一种猪瘟E2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gD蛋白基因及其应用的制作方法

一种猪瘟e2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gd蛋白基因及其应用
技术领域
1.本发明属于基因重组疫苗技术领域，具体涉及猪瘟e2蛋白基因、猪伪狂犬病毒gd蛋白基因及其应用。


背景技术：

2.猪瘟(classical swine fever,csf)是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,csfv)引起的一种高度接触性传染病，其主要特征是急性型以败血性变化为主，实质器官出血、坏死和梗死,慢性型则呈纤维素性坏死性肠炎变化。猪瘟是危害养猪业的主要传染病之一，世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020)》中，猪瘟也被列为优先防控的重大动物疫病之一。csfv基因组长约12.3kb,仅含有一个大的开放性阅读框(orf)，翻译成一种多聚蛋白，通过加工为1个结构蛋白和3个囊膜糖蛋白，即ems(e0)、e1和e2，其中e2蛋白具有很好的免疫原性，能诱导机体产生高水平的病毒中和抗体,csfv表面的单抗决定簇主要分布在e2蛋白上。
3.我国于1954年成功研制猪瘟兔化弱毒疫苗(hclv)推广至今，我国的猪瘟疫情得到了有效控制，但未根除。目前被广泛应用的csfv疫苗株有中国的c株、日本的gpe株、法国的thiverval株等，其中中国的c株是国际上公认的安全有效的疫苗株，该毒株免疫原性好、免疫谱广、安全性高、遗传性稳定。2008年，中国兽药监测所等单位利用猪瘟兔化弱毒疫苗接种传代细胞，成功研制出的新一代的猪瘟弱毒活疫苗，获农业部批准生产。猪瘟免疫防控的疫苗仍以猪瘟兔化弱毒细胞苗、传代细胞苗、脾淋苗为主。但经典c株不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰，给猪瘟疫病的防治及净化带来了很大的困难。亚单位疫苗目前国内普及使用较少。获得文号厂家目前只有一家。
4.猪伪狂犬病是由伪狂犬病病毒(prv)引起的多种动物以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。目前，伪狂犬病在世界范围内广泛流行，其中猪最易感，发病也最严重，是病毒的长期储存者和排毒者，且具有高致死率。疫苗接种是预防、控制甚至消灭猪伪狂犬病主要的措施之一。国内外已研制出猪伪狂犬病的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因缺失弱毒疫苗已经相对成熟弱毒活疫苗是将分离到的野毒株经非猪源细胞反复传到，或适应鸡胚、或加入致突变剂在高于一般的培养温度下，在细胞上反复传代而获得的疫苗，如匈牙利的bartha株、罗马尼亚的bucharest株、buk株、tk200株等。我国广泛使用的pr弱毒冻干疫苗(bartha-k61)是gi/ge双击因缺失弱毒疫苗，由于该基因缺失而进一步阻断弱毒疫苗返毒的可能性。但弱毒活疫苗与e2联合使用时存在抗原相容性问题，且仍然存在不能区分野毒株感染，免疫效果易受母源抗体的干扰的问题。
5.为有效预防猪瘟和猪伪狂犬病这2种疾病，同时区分野毒株感染，国内外有许多相关亚单位疫苗的研究，但全部为单苗，关于csfv和prv二联亚单位疫苗未见报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种基因片段，其核苷酸序列如seq id no.1所示或如seq id no.2所示。
7.本发明还提供了一种重组载体，它是包含权利要求1所述基因片段的质粒；所述质粒为pcho1.0质粒。
8.本发明还提供了一种重组细胞，它是包括前述重组载体的大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或者哺乳动物细胞中的任一种，优选哺乳动物细胞。
9.进一步地，所述哺乳动物细胞为cho细胞；所述cho细胞包括cho-k1、cho-s、cho-dxb11、cho-dg44、chozn gs、chok1sv gs-ko，优选cho-s。
10.本发明还提供了一种重组蛋白，它是前述重组细胞表达的蛋白，其中由seq id no.1所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪瘟e2蛋白，由seq id no.2所示核苷酸序列翻译的蛋白为猪伪狂犬病毒gd蛋白。
