核苷类衍生物改性的核酸适体R50

核苷类衍生物改性的核酸适体r50
技术领域
1.本发明属于生物技术和遗传工程技术领域，具体涉及一种核酸适体，其由核苷类衍生物改性，用于改善其稳定性，增加其成药性，以及改善其在体内应用时半衰期短以及肾清除等问题。


背景技术：

2.核酸适体
3.核酸适体是一段单链的dna或rna，通常通过筛选(指数富集配体进化技术,selex)的方法得到，与配体具有强的亲和力和特异性[1,2]。当前已有数百条基于各种靶标的核酸适体，如器官、细胞、组织、蛋白、小分子等等。其中基于肿瘤细胞和肿瘤相关蛋白的也有上百条[3]。目前有很多核酸适体已经处于临床研究阶段，但fda批准上市的目前只有一条靶向vegf，用于老年黄斑性病变的核酸适体[4]。稳定性和快速肾清除是核酸适体应用中的主要问题。
[0004]
核酸适体的改性
[0005]
当前核酸适体的改造方法有很多，主要包括末端修饰、糖环修饰、磷酸二酯键修饰、碱基修饰、镜像修饰、环化修饰、二聚化、多聚化修饰等。其中末端修饰包括生物素/荧光素等修饰，胆固醇/脂肪链修饰，peg修饰等。糖环修饰包括2位置换，4位置换等，锁核酸等。磷酸二酯键的修饰包括磷酸化/甲基化修饰，三唑改性等。当前临床实验阶段的核酸适体往往采用多种修饰相结合的方式，如当前fda批准的核酸适体macuge进行了碱基2位f代修饰,末端倒t修饰，末端peg修饰等[5]。
[0006]
药物碱基
[0007]
目前药物碱基有两种类型,一种是在原有碱基的基础上修饰药物,构成的药物碱基,另一种是将药物合成碱基类似物方便固相合成连接。如5-fu(5氟脲嘧啶)，是尿嘧啶5位上的氢被氟取代；吉西他滨是在糖环上进行氟代修饰，形成了胞嘧啶的类似物。而后有文献报道将药物构建成碱基类似物从而固相合成至dna链上。
[0008]
核酸适体连接药物碱基后使核酸适体本身有了药物活性，而药物则有了核酸适体的靶向性。根据目前文献的报道，药物碱基并不影响核酸适体的结合能力和亲和力[6,7]。
[0009]
核酸适体r50
[0010]
核酸适体r50是2012年筛选得到[8]。本专利拟通过药物碱基的修饰改善其稳定性，增加其成药性，改善其在体内应用半衰期短及肾清除等问题。
[0011]
参考文献：
[0012]
[1]craig tuerk,larry gold.science,1990,249,505-510.
[0013]
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[7]sven kruspe,ulrich hahn,2014,9,1998-2011.
[0019]
[8]li xu,zhen zhang,zilong zhao,et.al.american journal of biomedical sciences.2013,5,47-58.


技术实现要素：

[0020]
本发明提供了一种核苷类衍生物改性的核酸适体，以改善核酸适体r50的稳定性、成药性，使其能够用于靶向性成像以及治疗。
[0021]
本发明申请一方面涉及核苷类衍生物改性的核酸适体，包括如seq no:1所示的序列，所述核酸适体的至少一个核苷酸由核苷类衍生物替换，和/或末端经核苷类衍生物连接修饰；
[0022]
优选地，所述的核苷类衍生物为胸腺嘧啶核苷衍生物或胞嘧啶核苷衍生物。
[0023]
所述至少两个核苷酸由核苷类衍生物替换，优选地为两个核苷酸、四个核苷酸或六个核苷酸。
[0024]
优选地，所述替换发生在所述核酸适体的第15-30位和/或第39-45位；所述核酸适体的末端连接包括至少一个核苷酸类似物的核苷酸片段和/或一个核苷酸类似物。
[0025]
本发明申请的一个具体实施方案中，所述的核苷酸衍生物为5-fu或其衍生物，以替换所述核酸适体的目标位置的胸腺嘧啶核苷酸；所述的5-fu或其衍生物替换核酸适体的第15位、第20位、第23位、第24位、第27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸的一个、两个或多个。
[0026]
优选地，所述5-fu或其衍生物替换核酸适体的第15位、第20位、第24位和第27位的胸腺嘧啶核苷酸，可选地，所述5-fu或其衍生物替换核酸适体的第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸；优选地，所述5-fu或其衍生物替换所述核酸适体的第15位、第20位、第24位、第27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸。
