胆酸衍生物及其制备方法

1.本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及控制血糖血脂等代谢异常的天然药物/药物前体的制备。


背景技术：

2.近年来，随着人们生活方式的改变以及高脂高糖西方饮食的流行，高血糖、高血脂、非酒精性脂肪肝等常见的代谢类慢性疾病的患病率迅速上升，已经成为不可忽视的国民健康威胁。
3.由于多数代谢类疾病属于慢性病，具有服药周期长等特点，目前临床上常用的降血糖和血脂手段以口服药物为主，常用降糖药物包括磺脲类、双胍类口服药，降血脂主要用药为他汀类药物。这些药物的结构多数是人工合成的而非宿主体内天然存在的；且长期服用上述药物均会引起不同程度的副作用，例如双胍类药物会引起消化道异常反应，或者是乳酸中毒；长期服用他汀类药物会导致高血糖、认知障碍以及肝脏和肌肉损伤等。因此，如何寻找安全有效的天然产物进行高血糖高血脂等慢性代谢类疾病的长期用药开发，一直以来备受关注。


技术实现要素：

4.本发明的第一目的是提供了胆酸衍生物，其具有如下化学结构式：
[0005][0006]
其中，r为
[0007]
本发明还提供了胆酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：将sj-2菌株在改良gam液体培养基中培养24-48小时后得培养液；以体积比为1％-5％的接种量将培养液接入改良gam液体培养基培养24-48小时后，进行厌氧条件下的离心、收菌得收集液；将收集液用发酵培养基重悬并将sj-2菌在发酵培养基中的生物量调整到od
600nm
约为1后得重悬液；在厌氧条件下，重悬液在37℃下培养12-24小时之后离心收集上清得胆酸衍生物。
[0008]
在本发明的具体实施方式中，所述改良gam液体培养基的制备方法为：酪蛋白胨10
克，大豆蛋白胨3克，胰蛋白胨15克，消化血清13.5克，酵母提取物5克，牛肉粉2克，牛肝浸提物1.2克，葡萄糖3克，可溶性淀粉0.3克，l-半胱氨酸盐酸盐0.5克，l-精氨酸0.5克，l-色氨酸0.3克，碳酸氢钠2克，磷酸二氢钾2.5克，nacl 3克，巯基乙酸钠0.15克，乙酸钠2.46g，氯高铁血红素0.01g，刃天青0.001g，澄清瘤胃液10％(v/v)，加蒸馏水至1l，ph 7.2
±
0.1，115℃下高压灭菌25分钟。
[0009]
在本发明的具体实施方式中，所述发酵培养基培养的制备方法是在改良gam液体培养基中加入终浓度为1g/l胆酸盐溶液和终浓度为10mm的小分子酸混合液。
[0010]
在本发明的具体实施方式中，所述小分子酸混合液的制备方法为：等摩尔比的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸混合，ph调至7.0。
[0011]
本发明提供的胆酸衍生物在制备抑制fxr激活的拮抗剂中、在制备降血糖药物中、在制备降血脂药物中和在制备治疗脂肪肝药物中都有较好的技术效果。
附图说明：
[0012]
图1.sj-2菌落形态图。
[0013]
图2.sj-2菌体形态图。
[0014]
图3.sj-2生物转化产生的aca化合物的lc-ms检测结果图。
[0015]
图4.液相色谱分离aca化合物纯品的lc-ms检测结果图。
[0016]
图5.ace-ca 1
h nmr图。
[0017]
图6.ace-ca 13
c nmr图。
[0018]
图7.pro-ca 1
h nmr图。
[0019]
图8.pro-ca 13
c nmr图。
[0020]
图9.but-ca 1
h nmr图。
[0021]
图10.but-ca 13
c nmr图。
[0022]
图11.val-ca 1
h nmr图。
[0023]
图12.val-ca 13
c nmr图。
[0024]
图13.小鼠肝脏组织切片图。
具体实施方式：
[0025]
实施例
[0026]
1.发酵产aca化合物的生产菌株的获得、培养与鉴定
[0027]
生产菌株的获得、分离、鉴定：
[0028]
菌种由专利发明人于2019年6月17日，从经由粪便供体本人签署知情同意书后提供的新鲜粪便中厌氧分离获得。
