一类2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于天然小分子药物技术领域，特别涉及一类2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.2-喹啉酮是一类具有广泛作用的生物活性化合物。从上个世纪七八十年代开始，国内外学者对喹啉酮类化合物进行了广泛的合成研究，主要作为抗惊厥、镇痛、催眠作用等中枢系统的抑制活性药物开发。天然的2-喹啉酮类生物碱主要来源于植物，动物中也有报道，如中药蜣螂(化合物1-5)、白鲜皮(化合物6-14)、花椒(化合物15-21)等中药，如下式(一)所示。来源于蜣螂的生物碱与天然的香豆素基本一致，只是2,3-位双键经常消失。而来源于花椒的天然生物碱的特点是在内酰胺环一侧发生取代，3位羟基多与异戊烯基且形成吡喃环，1位n上有甲基取代，同时获得了一个天然的2-喹啉酮类生物碱zanthobisquinolone，通过亚甲基相连。此类生物碱主要用于肿瘤、皮肤病等治疗。
3.喹啉酮生物碱在植物中广泛分布，但是在丝状真菌中的分布很少。现在文献报道的丝状真菌来源的结构明显比植物中的结构复杂，其特征是含有4-苯基-3,4-二羟基喹啉酮-2-酮结构单元，同时在苯环一侧7位往往存在一个或两个异戊烯基取代，同时异戊烯基可以形成呋喃、吡喃或六元碳环，同时此类结构的对应异构体也是由此环状结构位置产生，到目前为止，未见内酰胺一侧手性对应异构体的报道。来源于海洋丝状真菌的2-喹啉酮类生物碱骨架丰富，而且常常以对映异构体形式存在。此类化合物在以往的抗肿瘤活性报道中几乎没有活性；偶见具有杀线虫和抗病毒活性，亦未见抑菌活性报道。所以此类化合物的活性有待进一步开发。
4.

技术实现要素：

5.为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一类2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物。
6.本发明的另一目的在于提供上述2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物的制备方法。
7.本发明的再一目的在于提供上述2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物在制备抗菌药物中的应用。本发明的2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物具有优异的抗菌活性。
8.本发明的目的通过下述方案实现：
9.一类2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物，为如下所示结构式中的一种：
10.本发明的2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物可由包括以下步骤方法制备得到：
将海洋来源真菌penicillium sp.ggf16-1-2(gdmcc no:61080)经发酵培养，所得发酵液用乙酸乙酯萃取，浓缩，得到发酵液etoac相浸膏；用硅胶柱层析进行分离，以体积比为100:0-0:100的石油醚/乙酸乙酯为洗脱液进行梯度洗脱，根据薄层层析结果区分合并，得到6个粗组分fr1-fr6；选取vpe:vetoac＝85:15-75:25的组分fr2进行sephdex lh-20柱层析，甲醇洗脱，薄层层析跟踪，得到fr2-1～fr2-5五个亚流份；对fr2-3亚流份进行hplc分离，v
乙腈
:v
水
＝80:20，1.0ml/min洗脱，分离得到4个组分，其中停留时间为40-60min的3个化合物即为本发明的2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物。
11.在其中一个实施例中，所述hplc分离中2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物的停留时间分别为45.410min(化合物ⅰ)，51.927min(化合物ⅱ)、47.327min(化合物ⅲ)。
12.所述fr2-3亚流份为亮黄色溶液，在tcl中表现为rf＝0.3-0.8，254nm暗斑，365nm淡黄色斑点。
13.所述fr2-1亚流份为淡黄色溶液，在tcl中无明显斑点。
14.所述fr2-2亚流份为深红色溶液，在tcl中表现为rf＝0.1-0.45，254nm暗斑，365nm黄色斑点。
15.所述fr2-4亚流份为黄色溶液，在tcl中表现为rf＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm米黄
→
橙红色斑点(硫酸乙醇可显色)。
