超临界溶剂提取和酊剂(tincture production)生产。在草药以整株(或其部分)的形式施用或销售的情况下，可在使用前干燥植物材料。可以使用任何方便的干燥形式，包括冷冻干燥、喷雾干燥或风干。
137.本发明的化合物可通过在极性溶剂(诸如乙醇/水混合物，例如≥50％v/v(例如最高达～70％v/v)的乙醇/水混合物)中提取来从高分子量组分(诸如蛋白质和多糖)中分离出来。其他合适的技术包括各种膜技术。这些技术包括微滤、超滤和纳滤。作为替代或另外，电渗析也可被用来浓缩带电荷的化合物。这些方法使用孔径大小仅允许低于特定大小的分子通过的膜，或依靠分子上的电荷来允许或不允许它们通过膜。阴离子和阳离子交换树脂
也可被用于浓缩所述化合物。
138.当所述化合物是分离自天然来源时，可以对根据本发明使用的化合物进行纯化。在所述化合物与药物上可接受的赋形剂被配制在一起的实施方案中，任何合适的赋形剂均可被使用，包括例如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在)一般将为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。
139.药物组合物可采取任何合适的形式，并且包括例如片剂、酏剂、胶囊、溶液、悬浮剂、粉剂、颗粒剂和气雾剂。
140.药物组合物可采取具有多个部分(parts)的试剂盒的形式，该药盒可包含本发明的组合物以及使用说明和/或单位剂型中的多种不同组分。
141.用于口服使用的片剂可包括根据本发明使用的化合物，其与药物上可接受的赋形剂(诸如惰性稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂)混合在一起。合适的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙以及乳糖，而玉米淀粉和藻酸是合适的崩解剂。粘合剂可包括淀粉和明胶，而润滑剂(如果存在)一般将为硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。如需要，可用诸如单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯的材料对片剂进行包衣，以延迟在胃肠道中的吸收。用于口服使用的胶囊包括硬明胶胶囊(其中根据本发明使用的化合物与固体稀释剂混合在一起)以及软明胶胶囊(其中活性成分与水或油例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合在一起)。
142.用于直肠施用的制剂可呈现为含合适基质的栓剂，所述基质包括例如可可脂或水杨酸酯。适合用于阴道施用的制剂可呈现为除活性成分外还含有此类本领域中已知适当的载体的子宫托、卫生棉条、霜剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
143.对于肌内、腹膜内、皮下和静脉内使用，本发明的化合物一般将以缓冲至适当的ph值且等渗的无菌水溶液或悬浮液的形式提供。合适的水性媒介物包括林格液和等渗氯化钠。根据本发明的水性悬浮液可包括悬浮剂，诸如纤维素衍生物、藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮和黄蓍胶，以及润湿剂例如卵磷脂。用于水性悬浮液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸正丙酯。
144.本发明的化合物还可呈现为脂质体制剂。
145.对于口服施用，一种或多种所述化合物可被配制成固体或液体制品，诸如胶囊、丸剂、片剂、糖锭、锭剂、熔体(melt)、粉剂、颗粒剂、溶液、悬浮液、分散体或乳液(所述溶液、悬浮液、分散体或乳液可以是水性或非水性的)。固体单位剂型可以是胶囊，其可以是含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(诸如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)的普通的硬壳明胶型或软壳明胶型。
146.在另一个实施方案中，本发明的化合物与同以下组合在一起的常规片剂基质(诸如乳糖、蔗糖和玉米淀粉)一起被压片：粘合剂(诸如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)、旨在帮助片剂在施用后分解和溶解的崩解剂(诸如马铃薯淀粉、海藻酸、玉米淀粉和瓜尔豆胶)、旨在改善片剂颗粒流动并防止片剂材料粘附到片剂模具和冲头表面的润滑剂(诸如滑石粉、硬脂酸或硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌)、染料、着色剂，以及旨在增强片剂的美观品质并使它们更容易被患者接受的调味剂。
