携带趋化因子受体且靶向MSLN抗原的CART免疫细胞的制备及其用途

携带趋化因子受体且靶向msln抗原的car t免疫细胞的制备及其用途
技术领域
1.本发明属于基因工程和肿瘤免疫技术领域，涉及携带趋化因子受体且靶向msln抗原的car t免疫细胞的制备及其用途，具体涉及一种特异靶向msln抗原且表达ccr2b/ccr4趋化因子受体的car t免疫细胞的制备及用途。


背景技术：

2.癌症是全世界范围内主要致死因素之一，危害着人类的健康与生命。最新的全球肿瘤统计显示，2018年癌症新增病例1819万，癌症死亡病例960万。致死率排名靠前的分别为肺癌、结直肠癌、胃癌、肝癌和乳腺癌，占到了所有癌症死亡比例的二分之一。肿瘤的传统治疗方式包括手术、化疗、放疗等，虽然能够杀死肿瘤细胞，但它们有很大的局限性。化疗、放疗针对的是增殖率高的细胞，但却不能区分恶性细胞和在正常生理条件下增殖的其他组织，无法选择性的针对恶性肿瘤细胞，在药物剂量上是过量的，带来了不可避免的副作用。靶向治疗虽然解决了一部分患者的问题，但适应群体小且易产生耐药性。细胞免疫治疗是继上述疗法后的一种极具疗效与前景的新治疗手段。自2017年8月首次批准抗cd19car t治疗急性淋巴细胞白血病(all)以来，如今已经有3款细胞治疗药物经fda批准上市。然而，在实体肿瘤中看到的治疗效果并不明显，其原因与缺乏肿瘤特异性抗原(tumor specific antigen,tsa)、t细胞的存活及扩增不足、t细胞向肿瘤组织的迁移效率低和免疫抑制的肿瘤微环境(tumor microenvironment,tme)等因素有关。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种特异靶向msln抗原且表达ccr2b/ccr4趋化因子受体的car t免疫细胞的制备及用途。
4.car t治疗血液瘤和实体瘤的效果差异显著，造成这种疗效差异的首要原因就是实体瘤组织特有的肿瘤微环境抑制了car t细胞向肿瘤组织的迁移。血液循环中car t细胞向肿瘤组织迁移是一个多步骤的过程，需要趋化因子的参与，当t细胞表面的趋化因子受体与肿瘤组织所分泌的趋化因子结合后，能促进免疫细胞向肿瘤的迁移。
5.基于上述思路，本技术将ccr2b/ccr4与在nsclc高表达间皮素(mesothelin,msln)的单链抗体融合构建成msln-ccr2b/ccr4-car共表达载体，通过慢病毒感染cd3 t细胞，制备msln-ccr2b/ccr4-car t细胞。
6.一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，包含cd8α信号肽、靶向msln的scfv、cd8α铰链域、cd8α跨膜域、4-1bb共刺激域及cd3ζ信号传导域。
7.本发明中，car包含胞外域、铰链域、跨膜域及胞内域。较好的，本发明的嵌合抗原受体包括：cd8α信号肽、靶向msln的scfv、cd8α铰链域、cd8α跨膜域、4-1bb共刺激域、cd3ζ信号传导域、p2a剪切信号肽、ccr2b/ccr4趋化因子受体。
8.更好的，所述的靶向msln的scfv氨基酸序列如seq id no:11所示；
9.所述的4-1bb胞内共刺激域的氨基酸序列如seq id no:14所示；
10.所述的cd3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如seq id no:15所示；
11.所述的ccr2b趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no:17所示；
12.所述的ccr4趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no:18所示；
13.所述的cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no:10所示；
14.所述的cd8α铰链域的氨基酸序列如seq id no:12所示；
15.所述的cd8α跨膜域的氨基酸序列如seq id no:13所示。
16.本发明还包括一种载体，所述的载体含有上述嵌合抗原受体的编码序列。
17.较好的，所述cd8α信号肽的编码序列如seq id no:1所示；
18.所述靶向msln的scfv编码序列如seq id no:2所示；
19.所述cd8α铰链域的编码序列如seq id no:3所示；
20.所述cd8α跨膜域的编码序列如seq id no:4所示；
21.所述4-1bb胞内共刺激域的编码序列如seq id no:5所示；
22.所述cd3ζ胞内信号传导域的编码序列如seq id no:6所示；
23.所述p2a剪切信号肽的编码序列如seq id no:7所示；
24.所述ccr2b趋化因子受体的编码序列如seq id no:8所示；
25.所述ccr4趋化因子受体的编码序列如seq id no:9所示。
26.上述嵌合抗原受体或者其编码载体，可以使用本领域的常规技术方法获得。例如，在市售的car质粒基础上改良，或者按照目标序列人工合成。
27.本发明还包括一种细胞，所述的细胞是表达靶向肿瘤细胞表面msln的嵌合抗原受体car，同时能够表达ccr2b/ccr4趋化因子受体的免疫细胞。
28.较好的，所述的细胞表达上述嵌合抗原受体。
