17-O-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体、其制备、活性和应用的制作方法

17-o-乙酰-17-β
雌二醇的自组装的三聚体、其制备、活性和应用
技术领域
1.本发明涉及一种17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3,涉及[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的制备方法及表征,进一步涉及[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对卵巢切除雌性小鼠的治疗作用。因而本发明阐明了[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3在制备治疗女性绝经反应药物中的应用。本发明属于生物医药领域。


背景技术：

[0002]
在过去的几十年里,普遍认为绝经前的健康女性的卵巢会分泌一种雌激素。这种雌激素被称为17-β雌二醇(lieveritz,r.w.,amer.j.of obstetrics and gynecology,vol.156,pp. 1289-1293,1987)。疾病,卵巢切除术,外伤性损害的衰老可导致17-β雌二醇缺乏。随着衰老逐步进展,女性的卵巢排卵变得既不太频繁和也大不可预测。相应地,卵巢分泌17-β雌二醇的量逐渐减少。女性卵巢逐渐丧失功能自然地发生在45-55岁的年龄,导致月经周期最终停止,也就是绝经。
[0003]
在过去的几十年里还认为,处在正常排卵周期中的卵巢分泌17-β雌二醇的产量范围为 60-600μg/天,导致血液循环中17-β雌二醇浓度范围为40-400pg/ml。绝经前的女性的血液循环中17-β雌二醇浓度随月经周期变化。女性进入绝经期后,逐步发生不可逆的卵巢衰竭, 卵巢分泌17-β雌二醇的产量范围逐步从60-600μg/天降到不足20μg/天,血液循环中17-β雌二醇的浓度逐步从40-400pg/ml大幅度降到不足30pg/ml(stumpf,p.g.,obstetrics andgynaecology,vol.75(suppl.)pp.95-135,1990)。如此低水平的17-β雌二醇可导致典型的绝经后症状,例如潮热,泌尿生殖器萎缩和矿物质丟失性骨质疏松(marsh,m.s.et.al., british medical bulletin,vol.48,pp.426-457,1992)。
[0004]
在过去的几十年里进一步认为,最具有活性的天然存在的人类雌激素是非结合的17-β雌二醇并提出雌激素替代治疗(hrt)。hrt的宗旨是,通过补充17-β雌二醇使绝经女性血液循环中17-β雌二醇浓度尽可能恢复到绝经前的生理水平,以便对抗绝经后症状。
[0005]
在补充17-β雌二醇的hrt的几十年里,发现这种hrt并没有产生预期效果。虽然这种hrt可对抗绝经后的骨质疏松症,但不能改善绝经后的潮热的泌尿生殖器萎缩。更加意外的是,这种hrt还有致癌和引起血栓等副作用。
[0006]
在化学修饰17-β雌二醇的长期研究中,发明人不得不反复思考,到底是什么原因使得补充17-β雌二醇出了问题。按照临床医学事实,绝经前的女性几乎没有致癌风险,血栓风险及出现潮热的泌尿生殖器萎缩风险。而补充17-β雌二醇的绝经女性却有这些风险。思考使发明人逐步认识到这里存在明显的逻辑性矛盾。这种逻辑性矛盾让发明人怀疑,卵巢分泌的雌激素或许不是17-β雌二醇。于是,发明人摘取雌性小鼠的卵巢并匀浆化。卵巢匀浆与光谱纯甲醇混合,反复超声震荡。卵巢匀浆的甲醇萃取液用氮吹干,再用光谱纯甲醇萃取。萃取液接受hplc-ft-icr-ms检测。令人惊讶的是,在雌性小鼠卵巢匀浆的甲醇萃取液的hplc-ft-icr-ms谱中未找到17-β雌二醇的峰,而找到了17-o-乙酰-17-β雌二醇的峰。于是,
发明人又制备并萃取了雌性小鼠的器官和血液的匀浆。萃取液接受hplc-ft-icr-ms检测。同样,在雌性小鼠的器官和血液的匀浆的甲醇萃取液的hplc-ft-icr-ms谱中未找到17-β雌二醇的峰,而找到了17-o-乙酰-17-β雌二醇的峰。根据这个发现,发明人提出了本发明。


技术实现要素：

[0007]
本发明的第一个内容是提供下式的17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇]3。
[0008][0009]
本发明的第二个内容是提供[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的制备方法,该方法包括以下步骤:
[0010]
1)将雌二醇溶于乙酸酐,得到的反应溶液于室温搅拌12小时；
[0011]
2)将室温搅拌12小时的溶液用蒸馏水缓慢稀释,用于稀释的蒸馏水的体积为乙酸酐体积的5-20倍,最佳为10倍；
[0012]
3)上面的稀释液减压浓缩,尽量除去稀醋酸；
[0013]
4)0℃将残留物用饱和碳酸氢钠水溶液中和至ph 8,超声下使生成的沉淀充分析出,过滤得到自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3；
[0014]
5)自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的结构表征。
[0015]
本发明的第三个内容的是测定自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的活性。
[0016]
本发明的第四个内容的是考察自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的副作用。
附图说明
[0017]
图1自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的合成路线图。
[0018]