147.用于口服液体剂型的合适赋形剂包括添加有或未添加药物上可接受的表面活性剂、悬浮剂或乳化剂的稀释剂(诸如水和醇，例如乙醇、苯甲醇和聚乙烯醇)。
148.本发明的化合物还可通过肠胃外，即皮下、静脉内、肌内或腹膜内施用。
149.在此类实施方案中，所述化合物是与药物载体(其可以是无菌液体或液体混合物)一起作为在生理学可接受的稀释剂中的可注射剂量提供。合适的液体包括水、生理盐水、水性右旋糖和相关糖溶液、醇(诸如乙醇、异丙醇或十六醇)、二元醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、甘油缩酮(诸如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇)、醚(诸如聚(乙二醇)400)、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯，或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加有或未添加药物上可接受的表面活性剂(诸如肥皂或洗涤剂)、悬浮剂(诸如果胶、卡洛默(carhomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药用佐剂。可用于本发明的肠胃外制剂中的合适的油是石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、凡士林和矿物油。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。合适的脂肪酸酯是例如油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯。
150.合适的肥皂包括脂肪族碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括阳离子洗涤剂，例如二甲基二烷基卤化铵、烷基吡啶鎓卤化物和烷基胺乙酸盐；阴离子洗涤剂，例如烷基、芳基和烯烃的磺酸盐，烷基、烯烃、醚和单甘油酯的硫酸盐和磺基琥珀酸盐；非离子洗涤剂，例如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；以及两性洗涤剂，例如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基咪唑啉季铵盐以及混合物。
151.本发明的肠胃外组合物通常将含有约0.5重量％至约25重量％的呈溶液形式的根据本发明使用的化合物。也可以使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有具有约12至约17的亲水亲油平衡值(hlb)的非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量在约5重量％至约15重量％的范围内。表面活性剂可以是具有上述hlb的单一组分或可以是具有所需hlb的两种或更多种组分的混合物。肠胃外制剂中使用的表面活性剂的示例是聚乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯类，例如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与通过环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水基质的高分子量加合物。
152.根据本发明使用的一种或多种化合物也可以局部施用，并且当局部施用时，载体可以适当地包括溶液、软膏或凝胶基质。该基质例如可包含以下物质中的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、稀释剂(诸如水和醇)以及乳化剂和稳定剂。局部制剂可含有约0.1％至约10％w/v(每单位体积的重量)的浓度的化合物。
153.当辅助使用时，一种或多种根据本发明使用的化合物可被配制成与一种或多种其他药物一起使用。因此，辅助使用可以反映在被设计成与一种或多种其他药物相容(或协同)的特定单位剂量中或者反映在其中一种或多种所述化合物与一种或多种酶混合在一起的制剂中。辅助使用也可以反映在其中本发明的化合物与酶共同包装(例如作为一系列单位剂量的一部分)的本发明的药物药盒的组合物中。辅助使用也可反映在与一种或多种所述化合物和/或酶共同施用相关的信息和/或说明中。
154.化妆品制剂
155.本发明的化妆品组合物可选自例如保湿组合物、清洁组合物或可为皮肤提供益处的任何组合物。本发明的化妆品组合物可包含化妆品上可接受的赋形剂或载体，其例如选自下面所描述的那些。
156.在一个实施方案中，化妆品组合物是清洁组合物。合适的清洁组合物在室温下为固体或半固体。有用的清洁组合物的实例包括但不限于脂肪酸皂，包括甘油皂、合成洗涤剂及其混合物。二十世纪九十年代的soap technology(其内容通过引用方式并入本文)中广泛教示了固体清洁组合物。期望清洁组合物是可流动的。