11.本发明还提供了一种前述重组蛋白的制备方法，它包括以下步骤：
12.1)取前述基因片段，与双酶切后的表达载体连接，再导入大肠杆菌，提取具有如seq id no.1所示或如seq id no.2所示核苷酸序列的质粒，线性化后转染到哺乳动物细胞中，加压筛选，得稳转细胞系；
13.2)取稳定细胞系，发酵培养，收集上清，纯化，即得。
14.进一步地，步骤1)所述表达载体为pcho1.0质粒载体；所述大肠杆菌细胞为大肠杆菌top10感受态细胞；所述哺乳动物细胞为cho细胞；所述转染的方式为脂质体转染；所述加压筛选是用含20nm mtx的cho培养基培养至细胞活率96％，共两次；和/或，步骤2)所述取稳定细胞系，经elisa法和/或hplc法筛选，取表达量最高的单克隆细胞，采用流加培养方式发酵培养，收集上清，亲和层析纯化，即得。
15.本发明最后提供了一种亚单位疫苗，它是由质量比9：1的前述重组蛋白与isa15a佐剂制成的疫苗。
16.进一步地，所述重组蛋白中e2蛋白与gd蛋白的比例为1：1。
17.更进一步地，所述重组蛋白的浓度为20～50μg/ml，优选25μg/ml。
18.本发明采用将截去跨膜疏水区的猪瘟e2蛋白、伪狂犬gd蛋白基因重组构建至进pcho1.0质粒，并将重组后质粒通过脂质体转染，双加压筛选的方式方法成功构建了稳定表达猪瘟e2蛋白、及伪狂犬gd蛋白的cho工程细胞系。通过所构建的cho工程细胞系表达的猪瘟e2蛋白、伪狂犬gd蛋白免疫原性好，表达产量高，免疫后便于临床血清诊断及猪场猪瘟、伪狂犬病原的净化，可一针两防，减少免疫次数和应激反应，具有较高的经济效益和市场前景。
19.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
20.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。
附图说明
21.图1克隆前后pcho1.0质粒图谱(a：e2蛋白转染质粒图谱；b：gd蛋白转染质粒图谱)
22.图2转染质粒的酶切鉴定(1、5：marker15000da；2：e2蛋白切转化质粒xmaji、bst1107i双酶切；3：线性e2蛋白转化质粒；4：e2蛋白质粒；
23.6：gd蛋白转化质粒xmaji、bst1107i双酶切；7：gd蛋白转化质粒)
24.图3琼脂糖凝胶电泳鉴定e2蛋白转化质粒pcr结果(1～10：e2蛋白转染质粒转化top10后单克隆；11：阴性对照；12：阳性对照；a～e：gd蛋白转染质粒转化top10后单克隆)
25.图4瞬时表达e2蛋白、gd蛋白wb鉴定结果(a：gd蛋白瞬转产物wb结果；b：e2蛋白瞬转产物wb结果)
26.图5sds-page(左)、western blot(右)检测纯化后猪瘟e2蛋白(1：7.5μl上样量；2：15μl上样量)
27.图6sds-page(左)、western blot(右)检测纯化后伪狂犬gd蛋白(1：表达上清；2：亲和层析流穿；3：亲和层析洗脱；4：过分子筛)
28.图7纯化后e2蛋白及gd蛋白的hplc结果
29.图8表达上清中e2及gd蛋白hplc定量结果(上样量30μl，最终含量mg/ml＝hplc含量结果/30)
具体实施方式
30.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，可通过购买市售产品获得，其中cho-2培养基、cho-5补料培养基购于苏州市沃美生物技术有限公司。
31.实施例1重组猪瘟e2蛋白、猪伪狂犬病毒gd蛋白疫苗及其二联疫苗研究
32.1 e2、gd蛋白转染质粒的构建及鉴定
33.委托金斯瑞生物合成c末端带his-tag纯化标签的猪瘟e2蛋白基因、猪伪狂犬gd蛋白基因并克隆至pcho1.0的xmaji与bstz1107i酶切位点。克隆前后质粒图谱见图1。构建后的e2蛋白质粒经双酶切验证可得到1109bp条带，gd蛋白质粒经双酶切验证可得到1085bp条带。经基因测序e2及gd蛋白序列与设计理论序列一致。质粒鉴定见图2。酶切体系为：gd转化质粒3μl，fastdigest bst1107i 1μl，fastdigest xmaji 1μl，10
×
fastdigest buffer 2μl，ddh2o 13μl；反应条件为：37℃孵育2小时。
34.猪瘟e2蛋白基因序列(seq id no.1)：
