自体纤维母细胞在制备抗类风湿关节炎药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及自体纤维母细胞在制备抗类风湿关节炎药物中的应用。


背景技术：

2.生物大分子药物已被全球公认为21世纪药物研究开发中最具尖端性及前沿性的研究领域。以蛋白质药物为代表的生物大分子药物发展尤为迅速。蛋白质药物与小分子化学药物相比为前者具有特异性高、毒副作用小、作用机理明确、临床成功率高的特点。以肿瘤为靶向的治疗肿瘤所采用的大分子药物开发研究领域尤为活跃。大约有100种药物获准用于临床或临床前人体试验。
3.在类风湿性关节炎中，肿瘤坏死因子-α(tnf-α)是一个关键性的炎性细胞因子，是由大量的淋巴细胞和巨噬细胞浸润至关节滑膜，在关节局部大量产生的因子，在局部介导关节损害，同时影响其它器官和系统。肿瘤坏死因子拮抗剂通过与肿瘤坏死因子的结合而阻止其炎性作用。肿瘤坏死因子(tnf-α)抑制剂为原理的药物在治疗类风湿关节炎和强直性脊柱炎中疗效肯定，耐受性好，可以治疗幼年类风湿性关节炎，牛皮癣，银屑病等自身免疫性疾病。该类药物治疗风湿病见效快，一般2－4周内可见症状开始改善，3-6个月临床症状继续改善。enbrel药物也是这样的一种肿瘤坏死因子抑制剂，它是人重组tnf-α受体p75和iggfc段的融合蛋白。但是它必须持续给药，每周75mg,有用量大，价格昂贵，全身给药的缺点。
4.临床上现行的给药方法通常为体外生产，注射入人体的治疗方法，这个方法使得需要治疗的剂量非常大，价格非常昂贵，因为全身用药，也许会带来副作用。
5.自体细胞治疗肿瘤的研究成为一个非常令人兴奋的领域。如使用改造过的杀伤性t-细胞特异性的杀伤肿瘤细胞的car-t(chimeric antigen receptor)技术，成功的治疗白血病病人。美国fda于2010年批准了第一个治疗性疫苗，用自体细胞体外刺激，回输给病人的治疗前列腺癌药物sipuleucel-t。细胞治疗在血友病，免疫缺陷病的研究上也取得举足轻重的进展。细胞治疗已经越来越广泛的应用于临床。
6.现有的用干细胞作为药物载体正引起广泛的兴趣，但是它不能提供大量细胞，而纤维母细胞能够大量获得，是分化末端的细胞，不会再分化成别种细胞。纤维母细胞或成纤维细胞能合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖，这些成分形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维以及基质成分。它们在创伤修复中起着重要的作用。纤维母细胞在体内存活时间较长，它们易于基因转导效率高，易于表达重组蛋白。


技术实现要素：

7.本发明的一个目的是提供一种重组细胞。
8.本发明提供的重组细胞，为表达抗风湿药物蛋白或其编码基因的离体纤维母细胞。
9.上述重组细胞中，所述抗风湿药物蛋白为dd.e蛋白或带有信号肽的dd.e蛋白或活性成分为dd.e蛋白的蛋白组合物。
10.上述重组细胞中，在本发明的实施例中，举例用dd.e蛋白为人源蛋白；dd.e蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2第20-486位；以带有信号肽的dd.e蛋白为例，其中信号肽选取了igg重链信号肽，带有信号肽的dd.e蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2。
11.所述离体纤维母细胞为人或动物的自体细胞。
12.本发明另一个目的是提供一种制备上述重组细胞的方法。
13.本发明提供的方法，包括如下步骤：使离体纤维母细胞表达抗风湿药物蛋白编码基因，得到重组细胞。
14.上述方法中，所述使离体纤维母细胞表达抗风湿药物编码基因为将所述抗风湿药物蛋白编码基因导入所述离体纤维母细胞中；
15.和/或，所述抗风湿药物蛋白编码基因通过慢病毒表达系统导入所述离体纤维母细胞中。