16.所述fr2-5亚流份为淡黄色溶液，在tcl中表现为rf＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm黄色斑点。
17.所述hplc的色谱柱为kromasil半制备色谱柱、10mm
×
250mm，5μm，瑞典akzo nobel公司。
18.在其中一个实施例中，所述fr2-3亚流份的加样量为143mg，所得化合物ⅰ为30.8mg；化合物ⅱ为6.0mg；化合物ⅲ为2.0mg。
19.所述硅胶柱层析的参数为直径10cm，长度110cm，硅胶h，柱体积3.85l。其中拌样硅胶165g(高度7cm)，装柱硅胶1.65kg(高度57cm)。
20.所述sephdex lh-20柱层析的参数为φ＝3.0cm、l＝200cm、lh-20(40-60μm)100g、高度160cm、柱体积300ml。
21.所述发酵培养可通过常规培养方法培养得到。如将菌株在pda培养基中活化后，接种于液体培养基中培养得到发酵液。
22.所述pda培养基的配方可为：每1l水中，马铃薯200g、葡萄糖20g、海盐35g。
23.所述液体培养基的配方可为：每1l液体培养基中，麦芽糖40g、色氨酸5g、山梨醇50g、味精10g、kh2po
4 5g、mgso4·
7h2o 3g、酵母膏13g、陈海水余量，ph为6.5。
24.更具体的，所述活化可通过将菌种挑取到装有pda培养基的培养瓶中，置于28℃的恒温摇床(165r/min)中培养2天，获得种子液。250ml的培养瓶中，pda培养基的量优选为100ml。
25.更具体的，所述接种培养可通过将已活化的种子液加入液体培养基中，28℃室内静置培养60天。所述接种的量优选为1.5ml种子液/400ml液体培养基。共培养150l培养基。以2l空白液体培养基为对比。
26.所得的发酵液可通过加入甲醇进行灭活，更优选为400ml液体培养基中加入10-20ml甲醇进行灭活。灭活后过滤即可分离得到发酵液和菌丝体。
27.所述发酵液优选由150l浓缩至10l再进行萃取操作。
28.所用乙酸乙酯优选与发酵液等体积。优选萃取3次。
29.本发明的2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物具有极强的抑菌活性，可应用于制备抗菌药物领域中。
30.本发明的2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物中的一个单体4-羟基-1-甲基喹啉-2-酮类生物碱目前主要从植物芸香科、大戟科和土壤来源的放线菌dactylosporangium sp.中得到。此类物质具有广泛的生物活性，如抗血小板聚集、糜蛋白酶抑制作用、抗肿瘤、抗菌以及抗结核等活性。
附图说明
31.图1为fr2-3的hplc分离hplc图。
32.图2为化合物ⅰ和化合物ⅱ的1h-1
h cosy和hmbc相关图。
33.图3为化合物ⅲ的1h-1
h cosy和hmbc相关图。
34.图4为化合物ⅰ(a)和化合物ⅱ(b)的cd曲线图。
35.图5为化合物ⅲ的xrd衍射图。
36.图6为化合物ⅲ的cd曲线图。
具体实施方式
37.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
38.所述海洋来源真菌penicillium sp.ggf16-1-2从采自中国南海三亚东锣岛附近海域的16号海星样品分离得到，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，简称gdmcc，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏号为gdmcc no:61080，保藏日期：2020年7月7日。
39.实施例1：2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物的分离
40.(1)菌株：penicillium sp.ggf16-1-2gdmcc no:61080。
41.pda培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g、海盐35g、纯水1l，ph自然；
42.液体培养基：1l，麦芽糖40g、色氨酸5g、山梨醇50g、味精10g、kh2po45g、mgso4·
7h2o 3g、酵母膏13g、陈海水余量，ph为6.5。
43.(2)菌种活化：用接种环从菌种管中挑取菌种到装有pda培养基的培养瓶中(100ml/250ml)，将其放置于28℃的恒温摇床(165r/min)中培养2天，获得种子液。
44.(3)接种：吸取已活化的种子培养液1.5ml至装有400ml液体培养基的1000ml培养瓶中，置于28℃的室内静置培养60天，共培养150l。