35.atgcgagcatggatcttttttctactatgcctggccggcagagccttagctagactgctgtgtaaggaggactaccggtacgccatctcttctactaacgagatcggacctctgggcgctgagggcctgaccaccacctggagagaatattcccacggctttcaactggacgacggcaccgtgcgggccatctgcaccgctggctccttcaaggtgatcgccctgaacgtggtgtccagaagatacctcgcttctctgcacaagcgggctctgcctaccagcgtgaccttcgagctgctgttcgacggaacctctcctgctatcgaagagatgggcgacaacttcggcttcggactgtgccctttcgacaccacacctgtggtgaaaggcaagtacaacaccacactgctgaacggctctgccttctacctggtgtgtcccatcggctggaccggcgtgatcgagtgtaccgccgtgtccccaacaaccctgagaaccgaagtggtcaagacctttaagcgcgaaaagccctttcctcggagagtggactgtgtgaccaccatcgtggaaaaagaagacctgttctactgcaagtggggcggcaactggacctgcgtgaagggcaatcctgtgacctacatgggaggccaggtgaagcagtgcagatggtgcggcttcgacttcaaagagcccgatggcctgcctcactaccctatcggaaagtgcatcctggccaacgagacaggctatagagtcgtggattctactgactgcaaccgggacggtgtggtcatctccaccaagggcgagcacgagtgcctgattggcaatacaaccgttaaagtgcacgccctggatggccggctgggccctatgccttgccggcctaaggaaatcgtgtccagcgccggccccg
tgcggaagacctcctgcaccttcaactacaccaagaccctgaagaacaagtactacgagccaagagactcctacttccagcagtacatgctgaagggagagtaccagtactggttcgatctggacgccaccgaccaccacaccgattacttcgcccaccaccatcaccaccattga
36.猪伪狂犬病毒gd蛋白基因序列(seq id no.2)：
37.gccgccaccatgcgagcatggatcttttttctactatgcctggctggcagagccctggccgccgatgtcgatgccgttccagctcctaccttccctccacctgcctacccctacaccgagtcctggcagctgaccctcaccaccgtgccctcccctttcgtgggccctgctgatgtgtaccacaccagacctctggaagatccttgcggcgtggtcgctctgatcagcgacccccaggtggacagactgctgaacgaggccgtggctcaccggagaccaacctaccgggcccacgtggcctggtatcggatcgccgacggctgtgcccacctgctgtacttcatcgagtacgccgactgcgaccctagacagatctttggccggtgcaggagaagaaccacccctatgtggtggacccctagcgctgactacatgttccccaccgaggacgagctgggcctgctgatggtggcccctggcagattcaacgaaggccagtaccggcggctggtgtccgtggatggcgtgaacatcctgaccgacttcatggtcgccctgcccgagggccaagagtgtccttttgccagagtggaccagcacagaacctacaagttcggcgcctgctggtccgacgactccttcaaacgaggagtggacgtgatgcggttcctgacaccattctaccagcagcctcctcatagagaagtggtgaattactggtatagaaagaacggccggaccctgcctagagcttacgctgctgctactccttacgccatcgaccctgctagaccctctgccggctctcctagaccccggcctagacctagaccacggcctcggcctaagcccgaacctgcccctgctacccctgcccctcctggaagactgcctgaacctgccacccgggaccacgccgctggcggcagacccacacctcgccctcctcggcctgagacacctcacagacccttcgccccccccgctgtggtgccttctggctggcctcagcctgccgagccatttcctcccaggaccacagctgctccaggagtgcaccaccaccaccatcattga