16.上述抗风湿药物蛋白编码基因通过慢病毒表达系统导入所述离体纤维母细胞中，具体为如下：
17.1)构建重组质粒plvx-puro-dd.e；
18.2)将质粒plvx-puro-dd.e、pcmv-dr8.91和pcmv-vsv-gpmd2.g导入lenti-x293t细胞中，包装得到表达dd.e的慢病毒；
19.3)将所述表达dd.e的慢病毒感染离体纤维母细胞，得到重组细胞。
20.上述重组细胞或其培养上清液在如下至少一种中的应用：
21.1)制备治疗或预防人或动物类风湿病产品；
22.2)制备减弱或抑制tnf-α对细胞的炎性毒害作用产品；其中细胞为表达tnf-α受体的细胞；
23.3)制备筛选治疗或预防人或动物类风湿病药物的动物模型中的应用；
24.4)制备中和炎性物质tnf-α产品；
25.5)治疗或预防与炎性物质tnf-α相关的疾病的产品。
26.本发明还有一个目的是提供一种具有如下1)-4)中至少一种功能产品。
27.本发明提供的产品，其包括上述重组细胞或其培养上清液；
28.1)治疗或预防人或动物类风湿病产品；
29.2)减弱或抑制tnf-α对细胞的炎性毒害作用产品；其中细胞为表达tnf-α受体的细胞；
30.3)中和炎性物质tnf-α；
31.4)治疗或预防与炎性物质tnf-α相关的疾病。
32.本发明还有一个目的是提供一种治疗或预防人或动物类风湿病的蛋白药物输送系统。
33.本发明提供的蛋白药物输送系统，包括上述第一个目的中的重组细胞。
34.自体纤维母细胞在制备蛋白药物输送系统中的应用也是本发明保护的范围；
35.或，自体纤维母细胞和蛋白药物在制备蛋白药物输送系统中的应用也是本发明保护的范围；
36.或，自体纤维母细胞和抗类风湿病蛋白药物在制备治疗或预防人或动物类风湿病的蛋白药物输送系统中的应用也是本发明保护的范围。
37.本发明设立一个以纤维母细胞(dermal fibroblast cell,df)为基础的药物供给平台，这个平台可以用于市场上热销产品：抗风湿药物/融合蛋白给药。而本发明的用自体细胞分泌生物大分子/大分子药物，这样，药物可以在体内逐步产生，局部产生，起到治疗慢性病目的。
附图说明
38.图1为plvx-pruo质粒和控制质粒plvx-ef1α-ires-zsgreen1的结构示意图。
39.图2为dd.e蛋白的结构示意图。
40.图3为dd.e在rdf(rat dermal fibroblast cell)细胞内稳定表达。
41.图4为药物基因dd.e转化后的rdf细胞(rdf/dd.e)能持续表达dd.e蛋白。
42.图5为dd.e中和tnf-α实验。
43.图6为dd.e基因转化的rdf细胞(rdf/dd.e)在动物体内表达dd.e蛋白及其消长。
44.图7为自定义关节炎级别。
45.图8为诱导类风湿关节炎后大鼠后腿后脚跟在用rdf/dd.e治疗前后的图片。
具体实施方式
46.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
47.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
48.下述实施例中部分试剂如下：
49.1.d10培养基：dmem(thermofisher scientific，cat:11965118)，添加10％(体积百分含量)fcs,20mmglutamax-1(thermofisher scientific.cat:35050-61)。
50.2.penicillin-streptomycin:10,000units/ml penicillin和10,000g/ml streptomycin gibco.cat:15-140-122，余量为生理盐水。
51.3.puromuycin:thermofisher scientific，cat:a1113802。