图2 esi( )-ft-icr-ms表征的自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3。
[0019]
图3 qcid支持自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3是17-o-乙酰-17-β雌二醇存在的唯一形式。
[0020]
图4 noesy 2d 1
hnmr揭示17-o-乙酰-17-β雌二醇形成自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的模式。
[0021]
图5子宫的组织形态照片:a-c生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫的组织形态照片；d-f,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态照片；g-i,2.3 μmol/kg/天[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态照片；j-l,0.23μmol/kg/天[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态照片。
[0022]
图6输卵管的组织形态照片:a-c生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的输卵管的组织形态照片；d-f,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输卵管的组织形态照片；g-i, 剂量为2.3μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输
卵管的组织形态照片；j-l,剂量为0.23μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28 天的卵巢切除小鼠的输卵管的组织形态照片。
[0023]
图7脾的组织形态照片:a-c生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾的组织形态照片；d-f,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态照片；g-i,剂量为2.3 μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态照片；j-l,剂量为0.23μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态照片。
[0024]
图8胸腺的组织形态照片:a-c生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的胸腺的组织形态照片；d-f,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态照片；g-i,剂量为2.3μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态照片；j-l,剂量为0.23μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态照片。
具体实施方式
[0025]
为了进一步阐明本发明,下面给出一系列实施例。必须指出的是,这些实施例完全是例证性的。给出这些实施例的目的是,充分表明本发明的意义和内容,决不对本发明造成任何形式的限制。
[0026]
实施例1制备17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3[0027]
将1.00g(3.7mmol)17-β雌二醇用5ml醋酐溶解,室温搅拌12小时,tlc(石油醚/乙酸乙酯,2/1)显示17-β雌二醇消失。反应溶液用50ml蒸馏水缓慢稀释,稀释液减压浓缩,尽量除去稀醋酸。0℃将残留物用饱和碳酸氢钠水溶液中和至ph 8,使生成的沉淀充分析出。过滤,得到1.11g(95％)17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体。为无色固体。 esi( )-ft-icr-ms(m/e):965.56758[m3 na]

(理论值:965.56108)；1h nmr(800mhz, dmso-d6):δ/ppm＝9.001(s,1h),7.033(d,j＝8.0hz,1h),6.508(d,j＝8.0hz,1h),6.439(s, 1h),4.600(t,j＝8.0hz,1h),2.731(m,j＝5.6hz,2h),2.225(m,j＝5.6hz,1h),2.091(m,j ＝4.0hz,2h),2.007(d,j＝4.0hz,3h),1.785(m,j＝4.8hz,2h),1.668(m,j＝8.0hz,1h), 1.493(q,j＝1.6hz,1h),1.361(m,j＝5.6hz,4h),1.298(m,j＝4.0hz,2h),0.772(s,3h)。
13
c nmr(201mhz,dmso-d6):δ/ppm＝169.74,154.22,136.49,129.56,125.46,114.26, 112.06,81.31,48.47,41.91,39.37,39.27,38.95,35.88,28.50,26.58,26.24,25.28,22.19,11.35. 下面用实施例说明本发明的自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3是17-o-乙酰-17-β雌二醇存在的唯一形式。
[0028]
实施例2表征自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3[0029]
