核壳型磁性荧光微球及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物医疗以及诊断检测领域，具体地涉及一种核壳型磁性荧光微球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.磁性微球的制备和应用是目前比较前沿的新兴交叉学科，涵盖了材料、高分子、有机、分析、生物、医药工程等众多领域。随着相关技术的高速发展，对纳米微球材料的性能和制备技术也提出了越来越高的要求，诸如对纳微米粒子大小的精确性、粒径分布的均一性、形态、孔道结构的精确调控以及材料的组成、表面功能化的控制等。
3.由于纳米微球的纳米孔道结构，使得微球材料具有极高的比表面积以及吸附性能；相关的技术中，往往通过在微球表面键合特殊功能的基团以赋予微球新的功能和效果。比如，磁性纳米复合微球就是一种新型磁性材料，一般通过将磁性无机粒子(如四氧化三铁)与有机微球结合的方式实现制备。由于磁性纳米复合微球不仅具有普通微球的众多特性，同时还具有磁响应性，所以其可以广泛用于体外检测和诊断、生物医学、细胞学和分离工程等。
4.荧光磁性纳米复合微球是在磁性复合微球的基础之上进一步发展优化的产品，其直径在一般在几纳米至几十微米之间，微球表面或内部负载有荧光物质，在受到一定的能量激发时能够发出荧光。现有的荧光磁性纳米复合微球制备方法中，通常是将特定荧光染料物质按不同比例，引入到某种基质中，以形成能在特定激发波长下产生两种或多种强度不同的荧光信号。
5.然而，现有技术中，当融合两种以上荧光染料物质且它们均被激发时，在检测荧光信号的过程中会存在互相干扰的情况，即存在背景噪声，进而对精确定量研究以及后续的精准分群造成困难；另一方面，由于荧光染料具有容易淬灭的物质特性，其存在不稳定性，因此使得荧光磁性纳米复合微球应用性能的稳定性也难以得到保障。
6.有鉴于此，本领域仍需要一种新型结构的磁性荧光微球以解决上述问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种具有新型结构的磁性荧光微球，其不仅能够解决当现有技术中的荧光微球融合两种以上荧光染料物质且均被激发时，在检测荧光信号的过程中会存在互相干扰的问题，也能够解决现有技术的磁性纳米复合微球因荧光染料易淬灭的物质特性而导致的应用性能不稳定性。
8.本发明人通过将荧光量子点和有机荧光染料同时偶联在磁性纳米颗粒表面，然后密封于核壳型结构中，发现这样得到的核壳型磁性荧光微球不仅解决了现有技术中存在的上述问题，而且由于封闭式的核壳结构实现了磁性荧光微球更好的结构稳定性。由此，完成了本发明。
9.因此，在第一方面，提供了一种核壳型磁性纳米微球，其包括：
[0010]-核微球；
[0011]-包覆所述核微球表面的磁性纳米颗粒；以及
[0012]-包覆所述核微球和所述磁性纳米颗粒的壳层；
[0013]
其中，所述磁性纳米颗粒上结合有至少一种的荧光量子点和至少一种荧光染料。
[0014]
在第二方面，本发明提供了制备第一方面所述的核壳型磁性纳米微球的方法，其包括以下步骤：
[0015]
(1)制备表面修饰有第一功能基团的荧光量子点；
[0016]
(2)使磁性纳米颗粒表面包覆有聚合物层，所述聚合物层的表面修饰有第二功能基团，形成聚合物磁性微粒；
[0017]
(3)使所述荧光量子点与所述聚合物磁性微粒结合，形成磁性量子点微粒；
[0018]
(4)使所述磁性量子点微粒包覆核微球的表面，形成磁性量子点微球；
[0019]
(5)在所述述磁性量子点微球的存在下，使荧光染料与所述磁性量子点微粒共价偶联，得到磁性纳米微球；
[0020]
(6)用壳层包覆所述磁性纳米微球，制得核壳型磁性纳米微球；
[0021]
其中，所述步骤(1)和所述步骤(2)顺序不分先后。
[0022]
在第三方面，提供了第一方面所述的核壳型磁性纳米微球或第二方面所述的方法制备的核壳型磁性纳米微球用于体外检测和诊断的用途。
[0023]