52.4.大鼠皮肤纤维母细胞传代细胞完全培养基(rdf完全培养基)：medium106(thermofisher scientific，cat m106500)按厂家推荐浓度添加low serum growth supplememntlsgs(thermofisherscinetific cat:s-003-10)，penicillin100单位/ml-streptomycin100mg/ml。
53.5.opti-mem：thermofisher scientific，cat 31985-062)。
54.6.伊那西普：恩利，注射用伊那西普，康德乐大药房。
55.7.转导试剂lipofectamine
tm
2000：thermofisherscientific,cat:11668027。
56.8.慢病毒滴度快速检测卡：安泰吉(北京)生物技术有限公司,cat:atg-lt。
57.9.polybrene:sigma-aldrich,cat.tr1003。
58.10.0.45um滤器：中创先锋,cat:slhp033rb。
59.11.lenti-x 293t细胞：clontech,cat:632180。
60.12.sd大鼠纤维母细胞(rat dermal fibroblast cell,rdf)：用剪刀取sd大鼠耳朵外侧2mm x 2mm大小；用剪刀剪碎，将碎片贴在细胞培养皿上，37度培养1小时。小心注入
10ml rdf完全培养基，纤维母细胞逐渐爬出皮肤组织。传代，细胞可以传代20代以上。
61.13.免疫缺陷性小鼠balb/c-nu：北京维通利华实验动物技术有限公司，4周大公鼠；
62.14.cd(sd)大公鼠：北京维通利华实验动物技术有限公司；4-6周大。
63.下面实施例中的慢病毒系统所需要的质粒：
64.1.plvx-pruo(dna序列如图1，上海联迈生物工程有限公司，cat:lm1465)；
65.2.pcmv-dr8.91(上海联迈生物工程有限公司，lm-1441)；
66.3.pcmv-vsv-gpmd2.g(武汉淼灵生物科技有限公司，cat：vsv-g)；
67.4.控制质粒plvx-ef1α-ires-zsgreen1(上海钰博生物科技有限公司cat:yb2014，dna序列如图1)。
68.下述实施例中elisa方法如下：
69.一、试剂与材料
70.1.抗人igg:sigma-aldrich cat:i3382 1mg/ml；
71.2.抗人igg-biotin:sigma-aldrich cat:sab3701279；
72.3.avidin-hrp:上海瑶韵生物科技有限公司cat:18-4100-51；
73.4.nuncmaxsorp:thermoscat:44-2404-21；
74.5.tmb:solarbio cat:pr1210；
75.6.pbs-t：tween20 0.05％融在pbs中；
76.7.封闭液：2.5％脱脂奶粉融在pbs中不含tween20；
77.8.抗体/样品稀释液：d10培养基dmem(thermofisher scientific，cat:11965118)，添加10％(v/v)fcs；
78.9.标准品：伊那西普(恩利，注射用伊那西普。康德乐大药房)
79.二、方法：
80.1.包被：抗人igg用pb缓冲液3ug/ml稀释。在每个酶标板的反应孔中加入50ul，37度2小时或4度过夜。弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗(pbs-t)洗3次(简称洗涤，下同)。
81.2.封闭：每孔加入200ul封闭液，封闭1个小时37度(封闭后不用洗涤)。
82.3.加样：
83.标准准备：用d10培养基对比稀释伊那西普标准品至浓度分别为400，200，100，50，25，12.5，6.25ng/ml。
84.样品准备:用样品稀释液d10分别倍比稀释样品，细胞培养上清稀释20倍或更高，根据样品可能表达的浓度。
85.加样：将封闭液弃去，将稀释的待检样品0.05ml加入包被好的反应孔中，每行第一孔加入样品稀释液。37度温孵育1小时。然后用洗涤液洗涤3次。