[0027]
在本发明申请的具体实施方案中，所述核酸适体3’端连接一个5-fu或其衍生物，和/或所述核酸适体5’端连接包括至少一个5-fu或其衍生物的核苷酸片段，所述核苷酸片段的长度为至少5个核苷酸或其衍生物；优选地，所述核苷酸片段为5
’‑
ftftf-。
[0028]
本发明申请的具体实施方案中，针对上述的核酸适体，所述核苷酸衍生物为吉西他滨或其衍生物，其替换所述核酸适体的胞嘧啶核苷酸；所述吉西他滨或其衍生物替换所述核酸适体第39-45位的胞嘧啶核苷酸，更优选地所述吉西他滨或其衍生物替换所述核酸适体的第39位和第45位胞嘧啶核苷酸；所述核酸适体5’端连接包括至少一个吉西他滨或其衍生物的核苷酸片段，所述核苷酸片段的长度为至少5个核苷酸或其衍生物；优选地，所述核苷酸片段为5
’‑
t(gem)t(gem)-。
[0029]
本发明另一方面具体涉及一种核苷类衍生物改性的核酸适体，包括如seq no:1所示的序列，所述核酸适体的核苷酸同时分别被5-fu或其衍生物和吉西他滨或其衍生物替换，和/或末端经核苷类衍生物连接修饰；所述5-fu或其衍生物替换所述核酸适体的第15位、第20位、第24位、第27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸，所述吉西他滨或其衍生物替换所述核酸适体的第39位和第45位胞嘧啶核苷酸；优选地，所述5-fu或其衍生物替换所
述核酸适体的第15位、第20位、第24位和第27位的胸腺嘧啶核苷酸。
[0030]
优选地，所述核酸适体的3’端修饰连接包括一个或多个核苷类衍生物的dna片段，和/或所述核酸适体的5’端修饰包括一个或多个核苷类衍生物替换的dna片段。
[0031]
优选地，所述核酸适体的5’端修饰连接的核苷类衍生物替换的dna片段为5
’‑
t(gem)t(gem)-，或所述核酸适体的5’端修饰连接的核苷类衍生物替换的dna片段为5
’‑
ftftf-。
[0032]
本发明申请另一方面涉及核苷类衍生物的核酸适体，上述的任一的核苷类衍生物改性的核酸适体，末端由c18修饰、peg修饰或反向dt修饰(invert dt)。
附图说明
[0033]
图1是未修饰的核酸适体r50；
[0034]
图2是6个5-fu修饰的核酸适体；
[0035]
图3是3’端3个5-fu修饰的核酸适体；
[0036]
图4是5’端3个5-fu修饰的核酸适体；
[0037]
图5是2个gem修饰的核酸适体；
[0038]
图6是4个gem修饰的核酸适体；
[0039]
图7是5-fu和gem双修饰的核酸适体；
[0040]
图8是体外稳定性实验；
[0041]
图9是细胞水平的结合实验；
[0042]
图10是活体水平的靶向实验；
[0043]
图11是体内稳定性实验；
[0044]
图12是体外活性实验；
[0045]
图13是体内活性实验。
具体实施方式
[0046]
结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步描述，以便于更好地理解本发明，但不能因此理解为限定本发明。
[0047]
本发明所涉及核酸适体首次记载上述文献8中(li xu,zhen zhang,zilong zhao,et.al.american journal of biomedical sciences.2013,5,47-58)。此核酸适体r50经cell-selex筛选得到，并且对egfr受体具有很高的特异性和亲和性，具有诱导细胞凋亡和抑制细胞增殖的能力，可以用于潜在候选的癌症药物或药物载体，例如高表达egfr的肺癌；所述核酸适体r50的结构如图1所示，其序列如下：
[0048]5’‑
taaagggcggggggtggggtggttggtagttgttttttctgtttc-3’(seq id no:1)。
[0049]
本发明涉及利用核苷类衍生物改性的核酸适体，包括如seq no:1所示的序列，其序列经核苷类衍生物改性，以用于改善核酸适体r50的稳定性、增强r50的成药性、改善r50体内易于肾消除、半衰期短的问题。核苷类衍生物(或称为核苷类似物)，其结构或其代谢物与天然核苷酸十分相似，或者是经过修饰和改造的核苷类化合物，在合成代谢过程中掺入dna中。本技术的具体实施例中，采用核苷类衍生物替换上述核酸适体的一个或多个核苷酸，例如某个具体实施例中，核苷类衍生物替换两个核苷酸、四个核苷酸或六个核苷酸。
[0050]