157.在本发明的一个实施方案中，清洁组合物包含甘油皂。可用于本发明的甘油皂的实例包括但不限于美国专利第4,405,492号和第4,879,063号中公开的甘油皂，该专利的公开内容在此通过引用并入。
158.合适的脂肪酸皂的实例包括衍生自大约10至22个碳(包括羧基碳)的烃链长度的皂并且可以是饱和或不饱和。该皂可为例如钠盐、钾盐、铵盐、三乙醇铵盐及其混合物。
159.合适的合成洗涤剂包括本领域已知的用于所需目的的洗涤剂。可用于个人清洁的洗涤剂的实例包括羟乙基磺酸盐、肌氨酸盐和甘油醚磺酸盐，其可以是纯链长变体或衍生自商业油(诸如椰子油)的变体。其他合适的洗涤剂包括阴离子酰基肌氨酸盐、甲基酰基牛磺酸盐、n-酰基谷氨酸盐、烷基磺基琥珀酸盐、烷基磷酸酯、乙氧基化烷基磷酸酯、十三烷醇聚醚硫酸盐、蛋白质缩合物、乙氧基化烷基硫酸盐和烷基氧化胺的混合物、甜菜碱、磺基甜菜碱及其混合物。包括了具有1至12个乙氧基的烷基醚硫酸盐，尤其是月桂基醚硫酸铵和月桂基醚硫酸钠。
160.化妆品组合物可为保湿组合物。
161.本发明的化妆品组合物的其他任选组分包括但不限于香水、香料、防腐剂、着色剂、染料、抗结块剂和个人护理成分，包括但不限于皮肤和头发护理成分。
162.可用于本发明的合适个人护理成分的实例包括但不限于安全且有效的量的以下成分：保湿剂、防晒活性剂、皮肤舒缓剂(skin soother)、抗刺激剂、抗炎剂、润肤剂(emollient)、调理剂、润湿剂、除臭剂、止汗剂、人工晒黑剂、抗微生物剂、抗粉刺剂、抗皱剂、抗皮肤萎缩剂、皮肤紧致剂、止痒剂、抗真菌剂、局部麻醉剂、皮肤色调均匀剂(skin tone evening agent)、活性天然成分、最大程度地减少不想要的毛发的出现或延缓其再生长的剂、皮肤质地改良剂和额外的清洁剂。
163.在一个实施方案中，所述化合物可通过利用诸如用于例如干性皮肤治疗和润肤应用的油包水(w/o)乳液而从水或含醇水提取物使用。
164.润肤剂通过其保留在皮肤表面上或在角质层中作为润滑剂的能力而起作用，以减少剥落以及以改善皮肤外观。典型的润肤剂包括脂肪酯、脂肪醇、矿物油、聚醚硅氧烷共聚物等。合适润肤剂的实例包括但不限于聚丙二醇(“ppg”)-15硬脂醚、ppg-10鲸蜡醚、硬脂醇聚醚-10、油醇聚醚-8、ppg-4月桂醚、维生素e醋酸酯、peg-7甘油椰酸酯、羊毛脂及其组合。维生素e醋酸酯、peg-7甘油椰酸酯及其组合是优选的。
165.合适的湿润剂的实例包括多元醇。合适的多元醇包括但不限于甘油(也称为丙三醇)、聚亚烷基二醇、亚烷基多元醇及其衍生物，包括丙二醇、二丙二醇、聚丙二醇、聚乙二醇及其衍生物、山梨糖醇、羟丙基山梨糖醇、己二醇、1,3-二丁二醇、1,2,6-己三醇、乙氧基化甘油、丙氧基化甘油及其混合物。
166.合适的皮肤舒缓剂包括但不限于泛醇、没药醇、尿囊素、芦荟及其组合。
167.合适的调理剂包括但不限于二甲硅油丙基pg-甜菜碱、二甲硅油共聚多元醇、聚季铵盐-10、瓜尔胶、瓜尔胶衍生物及其组合。合适的抗痤疮活性成分包括但不限于水杨酸、
edta和0.2mm苯甲基磺酰氟的冰冷缓冲液中。将细胞悬液置冰上以低设置(6％幅度)(vibracelltm；sonics and materials inc.,newtown,ct)超声15秒，然后在4℃下以25,000g离心15分钟。所得上清液被用于测定溶酶体唾液酸酶活性。如上所述的那样使用bio-rad蛋白质测定试剂盒对上清液进行蛋白质定量。为了测定溶酶体唾液酸酶活性，将200μg总蛋白与40nmol 4-甲基伞形基-α-n-乙酰-d-神经氨酸(sigma)、溶酶体唾液酸酶特异性底物、10μmol醋酸钠缓冲液ph 4.6和200μg牛血清白蛋白以总体积200μl进行混合。使唾液酸酶反应在37℃下进行1小时，并通过添加0.25m甘氨酸naoh ph 10.4终止反应。在365nm激发波长和448nm发射波长下通过荧光测定法(synergy 2多模式酶标仪)测量释放的4-甲基伞形酮。发现唾液酸酶活性在16小时细胞孵育时间点达到最大值。
183.结果
184.idobr1对内源性唾液酸酶活性的抑制
[0185][0186]
黄瓜提取物批号b17cf007(q-actin)
[0187]
对内源性唾液酸酶活性的抑制
[0188][0189]
发现唾液酸酶活性在lps(1μg/ml)处理后的16小时时间点时最高，因此该孵育时间被用于进一步评估idobr1和黄瓜提取物对thp-1细胞中唾液酸酶活性的影响。
[0190]
用试验样本处理2小时
[0191]
并然后用idobr1进行16小时lps刺激的thp-1细胞中的相对唾液酸酶活性
[0192][0193]
用试验样本处理2小时
[0194]
并然后用黄瓜提取物批次b17cf007(q-actin)进行16小时lps刺激的thp-1细胞中的相对唾液酸酶活性