86.4.加1:1000倍稀释的抗人igg-biotin。37度温孵育1小时，洗涤3次。
87.5.加1:5000倍稀释的avidin-hrp。37度温孵育0.5小时，洗涤3次。
88.6.加tmb底物液显色,每孔0.1ml，室温反应，至蓝色出现。
89.7.终止反应：于各反应孔中加入0.5m硫酸50ul。于450nm检测od值。
90.实施例1、自体纤维母细胞蛋白药物输送系统的制备
91.1、带有信号肽的dd.e基因
92.dd.e是一个融合蛋白，由tnf-α受体p75段与人源iggfc段组成的融合蛋白，该蛋白的氨基酸序列与市售药物伊那西普(外给药)同样。市售的伊那西普为重组蛋白，源于体外细胞培养，从细胞培养上清液里纯化的蛋白。
93.本发明需要将dd.e在转基因的纤维母细胞内表达，将转基因细胞注入人体，细胞在人体内持续的合成并且能够分泌dd.e到细胞外，起到一个体内不断给药的作用。为了让合成好的dd.e蛋白分泌到细胞外，在编码dd.e基因前加入一段编码信号肽的基因，信号肽在成熟的dd.e蛋白中不存在，在蛋白分泌时被分解。
94.带有信号肽的dd.e基因的核苷酸序列为序列表中序列1，第11-67位核苷酸序列为编码信号肽序列，第68-772位核苷酸序列为编码人源tnf-α受体p75序列，第773-1471位核苷酸序列为编码人源iggfc段序列。
95.带有信号肽的dd.e基因编码的蛋白为带有信号肽的dd.e蛋白(人源)，其氨基酸序列为序列表中序列2，序列2中第1-19位为信号肽，第20-254位为tnf-α受体p75段，第255-486位为iggfc段；该蛋白成熟体即为dd.e蛋白(序列2第20-486位)。
96.2、重组载体(plvx-puro-dd.e)的制备
97.重组载体plvx-puro-dd.e为将序列1所示带有信号肽的dd.e基因插入质粒plvx-puro的ecor1和bamh1酶切位点间，得到表达带有信号肽的dd.e蛋白的载体。
98.带有信号肽的dd.e蛋白结构示意图如图2所示，a为dd.e蛋白单体是tnf-α受体p75与iggfc融合蛋白，b为预测的dd.e蛋白-tnf-α受体p75-iggfc融合蛋白的二聚体结构，成熟蛋白不含信号肽。
99.3、慢病毒包装
100.上述2制备的重组载体plvx-puro-dd.e及控制质粒plvx-ef1α-ires-zsgreen1(编码gfp蛋白)需要用慢病毒为载体将目的基因或控制基因带入纤维母细胞中去。具体方法如下：
101.1)包装慢病毒
102.第一天：收获lenti-x293t细胞，用d10培养基调节细胞浓度为4x105个细胞/1ml，在6-孔培养皿中2孔分别加入2ml细胞，每孔相当于含有8x105个细胞。
103.第二天：上午用移液枪小心从边沿吸除6孔板中培养过夜的细胞培养上清。添加不含penicillin-streptomycin的d10培养基。注意不要触动细胞。
104.下午转染细胞制备病毒：在二只ep管子里均加入100ul opti-mem，再向一支ep管加入1.5ug表达目的基因的重组载体plvx-puro-dd.e、另一只ep管加入1.5μg控制质粒plvx-ef1α-ires-zsgreen1，再向二只ep管内均加入质粒1μg pcmv-dr8.91(包装病毒质粒，编码表达gag-pol-rev蛋白)和0.8μg质粒pcmv-vsv-gpmd2.g(包装质粒，编码表达vsv-g蛋白)，最后各加入48μl lipofectamine
tm 2000，混匀，室温放置20分钟，得到质粒混合物。
105.将以上二个质粒混合物100μl分别逐滴加入以上过夜培养的细胞上，边加边摇，37℃孵育过夜。
106.第三天：早上，小心用移液枪吸去6孔培养皿上细胞培养上清液，换上2ml含penicillin(100unit/ml)-streptomycin(100μg/ml)的d10培养基。继续在37℃孵育。