综上，本发明提供的新型核壳结构的磁性纳米微球，该结构将表面同时修饰有至少一种荧光量子点和至少一种荧光染料的磁性纳米颗粒密封于核壳之间，不仅避免了现有技术中同时融合两种以上荧光染料物质时难以避免的信号干扰问题，克服了现有技术中荧光磁性纳米复合微球因荧光染料的易淬灭性导致的荧光信号的不稳定问题，确保了应用磁性纳米荧光微球进行定量检测的精确度，同时也增强了磁性纳米微球在应用期间的结构稳定性，使得本发明的核壳型磁性纳米微球具有广泛应用于体外检测和诊断、细胞分离等领域的潜力。
附图说明
[0024]
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0025]
图1示出了根据本发明的一个实施方案制备的示例性磁性纳米微球(量子点为cdse/cds，荧光染料为apc-cy7)的电镜照片。
[0026]
图2示出了根据本发明的一个实施方案制备的示例性磁性纳米微球(量子点为cdse/cds，荧光染料为apc和apc-cy7)在荧光光谱仪上的荧光信号。
[0027]
图3示出了根据现有技术的磁性微球用两种不同的荧光染料apc和apc-cy7标记后在流式细胞仪上的检测结果。
[0028]
图4示出了根据本发明的实施例1的步骤制备的示例性磁性纳米微球(量子点为cdse/cds，荧光染料为apc-cy7)在流式细胞仪上的检测结果。
具体实施方式
[0029]
在下文中，将结合附图对本发明进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本发明进行说明，而无意于对本发明的范围进行限制，本发明的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本发明的精神和主旨的情况下，可以对本发明的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0030]
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
[0031]
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
[0032]
在整个申请中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由
……
组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由
……
组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由
……
组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由
……
组成”。
[0033]
在说明书全文中，术语“第一”、“第二”、“第三”和“第四”仅仅用于区分，而并非用于强调顺序、主次关系等。
[0034]
在说明书全文中，术语“至少一种”可以是两种、三种、四种等。
[0035]
为了更好地理解本教导并且不限制本教导的范围，除非另外指出，否则在说明书和权利要求中使用的表示数量、百分比或比例的所有数字以及其他数值在所有情况下都应理解为由术语“约”进行修饰。因此，除非相反地指出，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数值参数为近似值，其可以根据寻求获得的所需性质而变化。至少，每个数值参数应该至少根据所报告的有效数字的数值并通过应用普通的舍入技术来进行解释。
[0036]
如上所述，亟需一种新型结构的磁性荧光微粒，其不仅能够解决现有技术的磁性荧光微球中存在的前述问题，而且兼具检测精度和成本效益，具有大规模应用的潜力。本发明人通过将荧光量子点和有机荧光染料同时偶联在磁性纳米颗粒表面，然后密封于核壳型结构中，得到的核壳型磁性荧光微粒，一方面，由于荧光量子点和有机荧光染料的同时使用降低了多种荧光物质之间的荧光干扰，提高了检测精度，另一方面，由于采用了封闭式的核壳结构，本发明的磁性荧光微球在其应用期间具有更好的结构稳定性。由此，完成了本发明。
[0037]
在第一方面，提供了一种核壳型磁性纳米微球，其包括：
[0038]-核微球；
[0039]-包覆所述核微球表面的磁性纳米颗粒；以及
[0040]-包覆所述核微球和所述磁性纳米颗粒的壳层；
[0041]
其中，所述磁性纳米颗粒上结合有至少一种的荧光量子点和至少一种荧光染料。
