八宝丹在制备NF-κB-UPS信号通路抑制剂中的用途的制作方法

八宝丹在制备nf-κ
b-ups信号通路抑制剂中的用途
技术领域
1.本发明属于中药领域，更具体而言，本发明涉及八宝丹在制备nf-κb-ups信号通路抑制剂中的用途。


背景技术：

2.2020年全球新发癌症病例1929万例
1.，而癌症恶病质是癌症患者死亡的主要原因
2.。高达80％的晚期癌症患者都患有癌症恶病质，而其中20％的癌症患者死于癌症恶病质
3.，癌症恶病质不仅降低癌症患者的生活质量，而且还减弱抗癌化疗的疗效，增加毒性，并且会促进病人死亡率
4.。目前癌症恶病质还没有明确的治疗标准，目前的治疗策略将营养支持与药物干预和运动相结合，但治疗作用不显著
5.。中医将癌症恶病质归为“虚劳”范畴，临床表现多见形神衰败，身体消瘦，大肉尽脱，食少纳差，体倦乏力等症状
6.。
3.癌症恶病质是一种多因素综合征，其特征是持续的骨骼肌萎缩(伴或不伴脂肪量减少)，并导致进行性器官功能障碍
3.。骨骼肌萎缩是癌症恶病质最主要的临床表现，与生活质量下降、进行性功能障碍和预后恶化相关。肌肉萎缩会导致癌症恶病质患者出现活动能力下降，并且可能会增加恶病质患者呼吸肌萎缩并出现呼吸衰竭的风险
7.。
4.骨骼肌萎缩是由肌肉蛋白合成和降解失衡(表现为肌蛋白合成率降低和肌蛋白降解率增加)引起的。骨骼肌蛋白的降解主要受泛素蛋白酶体系统(ups)的调控
8.。ups激活后，泛素激活酶(e1)激活泛素，泛素被转移到泛素偶联酶(e2)上，e2泛素复合物与泛素连接酶(e3)结合，进而识别将被泛素化的底物蛋白，蛋白泛素化后，再利用atp转移到26s蛋白酶体复合物中，在26s蛋白酶体复合物蛋白降解
9.。atrogin-1是骨骼肌特异性泛素连接酶(e3)，在萎缩的骨骼肌中表达量增加，并介导肌肉蛋白的降解
4.。它的激活直接导致肌肉萎缩，因此被作为肌肉萎缩的标记物
8.。
5.全身性炎症是骨骼肌萎缩的主要原因，炎症因子如tnf-α、il-iβ、ifn-γ和il-6是最重要的肌肉萎缩诱导因子，在肌肉萎缩动物模型中，已经检测出炎症因子的血清水平升高
10.。而nf-κb信号通路作为经典炎症信号通路，可被多种炎症因子激活，特别是tnf-α，且nf-κb信号通路的激活被认为是炎症诱导的肌肉萎缩的一个重要步骤。nf-κb信号通路是ups的重要通路之一
11.，主要通过增加ups中e3连接酶的表达进而导致肌蛋白降解增多
9.。
6.nf-κb家族是一类转录因子，在静息状态下，通常与iκb家族结合为非活性复合体，其中p65-p50为nf-κb家族的主要存在形式。当胞外炎症因子，比如tnfα通过结合并激活其同源受体tnfαr后，促使ikkα磷酸化iκbα而被降解，使得nf-κb在胞浆累积并入核调控下游基因表达，进而诱导泛素蛋白酶体系统(ups)的关键组分——e3蛋白连接酶过度上调，最终使ups系统处于高应激(过度活化状态)状态
[12,13]
。
[0007]
大量研究表明炎症因子，如tnf-α和ifn-γ等在肌肉萎缩中发挥着重要的作用，其中tnf-α在肌肉萎缩中表达量高，且能通过激活nf-κb-ups信号通路诱导肌肉细胞凋亡和细胞萎缩
[14]
。
[0008]
厦门中药厂有限公司生产的八宝丹(bbd)作为我国经典复方，功效为清利湿热、活
血解毒、去黄止痛。临床实践证实bbd作为多种晚期癌症辅助用药可提高患者生活质量，缓解化疗出现的不良反应
[15]
，由此可见bbd可以缓解晚期癌症患者出现的不良状态。
[0009]
但目前尚无bbd治疗癌症恶病质的相关研究。


技术实现要素：

[0010]
本发明人通过实验发现bbd预处理可显著下调nf-κb信号通路中p-p65、p-iκb-α蛋白表达水平及下游atrogin-1蛋白表达水平，证明bbd可抑制tnf-α特异激活的nf-κb-ups信号通路，因此认为bbd可能在缓解癌症恶病质肌肉蛋白降解中发挥着一定的作用，可以用于制备nf-κb-ups信号通路抑制剂，进而用于制备预防和/或治疗肌肉萎缩和/或癌症恶病质的药物。
[0011]
一方面，本发明提供了八宝丹在制备nf-κb-ups信号通路抑制剂中的用途。
[0012]
在具体实施方式中，所述nf-κb-ups信号通路是由炎症因子(特别是tnf-α)激活的。
[0013]
另一方面，本发明提供了八宝丹在制备用于预防或治疗肌肉萎缩和/或癌症恶病质的药物中的用途。
[0014]
在一些实施方式中，本发明提供了八宝丹在制备用于预防或治疗肌肉萎缩的药物中的用途。特别地，所述肌肉萎缩是骨骼肌萎缩。
[0015]
在一些实施方式中，本发明提供了八宝丹在制备用于预防或治疗癌症恶病质的药物中的用途。
[0016]