107.第四天：收集培养上清液，用孔径0.45μm滤器去除细胞，得到的过滤液即为含有带有信号肽的dd.e基因的慢病毒悬液和含有控制基因(gfp)的慢病毒悬液。
108.2)慢病毒检测
109.用慢病毒滴度快速检测卡检测含有带有信号肽的dd.e基因的慢病毒悬液和含有控制基因(gfp)的慢病毒悬液，判断病毒包装效果。
110.检测卡上特异性检测条带存在，及条带颜色深浅作为判断病毒包装成功标准。
111.结果均包装成功。
112.4、慢病毒转导细胞制备表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞和表达控制蛋白的细胞rdf/gfp
113.目的基因通过病毒载体整合到细胞中去，具体如下：
114.第一天：慢病毒转导前18-24小时，将rdf(大鼠纤维母细胞)0.35
×
106个细胞悬浮在2ml rdf完全培养基中，种入6-孔细胞培养皿中的一孔，37℃培养。
115.第二天：小心去除细胞孔中1mlrdf完全培养基不触碰细胞，分别加入1ml上述3制备含有带有信号肽的dd.e基因的慢病毒悬液和含有控制基因(gfp)的慢病毒悬液(moi值均约为10)，再加入polybrene至8μg/ml，为增加转导效率，细胞在32℃离心1800g 90分钟，然后再在37℃孵育2小时，更换新鲜rdf完全培养基继续培养过夜。次日再加入1μg/ml puromycin入含有带有信号肽的dd.e基因的慢病毒悬液的细胞孔去筛选puromycin抗性细胞。经过1周培养，得到表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞；而含有控制基因(gfp)的慢病毒悬液孔对应表达控制蛋白gfp的细胞经过细胞流式仪器分选获得表达gfp的rdf/gfp控制细胞。
116.5、表达dd.e蛋白的纤维母细胞(rdf/dd.e)分泌dd.e药物的鉴定
117.rdf/dd.e细胞表达的蛋白结构是否与设计符合，能否分泌到细胞外，蛋白质能否在体外折叠成一定的构象，蛋白能否中和炎性物质tnf-α。药物在动物体内的药物代谢如何，在动物体内能否治疗风湿性关节炎，这些都需要试验来验证，具体如下：
118.1)western blotting检测rdf/dd.e细胞是否能够表达重组dd.e蛋白
119.将上述4得到的表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞、表达控制蛋白gfp的rdf/gfp细胞分别用rdf完全培养基进行体外培养过夜，收集培养过夜的细胞上清液。
120.还原加热处理：将上述各种培养上清液分别与含有2巯基乙醇(还原rd)混合，96℃加热10分钟，得到还原加热处理后培养上清液，再进行western blotting分析。
121.非还原nr：将上述各种培养上清液直接进行western blotting分析。
122.上述抗体为抗人igg。
123.结果如图3所示，除去marker外从左到右的泳道1为还原加热处理后的rdf/gfp细胞培养上清；泳道2为还原加热处理后的rdf/dd.e细胞培养上清；泳道3为rdf/dd.e细胞培养上清；可以看出，泳道2检出的蛋白在75kd左右，它与设计蛋白大小相符合；泳道3检出蛋白大小为140kd或140kd以上，这是由于蛋白质未经还原剂处理，未加热的情况下，蛋白质的二硫键保持完整，融合蛋白二聚体。泳道1在75kd处未检出设计蛋白大小的蛋白印迹。表明，在还原状态时，dd.e蛋白为75kd左右，在非还原状态下，dd.e蛋白为150kd左右，显示其为二条单体形成的二聚体。
124.2)elisa方法检测dd.e在rdf/dd.e细胞中是否持续表达
125.将上述4得到的表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞在rdf传代细胞完全培养基进行培养，50天内连续收集细胞培养上清。用elisa方法定量测定细胞培养上清中成熟体dd.e蛋白的浓度。