[0195][0196]
以50μg/ml和100μg/ml被测试的标准idobr1显示出与lps对照相比的相对唾液酸酶活性的最大降低，分别为0.63和0.55。100μg/ml和200μg/ml的q-actin显示出的相对唾液酸酶活性与对照(lps)相比分别最大降低至0.7和0.62。
[0197]
实施例3：用于使用elisa在idobr1存在下对cd44-ha(玻璃酸)结合活性进行的测定的thp-1细胞系处理
[0198]
简介
[0199]
cd44已被证明参与造血，归巢到粘膜淋巴组织，并且参与淋巴细胞浸润进入到发炎组织中。玻璃酸(ha)与cd44和cd168(rhamm)的相互作用可以诱导许多细胞行为，包括酪氨酸激酶、蛋白激酶c、fak和pi3k、mapk、nfκb和ras，以及炎症和癌症所需的细胞骨架成分的激活。尽管大多数细胞表达某种形式的cd44，但并非所有细胞都组成性地结合ha (kryworuchko,m.等人，1999,cellular immunol.,194,54；nandi等人，2000,j.biol.chem.,275,14939)。功能活性ha粘附cd44是通过mapk激活诱导唾液酸酶产生的。为了解mapk在lps诱导的炎症反应中的作用而进行的研究表明，mapk p42/44介导的tnf-α产生和随后tnf-α介导的p38激活导致由唾液酸酶活性所引起的ha粘附性cd44产生(gee,k.等人，2003，j biol chem.278,37275)。
[0200]
方法
[0201]
将thp-1细胞在补充有巯基乙醇和谷氨酰胺的rpmi培养基中培养，以在培养瓶中达到80％融合，然后将该细胞吸出并以1500rpm离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于1ml rpmi完全培养基中，并使用血细胞计数器按常规进行计数。将细胞(5
×
106)与phorbol 12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯pma)(10ng/ml)在单独的培养皿中孵育以引起thp-1细胞分化。为了测定cd44-ha结合活性，将thp-1细胞分别按浓度100μg/ml到12.5μg/ml和200μg/ml到25μg/ml用idobr1或黄瓜提取物-q-actin(批号b17cf001)预处理1小时，然后进行24小时lps(1μg/ml)刺激。孵育后，取细胞裂解物作进一步分析。
[0202]
将抗cd44单克隆抗体(invitrogen，2μg)在50mm碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(ph 9.6)中包被到96孔板的每个孔中，然后在4℃下孵育过夜。使用含有0.05％吐温20的pbs(pbs-t洗涤液)去除未被结合的抗体。使用1％bsa封闭孔并在37℃下孵育1小时。通过向孔中加入200μl pbs-t洗涤液来用pbs-t洗涤液彻底洗涤孔三次。向孔中加入50μl细胞裂解物，并在
37℃下孵育1小时。然后，在每次洗涤之前通过加入200μl pbs-t通过将孔浸泡30秒来将孔洗涤三次。加入生物素化-玻璃酸(ha)抗体，然后加入抗生蛋白链菌素-hrp以形成免疫复合物，并在37℃下孵育60分钟。吸出该溶液，并用200μl洗涤液通过将孔浸泡30秒来将孔洗涤三次。向每个孔中加入50μl色原a和色原b。将板在37℃下避光孵育15分钟。通过加入50μl终止液终止反应，在450nm处读取吸光度。
[0203]
结果
[0204]
idobr1对cd44-ha结合的抑制
[0205][0206]
黄瓜提取物批号b17cf007(q-actin)对cd44-ha结合的抑制
[0207][0208]
发现cd44结合的ha在lps刺激(1μg/ml)的thp-1细胞中为110.45ng/ml。100μg/ml的ido-br1显示出lps诱导的thp-1细胞炎症反应中的cd44-ha水平与lps对照相比的最大降低(26.62％)。200μg/ml的黄瓜提取物-q-actin表现出lps诱导的thp-1细胞炎症反应中的cd44-ha水平与lps对照相比的最大降低(30.60％)。
[0209]
实施例4：idobr1和q-actin黄瓜提取物所致的人血中tnf-α产生的减少
[0210]
简介
[0211]
tnf-α是由单核细胞(巨噬细胞)和t淋巴细胞产生的细胞因子，是产生炎症反应的级联因子中的关键元素，并且作为疾病状态的主要协调者(orchestrator)具有许多多效性效应(beutler,b.等人，1989,annual review of immunology,7,625)。tnf-α的生物学效应取决于其浓度和产生部位：在低浓度下，tnf-α可产生所需的稳态和防御功能，但在高浓度