[0029]
菌落形态：在改良gam肉汤培养基中生长快，37℃厌氧条件下培养2-3天，菌落直径1-2mm，白色，光滑，无水溶性色素(图1)。透射电镜下，观察细胞形态为短杆状或梭状，长约1.2-1.6微米，宽0.6-0.8微米(图2)。
[0030]
所述改良gam肉汤培养基中每升包含：酪蛋白胨10克，大豆蛋白胨3克，胰蛋白胨15克，消化血清13.5克，酵母提取物5克，牛肉粉2克，牛肝浸提物1.2克，葡萄糖3克，可溶性淀粉0.3克，l-半胱氨酸盐酸盐0.5克，l-精氨酸0.5克，l-色氨酸0.3克，碳酸氢钠2克，磷酸二
氢钾2.5克，nacl 3克，巯基乙酸钠0.15克，乙酸钠2.46g，氯高铁血红素0.01g，刃天青0.001g，澄清瘤胃液10％(v/v)，加蒸馏水至1l，ph 7.2
±
0.1，115℃灭菌25分钟高压灭菌后使用。固体培养基需额外加入15g琼脂。
[0031]
分子鉴定方法：
[0032]
16s rrna的全序列分析，鉴定分类命名为christensenella minuta，对应的中文命名为小克里斯腾森氏菌，菌株命名为sj-2，该菌株已于2021年4月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：cgmcc)，保藏号为：cgmcc no.22122，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。即专利菌株保藏号为：cgmcc no.22122；与小克里斯藤森氏菌标注的16s rran序列同源性为99％，序列如序列表中seq id no.1所示。
[0033]
菌种的培养与保存方法：
[0034]
小克里斯滕森氏菌(christensenella minuta)sj-2在加入10％澄清瘤胃液的改良gam肉汤培养基中活化1次。然后以体积比为0.1％-10％的接种量接入相同成分的改良gam液体培养基中，37℃，厌氧培养1-7天。
[0035]
菌的长期保存方法：
[0036]
菌液在4℃，10000rpm下离心2分钟收集沉淀细胞，并用pbs缓冲溶液清洗后，在含有15％-25％脱脂乳粉溶液中5:1重悬，冷冻干燥后密封保存，或在含有15％甘油和85％血清的保存液中液氮冷冻后-80℃保存。
[0037]
2、sj-2菌转化胆酸产生aca方法
[0038]
将sj-2菌株在改良gam液体培养基中培养24-48小时后得培养液；
[0039]
所述改良gam液体培养基(g/l)的制备方法为：酪蛋白胨10克，大豆蛋白胨3克，胰蛋白胨15克，消化血清13.5克，酵母提取物5克，牛肉粉2克，牛肝浸提物1.2克，葡萄糖3克，可溶性淀粉0.3克，l-半胱氨酸盐酸盐0.5克，l-精氨酸0.5克，l-色氨酸0.3克，碳酸氢钠2克，磷酸二氢钾2.5克，nacl3克，巯基乙酸钠0.15克，乙酸钠2.46g，氯高铁血红素0.01g，刃天青0.001g，澄清瘤胃液10％(v/v)，加蒸馏水至1l，ph 7.2
±
0.1，115℃下高压灭菌25分钟后使用。固体培养基需额外加入15g琼脂。
[0040]
待sj-2菌生长进入对数后期后，以体积比为1％～5％的接种量将培养液接入改良gam液体培养基中培养24-48小时后，将进入对数后期的sj-2菌进行厌氧条件下的离心、收菌得收集液；
[0041]
将收集液用发酵培养基重悬并将sj-2菌在发酵培养基中的生物量调整到od
600nm
约为1后得重悬液；
[0042]
所述发酵培养基是在改良gam液体培养基中加入终浓度为1g/l胆酸盐溶液和终浓度为10mm的单一小分子酸盐或者小分子酸盐混合液；所述单一小分子酸盐为ph为7.0的乙酸、丙酸、丁酸或戊酸的盐；所述小分子酸盐混合液为ph为7.0的等摩尔比的乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的盐的混合。
[0043]
在厌氧条件下，重悬液在37℃下培养12-24小时之后离心收集上清得aca，用于aca转化的检测与纯化等实验。
[0044]
3.aca化合物的lcms检测方法
[0045]