本发明的具体实施方案中，所采用的核苷类衍生物为胸腺嘧啶核苷衍生物或胞嘧啶核苷衍生物。因此，此类核苷类衍生物替换核酸适体特定位置上的胸腺嘧啶或胞嘧啶，例如位于核酸适体的第15-30位、第39-45位。本技术的某个具体实施方案中，采用的核苷类衍生物为5-fu(5-氟尿嘧啶，缩写为f)或其衍生物，以替换上述核酸适体的胸腺嘧啶核苷酸；例如5-fu或其衍生物替换核酸适体的第15位、第20位、第23位、第24位、第27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸的一个、两个或多个。具体的实施方式中，5-fu或其衍生物替换上述核酸适体的第15位、第20位、第24位和第27位的胸腺嘧啶核苷酸，在另外的优选地具体实施方式中，5-fu或其衍生物替换核酸适体的第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸。另外的具体实施方式中，5-fu或其衍生物替换核酸适体的第15位、第20位、第24位、地27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸。
[0051]
本技术另外的具体实施方式中，所述的核苷类衍生物为胞嘧啶核苷衍生物，例如，本发明的具体实施方式中，采用吉西他滨(化合物)或其衍生物，替换上述核酸适体的胞嘧啶核苷酸。在此具体实施方式中，吉西他滨(缩写为gem)替换所述核酸适体第39-45位的胞嘧啶核苷酸，即替换所述核酸适体的第39位和第45位胞嘧啶核苷酸。
[0052]
核酸适体或核苷类衍生物改性的核酸适体的末端可以经过修饰以进一步提高核酸适体r50的稳定性或成药性；例如核酸适体或核苷类衍生物改性的核酸适体的末端连接一个核苷酸或核苷类衍生物，或一段核苷酸片段或经核苷类衍生物替换的核苷酸片段。例如，核酸适体的3’端连接一个核苷类衍生物，同时地或独立地，核酸适体的5’端连接一段核苷酸片段，长度为包含至少5个核苷酸，此核苷酸片段包括一个或多个核苷类衍生物，例如此核苷酸片段的一个核苷酸或多个核苷酸被核苷类衍生物替换。在具体实施方式，核酸适体的3’端连接一个5-fu。在本发明的一个实施例中，核酸适体的5’连接的一段核苷酸片段，此核苷酸片段的序列5
’‑
ftftf-[核酸适体]，在本发明的另外一个实施例中，核酸适体5’连接的一段核苷酸片段的序列为5
’‑
t(gem)t(gem)-[核酸适体]，gem为吉西他滨。
[0053]
本发明的一个具体实施方式涉及的核苷类衍生物改性的核酸适体，其核苷酸分别由5-fu或其衍生物和吉西他滨或其衍生物替换，即5-fu或其衍生物替换所述核酸适体地15位、第20位、第24位、第27位、第42位和第44位的胸腺嘧啶核苷酸的一个或多个，吉西他滨或其衍生物替换核酸适体的第39位和第45位胞嘧啶核苷酸的一个或多个。优选的实施例中，5-fu或其衍生物替换所述核酸适体的第15位、第20位、第24位、第27位的胸腺嘧啶核苷酸，吉西他滨或其衍生物替换核酸适体的第39位和第45位胞嘧啶核苷酸；在此实施例中，核苷类衍生物改性的核酸适体的5’端连接一段核苷酸片段，例如5
’‑
t(gem)t(gem)-[核酸适体]。
[0054]
本技术另外的实施例中，为了能够提高本发明涉及的核酸适体的稳定性或使用性，利用稳定基团对核酸适体的末端进行修饰；例如核酸适体的末端由c18修饰、peg修饰或反向dt修饰(invert dt)。
[0055]
下面结合具体的实施例对本技术作详细的说明。
[0056]
通过固相合成技术，根据核酸适体r50的序列，合成过程中分别利用5-fu和吉西他滨替换核酸适体的部分胸腺嘧啶核苷酸，并且5’端连接核苷酸片段。
[0057]
实施例1
[0058]
本实施例得到的5-fu改性的核酸适体的序列如下，其结构如图2所示，称为f1，
[0059]5’‑
(5-fu)t(5-fu)t(5-fu)taaagggcggggggtggggtggttggtagttgttttttctg(5-fu)t(5-fu)c(5-fu)-3’。
[0060]
实施例2
[0061]
本实施例的5-fu改性的核酸适体的序列如下，其结构如图3所示，称为f2，
[0062]5’‑
taaagggcggggggtggggtggttggtagttgttttttctg(5-fu)t(5-fu)c(5-fu)-3’。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例的5-fu改性的核酸适体的序列如下，其结构如图4所示，称为f3，