下，tnf-α可全身地或在某些组织中与其他细胞因子，尤其白细胞介素-1(il-1)协同作用，从而加剧许多炎症反应。本研究的目的是评估idobr1或具有idobr1的黄瓜提取物在调节人全血中tnf-α水平的能力方面的抗炎活性。
[0212]
方法
[0213]
血液和血沉棕黄层级分由scottish national blood transfusion service(snbts),glasgow,uk(snbts)提供。ficoll histopaque(1.077g/l)，脂多糖(来自马流产沙门氏菌(salmonella abortus equi))购自sigma-aldrich co.ltd.(uk)。pge来自cayman chemical co.(ann arbor,mi)。用于tnf-αelisa测定的人tnf-α抗体对来自invitrogen/life sciences europe。将所有药物都溶解在来自gibco brl,uk的rpmi 1640培养基中。
[0214]
血液是在献血后未经任何进一步处理的情况下使用的。它是由苏格兰国家输血服务中心(scottish national blood transfusion service)从正常健康献血者友情提供的，正常健康献血者是通过确保他们的hiv、乙型肝炎和丙型肝炎、cmv和寄生虫病诸如疟疾检测均呈阴性(如由该国家输血服务中心测试)来界定的。我们的实验室还通过测量tnf-α的基础水平(始终《50pg/ml)来证实他们在采血时没有急性炎症性疾病。
[0215]
细胞刺激和tnf-α测量
[0216]
将全血的等分试样(800μl)与溶解在rpmi 1640中的化合物(如结果中所指示的)一起孵育适当的预孵育期，然后加入lps并在37℃下在含5％co2的空气的加湿(100％)环境中再继续孵育20小时。在孵育期结束时，通过在室温下以10,000g离心30秒收集血浆或培养基的上清液，并使用人tnf-αelisa系统(biosource europe s.a.,belgium，由invitrogen提供)测量tnf-α水平。
[0217]
结果
[0218]
黄瓜提取物和idobr1对lps诱导的人血中tnf-α的强活性列在以下两个表中。结果表明，含有0.09％idobr1的黄瓜提取物(试验性q-actin(pilot q-actin))可降低tnf-α，而idobr1在远低于10μm时有效，证实单独idobr1可促成黄瓜提取物的抗炎作用。q-actin含有的idobr1比此处使用的试验性提取物高10-100倍。含有低10倍的idobr1的q-actin提取物对tnf-α的影响低10倍(数据未示出)。
[0219]
第二项研究表明在预孵育的情况下idobr1在人血液中的活性甚至更高(在0.01μm时显著)。计算出预孵育48小时的idobr1的ic
50
，对于血液为182nm，而对于对人单核细胞系thp-1细胞的tnf-α产生的抑制为27nm。如通过台盼蓝吸收或mtt染料转化所测量，idobr1没有显著改变thp-1细胞的生活力。idobr1(在10μm下)的抑制作用与用地塞米松(50μm)进行的同一预处理的抑制作用相当，抑制率分别为》50％和》65％。米非司酮(糖皮质激素受体拮抗剂)单独与lps一起极大地增加了thp-1细胞的tnf-α产生，然而，在地塞米松存在的情况下，它逆转了地塞米松的遏抑作用，但不能逆转idobr1的遏抑作用。数据明确表明idobr1可以抑制人血液中tnf-α的产生。因此，它似乎可能是强效的抗炎剂。它似乎也可能通过与类固醇受体途径不同的新机制起作用。
[0220]
表格给出了各种idobr1浓度对lps刺激的人血液中的tnf-α产生的影响。将全血与变化浓度的idobr1一起预孵育48小时，然后加入lps(10μg/ml)并再继续孵育20小时。在37℃(5％co2，100％湿度)孵育后，通过离心从血液中收集血浆，并通过elisa测量血浆样本中的tnf-α水平。
[0221][0222]
值代表n＝3的平均值
±
sd。*表示与单独lps(零idobr1)相比p《0.05。
[0223]
表格给出了各种黄瓜提取物(0.09％idobr1)浓度对lps刺激的人血液中的tnf-α产生的影响。将全血与变化浓度的黄瓜q-actin提取物一起预孵育48小时，然后加入lps(10μg/ml)并再继续孵育20小时。在37℃(5％co2，100％湿度)孵育后，通过离心从血液中收集血浆，并通过elisa测量血浆样本中的tnf-α水平。值代表n＝3的平均值
±
s.d.。*表示与单独lps相比p《0.05。
[0224][0225]
实施例5：idobr1和黄瓜提取物对lps刺激的thp-1细胞中细胞因子il-10、il-12和il-1β的影响
[0226]
简介
[0227]