检测样品准备：取1ml发酵上清液，用0.22微米滤膜过滤后，高速离心机1.5万转离心30分钟后直接上样。
[0046]
液相色谱的条件为：c8色谱柱，柱长100mm，直径2.1mm，粒径1.7μm，流速0.2ml/min，柱温35℃，进样体积为5μl(考虑容积效应可适当调减)；液相色谱流动相a相为10mm nh4hco3水溶液，b相纯乙腈，采用梯度洗脱，初始25％b，保持0.5min后，随后在12分钟内线性升高到40％b。在1min内继续升高到90％b，维持3分钟，在0.5分钟恢复到25％b，平衡2.5分钟。
[0047]
质谱检测的条件为：采用esi源负离子模式，喷雾电压3kv，毛细管温度设置为300℃。鞘气和辅助气同为氮气，流速分别为45and 10(arbitrary units)，辅助气加热温度为350℃。方法采用全扫描模式，分辨率设置为120000，扫描范围设置为m/z 73.4到1100。
[0048]
4.sj-2菌株转化产生aca的效率计算方法：
[0049]
已知，在sj-2菌的转化下，添加到培养基中的胆酸全部转化为c2-c5酰基的aca化合物，因此aca总的转化效率以0时刻所加入的胆酸在转化催化24小时之后的lcms检测峰图中峰面积减少比例计算：(0时刻胆酸峰面积-24小时胆酸峰面积)/0时刻胆酸峰面积*100％。
[0050]
5.胆汁酸酰基化衍生物aca的分离纯化方法
[0051]
将转化24小时之后的发酵液上清中加入等体积的乙酸乙酯，超声提取3次，超声时间为3
×
0.5小时，分液漏斗收集乙酸乙酯提取液，经真空旋转蒸发仪浓缩得粗提物。将粗提物溶解在10ml甲醇中，使用c18制备柱进行分离。
[0052]
液相条件为：c18制备柱，柱长250mm，直径20mm，流速10ml/min，进样体积为100μl；液相色谱流动相a相为0.01％三氟酸水水溶液，b相纯甲醇，采用70％b 30％a相等度洗脱，接取a205nm下出现的目标峰相应组分，分离组分利用lcms方法检测其纯度后氮气吹干后称重备用。
[0053]
6.实验结果
[0054]
不同碳链长度酰基胆酸的lcms检测结果和sj-2转化率
[0055]
sj-2细胞转化胆酸0小时和24小时的上清液，分别取样通过lcms检测。如图3所示，0时刻样品结果为图3a and b(ca sa_0h)，24小时转化后的结果为图3c-h(ca sa_24h)。结果表明，0时刻只有质荷比(m/z)为407.3的胆酸(图3b)特征峰被检测到，提取407.3m/z特征峰之后的峰面积为93413948.47，而转化24小时候可明显看到4个新峰出现，其质谱图的m/z分别为449.3,463.3,477.3和491.3，对应乙酰胆酸、丙酰胆酸、丁酰胆酸和戊酰胆酸，分别提峰后的峰面积为18071866.68,20406632.73,22769156.54和8969173.10，反应后剩余胆酸(407.3)提峰的峰面积为45837961.92，通过计算，sj-2菌将胆酸转化为aca系列化合物的转化率为50.9％。
[0056]
微生物转化的aca产物的分离与纯化
[0057]
通过液相色谱法利用c18半制备柱对aca转化产物进行分离纯化实验，所收集的特征峰组分将甲醇蒸干复溶后的lcms检测结果如图4所示通过液相色谱法可有效将四种aca化合物进行分离纯化。分离后化合物的分子量分别为450.3、464.3、478.3和492.3的四种未知胆酸衍生物纯品，随后，通过核磁共振检测以下谱图：一维1h谱、一维13c谱实验、二维1h-1h相关谱(邻近碳氢偶合关系)、二维1h-13c相关谱(直接键连的碳氢偶合关系)、二维noesy相关谱(质子在分子立体空间结构中距离)、二维1h-13c远程相关实验(远程碳氢关系，确地伯仲叔季碳)。
[0058]
表1 13
c nmr data(δc)for compounds 1-4in cdcl3
[0059][0060][0061]
表2 1
h nmr data[δh,mult(j in hz)]for compounds 1-4in cdcl3
[0062][0063][0064]