将1μg上面制备的自组装的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3溶解于1ml光谱纯甲醇,取1μl进样测定esi( )-ft-icr-ms谱。结果见图2。图2的esi( )-ft-icr-ms在质量数为315.19770, 337.17980,651.36993和965.56758处给出4个峰。按照准确分子量,315.19770是17-o
-ꢀ
乙酰-17-β雌二醇单体加h(理论值为315.19547),337.17980是17-o-乙酰-17-β雌二醇单体加na(理论值为337.17741),651.36993是自组装的二聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]2加na (理论值为651.36561),965.56758是自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3加na(理论值为965.56108)。
[0030]
为了阐明17-o-乙酰-17-β雌二醇单体,自组装的二聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]2与自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3之间的关系,又针对质量数为965.56758[17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇]3的峰测定了qcid谱。结果见图3。图3的qcid在质量数为315.19567, 337.17748和651.36413处给出3个峰。与上面讲到的类似315.19567是17-o-乙酰-17-β雌二醇的单体加h(理论值为315.19547),337.17748是17-o-乙酰-17-β雌二醇的单体加na (理论值为337.17741),651.36413是自组装的二聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]2加na(理论值为651.36561)。结果说明在esi( )-ft-icr-ms谱中17-o-乙酰-17-β雌二醇单体与自组装的二聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]2的峰是自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3裂解的产物。也就是说,自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3是17-o-乙酰-17-β雌二醇存在的唯一形式。在电子流轰击下自组装的三聚体碎裂,生成单体和二聚体。
[0031]
实施例3表征17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装成[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的模式
[0032]
为了揭示17-o-乙酰-17-β雌二醇是通过什么模式自发组装为自组装三聚体,发明人测定了17-o-乙酰-17-β雌二醇的noesy 2d 1
hnmr谱。结果见图4。图4的noesy 2d 1
hnmr谱给出的有意义的相关峰是2位h和9位h之间的相关峰。这个相关峰来自一个 17-o-乙酰-17-β雌二醇分子的a环上的2位h与另一个17-o-乙酰-17-β雌二醇分子的b 环上的9位h。出现这个相关峰的基本要求是,这两个h之间的距离小于为此,一个分子的a环不得不与另一个分子的b环应相互接近。按照这种要求,17-o-乙酰-17-β雌二醇单体自组装为[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的模式是,一个分子单体的a环与另外两个分子单体的b环应相互接近到距离小于
[0033]
实施例4评价17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的抗骨质疏松活性
[0034]
雌性icr小鼠(40只,25
±
2g)腹腔注射水合氯醛的生理盐水溶液(5％,0.1ml/10g)麻醉。之后用碘伏/洁尔灭擦拭下腹部,沿着腹白线依次剪开下腹部表皮层,肌肉层和腹腔。之后,在膀胱下找到子宫。沿子宫找到两侧输卵管,两侧输卵管的盲端即为两侧卵巢。卵巢呈小菜花状,有脂肪包裹。在远离子宫处结扎输卵管之后,摘除两侧卵巢。在结扎处滴加一滴青霉素溶液,将输卵管放回腹腔。之后,缝合肌肉层。缝合前和缝合后都滴加一滴青霉素溶液防止感染。然后缝合表皮层。缝合前和缝合后都涂抹洁尔灭和碘伏防止伤口感染。手术之后将小鼠置于鼠笼中保温。3～5h后小鼠苏醒。即为造模小鼠。
[0035]
雌性icr小鼠(40只,25
±
2g)腹腔注射水合氯醛的生理盐水溶液(5％,0.1ml/10g)麻醉。之后用碘伏/洁尔灭擦拭下腹部,沿着腹白线依次剪开下腹部表皮层,肌肉层和腹腔。之后,在膀胱下找到子宫。沿子宫找到两侧输卵管,两侧输卵管的盲端即为两侧卵巢。卵巢呈小菜花状,有脂肪包裹。将输卵管放回腹腔。之后,缝合肌肉层。缝合前和缝合后都滴加一滴青霉素溶液防止感染。然后缝合表皮层。缝合前和缝合后都涂抹洁尔灭和碘伏防止伤口感染。手术之后将小鼠置于鼠笼中保温。3～5h后小鼠苏醒。即为假手术组(sham)小鼠。
[0036]
手术后恢复七天,第八天模型小鼠随机分为生理盐水组,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3高剂量组(0.77μmol/kg/天)和低剂量组(0.077μmol/kg/天) 以及假手术组,共4组。所有小鼠都连续治疗4周。最后一次给药30min后测定小鼠的尾出血时间。次日,小鼠称体重,乙醚麻醉并眼眶取血。然后处死,分离小鼠的器官和双侧股骨。小鼠的器官称重,其中子宫称重后还按照标准方法做病理切片。小鼠双侧股骨剔
除肌肉组织,用游标卡尺测量其解剖长度,用氯仿/甲醇(2/1)浸泡两次(每次3小时)以便脱脂,置120℃烘箱中烘6小时称干重,置800℃马福炉煅烧8小时并称得灰重。