126.结果如图4所示，在第45天体外培养的细胞上清里仍表达dd.e蛋白，并且在培养50天这个时间段里表达量没有明显降低。成熟体dd.e蛋白在rdf/dd.e细胞内表达在被测时段内没有明显下降，可以持续稳定表达。
127.上述试验结果显示，rdf/dd.e细胞可作为大鼠自体纤维母细胞蛋白药物输送系统。
128.3)炎性物质tnf-α体外中和实验
129.材料如下：
130.a)l929细胞：武汉普诺赛生命科技有限公司，cat:cl-0137，表达tnf-α受体；
131.b)培养基r10:rpmi1640(thermofisher cat:a4192301)加入10％(v/v)fcs；
132.c)分析培养基r2:rpmi1640(thermofisher cat:a4192301)加入2％(v/v)fcs；
133.d)96-孔平底板：costar，cat：3595；
134.e)放线菌素d(actinomycin d)：北京酷来搏科技有限公司，cat:50-76-0ca1201-2mg。500μg/ml储存液避光储存在-80℃。
135.f)cck8试剂盒：上海翊圣生物科技有限公司，cat:cck8；
136.g)tnf-α:peprotec,cat:300-01a
137.方法如下：
138.a)收获l929细胞，用培养基r10悬浮细胞，调整细胞为3.5x105/ml。在96-孔细胞培养皿上，每孔加入100μl的l929细胞，37℃过夜培养。
139.b)准备试验rdf/dd.e细胞培养上清与阴性控制rdf/gfp细胞培养上清分别与炎性因子tnf-α混合的混合物：
140.将上述4得到的表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞、表达控制蛋白gfp的rdf/gfp细胞分别用rdf完全培养基进行体外培养过夜，收集培养过夜的细胞上清液。
141.rdf/dd.e培养上清或阴性控制样品rdf/gfp细胞培养上清，用分析培养基r2做2倍系列稀释。然后取以上稀释物100μl至一空白的96-孔细胞培养皿中，同时设置阳性空白对照孔，其中加入100μl分析培养基r2。再在以上所有的孔中分别加入100μl浓度2ng/ml(用分析培养基r2稀释)的tnf-α溶液。混匀，37℃2小时孵育，得到混合物。
142.c)弃去a)l929细胞过夜培养的细胞上清液，分别将b)得到的50μl混合物转移至弃去上清液的含有l929细胞的孔里。再在每孔里加入50μl放线菌素d(用分析用培养基r2稀释至4μg/ml)。37℃24小时培养。
143.d)直接加入10％cck8溶液至每孔。该试剂中含有化学成分可以被活细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，其生成的多少与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。孵育1-4小时。酶标仪读吸光度。波长450nm，加入cck8后2小时测od
450
值。
144.e)将阳性对照孔的od
150
值计设为100％存活，而其它每孔细胞测出的od
450
值与阳性对照孔的od
450
比值做出“中和曲线“，比值越高，细胞培养上清中能够中和tnf-α毒性的成分越多，tnf-α对细胞的毒性作用越小，细胞被保护的作用越大。
145.结果如图5，二条曲线，其中上图曲线为实验用rdf/dd.e细胞培养上清中和tnf-α作用的曲线图，下图曲线为阴性控制样品rdf/gfp细胞培养上清中和tnf-α作用的曲线图组。实验结果显示rdf/dd.e细胞培养上清分泌dd.e能够减弱或抑制tnf-α对l929细胞的毒
害作用；在阴性控制rdf/gfp细胞培养上清液不能中和炎性因子tnf-α对l293细胞的毒害作用；表明，dd.e能够中和tnf-α对l929细胞的毒害作用，并且这样的中和作用是随着dd.e剂量的减少而降低的。dd.e减弱或抑制tnf-α对l929细胞的毒害作用是药物特异性的。