38.2e2蛋白、gd蛋白转染质粒的转化及阳性克隆的筛选
39.将e2蛋白基因、gd蛋白基因转染质粒转化进入top10感受态，转化程序如下：冰浴放置30分钟，42℃激活90秒，冰浴放置3分钟，加入600μl无抗lb培养基于37℃振荡培养45分钟，取100μl培养物于lb卡那霉素抗性培养平板上涂布，并于37℃过夜培养。通过卡那霉素抗性筛选及pcr鉴定的方式得到阳性克隆(图3)。pcr引物如表1：
40.表1转化阳性质粒pcr鉴定引物序列
[0041][0042]
3e2蛋白、gd蛋白线性质粒的转染及瞬转产物的鉴定
[0043]
挑取2中阳性e2蛋白及gd蛋白克隆摇菌进行质粒大提，并将提取的质粒进行线性化，线性化体系如下：用rrui酶对质粒进行线性化，线性化体系为：e2蛋白/gd蛋白质粒73μl，fastdigest rrui 7μl，10
×
fastdigest buffer 10μl，ddh2o 10μl；反应条件为：37℃孵育2小时。通过脂质体转染方式得到瞬时转染细胞系，具体转染操作如下：(1)取无菌1.5ml ep管，按表2加入体系后，将管a，管b轻轻混匀；(2)立即将管b中液体加入到管a中，加入过程中将枪头伸入到液面以下，边加边旋转枪头，加入完毕后轻轻混匀，静置10min后；(3)将管a中液体按照300μl/孔缓慢滴加到预先准备的细胞中，将细胞放入37℃，8％co2二氧化碳摇床，振荡培养。取该细胞系48小时培养上清与wh303单抗进行western blot鉴定，可在55kda处有特异性结合条带(图4)。
[0044]
表2线性化pcho1.0-csfv-e2-ecd质粒转染cho-s细胞方案
[0045][0046]
4稳转细胞系的筛选及表达e2蛋白的纯化鉴定
[0047]
用cho-2培养基(含20nm甲氨蝶呤(mtx))对转染后cho-s细胞进行两轮加压筛选(即用含mtx的cho培养基培养两次)，待细胞活率恢复至96％时，对稳转细胞系进行冻存，得到10支冻存细胞(1.5
×
107个/ml，1ml/支)，梯度降温后于液氮保存。利用流加培养的方式对稳转细胞系进行培养及猪瘟e2蛋白和gd蛋白的表达，培养第12天收集上清；利用亲和层析对收集上清进行纯化，洗脱后得到e2蛋白液及gd蛋白液。
[0048]
5纯化后e2蛋白、gd蛋白标准品的体外鉴定及hplc检测
[0049]
利用sds-page及western blot对纯化后e2蛋白及gd蛋白进行体外鉴定，e2蛋白在55kda处均有特异性条带出现，gd蛋白在50kda处有特异性条带出现(图5、图6)，sds结果可以看出纯化后蛋白纯度＞90％；bsa测定e2蛋白纯化后总蛋白含量为1.42mg/ml，gd蛋白总蛋白含量为2.27mg/ml。hplc结果显示纯化后e2蛋白的纯度可达到98.8％，保留时间为11.7分钟；gd蛋白纯度可达96.3％，保留时间为13.9分钟(图7)。hplc检测具体信息如下：1、仪器及色谱柱waters arc uhplc系统；色谱柱厂家为：sepax technologies；型号为zenix-c sec-300，规格：7.8mmi.d.
×
30cm，3μm2、流动相为：100mpb 100mm硫酸钠，ph6.8；3、检测流动相流速为0.6ml/分钟，样品上样量30μl。以上制备e2蛋白及gd蛋白符合标准品要求。
[0050]
6表达e2蛋白及gd蛋白cho-s细胞单克隆筛选
[0051]
用cho-2培养基(含20μg/ml嘌呤霉素(puromycin)，1mm mtx)将构建的稳定细胞系通过有限稀释法，将细胞按0.4个/孔细胞密度，200μl体积铺至96孔板中。待96孔板细胞生长18～20天将单克隆细胞扩大至24孔板，再通过elisa方法筛选表达量相对较高的克隆并扩大至6孔板及125ml摇瓶。将elisa筛选表达量较高单克隆细胞进行冻存，同时进行流加培养表达，hplc筛选出表达量最高的cho-e2、cho-gd单克隆细胞。
[0052]
7cho-e2、cho-gd单克隆细胞的摇瓶发酵
[0053]
分别将表达量最高的cho-e2及cho-gd单克隆细胞进行复苏及扩大。于1升摇瓶中进行e2及gd蛋白的流加培养表达。具体操作如下：按3
×