[0037]
小鼠治疗后的股骨干重列人表1。表1的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地阻止卵巢摘除小鼠丢失骨量。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性丢失骨量。
[0038]
表1治疗小鼠股骨干重
[0039][0040]
a)与生理盐水比p《0.01；b)与生理盐水比p《0.05；n＝8
[0041]
小鼠治疗后的股骨灰重列人表2。表2的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3都可有效地阻止卵巢摘除小鼠丢失骨矿物质。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性丢失骨矿物质。
[0042]
表2治疗小鼠股骨灰重
[0043][0044]
a)与生理盐水比p《0.01；b)与生理盐水比p《0.05；n＝8
[0045]
小鼠治疗后的骨灰用显色法测定骨钙含量,测得数据列入表3。表3的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地保持骨钙。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性丢失骨钙。
[0046]
表3治疗小鼠的骨钙含量
[0047]
[0048]
a)与生理盐水比p《0.01；b)与生理盐水比p《0.05；n＝8
[0049]
小鼠治疗后的体重列人表4。表4的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地阻止卵巢摘除小鼠体重增加。也就是说, 在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性肥胖。
[0050]
表4治疗小鼠体重
[0051][0052]
a)与假手术组比p《0.05；b)与假手术组比p》0.05；n＝8
[0053]
小鼠治疗后的尾出血时间列人表5。表5的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3都不缩短小鼠的尾出血时间。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3都不会给绝经女性带来凝血风险。
[0054]
表5治疗小鼠尾出血时间
[0055][0056]
a)各组数据无显著性差异；n＝8
[0057]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0058]
实施例5评价17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经引起的器官损伤的治疗作用
[0059]
为了考察17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经反应引起的女性器官损伤的治疗作用,本发明测定了在生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫重量,生理盐水连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的子宫重量及高剂量(0.77μmol/kg/天) 和低剂量(0.077μmol/kg/天)两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的子宫重量。表6的数据说明,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地减
缓卵巢摘除小鼠的子宫重萎缩。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体 [17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性的子宫萎缩。
[0060]
表6治疗小鼠子宫重
[0061][0062]
a)与生理盐水比p《0.01；n＝8
[0063]
为了考察17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经反应引起的女性器官损伤的治疗作用,本发明测定了在生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的输卵管重量,生理盐水连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的输卵管重量及高剂量(0.77 μmol/kg/天)和低剂量(0.077μmol/kg/天)两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体 [17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的输卵管重量。表7的数据说明, 在两种剂量下[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地减缓卵巢摘除小鼠的输卵管萎缩。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性的输卵管萎缩。
[0064]
表7治疗小鼠输卵管重
[0065][0066][0067]
a)与生理盐水比p《0.01；n＝8
[0068]
子宫萎缩和输卵管萎缩是绝经引起的最受到关注的女性生殖器官的绝经反应。表6和表 7的数据一致说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的生殖系统的绝经反应。
[0069]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0070]
