药用核酸合成工艺的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体的，涉及一种药用核酸合成工艺。


背景技术：

2.药用核酸广泛应用于小核酸药物开发和新型疫苗佐剂的开发。近些年，以核酸治疗为技术基础的第三代药物发展迅猛，核酸药物的特点在于它们可以直接与致病基因结合并阻止其翻译，从而防止致病蛋白质生产，较小分子药物和蛋白抗体药物，核酸药物能够精准制导，直达靶点，且易于工业化放大生产。
3.在药用核酸的生产过程中，其骨架是相邻核苷酸间的3
’→5’
磷酸二酯键，然后由于核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子是一个多步连续的反应，因此在反应过程中副反应较多，从而会显著降低目标产物的产率，提升纯化难度，降低了生产效率与产品质量，因此在实际生产过程中需要抑制副反应的发生以达到提升目标产物产率，降低纯化难度，提升生产效率的效果，为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种药用核酸合成工艺解决现有技术中药用核酸制备过程中副产物多影响纯化结果与纯化效率的问题。
5.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
6.一种药用核酸合成工艺，包括如下步骤：
7.第一步，将配制好的原料加入全自动合成仪中，在常温、全封闭的条件下进行合成操作，整个合成周期为24小时；
8.链的延长反应过程从3
’‑5’
方向延伸，包含脱保护、活化偶联、硫化/氧化、盖帽4步反应；待4步反应完成后，再进行下一轮的链的延长反应；
9.所述脱保护反应包括：用二氯乙酸脱去核苷酸上的保护基团dmt，得5
’‑
羟基端即核苷酸单体，供下一步偶联；
10.所述活化偶联反应包括：在偶联之前，亚磷酰胺保护的5
’‑
羟基端与活化剂乙硫基四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3’端被活化，5
’‑
羟基被dmt保护，与溶液中游离的5
’‑
羟基发生缩合反应；
11.所述硫化/氧化反应包括：在硫化试剂苯乙酰二硫化物或氧化剂碘液的作用下，亚磷酰形式转变为磷酸三酯；
12.所述盖帽反应包括：用乙酸酐终止5
’‑
羟基后续发生反应；
13.第二步，胺洗；
14.第三步，氨解；
15.第四步，纯化；
16.第五步，超滤；
17.第六步，冻干，得到成品。
18.作为本发明的进一步方案，硫化反应与氧化反应在单个链延长反应过程中不同时进行，在单个批次生产过程中反应次数相同。
19.作为本发明的进一步方案，活化偶联反应中，乙硫基四氮唑过量。
20.作为本发明的进一步方案，胺洗采用二乙胺对产品进行冲洗，脱出保护基团氰乙基的目的，胺洗过程二乙胺、乙腈混合液冲洗时间约为10min。
21.作为本发明的进一步方案，胺洗完成后采用乙腈对合成仪以及合成仪中的合成柱进行清洗。
22.作为本发明的进一步方案，氨解是将合成柱中反应后产品与固相载体一起转入氨解罐中，采用氮气将25％氨水压送至氨解罐，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱，再将含寡核酸产品的氨水通过氮气密闭管道压至移动罐中。
23.作为本发明的进一步方案，合成柱的两端分别安装进水口与出水口，并在合成柱的两端分别设置一个阀门，进水口与出水口上同样设置有阀门，在进行氨解时，关闭合成柱两端的阀门，通过氮气将25％氨水由储桶压送至合成柱，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱下来，再将含寡核酸产品的氨水通过合成柱的出水口排出并压送至移动罐中。
24.作为本发明的进一步方案，纯化方法包括离子交换法与反相层析法。
25.作为本发明的进一步方案，超滤前采用质量比16％naoh溶液对超滤膜进行润洗，润洗完成后采用注射水进行置换脱盐。
26.本发明的有益效果：
27.(1)核酸分子的基本骨架是相邻核苷酸间的3
’→5’