最终确定其化学结构，其中r基分别为乙酰基、丙酰基、丁酰基和戊酰基。
[0065]
所述化合物的结构式如下：
[0066]
[0067]
其中r为
[0068]
7.化合物及其制剂的用途和效果：
[0069]
荧光素酶报告基因检测细胞实验：
[0070]
法尼酯衍生物x受体(farnesoid x receptor,fxr)是一种胆汁酸受体,在胆汁酸代谢和胆固醇代谢中发挥重要作用,并有望成为降低胆固醇,治疗某些心血管病及肝脏疾病的治疗靶点。
[0071]
将fxr的荧光素酶报告系统转染24小时后，将细胞分别暴露于20mmol/l fxr激动剂鹅脱氧胆酸cdca(阳性对照),或者20mmol/l cdca和50mmol/l乙酰胆酸(ace-ca)、丙酰胆酸(pro-ca)、丁酰胆酸(but-ca)和戊酰胆酸(val-ca)的处理组；细胞不做任何处理作为阴性对照。
[0072]
使用商品化双荧光素酶测定系统(promega)进行荧光素酶测定。
[0073]
使用veritas微孔板照度计(turner biosystems)测量萤火虫和海肾萤光素酶活性。
[0074]
为了量化不同aca化合物对fxr的剂量反应抑制作用，将细胞暴露于浓度范围为5mmol/l至200mmol/l(溶解度上限)的ace-ca、pro-ca、but-ca和val-ca 8小时后测定荧光度并利用graphpad prism 6在“log(抑制剂)与归一化响应-可变斜率”模式下计算化合物的半抑制浓度ic
50
。
[0075]
荧光素酶报告基因检测细胞实验结果，aca系列化合物可以抑制由cdca诱导的fxr激活，发挥拮抗剂的作用。
[0076]
aca化合物对于fxr的抑制效果是剂量以来的，以ace-ca、pro-ca、but-ca和val-ca，它们的ic50分别为35.52，29.61,17.87和11.18μm。
[0077]
表3四种酰基胆酸对于双荧光素荧光系统的fxr抑制效果的相对荧光强度数值
[0078][0079]
表4不同浓度乙酰胆酸对于双荧光素荧光系统的fxr抑制效果的相对荧光强度数值
[0080][0081]
表5不同浓度丁酰胆酸对于双荧光素荧光系统的fxr抑制效果的相对荧光强度数值
[0082][0083][0084]
表6不同浓度丙酰胆酸对于双荧光素荧光系统的fxr抑制效果的相对荧光强度数值
[0085][0086]
表7不同浓度戊酰胆酸对于双荧光素荧光系统的fxr抑制效果的相对荧光强度数值
[0087][0088]
动物实验设计：
[0089]
实验采用高脂饮食诱导肥胖的c57小鼠(dio小鼠)，雄性，15周龄。灌胃频率为每天一次，aca组(3只)每天灌胃50mg/kg body weight的ace-ca、pro-ca、but-ca和val-ca纯品生理盐水溶液；制剂组(3只)每天灌胃有效成分为20mg/kg body weight的aca混合物(乙、丙、丁、戊酰基胆酸等质量混合)的改良gam培养基中；对照组(3只)每天灌同等剂量的生理盐水。总实验周期为8周。
[0090]
所述改良gam培养基为(g/l)：酪蛋白胨10克，大豆蛋白胨3克，胰蛋白胨15克，消化血清13.5克，酵母提取物5克，牛肉粉2克，牛肝浸提物1.2克，葡萄糖3克，可溶性淀粉0.3克，l-半胱氨酸盐酸盐0.5克，l-精氨酸0.5克，l-色氨酸0.3克，碳酸氢钠2克，磷酸二氢钾2.5克，nacl 3克，巯基乙酸钠0.15克，乙酸钠2.46g，氯高铁血红素0.01g，刃天青0.001g，澄清瘤胃液10％(v/v)，加蒸馏水至1l，ph 7.2
±
0.1，115℃灭菌25分钟高压灭菌后使用)
[0091]
终点取样：a、血浆样本(抗凝血离心收取上清)，b、肝等实质性脏器(肝脏拍照称重，取中叶左右分别多聚甲醛固定后进行石蜡包埋和冷冻切片，切片后进行红油染色和he染色；剩余肝脏准确称量100mg液氮速冻3管用于其他指标检测。c、肠道及内容物。
[0092]
组织样品检测指标：
[0093]
a)血糖相关指标：静脉血的自由血糖、禁食血糖、葡萄糖糖耐量(ogtt)、胰岛素抵抗(itt)测试；
[0094]