为了考察17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经反应引起的女性器官损伤的治疗作用,本发明测定了在生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾重量,生理盐水连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的脾重量及高剂量(0.77μmol/kg/
天)和低剂量(0.077μmol/kg/天)两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的脾重量。表8的数据说明,在0.77μmol/kg/天剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地防止卵巢摘除小鼠的脾增重。也就是说,在0.77μmol/kg/天剂量下[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性的脾增重。
[0071]
表8治疗小鼠脾重
[0072][0073]
a)与生理盐水比p《0.05；n＝8
[0074]
为了考察17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经反应引起的女性器官损伤的治疗作用,本发明测定了在生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的胸腺重量,生理盐水连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的胸腺重量及高剂量(0.77μmol/kg/天) 和低剂量(0.077μmol/kg/天)两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢摘除小鼠的胸腺重量。表9的数据说明,在两种剂量下[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地减缓卵巢摘除小鼠的胸腺肥大。也就是说,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可防止绝经女性的胸腺肥大。
[0075]
表9治疗小鼠胸腺重
[0076][0077]
a)与生理盐水比p《0.01；n＝8
[0078]
脾增重和胸腺肥大是绝经引起的最受到关注的女性内分泌器官的绝经反应。表8和表9的数据一致说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的内分泌系统的绝经反应。
[0079]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0080]
实施例6评价17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二
醇]3对绝经引起的组织损伤的治疗作用
[0081]
为了考察17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3对绝经反应引起的女性组织损伤的治疗作用,本发明制备了生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫,输卵管,脾和胸腺的病理切片；制备了生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫,输卵管,脾和胸腺的病理切片；制备了0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/天17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3治疗的卵巢切除小鼠的子宫,输卵管,脾和胸腺的病理切片。具体做法是将子宫,输卵管,脾和胸腺在浓度为4％的福尔马林中固定24小时。然后将福尔马林中固定的子宫,输卵管,脾和胸腺依次在70％,80％,90％, 95％和100％的乙醇中浸泡2.5小时,使脱水。将脱水的子宫,输卵管,脾和胸腺在二甲苯的石蜡溶液(1:1)中包埋1小时。石蜡溶液中包埋的子宫,输卵管,脾和胸腺切片。切片的厚度为5μm。将切片于50℃加热至干,he染色,然后转移到中性树脂并在光镜下制作组织形态照片。
[0082]
图5是生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫的组织形态的照片,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态的照片,以及0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/ 天17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态的照片。从图5可以看出生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫内膜层的上皮细胞上绒毛茂密,子宫内膜层的固定层里分布着健康的圆形腺体,子宫肌层的环形肌和纵行肌界线清晰排列有序。从图5还可以看出生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫内膜层的上皮细胞上看不见绒毛,子宫内膜层的固定层里的腺体萎缩,子宫肌层的环形肌和纵行肌分界线消失排列无序。从图5进一步看出剂量为0.77 μmol/kg/天和0.077μmol/kg/天的17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的子宫的组织形态与生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的子宫的组织形态相似。可见,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有效缓解了卵巢切除对子宫造成的损伤。也就是说,17-o-乙酰