[0042]
在一个具体的实施方案中，所述磁性纳米颗粒是超顺磁、顺磁或铁磁性的金属、金属合金或金属氧化物的纳米颗粒，例如选自γ-fe2o3、cofe2o3、mnfe2o3、nife2o3、nicofe、feco或nife，但不限于此。
[0043]
在又一个具体的实施方案中，所述荧光量子点选自纳米级量子点，例如cdse、cdte、inas、inp、cdse/zns、cdse/znse、cdte/zns、cdte/znse、cdhgte/zns、或hgte/hgcds、或其任意组合，但不限于此。
[0044]
在又一个优选的实施方案中，所述荧光量子点为cdse/zns、cdse、cdse/znse，但不限于此。
[0045]
在进一步具体的实施方案中，所述荧光量子点是粒径为2nm至10nm的球形或类球形颗粒。
[0046]
在更进一步具体的实施方案中，所述荧光量子点表面修饰有第一功能基团，例如为氨基、羧基、巯基、或羟基，以结合所述磁性纳米颗粒。
[0047]
在又一个具体的实施方案中，所述磁性纳米颗粒的粒径为10nm至1μm。在一个优选的实施方案中，所述磁性纳米颗粒的粒径为50nm至300nm。不希望被理论束缚，
[0048]
在本发明中，荧光量子点的粒径优选地小于磁性纳米颗粒的粒径，使得荧光量子点能够与磁性纳米颗粒结合并包覆其表面。
[0049]
在又一个具体的实施方案中，所述磁性纳米颗粒表面包被有聚合物层。在一个优选的实施方案中，所述聚合物层可以是聚苯胺层。
[0050]
在又一个具体的实施方案中，所述聚合物层的表面修饰有第二功能基团。在一个优选的实施方案中，所述第二功能基团选自氨基、羧基、巯基、或羟基，但不限于此。
[0051]
在本发明的上下文中，所述荧光量子点与所述磁性纳米颗粒的结合可以通过所述荧光量子点表面的第一功能基团和所述磁性纳米颗粒的聚合物层表面的第二功能基团之间的共价键合而实现。例如，荧光量子点上的第一功能基团是羧基，例如由巯基乙酸提供，并经由edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)活化的羧基，而第二功能基团是氨基，例如由磺酰氮宾基团提供的氨基，但不限于此。
[0052]
在又一个具体的实施方案中，所述核微球选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸共聚物、聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物、聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述核微球是聚苯乙烯。
[0053]
在进一步优选的实施方案中，所述核微球表面修饰有第三功能基团，其选自氨基、羧基、巯基、或羟基，但不限于此，以使磁性纳米颗粒能够包覆在其表面上。
[0054]
在又一个具体的实施方案中，所述荧光染料上具有可活化偶联基团以结合所述磁性纳米颗粒，例如，所述可活化偶联基团选自羧基、氨基、苯磺基、巯基、羟基和/或环氧基，优选为羧基、氨基和/或巯基。
[0055]
在本发明的上下文中，所述荧光染料与所述磁性纳米颗粒的结合可以通过所述荧光染料上的可活化偶联基团与所述磁性纳米颗粒的聚合物层表面的第二功能基团之间的
共价键合而实现。
[0056]
不希望被理论束缚，荧光染料的选择在本发明的上下文中并无特别限定，本领域技术人员可以根据实际使用的需要进行选择，例如可以参考使用chandler等人在美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号中所述的那些，其全文通过引用并入本文。又例如，荧光染料可以是藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、罗丹明、四甲基罗丹明、香豆素、氟硼二吡咯、吲哚菁绿、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、cy7.5、alexa fluor 594、alexa fluor 488、alexa fluor 532、pe-cy5、pe-cy5.5或pe-cy7，优选为藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素，但不限于此。