b)血脂相关指标：血浆中的总胆固醇和总甘油三酯的含量；
[0095]
c)肝功能相关：h&e染色和油红染色，肝组织中的胆酸合成限速酶胆固醇7α-羟化酶(cyp7a1)和糖异生限速酶葡萄糖-6-磷酸酶(g6pase)的表达量。
[0096]
上述血糖相关指标为血糖仪检测，除血糖以外的其他生理生化指标通过将血液或匀浆肝组织进行蛋白粗提后，利用商品化elisa试剂盒进行检测。
[0097]
统计学检验：
[0098]
每个处理组相较于对照组的数据是否具有统计学差异，采用双侧新复极差法(dunnett-t test)进行显著性检验，以对照组作为控制类别，p值《0.05认为差异显著。
[0099]
实验结果：
[0100]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠自由血糖：
[0101]
表8数据结果表明，aca化合物及相关制剂具有明显的降低自由血糖的效果，缓解高血糖症状。
[0102]
表8.模型小鼠干预8周后静脉血的自由血糖浓度(mmol/l)
[0103][0104]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠禁食血糖：
[0105]
表9数据结果表明，aca化合物及相关制剂具有明显的降低模型小鼠禁食血糖的效果，缓解高血糖症状。
[0106]
表9.模型小鼠干预8周后禁食血糖浓度(mmol/l)
[0107][0108][0109]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠葡萄糖糖耐量：
[0110]
表10结果表明，aca化合物及相关制剂可以显著增加模型小鼠的葡萄糖耐受能力，缓解糖耐量受损情况。
[0111]
表10.模型小鼠干预7周后葡萄糖耐量的曲线下方面积(auc)
[0112]
[0113]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠胰岛素抵抗：
[0114]
表11结果表明，aca化合物及相关制剂可以显著降低模型小鼠的胰岛素抵抗症状。
[0115]
表11.模型小鼠干预8周后胰岛素抵抗的曲线下方面积(auc)
[0116][0117]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠血液中总甘油三酯含量：
[0118]
表12结果表明，aca化合物及相关制剂可以显著降低模型小鼠血液中总甘油三酯的含量，缓解高血脂症状。
[0119]
表12.模型小鼠干预8周后终点血总甘油三酯浓度(mmol/l)
[0120][0121]
aca化合物及相关制剂降低模型小鼠血液中总胆固醇含量：
[0122]
表13结果表明，aca化合物及相关制剂可以显著降低模型小鼠血液中总胆固醇的含量，缓解高胆固醇症状。
[0123]
表13.模型小鼠干预8周后终点血总胆固醇浓度(mmol/l)
[0124][0125]
aca化合物及相关制剂降低肝脏脂肪堆积和肝细胞损伤等病理学指标：
[0126]
从图13可以看出，aca和制剂处理后的小鼠肝脏的脂肪堆积明显减少，组织切片中极少见到脂肪空泡，大泡性脂肪变易基本消失。模型小鼠干预后，肝小叶结构紊乱与清晰界限被纠正，肝细胞网状结构减少或基本消失，形态正常，核圆且居中。上述表型表明疾病模型小鼠的非酒精性脂肪肝与肝损伤症状得到极大程度的缓解。
[0127]
aca化合物及相关制剂上调肝组织中cyp7a1的表达量、下调g6pase的表达量
[0128]
通过检测两个处理组小鼠肝组织中的胆酸合成限速酶胆固醇7α-羟化酶(cyp7a1)
receptors:targeting tgr5 and farnesoid-x-receptor in lipid and glucose disorders.trends pharmacol sci.2009；30:570-80.
[0143]
10.zheng xj,chen tl,jiang rq,zhao ah,wu q,kuang jl,et al.hyocholic acid species improve glucose homeostasis through a distinct tgr5 and fxr signaling mechanism.cell metab.2021；33:791- .