本发明的抑制剂或药物可以为本领域常规的各种剂型，例如固体、半固体或液体的形式，可以为水溶液、非水溶液、混悬液、锭剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂和散剂等。所述抑制剂或药物的给药途径可以为注射给药或口服给药。所述注射给药可以包括静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。
[0017]
基于质量百分比，所述抑制剂或药物可以包括0.01～99.99％八宝丹或其提取物，以及99.99～0.01％的辅助成分。
[0018]
所述抑制剂或药物可以包括一种或多种药学上可接受的常规辅料。所述药学上可接受的常规辅料可以为赋形剂、填充剂或稀释剂等。
[0019]
本发明通过研究八宝丹对小鼠成肌细胞中tnf-α激活的nf-κb-泛素蛋白酶体系统(ups)信号通路的影响，证明了八宝丹可以抑制小鼠成肌细胞中tnf-α激活的nf-κb-ups信号通路。
[0020]
在上文中已经详细地描述了本发明，但是上述实施方式本质上仅是例示性，且并不欲限制本发明。此外，本文并不受前述现有技术或发明内容或以下实施例中所描述的任何理论的限制。
[0021]
除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值范围包括其中的任何子范围和以其中给定值的最小子单位递增的任何数值。除非另有明确说明，在整个申请文件中的数值表示对包括与给定值的微小偏差以及具有大约所提及的值以及具有所提及的精确值的实施方案的范围的近似度量或限制。除了在详细描述最后提供的工作实施例之外，本技术文件(包括所附权利要求)中的参数(例如，数量或条件)的所有数值在所有情况下都应被理解为被术语“大约”修饰，不管“大约”是否实际出现在该数值之前。“大约”表示所述的数值允许
稍微不精确(在该值上有一些接近精确；大约或合理地接近该值；近似)。如果“大约”提供的不精确性在本领域中没有以这个普通含义来理解，则本文所用的“大约”至少表示可以通过测量和使用这些参数的普通方法产生的变化。例如，“大约”可以包括小于或等于10％，小于或等于5％，小于或等于4％，小于或等于3％，小于或等于2％，小于或等于1％或者小于或等于0.5％的变化。
附图说明
[0022]
图1为显示实施例中mtt法检测不同浓度八宝丹对c2c12细胞活力的影响的图。其中，与对照组比较，n.s.表示无统计学意义。
[0023]
图2a为显示实施例中tnf-α激活nf-κb信号通路的浓度摸索的图。其中，与对照组比较，*p＜0.05，n.s.表示无统计学意义。
[0024]
图2b为显示实施例中tnf-α激活nf-κb信号通路的时间摸索的图。其中，与对照组比较，*p＜0.05，n.s.表示无统计学意义。
[0025]
图2c为显示实施例中tnf-α激活ups信号通路的浓度摸索的图。其中，与对照组比较，*p＜0.05，n.s.表示无统计学意义。
[0026]
图2d为显示实施例中tnf-α激活ups信号通路的时间摸索的图。其中，与对照组比较，**p＜0.01，n.s.表示无统计学意义。
[0027]
图3a为显示实施例中八宝丹对tnf-α激活nf-κb信号通路的影响的图。其中，与对照组比较，**p＜0.01；与模型组比较，#p＜0.05。
[0028]
图3b为显示实施例中八宝丹对tnf-α激活ups信号通路的影响的图。其中，与对照组比较，*p＜0.05；与模型组比较，#p＜0.05。
具体实施方式
[0029]
下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]
下述实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031]
实施例
[0032]
1实验材料
[0033]
1.1实验细胞：小鼠成肌细胞c2c12购买于中国科学院细胞库(目录号：scsp-505)，将其培养于含10％胎牛血清、1％链霉素和1％青霉素的dmem培养基中，置于5％二氧化碳、37℃培养箱培养，待细胞密度至70％-80％进行实验。
[0034]
1.2实验药物：八宝丹从厦门中药厂有限公司购得，pbs溶解为25mg/ml的浓度，高压灭菌，分装储存-20℃备用。
[0035]
1.3实验试剂：p-p65抗体(货号：3033t)、p-iκb抗体(货号：2859s)购自美国cell signaling technology公司，gapdh抗体(货号：60004-1-ig)购自美国proteintech公司，atrogin-1抗体(货号：ab168372)购自英国abcam公司，goat-anti-mouse-igg(货号：l3032)，goat-anti-rabbit-igg(货号：l3012)均购自美国signaling antibody公司，dmem基础高糖培养液(货号：kgm12800n-500)购自江苏凯基生物技术有限公司，南美胎牛血清(货号：s-fbs-sa-015)购自peak serum公司，青霉素和链霉素混合液(货号：sv30010)、20