29.所述的免疫细胞可以由慢病毒感染后获得。所述的慢病毒包括：cd8α信号肽、靶向msln的scfv、cd8α铰链域、cd8α跨膜域、4-1bb共刺激域、cd3ζ信号传导域、p2a剪切信号肽、ccr2b/ccr4趋化因子受体。
30.较好的，所述免疫细胞为t淋巴细胞或者nk细胞。
31.较好的，所述的细胞中，所述cd8α信号肽的氨基酸序列如seq id no:10所示；
32.所述靶向msln的scfv氨基酸序列如seq id no:11所示；
33.所述cd8α铰链域的氨基酸序列如seq id no:12所示；
34.所述cd8α跨膜域的氨基酸序列如seq id no:13所示；
35.所述4-1bb胞内共刺激域的氨基酸序列如seq id no:14所示；
36.所述cd3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如seq id no:15所示；
37.所述p2a剪切信号肽的氨基酸序列如seq id no:16所示；
38.所述ccr2b趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no:17所示；
39.所述ccr4趋化因子受体的氨基酸序列如seq id no:18所示。
40.另一方面，本发明还提供了上述嵌合抗原受体和免疫细胞的应用，即上述嵌合抗原受体或者免疫细胞在制备治疗药物中的应用。
41.在本发明的一个优选实施例中，所述的肿瘤源自非小细胞肺癌。
42.在一个优选实施例中，所述免疫细胞由表达嵌合抗原受体和ccr2b/ccr4趋化因子
受体的慢病毒载体感染后获得。
43.在一个优选实施例中，所述的嵌合抗原受体表达序列及ccr2b/ccr4趋化因子受体表达序列均整合入所述免疫细胞的基因组中。
44.在一个优选实施例中，所述肿瘤细胞为msln阳性的nsclc细胞系，本发明所述的免疫细胞使用范围不仅限于此，优选地，所述癌症包含msln阳性的卵巢癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、间皮瘤等。
附图说明
45.图1：msln-ccr2b/ccr4-car载体元件示意图及酶切鉴定。
46.图2：msln-ccr2b/ccr4-car在原代cd3 t细胞的表达效率。
47.图3：ccr2b/ccr4在原代cd3 t细胞体外功能活性的检测。
48.图4：msln-ccr2b/ccr4-car t细胞体外对肿瘤细胞的杀伤作用。
49.图5：msln-ccr2b/ccr4-car t细胞体外il-2、tnf-α、inf-γ细胞因子的分泌。
50.图6：在nsg小鼠肺癌cdx移植瘤模型中，msln-ccr2b/ccr4-car t细胞具有更强的迁移和抗肿瘤功能。
具体实施方式
51.通过以下公开的实施例来说明本发明的优越性，结合本发明所出示的附图，对本发明以下实施例中的具体实施方法进行详细阐述。
52.实施例1.构建msln-ccr2b/ccr4-car载体
53.人工合成anti-msln scfv，然后与cd8α信号肽、cd8α铰链域、cd8α跨膜域、4-1bb共刺激域及cd3ζ胞内域连接，构建msln-car载体。将pcr得到的ccr2b/ccr4片段胶回收，进行overlap pcr，通过p2a剪切信号肽与msln-car相连。载体构建后，msln-car双酶切后，得到4449bp、3250bp、1527bp三条带；msln-ccr2b-car双酶切后，得到6609bp、2750bp、998bp三条带，与预期一致；msln-ccr4-car双酶切后，得到5324bp、2664bp、2375bp三条带，与预期符合，进一步通过sanger测序确认所有载体序列正确无误(图1)。
54.实施例2.制备msln-ccr2b/ccr4-cart细胞，检测car表达效率
55.利用三质粒包装系统，将构建好的car载体与pspax2、pmd2g以5:4:3的摩尔比包装慢病毒，然后感染293ft-17细胞，通过定量pcr检测病毒滴度在5
×
107/ml左右。利用阴选的方法从pbmc分离人cd3 t细胞，加入cd3/cd28磁珠进行活化，48h后，病毒感染活化后的cd3 t细胞，如图2所示，car的表达效率在50-60％，同时，流式检测细胞表面ccr2b与ccr4也能有效表达。
56.实施例3.ccr2b/ccr4对msln-cart细胞迁移的影响
57.首先铺板a549-mlm细胞系，6孔板中培养24h，吸取分泌有mcp-1的上清，离心去杂质后吸取600μl置于transwell的下层小室，上层小室计数2
×
105/100μl mock，msln-car与msln-ccr2b/ccr4-cart细胞，培养24h后，通过cck-8统计穿梭到下层小室的细胞数。结果表明，与相比，修饰ccr2b/ccr4后，促进了cart细胞向下层小室的迁移，下层的细胞数分别是对照组的2.6/2.2倍。
58.实施例4.msln-ccr2b/ccr4-cart细胞在体外对靶细胞的杀伤检测
59.在体外将mock t、msln-car t、msln-ccr2b-car t与a549-mlm按照1:1，5:1，10:1的效靶比(e:tratio)分别共孵育10h后，利用ldh检测其杀伤效率，如图4所示，单独的msln-cart细胞和a549-mlm按照10:1共孵育时，能达到65％的杀伤，5:1时杀伤效率为35％。当加了ccr2b元件，10:1的效靶比下，杀伤效率为61％。与mockt细胞相比，在5:1及10:1的情况下，msln-car t和msln-ccr2b/ccr4-cart杀伤效率无显著差异性。