146.6、纤维母细胞rdf/dd.e在裸鼠及sd大鼠体(自体)内表达的重组dd.e蛋白的的代谢
147.rdf细胞来源于sd大鼠，在正常小鼠体内，rdf会被小鼠体内免疫系统清除，因此，下面实验采用了没有免疫功能的裸鼠来检查rdf/dd.e细胞在裸鼠体内表达dd.e蛋白的情况。同时也在sd(自体)大鼠体内检查rdf/dd.e细胞表达dd.e蛋白的情况。
148.1)dd.e蛋白在免疫缺陷性小鼠体内的表达
149.实验组试验小鼠：将1.6x107个上述4得到的表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞悬浮在0.2ml生理盐水中，再将细胞悬浮液分别通过皮下注射到2只免疫缺陷性小鼠balb/c-nu(18g大小)，注射剂量为每只小鼠注射0.1ml含8x106个细胞；注射方式为在近后腿部腹测皮下，记作实验鼠1和实验鼠2。
150.对照组对照小鼠：将1.6x107个上述4得到的表达控制蛋白gfp的rdf/gfp细胞悬浮在0.2ml生理盐水中，再将该细胞悬浮液分别通过皮下注射到2只免疫缺陷性小鼠balb/c-nu(18g大小)，注射剂量为为每只小鼠注射0.1ml含8x106个细胞。注射方式为在近后腿部腹测皮下，记作对照鼠1和对照鼠2。
151.在注射前及注射后1-22天采集小鼠尾部血，western blotting检测小鼠血液中dd.e蛋白是否存在。
152.结果如图6a所示，为裸鼠注射实验用细胞rdf/dd.e及阴性控制细胞(rdf/gfp)前后尾巴采血，westernbloting方法检测血中dd.e的存在与消长；这是一只试验小鼠，一只对照试验小鼠的试验结果。可以看出，在rdf/dd.e细胞注射后小鼠在第二天开始检测到血液中存在dd.e，并且随着时间推移，dd.e表达有逐步增加的趋势。在第15天和22天，仍然可以检测到dd.e蛋白。由于试验采用的二抗与鼠igg有交叉反应，该交叉反应的条带在45kd左右，不影响对75kd蛋白的观察，故这里用它作为样品加样的理想内参。
153.同时检查注射后小鼠体重和内脏情况，小鼠体重结果如表1所示，可以看出，注射前后体重没有明显变化，也未检出内脏的变化。
154.表1为裸鼠注射实验用细胞rdf/dd.e及阴性控制细胞(rdf/gfp)前后体重变化
155.体重试验鼠1试验鼠2对照鼠1对照鼠2dayo18.118.818.518.4day120.219.219.118.9day22019.419.219.1day319.419.419.519.4day419.619.319.419.5day518.418219.519.4day150.619.419.619.6day1721.119.919.719.5day222119.9.19.719.9
156.2)dd.e蛋白在sd大鼠(自体)体内的表达
157.实验组试验大鼠：将18x107个上述4得到的表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞悬浮在0.6ml生理盐水中，再将细胞悬浮液分别通过皮下注射到#3，#4#5号sd大鼠后腿内部皮下，注射剂量为每只大鼠注射0.2ml含6x107个细胞；注射方式为在近后腿部腹测皮下。
158.对照组对照小鼠：将18x107个上述4得到的表达控制蛋白gfp的rdf/gfp细胞悬浮在0.6ml生理盐水中，再将该细胞悬浮液分别通过皮下注射到#1，#2和#3号sd大鼠后腿内部皮下，注射剂量为每只大鼠注射0.2ml含6x107个细胞。注射方式为在近后腿部腹测皮下。
159.在注射前及注射后1-50天采集大鼠尾部血，分离血清，用elisa方法检测血清中dd.e蛋白含量。
160.结果如图6b所示，为sd大鼠注射实验用细胞rdf/dd.e(鼠3，5，6)与阴性控制细胞rdf/gfp(鼠2，4)前后从尾巴采血elisa方法定量检测血中dd.e药物的浓度；dd.e在试验组sd大鼠体内1-15天有逐步上升的趋势，在16到50天dd.e维持在30ng/ml左右；而dd.e在对照组sd大鼠体内呈阴性，检测不到dd.e。