il-10是抗炎细胞因子以及促炎细胞因子的重要负调节因子。包括t细胞、b细胞和单核细胞/巨噬细胞在内的多种细胞类型在不同的免疫激活条件下都会分泌il-10(moore,k.等人，1993，annu.rev.immunol.,11,165)。体外研究表明，il-10遏抑il-1β、il-6、tnf-α、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和il-12的释放和功能(casatella,m.等人，1993,j.exp.med.,178,2207；de waal malefyt,r.等人，1991,j.exp.med.,174,1209；fiorentino,d.等人，1991,j.immunol.,147,3815)，从而揭示免疫反应和炎症控制的正常内源性反馈机制(asadullah,k.等人，1998,j.clin.invest.101,783；joosten,l.等人，1997,arthritis rheum.,40,249)。研究表明，il-10主要在转录水平下对il-12p40和p35以及对tnf-a基因表达施加其遏抑作用(aste-amezaga,m.等人，1998,j.immunol.,160,5936)。在参与多种自身免疫疾病发病机制的促炎细胞因子中，il-12是ifn-γ产生和t辅助(th)1自身免疫反应发展的主要刺激物(paunovic,v.等人，2008,rheumatology,47,771)。已经证明il-12与多种细胞因子协同作用并诱导ifn-γ和促炎细胞因子的产生。单核细胞/巨噬细胞产生il-1β以及tnf-α，后者在感染后或通过刺激lps介导炎症。它可独立地以及与
其他介质结合地诱导炎症反应和分解代谢作用。il-1β对细胞的生物激活是由与膜受体即il-1r1(il-1ri,cd121a)的相互作用来介导的，il-1r1(il-1ri，cd121a)也可以结合另一个il-1组，即il-1α。
[0228]
方法
[0229]
对thp-1单核细胞的elisa测定
[0230]
elisa测定的样品制备
[0231]
吸出80％融合培养瓶中的细胞并将其以1500rpm离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于1ml rpmi完全培养基中，并按1
×
105个细胞/孔接种到96孔微量滴定板的每个孔中。孵育24小时后，向96孔板中加入pma(10ng/ml)以使thp-1细胞分化以确定tnf-α产生，将thp-1细胞以200μg/ml到25μg/ml浓度用idobr1或黄瓜提取物-q-actin(批号b17cf001)预处理1小时，连续稀释两倍，然后进行2小时lps(100ng/ml)刺激。孵育后，将每个孔的细胞上清液吸入无菌微量离心管中，并以1000rpm离心2-3分钟。然后，细胞上清液被用于使用elisa对细胞因子的存在进行的评价中。
[0232]
夹心elisa测定
[0233]
包被有il-12、il-1β或il-10抗体的elisa板(r&d systems,usa)被用于以下研究。混匀后，向每孔中加入50μl assay diluentrd1f。向每孔中加入200μl样品(idobr1或提取物)或对照，并用胶带覆盖。在室温下孵育2小时后，吸出每个孔并用洗涤缓冲液(400μl)洗涤4次。最后一次洗涤后，通过抽吸或倾析除去任何剩余的洗涤缓冲液。将板倒置并用干净的纸巾吸干。向每个孔中加入200μl合适的人缀合物，然后用新的胶带覆盖并在室温下孵育1小时。然后重复抽吸/洗涤。然后，向每个孔中加入200μl底物溶液，并在室温避光下进一步孵育20分钟。向每孔中加入50μl终止液。孔中的颜色从蓝色变为黄色。在30分钟内在450nm处测量od。
[0234]
结果
[0235]
[0236][0237]
不同idobr1浓度下il-12的减少
[0238][0239]
不同黄瓜提取物(批号b17cf007)浓度下il-12的减少
[0240][0241]
不同idobr1浓度下il-1β的减少
[0242][0243]
不同黄瓜提取物(批号b17cf007)浓度下il-1β的减少
[0244][0245]
采用idobr1和黄瓜提取物时抗炎标志物il-10分别增加了3.04倍和3.65倍。il-10结果提示有抗炎作用。100μg/ml的idobr1显示出lps诱导的thp-1细胞炎症反应中的il-12水平与lps对照相比降低了24.53％。200μg/ml的黄瓜提取物q-actin显示出lps诱导的thp-1细胞炎症反应中的il-12水平与lps对照相比降低了25.88％。100μg/ml的idobr1使lps诱导的thp-1细胞炎症反应中的il-1β水平与lps对照相比降低了24.07％。200μg/ml的黄瓜提取物q-actin表现出lps诱导的thp-1细胞炎症反应中il-1β水平的最大降低(22.53％)。
[0246]