磷酸二酯键，由于核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子是一个多步连续的反应，因此本发明在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来，在一轮偶联反应之后，再将上一轮基团上的保护基选择性的脱下来，以形成专一的磷酸二酯键，从而尽可能减少副反应，提升目的产物的产率，降低纯化难度。
28.(2)本发明能够通过对合成柱进行简单的改造，从而能够实现在氨解过程中不对合成柱进行转移，在线氨解，将合成柱内的固相负载物表面负载的寡核酸产品洗脱，对含有寡核酸产品的洗脱液收集并进行后续的纯化处理工序，由于整个过程合成柱无需下线，从而一方面大大降低了工作难度与复杂程度，另一方面显著降低了拆卸安装过程中的废气泄露。
附图说明
29.下面结合附图对本发明作进一步的说明。
30.图1是本发明合成板的结构示意图；
31.图2是本发明合成板的结构示意图；
32.图3是本发明调节连接管的结构示意图；
33.图中：1、上封板；2、下封板；3、气压调节区域；4、合成柱结构；5、调节连接管；11、进料圆孔；51、通气管；52、管体；53、密封挡圈；54、螺纹区。
具体实施方式
34.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
35.一种药用核酸合成工艺，包括如下步骤：
36.第一步，将配制好的原料加入全自动合成仪中，在常温、全封闭的条件下进行合成操作，整个合成周期为24小时。
37.合成仪设合成柱350mm、600mm、800mm；
38.链的延长反应过程是从3
’‑5’
方向延伸，主要包含脱保护、活化偶联、硫化/氧化、盖帽4步反应；待4步反应完成后，再进行下一轮的链的延长反应，链的延长反应次数根据需求设定；
39.其中硫化反应与氧化反应在单个链延长反应过程中不同时进行，在单个批次生产过程中反应次数相同；
40.所述脱保护反应包括：用二氯乙酸脱去核苷酸上的保护基团dmt(二甲氧基三苯甲基)，获得5
’‑
羟基端(核苷酸单体)，供下一步偶联；
41.方程式如下：核苷单体 二氯乙酸
→5’‑
羟基端 二甲氧基三苯甲基 二氯乙酸根；
[0042][0043]
所述活化偶联反应包括：在偶联之前，核苷酸单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给磷酸上二异丙胺基的n原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体，四唑过量保证了活化充分。
[0044]
亚磷酰胺保护的5
’‑
羟基端与活化剂乙硫基四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3’端被活化，5
’‑
羟基仍然被dmt保护，与溶液中游离的5
’‑
羟基发生缩合反应；
[0045]
方程式如下：活化剂5
’‑
羟基端 亚磷酰胺
→
核苷亚磷酸活化中间体 nr2(烷基胺)；
[0046][0047]
所述硫化/氧化反应包括：在硫化试剂苯乙酰二硫化物(pads)或者在氧化剂碘液的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯(核酸中间体)，即将三价磷硫化成五价磷，副产物为苯甲酸；
[0048]
方程式如下：核苷亚磷酸活化中间体 硫化剂(pads)
→
磷酸三酯 苯甲酸；
[0049][0050]
所述盖帽反应包括：缩合反应中可能有极少数5
’‑
羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和n-甲基咪唑(作为溶剂，不参与反应)终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉；
[0051]
方程式如下：5
’‑
羟基端 乙酸酐
→
核酸中间体 乙酸；
[0052][0053]
在本发明的一个实施例中，在通过全自动合成仪中进行合成反应时，通过合成板对合成柱结构4进行支撑；
[0054]
如图1至图3所示，合成板包括上封板1与下封板2，上封板1与下封板2之间把保持一定距离，上封板1与下封板2之间形成气压调节区域3，上封板1与下封板2之间对应合成柱结构4设置有若干调节连接管5；
[0055]
调节连接管5包括管体52，管体52为两端开口的空心管状结构，管体52的两端管壁分别与上封板1以及下封板2无缝密封连接；