×
pbs缓冲液(货号：p1032)购自北京索莱宝科技有限公司，0.25％胰蛋白酶(trypsin)(货号：
25200072)购自美国gibco公司，0.4％台盼蓝染液(货号：c0040)购自北京索莱宝科技有限公司，bca蛋白浓度测定试剂盒(货号：ar0197)购自武汉博士德生物工程有限公司，mtt试剂盒(货号：c0009s)购自上海碧云天生物技术有限公司，蛋白酶抑制剂cocktail、磷酸酶抑制剂cocktail i及磷酸酶抑制剂cocktail ii均购自mce公司，np-40裂解液(货号：n8032-500ml)购自北京索莱宝科技有限公司，superkine
tm
超敏型ecl发光液(货号：bmu102-cn)购自abbkine公司。
[0036]
1.4实验仪器：-80℃恒温冰箱(美国thermo fisher公司)，-20℃冰箱(德国西门子有限公司)，4℃冰箱(德国西门子有限公司)，恒温水浴箱(上海精宏实验设备有限公司)，二氧化碳培养箱(美国thermo fisher公司)，移液器(美国gilson)，超净工作台(苏州净化设备公司)，countstar全自动细胞计数仪(上海睿钰生物科技有限公司)，倒置显微镜(德国leica公司)，多功能酶标仪(美国thermo fisher公司)，干式恒温金属浴(上海培青科技有限公司)，sds-page电泳仪(美国bio-rad公司)，trans-blot小型转膜槽转膜仪(美国bio-rad公司)，旋转摇床(中国江苏其林贝尔仪器有限公司)，超高灵敏化学发光系统(美国bio-rad公司)。
[0037]
2实验方法
[0038]
2.1 mtt检测不同浓度八宝丹对c2c12细胞的药物毒性
[0039]
将细胞以3
×
103个/孔的密度接种于96孔板中，每孔100μl细胞悬液，待细胞密度至70％-80％，弃上清液，加不同浓度bbd(0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml)和10％胎牛血清、1％链霉素和1％青霉素的dmem培养基混合液，对照组加dmem培养基混合液，每组6个复孔，48h后弃上清液，每孔加入100μl mtt(0.5mg/ml)溶液，培养箱内继续孵育4h，每孔再加入100μl formazan溶解液，适当混匀，使用酶标仪在570nm处测吸光度，根据公式计算细胞活力。
[0040]
2.2 western blot法检测tnf-α激活nf-κb-ups信号通路的最佳浓度和时间
[0041]
取3
×
105个/ml的c2c12细胞接种于35mm培养皿中，待细胞密度至70％-80％，用不同浓度tnf-α(1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml)干预c2c12细胞，检测p-p65、atrogin-1蛋白表达情况，确认tnf-α激活nf-κb-ups信号通路的最佳浓度，再根据最佳浓度摸索tnf-α激活nf-κb-ups信号通路的最佳时间，根据最佳浓度和时间进行后续实验。
[0042]
2.3 western blot法检测bbd对tnf-α激活的nf-κb-ups信号通路的作用
[0043]
设置对照组(未加bbd和tnf-α，但加入等体积的pbs)，bbd组(单独加bbd)、模型组(单独加tnf-α)、bbd 模型组(加bbd和tnf-α),待细胞汇合度达到70％-80％，bbd预处理2h，根据tnf-α激活信号通路的最佳浓度和最佳时间点刺激c2c12细胞，冰pbs清洗收板，用np-40裂解液提取细胞总蛋白，bca蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，取最低蛋白浓度样本作为参照，并将所有样品调整为相同蛋白浓度，再加入25％体积的sds-page蛋白上样缓冲液(还原性，5
×
)，100℃，5至10分钟蛋白变性。20-30μl蛋白样本经聚丙烯酰胺(sds-page)凝胶电泳分离，电压：80v，30min；120v，90min，tbst洗膜3次，5min/次，通过湿转法将蛋白转至pvdf膜上，tbst清洗，5％脱脂奶粉常温封闭1h，tbst洗膜，抗体p-p65(1:1000)，p-iκb(1:1000)，atrogin-1(1:000)，gapdh(1:5000)4℃孵育过夜，随后tbst洗膜3次，5min/次，加山羊抗兔二抗或山羊抗鼠二抗(1:5000)室温孵育1h，tbst清洗3次，5min/次，使用超敏型ecl发光液显色，将gapdh作为总蛋白内参，运用imagej软件分析各目的蛋白的灰度值，比较各组蛋白