实施例6：健身运动与q-actin一起增加了在人血液中测量到的il-10
[0247]
简介
[0248]
我们已经证明了idobr1和黄瓜提取物(q-actin)对thp-1细胞中抗炎细胞因子il-10的调节。此处测试了服用q-actin和给予可自然引起肌肉炎症反应的剧烈运动方案的人中细胞因子的调节。
[0249]
方法
[0250]
在使用7名安慰剂受试者和10名q-actin受试者的运动恢复实验中，测量了血液样本中的il-10。从第0天开始，受试者每天两次服用10mg q-actin或安慰剂(均呈胶囊形式)，持续4天，并在第1、2、3和第4天(恢复日)进行剧烈运动。在第1、2、3天运动前后和恢复第4天结束时采集血样。通过elisa测定测量il-10。
[0251]
结果
[0252]
一旦运动开始，接受了q-actin的受试者显示il-10明显更大增加的趋势，证实了在lps刺激的thp-1细胞中获得的结果。
[0253]
表格给出了接受了剧烈运动方案的受试者的血液的il-10反应(加上和减去q-actin、含》1％idobr1的黄瓜提取物)
[0254]
[0255][0256]
d1-运动前＝运动前采集的血液
[0257]
d1-1h＝运动后1小时采集的血液
[0258]
实施例7：idobr1和含有idobr1的黄瓜提取物的mapk信号传导效应
[0259]
简介
[0260]
mapk信号传导级联在炎症反应的启动中起重要作用。炎症性细胞因子基因的诱导需要激活mapk，并且细胞外调节蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶(erk/mapk)通路的刺激对下游炎症反应至关重要(kaminska,b.,2005,biochim.biophys.acta,1754,253；buchholz,k.等人，2007,infection and immunity,75,5924)。mapk通路也是包括cox-2、inos、il-1β和tnf-α在内的炎症介质基因的表达所必需的。据报道，erk和/或p38 mapk参与il-1β的上调(baldassare,j.等人，1999,j.immunol.,162,5367)。
[0261]
方法
[0262]
将thp-1细胞在补充有巯基乙醇和谷氨酰胺的rpmi培养基中培养，以在培养瓶中达到80％融合，然后将它们吸出并以1500rpm离心5分钟。然后将细胞沉淀重悬于1ml rpmi完全培养基中，并使用血细胞计数器按常规进行计数。将细胞(5
×
106)与pma(10ng/ml)在单独的培养皿中孵育以使thp-1细胞分化。为确定蛋白表达p38和p42/44，将thp-1细胞用idobr1(100μg/ml和50μg/ml)和黄瓜提取物(q-actin批号b17cf001)(200μg/ml和100μg/ml)预处理1小时，然后进行2小时lps(1μg/ml)刺激。孵育后，收获细胞并分离全蛋白。
[0263]
蛋白质印迹程序裂解细胞沉淀，并使用bio-rad蛋白质测定试验(bio-rad)测定蛋白质浓度。对总细胞蛋白进行8％聚丙烯酰胺sds凝胶电泳，然后将该总细胞蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜(thermoscientific)上。用小鼠抗磷酸-p38 mab(thermoscientific)或小鼠抗磷酸-p42/44mab(thermoscientific)，然后用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠多克隆抗体(thermoscientific)对该膜进行探测。所有免疫印迹均通过ecl(amersham biosciences)进行可视化。以100μg/ml和200μg/ml被测试的测试样本q-actin显示出的磷酸化p38表达与lps对照相比分别相对降低了0.92和0.83。在50μg/ml和100μg/ml的idobr1的情况下，它显示出的磷酸化p38表达与lps对照相比分别降低了0.88和0.80。以100μg/ml和200μg/ml被测试的q-actin显示出磷酸化erk 42/44表达与lps对照相比分别相对降低了0.81和0.78。50μg/ml和100μg/ml的idobr1显示出的磷酸化erk 42/44表达与lps对照相比分别降低了0.80和0.76。
[0264]
表格显示了p42/44的相对表达
[0265][0266]
表格给出了p38/的相对表达。
[0267][0268]
因此，idobr1和含有idobr1的黄瓜提取物(q-actin)被证明能够减少在炎症反应中起重要作用的mapk信号级联。
[0269]
实施例8：idobr1的口服利用度和体内稳定性
[0270]
简介
[0271]