[0057]
同样，不希望被理论束缚，量子点的荧光发射光谱的中心波长与荧光染料的荧光发射光谱的中心波长可以重合，也可以具有可分辨的差值，例如大于或等于50nm的差值。
[0058]
在又一个具体的实施方案中，所述壳层由选自以下的聚合物制成：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸共聚物、聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物、聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物。
[0059]
在一个优选的实施方案中，所述壳层由聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物或聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物制成。不希望被理论束缚，壳层可以与核微球(即，核)可以采用相同的聚合物材料，也可以是不同的聚合物材料。
[0060]
在进一步优选的实施方案中，所述壳层的内表面修饰有第四功能基团，其选自氨基、羧基、巯基、或羟基，以结合所述磁性纳米颗粒、所述量子点、所述荧光染料中的一种或多种。
[0061]
在又一个具体的实施方案中，所述核壳型磁性纳米微球是粒径为10nm至10μm的球形、方形或椭圆形颗粒。
[0062]
在第二方面，本发明提供了制备第一方面所述的核壳型磁性纳米微球的方法，其包括以下步骤：
[0063]
(1)制备表面修饰有第一功能基团的荧光量子点；
[0064]
(2)使磁性纳米颗粒表面包覆有聚合物层，形成聚合物磁性微粒，其中，所述聚合物层的表面修饰有第二功能基团；
[0065]
(3)使所述荧光量子点与所述聚合物磁性微粒结合，形成磁性量子点微粒；
[0066]
(4)使所述磁性量子点微粒包覆核微球的表面，形成磁性量子点微球；
[0067]
(5)在所述述磁性量子点微球的存在下，使荧光染料与所述磁性量子点微粒共价偶联，得到磁性纳米微球；
[0068]
(6)用壳层包覆所述磁性纳米微球，制得核壳型磁性纳米微球；
[0069]
其中，所述步骤(1)和所述步骤(2)顺序不分先后。
[0070]
在步骤(1)中，所述荧光量子点可以选自粒径为2nm至10nm的纳米级量子点，例如cdse、cdte、inas、inp、cdse/zns、cdse/znse、cdte/zns、cdte/znse、cdhgte/zns、或hgte/hgcds、或其任意组合，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述荧光量子点为cdse/zns、cdse、cdse/znse，但不限于此。在本发明中，对于在所述荧光量子点的表面修饰第一功能基团如氨基、羧基、巯基或羟基而采用的方法和试剂并无限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择，例如使用巯基乙酸在所述荧光量子点的表面引入羟基。
[0071]
在步骤(2)中，所述磁性纳米颗粒可以是粒径为10nm至1μm，优选为50nm至300nm的
超顺磁、顺磁或铁磁性的金属、金属合金或金属氧化物的纳米颗粒，例如选自γ-fe2o3、cofe2o3、mnfe2o3、nife2o3、nicofe、feco或nife，但不限于此。所述聚合物层可以是聚苯胺层，即形成聚苯胺磁性微粒。在本发明中，对于使聚合物层包覆磁性纳米颗粒的方法并无限制，例如通过悬浮法，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。同样地，在聚苯胺上引入第二功能基团如氨基的方法和试剂对于本发明而言也并无限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行选择。
[0072]