60.实例5.msln-ccr2b-cart体外细胞因子的释放
61.将效应细胞和靶细胞共孵育24h后，收集培养基上清，检测细胞因子的表达。与mock组相比，msln-car与msln-ccr2b-car组il-2的分泌量达到3000pg/ml左右，比mock组升高了约2倍，inf-γ的分泌量达到6000pg/ml，与mock组相比具有显著差异，tnf-α的分泌量为8000pg/ml左右，明显高于mock组，msln-car与msln-ccr2b-car组相比细胞因子的分泌没有明显差异。
62.实施例6.msln-ccr2b-car t细胞体内抗肿瘤作用检测
63.选用4-8周的nsg免疫缺陷雌鼠，每只小鼠皮下注射5
×
106a549-mlm靶细胞，待肿瘤细胞移植成功后随机分为pbs、msln-car及msln-ccr2b-car三组，7天后，尾静脉注射1
×
107效应细胞，14天后，尾静脉重复注射效应细胞一次，每周一次活体成像，监测荧光强度变化。如图所示，第7天，15只小鼠均检测到明显的荧光信号，光子强度达到10000cps左右，成像当天注射第1次效应细胞。第14天，每只小鼠的荧光强度仍在增强，但car t细胞注射组的光子强度低于pbs组，尤其msln-ccr2b-car t组与pbs组相比已经出现显著性差异(p《0.05)，成像当天注射第2次效应细胞。第21天，pbs组小鼠的荧光信号达到最高65535cps，已经是所用活体成像仪的阈值上限，从图中可以看到，在肿瘤荧光信号的中心部位出现了灰色的空洞，表明信号值已经过曝，而car t细胞治疗组信号强度开始有回落趋势。第28天，pbs组肿瘤继续在增大，在car t细胞作用下，肿瘤的荧光强度仍然在持续下降，和对照组相比，已经具有显著性差异(p《0.001)。从图6a可以看出，第28天msln-ccr2b-car组已经低于msln-car。第35天，msln-car组有40％的小鼠肿瘤完全清除，60％的小鼠肿瘤仍然具有微弱的荧光信号(8000cps左右)，而msln-ccr2b-car组小鼠肿瘤已达到100％清除。除了小鼠活体成像的结果，对剥离肿瘤组织进行拍照、称重，更为直观地呈现了不同处理组肿瘤的生长情况，结果显示，msln-car与msln-ccr2b-car t细胞在体内均能有效地清除肿瘤细胞，msln-ccr2b-car t具有更高的清除率。
64.序列表
65.seq id no:1:
66.cd8αleader
67.dna
68.人工序列(artificial sequence)
69.63
70.atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccg
71.seq id no:2
72.msln scfv
73.dna
74.人工序列(artificial sequence)
75.774
76.caggtgcagctgcagcagtcaggaccaggactggtgacacctagccagacactgagcctgacctgcgccattagcggcgatagcgtgtctagcaacagcgccacttggaattggatccggcagagcccttctagaggactggagtggctcggcaggacctactaccgcagcaagtggtataacgactacgccgtgtccgtgaagagcaggatgagcatcaaccccgacaccagcaagaaccagttctccctgcagctgaacagcgtgacacccgaggataccgcagtgtactattgcgcccggggcatgatgacctactactacggcatggacgtgtggggacagggaacaacagtgaccgtgagcagcggaattctgggaagcggaggaggaggtagcggaggaggaggaagcggaggaggaggatctcagccagtgctgacacagagctcttctctgagcgcctctccaggagctagcgctagcctgacttgcaccctgagaagcggaatcaacgtgggcccctaccggatctattggtaccagcagaagccaggctctcctcctcagtacctgctgaactacaagagcgacagcgacaagcagcagggaagcggagtgcctagcagattcagcggcagcaaagacgccagcgccaacgcaggagtgctgctgatcagcggactgagaagcgaggacgaggccgactactactgcatgatttggcacagcagcgccgccgtgtttggaggaggcacccagctgacagtgctg
77.seq id no:3
78.cd8α铰链域
79.dna
80.人工序列(artificial sequence)
81.135
82.accacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgat
83.seq id no:4
84.cd8α跨膜域
85.dna
86.人工序列(artificial sequence)
87.72
88.atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc
89.seq id no:5
90.4-1bb共刺激域
91.dna
92.人工序列(artificial sequence)
