一种基于实时荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物及其应用、试剂盒与流程

一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物及其应用、试剂盒
技术领域
1.本技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物及其应用、试剂盒。


背景技术：

2.幽门螺杆菌(helicobacter pylori，hp)感染与上消化道疾病有关，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤等疾病密切相关，部分患者消化道不适症状与幽门螺杆菌相关。
3.目前认为幽门螺杆菌的致病机制包括运动、定植和毒素引起的粘膜损伤，宿主免疫应答介导的粘膜损伤，菌体感染后引发的胃泌素和生长抑制素调节失衡所致胃酸分泌异常等。参与致病的因子可分两类定植因子和毒力因子，其中，定植因子是幽门螺杆菌感染的首要条件。幽门螺杆菌本身的动力、粘附特性以及所含有的多种毒素，既有利于幽门螺杆菌的定植，也有助于在高酸环境下幽门螺杆菌的存活和致病。
4.目前认为幽门螺杆菌相关致病因子主要包括尿素酶(ure)、鞭毛蛋白、细胞空泡毒素 (vaca)、细胞毒素相关蛋白(caga)、脂多糖(lps)和lewis抗原、热休克蛋白(hsp)、细胞增殖抑制蛋白(pip)、细菌粘附素以及能导致炎症反应的物质。它们从不同方面起作用，使幽门螺杆菌附着在胃粘膜，并深入至粘液层，破坏上皮细胞。
5.尿素酶对幽门螺杆菌在胃肠道酸性环境的存活和定植至关重要。在胃内强酸性环境下，尿素酶在细菌周围形成“氨云”，有效抵抗胃酸对细菌的破坏是重要的毒力因子之一。ure基因有urec、ured、urea、ureb、urei、uree、uref、ureg、ureh等共计9个亚基，其中urea 和ureb为结构基因，其它亚基为辅助基因。ure基因在幽门螺杆菌中的含量丰富，约占可溶性蛋白总量的6％，ure基因的活性部分主要暴露于细菌表面，并在细菌表面广泛表达并高度保守，可作为幽门螺杆菌鉴定的靶标基因。
6.实时荧光定量pcr技术是1996年由美国applied biosystems公司推出的。经过二十年的发展，该技术已经被广泛应用于临床疾病诊断、各种病原微生物检测、动物疾病检测、食源微生物、食品过敏源、转基因研究等食品安全操作等各个领域。该技术具有灵敏度高、特异性强、操作方便、可在早期检测发现病原体感染等优点。