161.因此，表达dd.e蛋白的rdf/dd.e细胞可作为自体纤维母细胞蛋白药物输送系统实现在大鼠体内持续表达成熟体dd.e蛋白。
162.实施例2、自体纤维母细胞蛋白药物输送系统的应用
163.1、sd大鼠的动物关节炎模型的制备
164.诱导大鼠的关节炎模型，是一个比较成熟的技术。
165.试剂：
166.1)牛ii型胶原蛋白：chondrex，cat:20022；
167.2)弗氏完全佐剂：sigma-aldrich,cat:f5881；
168.方法：
169.1)将牛ii型胶原溶解在pbs溶液中，得到浓度为2mg/ml的牛ii型胶原溶液。取0.5ml的牛ii型胶原溶液和0.5ml弗氏完全佐剂，得到注射剂。
170.2)在sd大鼠尾跟部多点皮内注射。每只大鼠注射0.1ml上述1)得到的注射剂，7到30天内大鼠后脚足垫变厚，红肿。用胶原蛋白诱导了6只sd大鼠，大鼠陆续在1个月内发病。鼠1#，4#没有发病。用卡尺测量鼠脚板厚度。正常鼠脚板厚度在4.5cm。发病鼠脚板厚度在4.6cm或以上,2#，3#，5#，6#鼠发病，鼠后退发生红肿，后脚外翻。
171.根据sd大鼠红肿程度，是否外翻，将严重程度分为5级，关节炎级别如图7所示，0级：正常后腿；i级：刚可见红肿，关节僵直；ii级：明显红肿，足底变宽变厚，关节僵直；iii级：后腿根部肥大，足底变宽变厚，脚不能着地；iv级：后腿根部肥大，足底变宽变厚，脚不能着地，脚外翻。
172.sd动物在诱导类风湿关节炎前4周-6周(未成年)，体重比较统一，在380克( /-10克)，体重会有增加的趋势。动物在处死前体重差别很大，与类风湿关节炎严重程度相关。预示疼痛影响动物的食欲与睡眠从而影响动物的增重。脾重与体重的比在动物之间基本恒定。并且检查动物内脏，未发现动物脏器有异常。
173.6只sd大鼠发病级别及脚板厚度，治疗前后体重，脾重，脚重如表2和图7所示。
174.表2为sd大鼠治疗前后
[0175][0176]
2、自体纤维母细胞蛋白药物在治疗关节炎中的应用
[0177]
发病动物分成治疗组与阴性控制治疗组：
[0178]
治疗组sd大鼠#3与#6：在肿胀的脚背面皮下每只大鼠注射0.2ml悬在生理盐水中的含有4x107个上述4得到试验用rdf/dd.e细胞；
[0179]
对照组sd大鼠#2#5:在肿胀的脚背面皮下每只大鼠注射0.2ml悬在生理盐水中的含有4x107个阴性控制rdf/gfp细胞。
[0180]
注射4天后，处死大鼠，称量大鼠体重，称量脚重(在离脚后跟1cm处剪开)，用卡尺测量脚板厚度，称量大鼠的脾重，结果如表2所示和图8，诱导类风湿关节炎后大鼠后腿后脚跟部图片；4只发病鼠。后腿都达到iv级。#2，#5号鼠设为对照组与#3，#6号鼠设为治疗组，注射阴性控制细胞rdf/gfp进入#2号与#5号鼠后背部皮下。注射治疗用细胞(rdf/dd.e)进入#3号与#6号鼠后腿背部皮下。经过4天治疗检查鼠病退恢复状况。#3号鼠，#6号鼠腿肿改善明显，后腿能够着地，根据脚板厚度，期消肿程度分别为58％与120％。炎症程度改善达到ii级程度。#2号鼠，#5号鼠炎症程度没有太大的改善，仍然维持在iv级程度。其脚虽有消肿，但是消肿的幅度只有7.6％与33％。
[0181]
虽然试验动物数量小了点，不排除动物个体差异的原因，但它有趋势表明，dd.e修饰rdf细胞(rdf/dd.e细胞)有消炎作用。
[0182]
注射4天后对处死大鼠的后腿进行了ct扫描分析，结果见表3所示，可以看出，发病大鼠的骨体积增大，治疗与否对骨体积增大没有显著影响。同样发病动物后腿骨头的表面积增大。但是治疗与否对骨表面积影响不大。这表示在肉眼可见后腿肿胀发生时，骨头的伤害已经不可逆。所以今后大规模动物试验，治疗应该在发病早期进行。
[0183]
表3为小动物ct扫描结果
[0184]