本研究的目的是通过测量尿液中idobr1的含量来研究来自食用的黄瓜/小黄瓜的idobr1的口服利用度。该研究不仅提示了idobr1的口服利用度和可能的全身活性，而且还支持该化合物不改变地通过细胞膜未的能力，因此也支持局部利用度。
[0272]
方法
[0273]
巴黎人腌黄瓜(种子购自lidl 2013)是有机种植的，一名男性志愿者和一名女性志愿者在中午各吃三个。食用的新鲜黄瓜重量在每种情况下均为260g，从食用的所有黄瓜取出30g的相似重量，并将其保留用于分析。志愿者在实验前15小时不吃葫芦科食物。在3小时内收集食用前尿样作为t＝0，然后为雌性收集9小时的样本，为雄性收集15小时的样本。将30g黄瓜样本在50％乙醇(水)中匀浆，提取15小时后过滤，并使idobr1级分以h 形式与阳离子交换树脂ir120结合。用水洗涤柱后，干燥用2m氨溶液置换的材料(52.3mg)，并在使用pierce trisil进行三甲基硅烷化后通过gc-ms进行分析。然后，在剩余的51mg材料中添加0.2mg栗精胺，用于比较定量目的。使用阳离子交换树脂对全部尿液样品进行类似处理，但是使用氨溶液置换的材料第二次运行通过相同的阳离子交换树脂(目前为铵形式)以降低强碱(其将以铵形式结合到ir120)，并且仅保留未保留的材料。将尿液idobr1级分干燥并在水中稀释至20ml。各取样500ul并添加0.025mg栗精胺。
[0274]
结果
[0275]
黄瓜的gcms分析这是在perkin elmer turbomass gold gcms上进行的。10.33分钟处主峰的图谱与真实idobr1(900288phytoquest ltd,uk)的gcms图谱匹配。计算真实br1(900125，phytoquest ltd)和栗精胺之间的相对响应因子为1:2。假设响应因子相同，30g样
本中idobr1的量估计为1.5mg，这意味着志愿者食用了大约260/30
×
1.5mg＝13mg idobr1。
[0276]
尿液结果
[0277]
食用黄瓜之前收集的尿液样本在idobr1的保留时间(10.33min)处未出现显著峰。15小时后，与栗精胺参考峰面积相比，男性显示出约2.4mg的idobr1排泄，但需要更准确地测量摄入和排泄以实现最终的质量平衡。女方已排泄约2.1mg idobr1。该研究证实idobr1可口服利用，并且可以在尿液中测出，这意味着它可以通过口服摄入进入血流，并且至少有很大一部分在尿液中原样排出。这表明该化合物可通过消化道中的膜，并且在尿液中是显著的。在尿液分析中没有观察到明显缀合。
[0278]
剩余的idobr1可能在体内停留更长时间。因此，它似乎可为强效抗炎剂，并且可能是持久的。
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实施例9：idobr1对小胶质细胞的影响
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简介
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小胶质细胞是中枢神经系统(cns)的常驻巨噬细胞。这些细胞是cns中主动免疫防御的主要形式。在神经退行性病症(诸如阿尔茨海默病和帕金森病)中，小胶质细胞被长期激活并促进促炎细胞因子的释放，从而进一步破坏正常的cns活动。人们对检查生物活性食物成分通过降低氧化应激和/或通过降低促炎基因表达来减轻炎症影响的程度具有相当大的兴趣。
[0282]
方法
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以0、20、40和80μg/ml加减次优lps，将idobr1用于鼠小胶质细胞系bv-2的细胞培养物中。24小时后测量tnf-α和亚硝酸盐的产生。有趣的是，发现来自q-actin的idobr1在降低受刺激的小胶质细胞的tnf-α和亚硝酸盐产生方面是有效的。
[0284][0285]
*在
±
lps情况下并且针对测试样本与lps 0idobr1(n＝》3)相比计算而得的显著性。
[0286]
用化合物预处理细胞30分钟，然后用lps再刺激24小时。所有实验的数据表示为至少3次实验的平均值
±
sem。使用单因素方差分析比较值，然后进行事后student newman-keuls检验。使用graphpad prism软件分析数据。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001
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等同方案
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前面的描述详细描述了本发明的当前优选实施方案。预计本领域技术人员在考虑这些描述后，可在其实践中作出许多修改和变化。这些修改和变化旨在涵盖在此处随附的权利要求书中。