[0056]
上封板1上对应管体52的一端设置有进料圆孔11，通过进料圆孔11能够向合成柱结构4内进料；
[0057]
管体52的侧壁上设置有通气管51，通气管51上设置有流量调节阀，工作时能够远程对流量调节阀的开启关闭状态进行调整；
[0058]
管体52的内侧壁上设置有密封挡圈53，密封挡圈53的内径与合成柱结构4的进料口内径相匹配，密封挡圈53为不锈钢内衬表面包覆有一层耐腐蚀橡胶的结构；
[0059]
当装配合成柱结构4时，合成柱结构4的顶部与密封挡圈53的表面紧密接触，起到密封的效果；
[0060]
在本发明的一个实施例中，所述管体52的内壁在密封挡圈53的下方设置有与合成柱结构4匹配的螺纹区54；
[0061]
本发明在工作时，将所有进料圆孔11密封堵塞，通过对气压调节区域3内进行增压或者抽气，从而形成局部的高压区域或者负压区域，然后再通过对通气管51上的流量调节阀进行调整，控制器开闭状态以及开闭程度，从而达到预期的效果；
[0062]
具体举例，在需要对各合成柱结构4进行试剂排空处理时，对所有进料圆孔11进行密封堵塞，通过对气压调节区域3内进行增压，从而形成局部的高压区域，然后关闭未连接合成柱结构4的调节连接管5上的流量调节阀，开始进行排空处理，在各合成柱结构4的排空进度不一样时，可以先关闭完成排空的合成柱结构4对应的流量调节阀或者在未完成排空时，对流量调节阀的开度进行调整。
[0063]
第二步，胺洗
[0064]
对合成仪中的产品和固相载体进行胺洗，胺洗采用二乙胺对产品进行冲洗，使得二乙胺与保护基团氰乙基进行反应，达到脱出保护基团氰乙基的目的，胺洗过程二乙胺、乙腈混合液冲洗时间约为10min，冲洗产生的废液通过管道接管至废液储罐；
[0065]
胺洗完成后采用乙腈对合成仪进行冲洗，去除合成仪中的杂质，对合成仪中的合成柱进行清洗，以去除合成柱中的残留物，清洗过程由有机废液产生，通过密闭管道输送至废液储罐暂存；
[0066]
第三步，氨解
[0067]
合成结束后，进行氨解工序；
[0068]
在本发明的一个实施例中，将第二步中完成胺洗的合成柱转移至氨解车间，将合成柱中反应后产品与固相载体一起转入氨解罐中，采用氮气将25％氨水由储桶压送至氨解罐，操作温度65℃(采用乙二醇作为冷热媒介，采用乙二醇蒸汽间接加热，采用冷冻水进行冷却降温)，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱下来，再将含寡核酸产品的氨水通过氮气密闭管道压至移动罐中，管道中加装滤网，过滤掉固相载体，该工序氨水进料以及氨解釜开盖过程中少量废气产生、合成柱开盖过程中有少量有机废气挥发，同时有废固相载体以及废滤网产生；
[0069]
在本发明的另一个实施例中，在合成柱的两端分别安装进水口与出水口，并在合成柱的两端分别设置一个阀门，进水口与出水口上同样设置有阀门，在胺洗等工序中，进水口与出水口上的阀门处于常闭状态，在进行氨解操作时，关闭合成柱两端的阀门，通过氮气将25％氨水由储桶压送至合成柱，操作温度65℃(采用乙二醇作为冷热媒介，采用乙二醇蒸汽间接加热，采用冷冻水进行冷却降温)，将固相支持物上合成的寡核酸洗脱下来，再将含寡核酸产品的氨水通过合成柱的出水口排出并压送至移动罐中，通过在合成柱出水口上设置滤网，避免固相载体脱离合成柱，整个过程中会产生氨气、少量有机废气；
[0070]
第四步，纯化
[0071]
纯化方法包括离子交换法与反相层析法；
[0072]
通过纯化除去产品中的副产物与杂志，提升所得产品中目标产物的纯度；
[0073]
第五步，超滤
[0074]
产品纯化后需要去除纯化中带入的盐类物质，通过超滤的方法进行脱盐处理。超滤之前需要采用16％naoh溶液对超滤膜进行润洗；润洗完成后采用注射水进行置换脱盐，超滤过程超滤膜定期更换，该工序有润洗废水以及超滤废水以及废超滤膜产生；
[0075]
第六步，冻干
[0076]
将含水物料冷冻到冰点以下(-40℃，12h)，使水转变为冰，然后在较高真空下将冰转变为蒸气而除去的干燥方法。冷冻干燥产生的水蒸气通过低温冷凝器捕集后变成冰，再化霜变成水，从而得到脱水的产品。
[0077]
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。