93.126
94.aaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactg
95.seq id no:6
96.cd3ζ信号传导域
97.dna
98.人工序列(artificial sequence)
99.336
100.agagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgag
ctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc
101.seq id no:7
102.p2a剪切信号肽
103.dna
104.人工序列(artificial sequence)
105.57
106.gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct
107.seq id no:8
108.ccr2b趋化因子受体
109.dna
110.人工序列(artificial sequence)
111.1083
112.atgctgtccacatctcgttctcggtttatcagaaataccaacgagagcggtgaagaagtcaccaccttttttgattatgattacggtgctccctgtcataaatttgacgtgaagcaaattggggcccaactcctgcctccgctctactcgctggtgttcatctttggttttgtgggcaacatgctggtcgtcctcatcttaataaactgcaaaaagctgaagtgcttgactgacatttacctgctcaacctggccatctctgatctgctttttcttattactctcccattgtgggctcactctgctgcaaatgagtgggtctttgggaatgcaatgtgcaaattattcacagggctgtatcacatcggttattttggcggaatcttcttcatcatcctcctgacaatcgatagatacctggctattgtccatgctgtgtttgctttaaaagccaggacggtcacctttggggtggtgacaagtgtgatcacctggttggtggctgtgtttgcttctgtcccaggaatcatctttactaaatgccagaaagaagattctgtttatgtctgtggcccttattttccacgaggatggaataatttccacacaataatgaggaacattttggggctggtcctgccgctgctcatcatggtcatctgctactcgggaatcctgaaaaccctgcttcggtgtcgaaacgagaagaagaggcatagggcagtgagagtcatcttcaccatcatgattgtttactttctcttctggactccctataacattgtcattctcctgaacaccttccaggaattcttcggcctgagtaactgtgaaagcaccagtcaactggaccaagccacgcaggtgacagagactcttgggatgactcactgctgcatcaatcccatcatctatgccttcgttggggagaagttcagaaggtatctctcggtgttcttccgaaagcacatcaccaagcgcttctgcaaacaatgtccagttttctacagggagacagtggatggagtgacttcaacaaacacgccttccactggggagcaggaagtctcggctggtttataaseq id no:9
113.ccr4趋化因子受体
114.dna
115.人工序列(artificial sequence)
116.1083
117.atgaaccccacggatatagcagacaccaccctcgatgaaagcatatacagcaattactatctgtatgaaagtatccccaagccttgcaccaaagaaggcatcaaggcatttggggagctcttcctgcccccactgtattccttggtttttgtatttggtctgcttggaaattctgtggtggttctggtcctgttcaaatacaagcggctcaggtccatgactgatgtgtacctgctcaaccttgccatctcggatctgctcttcgtgttttccctccctttttggggctactatgcagcagaccagtgggtttttgggctaggtctgtgcaagatgatttcctggatgtacttggtgggcttttacagtggcatatt