ꢀ-
17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可治疗女性因绝经造成的子宫的组织损伤。
[0083]
图6是生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的输卵管的组织形态的照片,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输卵管的组织形态的照片,以及0.77μmol/kg/天和0.077 μmol/kg/天17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输卵管的组织形态的照片。从图6可以看出生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的输卵管内膜层的上皮细胞上绒毛茂密,输卵管内膜层的固定层里分布着健康的圆形腺体,输卵管肌层的环形肌和纵行肌界线清晰排列有序。从图6还可以看出生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输卵管内膜层的上皮细胞上看不见绒毛,输卵管内膜层的固定层里的腺体萎缩,输卵管肌层的环形肌和纵行肌分界线消失排列无序。从图 6进一步看出剂量为0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/天的17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的输卵管的组织形态与生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的输卵管的组织形态相似。可见,在两种剂量下17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有效地缓解了卵巢切除对输卵管造成的组织损伤。也就是说,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌
二醇]3可治疗女性因绝经造成的输卵管的组织损伤。
[0084]
子宫组织损伤和输卵管组织损伤是绝经引起的最受到关注的女性生殖器官的绝经反应。图5和图6一致说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的生殖系统的组织损伤,这是意想不到的技术效果。
[0085]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0086]
图7是生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾的组织形态的照片,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态的照片,以及0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/天 17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态的照片。从图7可以看出生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾中淋巴细胞排列紧密,白髓体积正常,红髓中有充分的细胞成分。从图7还可以看出生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾中淋巴细胞排列松弛,脾髓内充血,白髓体积明显缩小,红髓中的细胞成分明显减少。从图7进一步看出剂量为0.77μmol/kg/天和 0.077μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的脾的组织形态与生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾的组织形态相似。可见,在两种剂量下 [17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有效地缓解了绝经对脾造成的组织损伤。
[0087]
图8是生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的胸腺的组织形态的照片,生理盐水连续治疗28天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态的照片,以及0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/ 天17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态的照片。从图8可以看出生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的胸腺中淋巴细胞排列紧密,皮质和髓质比例正常。从图7还可以看出生理盐水连续治疗28 天的卵巢切除小鼠的胸腺中淋巴细胞排列松弛,皮质比例上升,髓质比例下降。从图8进一步看出剂量为0.77μmol/kg/天和0.077μmol/kg/天的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3连续治疗28 天的卵巢切除小鼠的胸腺的组织形态与生理盐水连续治疗28天的假手术小鼠的脾的组织形态相似。可见,在两种剂量下[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有效地缓解了卵巢切除对胸腺造成的组织损伤。
[0088]
脾组织损伤和胸腺组织损伤是绝经引起的最受到关注的女性内分泌器官的绝经反应。图 7和图8一致说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的内分泌系统的组织损伤,这是意想不到的技术效果。