45.(4)提取：将上述每个培养瓶加10-20ml甲醇进行菌株灭活，纱布过滤，将发酵液和菌丝体分开；将得到的发酵液浓缩至10l，用等体积etoac萃取三次，得到的萃取液进行浓缩，最后得到发酵液etoac相浸膏；
46.(5)分离：上述150l液体培养基中共获得etoac部位粗提物(发酵液etoac相浸膏111.9g)经硅胶柱层析(φ＝10cm、l＝110cm、硅胶h、165g拌样硅胶(高度7cm)，装柱硅胶
1.65kg(高度57cm)、柱体积3.85l)石油醚-乙酸乙酯体系洗脱(vpe:vetoac＝100:0
→
0:100、1l/瓶)，根据薄层tlc情况合并得到7个粗组分fr.1～z1-fr.7。选择fr2(vpe:vetoac＝85:15-75:25的组分)进行sephdex lh-20柱层析(φ＝3.0cm、l＝200cm、lh-20(40-60μm)、100g、高度160cm、柱体积300ml、纯甲醇洗脱)，每次载样1.5g样品，25ml试管接液，tlc点板追踪，共得到fr2-1～fr2-5五个亚流份。其中，fr2-1(淡黄色溶液)：tlc无明显斑点；fr2-2(深红色溶液)：rf＝0.1-0.45，254nm暗斑，365nm黄色斑点；fr2-3(亮黄色溶液)：rf＝0.3-0.8，254nm暗斑，365nm淡黄色斑点；fr2-4(黄色溶液)：rf＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm米黄
→
橙红色斑点(硫酸乙醇可显色)；fr2-5(淡黄色溶液)：rf＝0.3-0.9，254nm暗斑，365nm黄色斑点。
47.将fr2-3(黄色胶状物，143mg)经hplc纯化(kromasil半制备色谱柱、10mm
×
250mm，5μm，瑞典akzo nobel公司)，乙腈水洗脱(v
乙腈
:v
水
＝80:20，1.0ml/min)，结果见图1，依次得到4个组分化合物，分别为peak1(4.5mg、τr＝15.027min)、peak2(化合物ⅰ、30.8mg、τr＝45.410min)、peak3(化合物ⅲ、淡黄色晶体、2.0mg、τr＝47.327min)和peak4(化合物ⅱ、6.0mg、τr＝51.927min)。
48.实施例2：2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物的鉴定
49.(1)化合物ⅰ，橙黄色无定形粉末，正离子hresims给出的准分子离子峰m/z：394.1647[m h]

(计算值为m/z：394.1649[m h]

)，确定其分子式为c
23h23
no5，不饱和度为13。紫外光谱中显示最大吸收波长为：220nm、286nm和320nm。红外光谱中显示有羰基(1722cm-1
、1635cm-1
)以及苯环(1608cm-1
、1519cm-1
、1494cm-1
和1457cm-1
)基团。
[0050]1h和
13
c nmr谱图结果显示大部分信号成对出现且比例为1:1，可能由于该化合物在cdcl3溶剂中存在分子内氢键导致其旋转受阻而出现两套谱图。1h nmr谱中显示4个芳香质子信号δ
h 7.27(1h,t,7.6,2.0hz,h-7)、7.35(1h,d,8.0hz,h-9)、7.55(1h,t,7.2,1.2hz,h-8)、8.16(1h,d,8.0hz,h-6)和甲基信号3.74/3.75(3h,s,1-ch3)，显示结构中含有喹啉酮结构片段；3个甲基信号δ
h 1.19/1.12(3h,d,7.2hz,h-11')、1.32/1.21(3h,d,6.8hz,h-12')、1.99/1.98(3h,s,h-13')，2个次甲基信号δh 2.86/2.86(1h,m,7.2hz,h-3')和δh 4.59/4.58(1h,q,2.4hz,h-2')以及1个双键质子信号δ
h 7.91/7.91(1h,s,h-10')显示结构中含有一个桔霉素片段a(图2中虚线框部分)；1个亚甲基信号δh3.82/3.85(2h,d,8.0hz,h-1”)；2个活泼质子信号δ
h 12.08/11.99(1h,s,8'-oh)、12.78/12.71(1h,s,4-oh)。
13
c nmr谱中共有40个碳信号，大部分碳信号成对出现，结合dept 135显示11个季碳(包括1个酮羰基)、7个次甲基、1个亚甲基和4个甲基信号。
[0051]
进一步解析二维谱图(hsqc、1h-1
h cosy、hmbc)(见表1)，分析ch
3-11'与h-2'、h-2'与h-3'、h-3'与ch
3-12'之间的1h-1
h cosy相关信号，以及hmbc谱中h-2'与c-3'、c-4'、c-9'，h-3'与c-4'、c-5'、c-9'、c-12'，h-10'与c-2'、c-8'、c-9'，11'-ch3与c-2'、c-3'，ch