ctttgtcatgctcatgagcattgatagatacctggcaattgtgcacgcggtgttttccttgagggcaaggaccttgacttatggggtcatcaccagtttggctacatggtcagtggctgtgttcgcctcccttcctggctttctgttcagcacttgttatactgagcgcaaccatacctactgcaaaaccaagtactctctcaactccacgacgtggaaggttctcagctccctggaaatcaacattctcggattggtgatccccttagggatcatgctgttttgctactccatgatcatcaggaccttgcagcattgtaaaaatgagaagaagaacaaggcggtgaagatgatctttgccgtggtggtcctcttccttgggttctggacaccttacaacatagtgctcttcctagagaccctggtggagctagaagtccttcaggactgcacctttgaaagatacttggactatgccatccaggccacagaaactctggcttttgttcactgctgccttaatcccatcatctacttttttctgggggagaaatttcgcaagtacatcctacagctcttcaaaacctgcaggggcctttttgtgctctgccaatactgtgggctcctccaaatttactctgctgacacccccagctcatcttacacgcagtccaccatggatcatgatctccatgatgctctgtag
118.seq id no:10
119.cd8αleader
120.prt
121.人工序列(artificial sequence)
122.21
123.malpvtalllplalllhaarp
124.seq id no:11
125.msln scfv
126.prt
127.人工序列(artificial sequence)
128.258
129.qvqlqqsgpglvtpsqtlsltcaisgdsvssnsatwnwirqspsrglewlgrtyyrskwyndyavsvksrmsinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycargmmtyyygmdvwgqgttvtvssgilgsggggsggggsggggsqpvltqssslsaspgasasltctlrsginvgpyriywyqqkpgsppqyllnyksdsdkqqgsgvpsrfsgskdasanagvllisglrsedeadyycmiwhssaavfgggtqltvl
130.seq id no:12
131.cd8α铰链域
132.prt
133.人工序列(artificial sequence)
134.45
135.tttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacd
136.seq id no:13
137.cd8α跨膜域
138.prt
139.人工序列(artificial sequence)
140.24
141.iyiwaplagtcgvlllslvitlyc
142.seq id no:14
143.4-1bb共刺激域
144.prt
145.人工序列(artificial sequence)
146.42
147.krgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcel
148.seq id no:15
149.cd3ζ信号传导域
150.prt
151.人工序列(artificial sequence)
152.112
153.rvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr
154.seq id no:16
155.p2a剪切信号肽
156.prt
157.人工序列(artificial sequence)
158.19
159.atnfsllkqagdveenpgp
160.seq id no:17
161.ccr2b趋化因子受体
162.prt
163.人工序列(artificial sequence)
164.360
165.mlstsrsrfirntnesgeevttffdydygapchkfdvkqigaqllpplyslvfifgfvgnmlvvlilinckklkcltdiyllnlaisdllflitlplwahsaanewvfgnamcklftglyhigyfggiffiilltidrylaivhavfalkartvtfgvvtsvitwlvavfasvpgiiftkcqkedsvyvcgpyfprgwnnfhtimrnilglvlpllimvicysgilktllrcrnekkrhravrviftimivyflfwtpynivillntfqeffglsncestsqldqatqvtetlgmthccinpiiyafvgekfrrylsvffrkhitkrfckqcpvfyretvdgvtstntpstgeqevsagl
166.seq id no:18
167.ccr4趋化因子受体
168.prt
169.人工序列(artificial sequence)
170.360
171.mnptdiadttldesiysnyylyesipkpctkegikafgelflpplyslvfvfgllgnsvvvlvlfkykrlrsmtdvyllnlaisdllfvfslpfwgyyaadqwvfglglckmiswmylvgfysgiffvmlmsidrylaivhavfslrartltygvitslatwsvavfaslpgflfstcyternhtycktkyslnsttwkvlssleinilglviplgimlfcysmiirtlqhcknekknkavkmifavvvlflgfwtpynivlfletlvelevlqdctferyldyaiqatetlafvhcclnpiiyfflgekfrkyilqlfktcrglfvlcqycgllqiysadtpsssytqstmdhdlhdal。