[0065]5’‑
(5-fu)t(5-fu)t(5-fu)taaagggcggggggtggggtggttggtagttgttttttctgtttc-3’。
[0066]
实施例4
[0067]
本实施例涉及的吉西他滨(gem)改性的核酸适体，其序列如下所示，结构如下图5所示，称为g1，
[0068]5’
taaagggcggggggtggggtggttggtagttgtttttt(gem)tgttt(gem)-3’。
[0069]
实施例5
[0070]
本实施例涉及的吉西他滨(gem)改性的核酸适体，其序列如下所示，结构如图6所示，称为g2，
[0071]5’‑
t(gem)t(gem)taaagggcggggggtggggtggttggtagttgtttttt(gem)tgttt(gem)-3’。
[0072]
实施例6
[0073]
本实施例涉及5-fu和吉西他滨(gem)改性的核酸适体，其序列如下所示，结构如图7所示，称为g2-f，
[0074]5’‑
t(gem)t(gem)taaagggcgggggg(5-fu)gggg(5-fu)ggt(5-fu)gg(5-fu)agttgtttttt(gem)tgttt(gem)-3’。
[0075]
实施例7体外稳定性检测
[0076]
将实施例1-实施例6得到的改性核酸适体，与细胞培养液孵育0-72小时等不同的时间，通过琼脂糖凝胶技术，检测所剩余的核酸的含量(图8)。如图所示，单纯核酸适体的半衰期为0.5小时，而改性后的核酸适体稳定性可达到3小时。
[0077]
实施例8核酸适体的结合能力检测-细胞水平和活体水平
[0078]
将上述改性的核酸适体(f1、f2、f3、g1、g2)250nm和未改性过的核酸适体r50与肺癌细胞h460在200μl缓冲液体系中孵育30分钟，清洗后检测细胞表面核酸适体的荧光强度，考察改性后的核酸适体与细胞结合能力的变化(图9)。如图9所示，细胞本身的荧光强度在103的位置，阴性对照(随机序列)lib的位置在104的位置，而序列r50本身的位移在10
5-106的位置，有明显的阳性信号。药物碱基修饰之后的序列f1、f2、f3、g1、g2位移与r50的位移一致，说明修饰并不影响核酸适体对靶标的靶向结合。
[0079]
构建肺癌细胞h460的裸小鼠皮下移植瘤模型，将上述的核酸适体(r50和f1)20μm，100μl通过尾静脉注射的方式打入小鼠体内。6小时后将小鼠安乐死并解剖取出皮下移植瘤，观察核酸适体在小鼠肿瘤部位的靶向效果(图10)。显示6小时后药物碱基改性的核酸适体f1依然具有很好的靶向性，而单纯的核酸适体组肿瘤部位已经检测不到荧光，而核酸适体f1能够表现出红色荧光。
[0080]
实施例9核酸适体的体内稳定性检测
[0081]
构建肺癌细胞h460的裸小鼠皮下移植瘤模型，将上述改性的核酸适体f1-r50，20μm，100μl通过尾静脉注射的方式打入小鼠体内，通过荧光成像仪对比单纯r50，观察小鼠肿瘤部位的荧光富集情况，及维持时间(图11)。如图，显示0、0.5、1、2、3小时内的成像结果，显示3小时内能观察到肿瘤部位有明显的靶向效果，且药物碱基修饰的核酸适体f1靶向效果更好。
[0082]
实施例10核酸适体的体外药物活性
[0083]
肺癌细胞h460接种96孔板，将上述改性的核酸适体配置成1nm，10nm，50nm，100nm，500nm，1000nm，10000nm等不同浓度，加入各孔中，48小时后加入cck-8，检测细胞的存活情况，并统计细胞存活率，对比单纯r50及药物，评估改性后核酸适体的药效(图12)。结果显示单纯的核酸适体没有细胞毒性(图未显示)，与单纯药物相比，药物碱基修饰的核酸适体保持了药物的药效，其中f1、f2、f3、g1、g2、g2-f(图示为g25fu1 ap3)的ic50如图12所示，也分别为739.3nm、2271nm、991.4nm、356.8nm、95.32nm、8.325nm。
[0084]
实施例11核酸适体的体内药物活性
[0085]
构建肺癌细胞h460的皮下移植瘤模型，通过尾静脉注射药物100μl(5-fu 30mg/kg；f1-r50 100mg/kg)，每周两次给药，观察肿瘤的生长曲线及小鼠的存活情况。评估改性后的核酸适体的药效(图13)。结果显示药物碱基改性的核酸适体g2保持了药物吉西他滨(gem)的药效，且治疗效果优于单纯的药物。
[0086]
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。