3-12'与c-2'、c-3'、c-4'，13'-ch3与c-4'、c-5'、c-6'、c-7'和8'-oh与c-8'、c-9'相关信号说明结构中含有7-取代的脱羧桔霉素片段a；h-6、h-7、h-8和h-9之间的1h-1
h cosy相关信号，以及hmbc谱中h-6与c-4、c-5、c-10，h-8与c-7、c-9、c-10，h-9与c-5、c-10，n-ch3与c-10、c-2相关信号说明结构中含有4-羟基-1-甲基喹啉-2-酮片段。h-1”与c-2、c-3、c-4、c-6'、c-7'、c-8'的相关两个片段通过亚甲基直接相连，从而确定化合物ⅰ的平面结构(见图2)。
[0052]
为了确定化合物ⅰ的立体构型，对其进行noesy测试确定c-2'、c-3'的相对构型。
noesy结果显示h-2'与12'-ch3、h-3'与11'-ch3分别有相关信号，说明c-2'、c-3'上的甲基是反式的，即2'r*、3's*。根据现有文献可知桔霉素类化合物c-2'、c-3'的绝对构型从生物遗传学角度以及采用ecd、vcd计算确定其绝对构型为2'r，3's。对化合物ⅰ进行旋光测试以及cd，其比旋光值为-79.1(c 0.055，meoh)。cd测试结果显示在230、256、以及283nm处为( )cotton效应，在332nm处为(-)cotton效应(见图4a)，经检索确定为新化合物，命名为penicilloneine a。
[0053]
表1化合物ⅰ的nmr数据(cdcl3)
[0054][0055]
注释：1h nmr(400mhz),
13
c nmr(100mhz)，a表示重叠峰。
[0056]
(2)化合物ⅱ，橙黄色无定形粉末，正离子hresims给出的准分子离子峰m/z：408.1812[m h]

(计算值为m/z：408.1811[m h]

)，确定其分子式为c
24h25
no5，不饱和度为13。紫外光谱中显示最大吸收波长为：220nm和320nm。红外光谱中显示有羰基(1726cm-1
、1631cm-1
)以及苯环(1494cm-1
和1448cm-1
)基团。
[0057]
化合物ⅱ的1d和2d nmr数据(见表2)与化合物ⅰ的核磁数据高度相似，说明化合物ⅱ与化合物ⅰ为同一类结构。区别在于化合物ⅱ的1h nmr图谱中没有亚甲基信号，多了一个甲基信号δ
h 1.79/1.78(3h,d,7.2hz,h-2”)以及δ
h 4.86/4.78(1h,q,6.4hz,h-1”)。结合
13
c nmr和dept135图谱中发现亚甲基信号消失而出现1个甲基信号δ
c 15.5,15.4/15.3,15.3(q,c-1”)。对比hmbc和1h-1
h cosy图谱可知化合物ⅱ的与化合物ⅰ的平面结构类似，由4-羟基-1-甲基喹啉-2-酮片段和桔霉素片段a通过碳桥连接组成，但c-1”上的一个质子被甲基取代(见图2)。1h nmr谱图结果显示大部分信号成对出现且比例为1:1，可能由于该化合物
在cdcl3溶剂中存在分子内氢键导致其旋转受阻而出现两组信号，此外由于c-1”为手性碳，可能存在差向异构体导致碳谱出现四组信号(1:1:1:1)。
[0058]
表2化合物ⅱ的nmr数据(cdcl3)
[0059][0060]
注释：1h nmr(400mhz),
13
c nmr(100mhz)，a表示重叠峰。
[0061]
noesy谱图结果显示化合物ⅱ的c-2
′
、c-3
′
的相对立体构型相同，同时根据化合物ⅰ确定立体构型为2
′
r，3
′
s。此外，c-1”由于其距离c-2
′
、c-3
′
空间位置较远无法利用noesy、noe等确定其相对构型从而无法确定该位置的立体构型。该化合物进行旋光测试以及cd，其比旋光值为-38.2(c 0.21，meoh)。cd测试结果显示在215、233、以及283nm处为( )cotton效应，在334nm处为(-)cotton效应(见图4b)。经检索确定为新化合物，命名为penicilloneine b。
[0062]
(3)化合物ⅲ，淡黄色块晶，正离子hresims给出的准分子离子峰m/z：410.1598[m h]

(计算值为m/z：410.1598[m h]

)，负离子hresims给出的准分子离子峰m/z：408.1447[m-h]-(计算值为m/z：408.1452[m-h]-)确定其分子式为c
23h23
no6，不饱和度为13。紫外光谱中显示最大吸收波长为：220nm、280nm和320nm。红外光谱中显示有羟基(3288cm-1
)、羰基(1644cm-1
)以及苯环(1544cm-1
)基团。
[0063]
化合物ⅲ的1d nmr数据(见表3)与化合物ⅰ的核磁数据相似，结构中同样含有一个4-羟基-1-甲基喹啉-2-酮片段，区别在于化合物ⅲ的桔霉素结构片段发生变化。1h nmr图谱中含有桔霉素片段的两个次甲基信号δ
h 4.68(1h,q,7.2hz,h-2