[0089]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0090]
实施例7评价评价17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的抗静脉血栓活性
[0091]
sd品系雄性大鼠(250
±
20g),购自北京维通利华实验动物技术有限公司,用于制作大鼠下腔静脉结扎模型。sd雄性大鼠在实验前适应25-28℃的环境并禁食一天。之后,随机分为阳性对照华法林组,口服剂量为0.82μmol/kg；阴性对照cmc-na组,口服剂量为10ml/kg；17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3组, 口服剂量为5.3μmol/kg。
[0092]
给药30min后大鼠腹腔注射20％乌拉坦溶液使麻醉。用鼠板将大鼠四肢以皮筋系紧关节处而固定在鼠板上,备皮。脱脂棉蘸取适量肥皂水,在大鼠腹部中段擦拭,润湿表面皮毛,再用刮刀小心刮去,避免划伤皮肤。备皮后,沿大鼠腹部中部剪开表层皮肤, 暴露肌肉层,显示腹白线。将开有孔洞的纱布用生理盐水润湿,覆盖在手术创口附近。沿腹白线剪开肌肉层,暴露腹腔,找到下腔静脉。钝性分离下腔静脉周围的组织与血管, 在左肾静脉与下腔静脉交汇处结扎,结扎后立即计时,开始为时4小时的深静脉造栓。并将取出的脏器放回腹腔,缝合肌肉层的皮肤。让大鼠静息,血液循环4小时之后深静脉造栓结束。剪开大鼠腹壁,取出深静脉血栓块之前结扎下腔静脉附近所有的分支血管。然后剪断分支血管,剪下2cm下腔静脉。从下腔静脉中取出血栓块,用吸水纸吸去血栓块上面未凝固的血液,称血栓块的湿重用以表示抗血栓活性,数据列入表10。表10的数据说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有优秀的抗静脉血栓活性。这是意想不到的技术效果。
[0093]
静脉血栓是绝经引起的最受到关注的女性的绝经反应之一。17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的静脉血栓症,这是意想不到的技术效果。
[0094]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0095]
表10[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的抗静脉血栓活性
[0096]
治疗剂剂量血栓湿重(均值
±
sdmg)cmc-na10ml/kg21.1
±
4.0华法林0.82μmol/kg6.8
±
2.9[17-o-乙酰-17-β雌二醇]35.3μmol/kg13.5
±
4.6a[0097]
a)与cmc-na组比p《0.01；n＝9
[0098]
实施例8评价评价评价17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的抗动脉血栓活性
[0099]
将聚乙烯管拉成一端为斜口的细管,定长为10.0cm,分别为右颈静脉(管径较粗)的左颈动脉(管径较细)插管；中段聚乙烯管定长为8.0cm,将准确称重的供血栓附着的丝线压在颈动脉插管方向,插管前需在管中充满肝素。将体重200
±
20g雄性大鼠在手术前适应环境并禁食一天。随机分为阴性对照cmc-na组,口服剂量为10ml/kg；阳性对照阿司匹林组,口服剂量为167μmol/kg；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体 [17-o-乙酰-17-β雌二醇]3组,口服剂量为5.3μmol/kg。给药30min后,大鼠腹腔注射 20％乌拉坦溶液麻醉(7ml/
kg),2min之后开始手术。手术中将大鼠仰卧位于固定板上, 剪开颈部皮肤,分离右颈总动脉的左颈静脉,血管下压线,结扎远心端,在静脉靠远心端处剪一小口,将插管插入静脉端,注射肝素,而后取下注射肝素的注射器,系线固定, 再用动脉夹夹住动脉近心端,在靠近远心端方向剪一小口,将动脉端结扎,系线固定后松开动脉夹,建立体外循环旁路。循环15分钟后先剪断静脉端并观察血液循环是否正常,若正常从动脉端取出附有血栓的丝线。用吸水纸吸去附有血栓的丝线上面未凝固的血液,准确称重。计算丝线的增重,用以表示抗血栓活性,数据列入表11。表11 的数据说明,17-o-乙酰-17-β雌二醇的自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3有优秀的抗动脉血栓活性。这是意想不到的技术效果。
[0100]
动脉血栓是绝经引起的最受到关注的女性的绝经反应之一。17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3可有效地治疗绝经引起的女性的动脉血栓症,这是意想不到的技术效果。
[0101]
本发明进一步发现17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与药物上可接受的辅料构成的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体的[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它性激素的组合物具有相似的作用；17-o-乙酰-17-β雌二醇自组装的三聚体[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3与其它孕激素的组合物具有相似的作用。
[0102]
表11[17-o-乙酰-17-β雌二醇]3的抗动脉血栓活性
[0103]
治疗剂剂量血栓湿重(均值
±
sdmg)cmc-na10ml/kg34.2
±
7.4阿司匹林167μmol/kg18.9
±
4.7[17-o-乙酰-17-β雌二醇]35.3μmol/kg23.5
±
7.8a[0104]
a)与cmc-na组比p《0.01；n＝9。