相对表达量。
[0044]
2.4统计学分析
[0045]
所有统计分析均采用spss软件(26.0版；ibm公司，armonk，纽约，美国)进行。对正态分布和方差齐性数据采用单因素方差分析，对不满足正态分布和方差齐性数据采用秩和检验和非参数检验。p《0.05为差异有统计学意义。
[0046]
3结果
[0047]
3.1 bbd对c2c12细胞活力的影响
[0048]
本研究用c2c12小鼠成肌细胞为研究对象，通过mtt实验检测bbd对c2c12细胞的药物毒性作用，为后续实验bbd浓度选择提供实验基础。
[0049]
检测了bbd干预后对c2c12细胞的生长状态与细胞存活率的影响。结果如图1所示，与对照组比较，不同浓度(0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml)的bbd干预c2c12细胞48h，对c2c12细胞活力无明显影响，差异无统计学意义。该结果表明不同浓度(0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml)的bbd处理48h对c2c12细胞无细胞毒性，最终选取0.75mg/ml bbd处理c2c12细胞。
[0050]
3.2 tnf-α激活c2c12细胞中nf-κb-ups信号通路的浓度和时间点摸索
[0051]
首先摸索了tnf-α激活nf-κb-ups信号通路的最佳浓度和时间。结果如图2a所示，与对照组比较，在不同浓度tnf-α条件刺激下，10ng/ml、50ng/ml tnf-α刺激c2c12细胞8分钟均能显著上调c2c12细胞中p-p65的蛋白表达，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0052]
进而选取10ng/ml tnf-α在不同时间条件下8min、15min、30min、1h刺激c2c12细胞。结果如图2b所示，与对照组比较，10ng/ml tnf-α刺激8min能显著上调c2c12细胞p-p65的蛋白表达，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0053]
为探究tnf-α如何影响nf-κb下游ups信号通路，进而摸索tnf-α激活ups信号通路的最佳浓度和时间点，进一步研究了bbd对tnf-α激活的nf-κb-ups信号通路的干预作用。结果如图2c所示，与对照组比较，1ng/ml、10ng/ml、50ng/ml tnf-α刺激c2c12细胞4h，能显著上调c2c12细胞中atrogin-1的蛋白表达，差异有统计学意义(p《0.05)。
[0054]
为与前tnf-α刺激浓度保持一致，最终选取10ng/ml tnf-α刺激c2c12细胞。10ng/ml tnf-α在不用时间条件下刺激8min、15min、30min、1h、4h、12h c2c12细胞，如图2d结果所示，与对照组比较，10ng/ml tnf-α刺激c2c12细胞4h，atrogin-1的蛋白表达显著上调，差异有统计学意义(p《0.01)。
[0055]
3.3 bbd对tnf-α激活c2c12细胞中nf-κb-ups信号通路的影响
[0056]
为探讨bbd如何调控tnf-α干预下c2c12细胞中nf-κb-ups信号通路的影响，采用模型组运用tnf-α刺激造模。结果如图3a、3b所示，与对照组相比，模型组nf-κb信号通路中p-p65、p-iκb-α蛋白表达水平及下游ups信号通路中atrogin-1的蛋白表达水平显著上调，差异有统计学意义(p《0.05)；而与模型组比较，bbd 模型组nf-κb信号通路中p-p65、p-iκb-α蛋白表达水平及下游ups信号通路中atrogin-1蛋白表达水平显著下调，差异有统计学意义(p《0.05)，表明bbd可抑制c2c12细胞中tnf-α激活的nf-κb-ups信号通路。
[0057]
上述体外研究结果证明了bbd可抑制tnf-α特异激活的nf-κb-ups信号通路，因此可以用于制备nf-κb-ups信号通路抑制剂。
[0058]
nf-κb-ups信号通路是肌肉蛋白降解最主要的途径
9.。因此，本研究提示bbd可能
在缓解肌肉蛋白降解中发挥着一定的作用，可能用于制备预防或治疗肌肉萎缩(包括骨骼肌萎缩)的药物。进而，bbd可能用于制备预防或治疗癌症恶病质的药物。本研究为bbd抑制肌蛋白降解相关通路提供了体外实验数据，为治疗癌症恶病质提供新的治疗思路。
[0059]
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