在步骤(3)中，使所述荧光量子点与所述聚合物磁性微粒的结合是通过使所述荧光量子点的第一功能基团与所述聚合物磁性微粒表面的第二功能基团共价偶联实现的。
[0073]
在步骤(4)中，使所述磁性量子点微粒包覆核微球的表面可以经由核微球表面上的第三功能基团如氨基、羧基、巯基或羟基与所述聚合物磁性微粒表面的第二功能基团之间的共价偶联实现的。第三功能基团与第一功能基团可以是相同或不同的，只要能够与聚合物磁性微粒表面的第二功能基团发生共价偶联即可。
[0074]
所述核微球可以选自聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸共聚物、聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物、聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物，但不限于此。在一个优选的实施方案中，所述核微球是聚苯乙烯。
[0075]
在步骤(5)中，使荧光染料与所述聚合物磁性微粒共价偶联可以通过加热或光照使荧光染料的可活化偶联基团活化，并与所述磁性量子点微粒共价偶联，得到磁性纳米微球。更进一步，所述荧光染料与所述聚合物磁性微粒的结合是通过所述荧光染料上的可活化偶联基团与所述磁性量子点微粒表面(聚合物层表面)的第二功能基团之间的共价键合而实现的。
[0076]
荧光染料的选择在本发明的上下文中并无特别限定，本领域技术人员可以根据实际使用的需要进行选择，可以参考例如chandler等人在美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号中所述的那些，其全文通过引用并入本文。在具体的实例中，荧光染料可以是藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物、罗丹明、四甲基罗丹明、香豆素、氟硼二吡咯、吲哚菁绿、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、cy7.5、alexa fluor 594、alexa fluor 488、alexa fluor 532、pe-cy5、pe-cy5.5或pe-cy7，优选为藻红蛋白、别藻蓝蛋白、异硫氧酸荧光素，但不限于此。
[0077]
所述可活化偶联基团可以选自羧基、氨基、苯磺基、巯基、羟基和/或环氧基，但不限于此。
[0078]
在步骤(6)中，所述壳层可以由选自一下的聚合物制成：聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚苯乙烯-聚丙烯酸共聚物、聚苯乙烯-聚甲基丙烯酸共聚物、聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物、聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物。在一个优选的实施方案中，所述壳层可以选自聚苯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物或聚氯乙烯与二乙烯基苯的交联共聚物。
[0079]
所述壳层的内表面修饰有第四功能基团，例如氨基、羧基、巯基、或羟基，以结合所述磁性纳米颗粒、所述量子点、所述荧光染料中的一种或多种。
[0080]
在本发明中，对于用壳层包覆所述磁性纳米微球的方法并无限制，本领域技术人员可以根据实际需要进行合理的选择。本发明的上述方法制得的核壳型磁性纳米微球可以是粒径为10nm至10μm的球形、方形或椭圆形颗粒。
[0081]
在第三方面，提供了第一方面所述的核壳型磁性纳米微球或第二方面所述的方法
制备的核壳型磁性纳米微球用于体外检测和诊断的用途。
[0082]
本领域技术人员熟知，磁性纳米微球是体外检测和诊断中常用的固相载体，能够起到识别、捕获、控制与运输目标待测分子的载体作用。
[0083]
下文中，结合示例性的实施方案会更详细地描述本发明。然而，本文公开的示例性的实施方案仅出于示例的目的，而不应该被认为旨在解释本发明的范围。
[0084]
实施例
[0085]