105个/ml细胞密度将单克隆细胞进行扩大至200ml。置37℃，5％co2摇床100转/分振荡培养。流加培养第3天向每个摇瓶中添加3mmol/l l-glutamine，流加培养第5天将培养温度降低至32℃，流加培养第3、5、7、9、11、13及15天分别添加5％cho-5补料培养基。培养第四天开始每天检测葡萄糖、乳酸浓度，当葡萄糖浓度低于3g/l时，补加葡萄糖浓度至5g/l，第16天收获细胞液，15000g 15分钟离心收集细胞上清进行hplc检测上清中各蛋白表达量。将定量后的e2蛋白上清和gd蛋白上清按照目的蛋白1.5mg/ml进行稀释后，按照上样流速4ml/分钟、洗杂液咪唑浓度10mm、目的蛋白洗脱液20mm tris-hcl 0.5m咪唑，洗脱体积5cv、最大上样量12cv，亲和层析柱：ni focurose 6ff(ted)进行亲和层析纯化，并用hplc方法对纯化后的蛋白进行定量。表达上清中e2蛋白
含量可达1.97mg/ml、gd蛋白含量可达1.58mg/ml(图8)；纯化后e2蛋白gd蛋白纯度＞90％，蛋白浓度为2mg/ml左右；纯化后gd蛋白纯度＞90％，蛋白浓度为1.8mg/ml左右。
[0054]
8猪瘟、伪狂犬二联亚单位疫苗的制备及免疫原性验证
[0055]
8.1实验方法将纯化定量后的e2蛋白、gd蛋白与isa15a佐剂按照9:1(w/w)制成e2单苗乳化苗(含猪瘟e2蛋白25μg/ml)、gd单苗乳化苗(伪狂犬gd蛋白25μg/ml)及e2 gd二联乳化苗(含猪瘟e2蛋白25μg/ml 伪狂犬gd蛋白25μg/ml)，制备方式为：将佐剂缓慢加入抗原液中，并持续混合5-10分钟，制备完成后2-8℃保存备用。
[0056]
筛选3～4周龄猪瘟抗原抗体阴性仔猪30头，随机分为6组，每组5头；第一组颈部肌肉注射e2单苗乳化苗2ml，第二组颈部肌肉注射gd单苗乳化苗2ml，第三、四组接种e2 gd二联乳化苗2ml/头份，第五、六组不接种作为对照。一免21日各免疫组按相同方式、相同剂量加强免疫一次。二免14日，测定猪瘟及伪狂犬血清中和抗体。此外二免14日第一、三、五组每头肌肉注射1ml猪瘟石门系强毒(105个最小致死剂量)进行攻毒，二、四、六组每头滴鼻prv ah株强毒2ml(含10
5.85
tcid
50
)进行攻毒，猪瘟攻毒后连续观察16日，伪狂犬攻毒后连续观察14日。猪瘟及伪狂犬按照以下发病及保护标准判定结果。
[0057]
猪瘟石门系强毒攻毒后的发病标准为：(1)连续3日及以上体温高于40.5℃；(2)食欲减退或废绝、精神沉郁、喜卧、攻毒后逐渐出现皮肤发绀、充血情况、便秘及腹泻交替；(3)死亡；符合以上任意两条判为发病。保护标准为：(1)免疫猪健活；(2)如出现精神萎靡或体温升高(体温不低于40.5摄氏度)，累计应不超过2日；(3)不出现皮肤充血发绀、腹泻及便秘交替等典型症状。
[0058]
prv ah株攻毒后发病标准为：(1)体温升高超过40.5℃，且持续至少3日；(2)出现精神沉郁、食欲减退、共济失调、转圈、走路摇晃等症状；(3)死亡。符合以上任意两条符合以上其中2条，即可判为发病。保护标准为：(1)免疫猪健活；(2)如出现精神萎靡或食欲不振(体温不低于40.5摄氏度)，累计应不超过2日；(3)不出现共济失调、转圈、走路摇晃等神经症状。
[0059]
8.2实验结果
[0060]
二免后14日各免疫组猪瘟及伪狂犬中和抗体及各组攻毒保护结果如表3所示。从结果可见：e2单苗、e2 gd联苗均能为仔猪提供抵抗猪瘟病毒100％的保护；gd单苗及gd e2联苗均能为仔猪提供抵抗伪狂犬病毒100％的保护。此外，从中和抗体结果可以看出，e2 gd蛋白联苗二免后猪瘟及伪狂犬中和抗体水平与各单苗相当。攻毒保护结果表明联苗及单苗均能抵抗该猪瘟及伪狂犬病毒攻击，说明临床上可实现一针两防的作用。
[0061]
表3猪瘟中和抗体及攻毒保护结果
[0062][0063]
备注：“ ”表示出现死亡或体温≥40.5℃超过3日，食欲减退或废绝、精神沉郁、喜卧、攻毒后逐渐出现皮肤发绀、充血情况、便秘及腹泻交替等。“—”表示无体温反应、精神食欲正常、未死亡。
[0064]
表4伪狂犬中和抗体及攻毒保护结果
[0065]
[0066][0067]
备注：“ ”表示出现死亡或体温≥40.5℃超过3日，出现精神沉郁、食欲减退、共济失调、转圈、走路摇晃等症状等。“—”表示无体温反应、精神食欲正常、未死亡。
[0068]
综上，本发明采用截去跨膜疏水区的猪瘟e2蛋白、伪狂犬gd蛋白基因表达的重组猪瘟e2蛋白、伪狂犬gd蛋白免疫原性好，表达产量高，免疫后便于临床血清诊断及猪场猪瘟、伪狂犬病原的净化，可一针两防，减少免疫次数和应激反应，具有较高的经济效益和市场前景。