[0144]
11.sun ll,xie c,wang g,wu y,wu q,wang xm,et al.gut microbiota and intestinal fxr mediate the clinical benefits of metformin.nat med.2018；24:1919- .
[0145]
12.tahrani aa,barnett ah,bailey cj.pharmacology and therapeutic implications of current drugs for type 2diabetes mellitus.nat rev endocrinol.2016；12:566-92.
[0146]
13.梁莉,乔华,王婷,常威.盐酸二甲双胍的不良反应.中国药事.2007；21:652-4.
[0147]
14.文依娜.他汀类药物的副作用.心血管病防治知识(科普版).2014；10:24-6.
[0148]
15.李静,吕迁洲.服"他汀"4类人"肌肉"副作用大.大众医学.2017；000:68.
[0149]
16.wu jy,wang k,wang xm,pang yl,jiang ct.the role of the gut microbiome and its metabolites in metabolic diseases.protein cell.2020,10.1007/s13238-020-00814-7.
[0150]
17.wahlstrom a,sayin si,marschall hu,backhed f.intestinal crosstalk between bile acids and microbiota and its impact on host metabolism.cell metab.2016；24:41-50.
[0151]
18.wang k,liao m,zhou n,bao l,ma k,zheng z,et al.parabacteroides distasonis alleviates obesity and metabolic dysfunctions via production of succinate and secondary bile acids.cell reports.2019；26:222-35.e5.
[0152]
19.kliewer sa,mangelsdorf dj.bile acids as hormones:the fxr-fgf15/19pathway.digest dis.2015；33:327-31.
[0153]
20.fiorucci s,mencarelli a,palladino g,cipriani s.bile-acid-activated receptors:targeting tgr5 and farnesoid-x-receptor in lipid and glucose disorders.trends pharmacol sci.2009；30:570-80.
[0154]
21.zheng xj,chen tl,jiang rq,zhao ah,wu q,kuang jl,et al.hyocholic acid species improve glucose homeostasis through a distinct tgr5 and fxr signaling mechanism.cell metab.2021；33:791- .
[0155]
22.sun ll,xie c,wang g,wu y,wu q,wang xm,et al.gut microbiota and intestinal fxr mediate the clinical benefits of metformin.nat med.2018；24:1919- .