提供以下实施例以更好地示例要求保护的发明，并且不能以任何方式解释为限制本发明的范围。下述所有具体化合物、材料和方法全部或部分地落入本发明的范围内。这些具体的化合物、材料和方法并不旨在限制本发明，而仅用于示例落入本发明范围内的具体实施方案。本领域技术人员可以对其中所体现的本发明进行任何修改和变化。这些修改和变化也被认为在本发明的范围内。
[0086]
如无特殊说明，其中采用的试验方法均为常规方法，并且如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规化试剂商店购买所得。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。
[0087]
实施例1：核壳型fe3o4/cdse/cds磁性纳米微球的制备在本实施例中，使用fe3o4磁性纳米颗粒，硒化镉外包硫化锌(cdse/cds)为荧光量子点制备核壳型磁性纳米微球，具体步骤如下：
[0088]
硒化镉外包硫化锌(cdse/cds)为荧光量子点的制备：将一定量的cdo加入到油酸和液体石蜡中放入三颈瓶加热搅拌，在150℃时候cdo溶解生成均匀淡黄色cd溶液a。将se粉放入另一个盛有液体石蜡的三口烧瓶中快速搅拌，加入到220℃，溶液先变成橘色然后变成红色se溶液b。将cd溶液a轻轻地注射到se溶液b中，同事快速搅拌，形成cdse溶液，并将温度保持在220℃。同时称取一定量s粉，nahb4固体溶于30ml的无水乙醇加到圆底烧瓶中，通入n2加热搅拌。大约十分钟后将生成的h2s气体通入上述形成cdse溶液中，继续加热搅拌半小时后即生成cdse/cds量子点。
[0089]
取一定量上述10mg量子点，加入30ml正己烷，至于磁力搅拌器上搅拌，使cdse/cds全部溶解。将溶液用告诉离心机进行离心分离，留取上清液。取过量的巯基乙酸加入青液中，继续搅拌30分钟。静置得到红色乙酸稳定的cdse/cds沉淀，去除上清，并用正己烷洗涤2～3次。将沉淀风干后溶于乙醇溶液，即得到水溶性的红色透明cdse/cds溶液。控制量子点粒径范围为1nm至20nm。
[0090]
用化学共沉淀法制备fe3o4纳米粒子：取氯化铁0.09摩尔，feso4·
7h2o 0.06摩尔，分别溶解在80毫升蒸馏水中，倒入通高纯氩气的三口瓶中，在80℃下剧烈搅拌，随后驻地加入新配制的naoh溶液，将ph调至11，此时溶液呈现黑色。静置30分钟后，加入2g油酸，继续反应3个小时，形成黑色沉淀物。将黑色沉淀物倒入烧杯中，借助磁铁分离磁性颗粒，用无水乙醇和蒸馏水洗涤数次，得到油酸四氧化三铁纳米粒子，产物在烘箱中烘干备用。
[0091]
用悬浮方法使聚苯胺包裹的油酸四氧化三铁制备聚苯胺磁性微粒：称取0.93g制备好的油酸四氧化三铁，0.52g的十二烷基苯磺酸钠，量取0.6g吐温20和0.15g司盘(span)s-80，于30ml蒸馏水中搅拌均匀倒入250ml三口烧瓶中，加入135ml水，使其充分溶解均匀。添加15g苯胺，继续搅拌1小时，然后超声波处理10min，得到稳定的细乳液。通入氩气20分钟以去除细乳液中的氧气，加入15ml浓度0.01mol/l的十二磺基本磺酸，剧烈搅拌。随后逐滴
加入20g水，引发苯胺聚合，6小时后聚合物在磁铁的帮助下，用蒸馏水和乙醇反复洗涤，在室温下自然风干，得到聚苯胺磁性微粒。
[0092]
使cdse/cds荧光量子点与聚苯胺磁性微粒结合：取足量的edc活化过的巯基乙酸修饰过的cdse/cds溶液放入称量瓶中，称取少量的前步骤中制备的聚苯胺磁性微粒，先超声10分钟，然后放到恒温摇床上摇两个小时，少量量子点有所沉淀，当磁铁靠近时量子点跟随移动，则说明量子点已经与聚苯胺磁性微粒偶联。用磁铁帮助进行分层，去除上层溶液，瓶底吸附磁铁的量子点用少量蒸馏水洗涤一次，再次吸干。加入适量的去离子水保存备用。
[0093]
使磁性量子点微粒包覆聚苯乙烯核微球的表面：将经官能羧基化表面改性的10.2克聚苯乙烯核微球悬浮在总体积100毫升的甲醇中。将12.4毫升制备好磁性量子点用1m hcl清洗两次，再用甲醇清洗两次，最后悬浮于100毫升甲醇中。混合核微球和磁性量子点溶液，反应3小时，得到磁性量子点微球。加入去离子水备用。
[0094]