′
)、2.98(1h,q,7.2hz,h-3
′
)以及三个甲基信号δ
h 1.25(3h,m,h-11
′
)、δ
h 1.25(3h,m,h-12
′
)、2.14
′
(3h,s,h-13
′
)均向低场移动。
13
c nmr谱中共有23个碳信号，结合dept 135显示12个季碳(包括2个酮羰基信
号)、6个次甲基、1个亚甲和4个甲基信号。
[0064]
进一步解析二维谱图(hsqc、1h-1
h cosy、hmbc)(见表3)，分析11
′‑
ch3与h-2
′
、h-2
′
与h-3
′
、h-3
′
与12
′‑
ch3之间的1h-1
h cosy相关信号，以及hmbc谱中h-2
′
与c-3
′
、c-4
′
、c-10
′
、c-12
′
，h-3
′
与c-4
′
、c-5
′
、c-9
′
、c-12
′
，11
′‑
ch3与c-2
′
、c-3
′
，12
′‑
ch3与c-2
′
、c-3
′
，13
′‑
ch3与c-4
′
、c-5
′
、c-6
′
、c-7
′
和8
′‑
oh与c-7
′
、c-8
′
、c-9
′
相关信号说明桔霉素片段中c-10
′
为酮羰基，从而确定其平面结构由4-羟基-1-甲基喹啉-2-酮片段和桔霉素片段b通过碳桥连接组成(见图3)。
[0065]
由化合物ⅰ和化合物ⅱ的c-2
′
、c-3
′
的立体构型推测化合物ⅲ的立体构型为2
′
r、3
′
s，并首次通过单晶衍射(xrd)实验加以证实(见表4，xrd透射图见5)，绝对构型常数(flack parameter)为0.08(7)。该化合物进行旋光测试以及cd，其比旋光值为-66.5(c 0.04，meoh)。cd测试结果显示在230、270以及320nm处为( )cotton效应(见图6)。经检索该化合物未被报道，确定其为新化合物，命名为penicilloneine c。
[0066]
表3化合物ⅲ的nmr数据(cdcl3)
[0067][0068]
注释：1h nmr(400mhz),
13
c nmr(100mhz)，a表示重叠峰。
[0069]
表4化合物ⅲ的晶体数据
[0070][0071]
实施例3：2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物的抑菌性能测试：
[0072]
由于只有抑菌的性能测试，因此，本发明将同时申请保护化合物及其应用，应充分公开并针对多种抑菌性能进行表征，从而扩大其应用范围，可考虑采用多种菌株包括阳性菌和阴性菌进行试验。
[0073]
(1)菌丝生长速率法：配制不同浓度的化合物药液(每个浓度设3次重复)，倒入培养皿中备用，以加入无菌水的pda培养基平板作对照。用无菌打孔器取培养好的病原菌菌饼(表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌由广东微生物所提供)，接种到pda培养基平板中央，置于28℃恒温培养箱中培养3天。阳性对照为多菌灵。十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。求出毒力回归方程，进一步算出lc
50
。
[0074]
菌丝生长抑制率＝[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)]
×
100％。
[0075]
(2)对炭疽病菌的抑菌活性：
[0076]
配制不同浓度的化合物药液(每个浓度设3次重复)，倒入培养皿中备用，以加入无菌水的pda培养基平板作对照。用无菌打孔器取培养好的病原菌菌饼(炭疽病菌株、果树白粉病菌由广东省农业科学院果树研究所提供)，接种到pda培养基平板中央，置于28℃恒温培养箱中培养3天。阳性对照为多菌灵。十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率。求出毒力回归方程，进一步算出lc
50
。
[0077]
菌丝生长抑制率＝[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)]
×
100％。
[0078]
表5化合物i、ii、iii抑菌活性表(lc
50
、μg/ml)
[0079]
[0080]
注：a表皮葡萄球菌、b金黄色葡萄球菌、c耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、d大肠杆菌、e铜绿假单胞菌、f木瓜炭疽病菌、g果树白粉病菌、h多菌灵(阳性对照)、i卡那霉素(阳性对照)。
“‑”
代表未测试。
[0081]
经计算，本发明2-喹啉酮-桔霉素杂合二聚体化合物具有极强的抑菌活性(见表5)。
[0082]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。