用荧光染料染色的磁性量子点微球：使用chandler等人在美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号中所述的步骤，用活化的荧光染料apc-cy7对磁性量子点微球进行浸渍，所述专利文献都全文参考结合入本文中。然后，将染色的磁性量子点微球在甲醇中的分散液置于5毫升的锥形烧瓶中，真空浓缩。这些磁性量子点微球在氮气气氛下，在110℃的油浴中加热13小时。所述微球体用四氢呋喃清洗三次，用甲醇清洗一次，用去离子水清洗一次，得到磁性纳米微球。用去离子水悬浮备用。
[0095]
用壳层包覆所述磁性纳米微球：取磁性纳米微球的悬浮液375ml，倒入三颈圆底烧瓶中。制备12.6克馏出苯乙烯、0.768克馏出二乙烯苯、0.173克过氧化苯甲酰和1.47克丙烯酸的混合物倒入三颈圆底烧瓶中。加入至60℃，反应24小时。用甲醇、四氢呋喃清洗涂层微球，用甲醇反复清洗三次，去离子水清洗一次。最后在去离子水中再次形成悬浮液。
[0096]
图1示出了根据上述方法制备得到的本发明的示例性磁性纳米微球的电镜照片。
[0097]
实施例2:包括量子点和两种荧光染料分子的磁性纳米微球的制备
[0098]
除了在用荧光染料染色的磁性量子点微球的步骤中使用包含两种不同的荧光染料apc和apc-cy7的溶液对磁性量子点微球进行浸渍之外，其他步骤与实施例1相同。图2示出了由此制备的磁性纳米微球在荧光光谱仪上的荧光信号，其中，ps为没有任何荧光物质的对照球，ps-1、ps-2和ps-3均为本实施例中制备的磁性纳米微球上荧光物质得到的荧光曲线，其中ps-3是cdse/cds量子点的荧光曲线。
[0099]
实施例3：荧光检测的精准分群
[0100]
使用chandler等人在美国专利第6,514,295号、第6,599,331号和第6,632,526号中所述的步骤用荧光染料apc和apc-cy7标记磁性微球，分别编码为p1-p5，其中荧光染料的浓度见下表1：
[0101]
表1：由不同浓度的荧光染料apc和apc-cy7标记的磁性微球
[0102]
染料p1p2p3p4p5apc1mg/ml2mg/ml2mg/ml2mg/ml3mg/mlapc-cy73mg/ml3mg/ml2mg/ml1mg/ml3mg/ml
[0103]
在流式细胞仪上对这五种磁性微球进行检测，结果如图3所示。可以看出，尽管这5个编码微球可以分群，但分群有交叠。
[0104]
使用实施例1方法，用不同浓度的量子点cdse/cds和荧光染料apc-cy7进行磁性纳
米微球的制备，同样分别编码为p1-p5，其中量子点和荧光染料的浓度见下表2：
[0105]
表2：由不同浓度的荧光染料和量子点标记的磁性纳米微球
[0106]
染料/量子点p1p2p3p4p5cdse/cds1mg2mg3mg3mg3mgapc-cy72mg/ml2mg/ml2mg/ml1mg/ml3mg/ml
[0107]
在流式细胞仪上对这五种磁性微球进行检测，结果如图4所示。可以看出，按照本发明方法制备的磁性纳米微球在流式细胞仪上的检测结果分群清晰，无交叠。由此证实了本发明的磁性纳米微球能够解决现有技术中同时融合两种以上荧光染料物质时的信号干扰问题。
[0108]
实施例4:磁性纳米微球的荧光信号稳定性
[0109]
用实施例3中制备的荧光染料apc和apc-cy7标记的磁性微球(记为p5a)和实施例1中制备的本发明的磁性纳米微球p5b，分别进行光稳定性和/或热稳定性实验，条件如下：
[0110]
条件1：将微球置于室温下，避光放置三天。
[0111]
条件2：将微球置于室温下，50w日光灯下3天，距光源直线距离30cm。
[0112]
条件3：将微球置于60℃，避光放置三天。
[0113]
条件4：将微球置于60℃，50w日光灯下3天，距光源直线距离30cm。
[0114]
将按照上述条件放置的微球分别在荧光光谱仪上样检测，结果如下表3所示。
[0115]
表3：现有技术的磁性微球p5a和本发明的磁性纳米微球p5b经条件1-4后的荧光强度
[0116][0117]
由上表可知，本发明包含量子点的磁性纳米微球的光稳定性和热稳定性均非常好，而荧光染料热稳定性好，光稳定性较差，在同时加热且光照的情况下，荧光染料的荧光强度下降更快。