技术实现要素：

7.本技术提供一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物、试剂盒和方法。本技术根据实时荧光定量pcr技术的原理，针对幽门螺杆菌的特异性基因ure设计特异性引物和探针检测靶标基因，并针对人源rnp基因设计特异性引物和探针作为内参基因；在同一反应体系中，通过靶标基因的扩增可有效检测幽门螺杆菌，通过内参基因的扩增，可有效质控待测样本的处理过程。进一步的，结合试剂盒的阳性对照、临界阳性对照及阴性对照的检测结果，质控诊断试剂的检测性能，使得检测结果科学、合理、可靠。
8.第一方面，本技术提供的一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物，采用如下技术方案：
9.一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的引物和探针组合物，包括用于检测幽门螺杆菌的urea靶标基因的引物和探针、人源rnp内参基因引物和探针；
10.所述urea靶标基因的引物及探针的核苷酸序列为：
11.seq id no.1：5'-tggaagaagcgagagctggtaa-3'
12.seq id no.2：5'-atggatcatgcttgccacac-3'
13.seq id no.3：5'-gctgaattgatgcaagaagggcgc-3'
14.所述seq id no.3的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
15.所述人源rnp内参基因的引物及探针的核苷酸序列为：
16.seq id no.4：5'-tttgcagatttggacctgc-3'
17.seq id no.5：5'-ggtgagcggctgtctccaca-3'
18.seq id no.6：5'-ggttctgacctgaaggctctgcgcg-3'
19.所述seq id no.6的5'端标记荧光报告基团、3'端标记荧光淬灭基团；
20.所述seq id no.3的荧光报告基团和所述seq id no.6的荧光报告基团不同。
21.可选的，所述seq id no.3的荧光报告基团为fam、荧光淬灭基团为bhq1。
22.可选的，所述seq id no.6的荧光报告基团hex、荧光淬灭基团为bhq1。
23.第二方面，本技术提供一种上述引物和探针组合物在制备用于检测幽门螺杆菌的试剂或试剂盒的应用。
24.第三方面，本技术提供的一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的试剂盒，采用如下技术方案：
25.一种基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌的试剂盒包括主要由上述引物和探针组合物、dntps和缓冲液组成的反应液a，主要由dna聚合酶组成的反应液b，阳性对照，临界阳性对照和阴性对照。
26.可选的，所述缓冲液为10
×
buffer。
27.可选的，所述反应液a中，seq id no.1、seq id no.2、seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6的浓度分别为0.5μm；所述dntps的浓度为0.8mm；所述缓冲液的浓度为1
×
。
28.可选的，所述反应液b中，dna聚合酶的浓度为2.5u/反应。
29.可选的，所述阳性对照主要由包含urea靶标基因的puc57载体质粒和包含人源rnp内参基因puc57载体质粒组成；所述阳性对照中，所述包含urea靶标基因的puc57载体质粒的浓度为1
×
103copies/μl，所述包含人源rnp内参基因puc57载体质粒的浓度为1
×
10
3 copies/μl。
30.可选的，所述临界阳性对照主要由包含urea靶标基因的puc57载体质粒和包含人源 rnp内参基因puc57载体质粒组成；所述临界阳性对照中，所述包含urea靶标基因的puc57 载体质粒的的浓度为50copies/μl，所述包含人源rnp内参基因puc57载体质粒的浓度为50 copies/μl。
31.可选的，所述阴性对照主要由不包含任何基因的puc57空载体质粒组成；所述阴性对照中，所述不包含任何基因的puc57空载体质粒的浓度为1
×
103copies/μl。
32.可选的，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
33.(1)提取待测样本dna；
34.(2)单管多重荧光定量pcr反应：
35.使用试剂盒进行单管多重荧光定量pcr反应，分别得到待测样本的实时荧光定量pcr 扩增曲线、阳性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线、临界阳性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线、阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线；
36.(3)结合待测样本、阳性对照、临界阳性对照、阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线判断幽门螺杆菌的感染情况。
37.可选的，所述待测样本包括但不限于石蜡包埋组织、粪便组织和唾液。
38.可选的，所述实时荧光定量pcr反应的扩增程序为：94℃预变性3min，进行1个循环； 94℃变性15s，58℃退火与延伸40s，进行40个循环。
39.可选的，在所述退火与延伸时收集靶标基因荧光通道和内参基因荧光通道的荧光信号，分别得到待测样本、阳性对照、临界阳性对照和阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线。
40.可选的，所述幽门螺杆菌的感染情况的判断标准如下：
41.①
阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增，有典型s型曲线，且ct值应在18.00～24.00之间；
42.②
临界阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增，有典型s 型曲线，且ct值小于35.00；
43.③
阴性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应无明显扩增；
44.④
待测样本的内参基因荧光通道上均应有明显扩增，且ct值≤35.00，否则该待测样本的检测结果不成立；
45.⑤
在满足
①
～
④
的前提下，若待测样本的靶标基因荧光通道上的ct值≤35.00，则为阳性；若待测样本的靶标基因荧光通道上的ct值＞35或无扩增信号，则为阴性。
46.综上所述，本技术具有以下有益效果：
47.第一、由于本技术采用urea基因作为幽门螺杆菌的靶标检测基因，由于urea基因在幽门螺杆菌中含量丰富且高度保守，使用该基因作为靶标基因能更有利于检出幽门螺杆菌且具有较高的特异性。
48.第二、本技术中优选采用人源rnp基因作为内参，并结合阳性对照、临界阳性对照及阴性对照等外对照，由于可有效质控样本核酸提取过程及检测试剂性能，获得了非常好的临床应用效果。
49.第三、本技术的试剂盒，通过对检测结果科学的判读标准可明确区分阳性样本、阴性样本及未成功提取核酸的样本，因此可获得科学、合理、可靠的检测结果。
附图说明
50.图1是本技术实施例5中5例阳性样本的实时荧光定量pcr扩增曲线；
51.图2是本技术实施例5中5例阴性样本的实时荧光定量pcr扩增曲线；
52.图3是本技术实施例5中阳性对照和临界阳性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线；
53.图4是本技术实施例5中阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线。
具体实施方式
54.以下结合附图和实施例对本技术作进一步详细说明。
55.实施例1：引物和探针的设计及合成
56.根据genebank dna序列数据库中已知的幽门螺杆菌urea基因序列和人rnp基因序列，设计引物及探针。
57.其中，urea基因序列seq id no.1为：
58.atgaaactcaccccaaaagagttagataagttgatgctccactacgctggagaat tagctaggaaacgcaaagaaaaaggcattaagcttaactatgtagaagcagtagcttt gattagtgcccatattatggaagaagcgagagctggtaaaaagactgcggctgaattg atgcaagaagggcgcactcttttaaaaccggatgatgtgatggatggtgtggcaagca tgatccatgaagtgggtattgaagcgatgtttcctgatgggaccaaactcgtaaccgt gcatacccctattgaggctaatggtaaattagttcctggtgagttgttcttaaaaaatg aagacatcactatcaacgaaggcaaaaaagccgttagcgtgaaagttaaaaacgtgg gcgacagacccgttcaaatcggttcacacttccatttctttgaagtgaatagatgccta gactttgacagagaaaaaactttcggtaaacgcttagacattgcgagcgggacagcgg taaggtttgagcctggcgaagaaaaatccgtagaattgattgacattggcggtaacag aagaatctttggatttaacgcgttggttgataggcaagcagacaacgaaagcaaaaaa atcgctttacacagagctaaagagcgtggttttcatggcgctaaaagcgatgacaact atgtaaaaacaattaaggagtaa
59.人rnp基因序列seq id no.2：
60.atgggacttcagcatggcggtgtttgcagatttggacctgcgagcgggttctgacc tgaaggctctgcgcggacttgtggagacagccgctcaccttggctattcagttgttgct atcaatcatatcgttgactttaaggaaaagaaacaggaaattgaaaaaccagtagctg tttctgaactcttcacaactttgccaattgtacagggaaaatcaagaccaattaaaatt ttaactagattaacaattattgtctcggatccatctcactgcaatgttttgagagcaac ttcttcaagggcccggctctatgatgttgttgcagtttttccaaagacagaaaagcttt ttcatattgcttgcacacatttagatgtggatttagtctgcataactgtaacagagaaa ctaccattttacttcaaaagacctcctattaatgtggcgattgaccgaggcctggcttt tgaacttgtctatagccctgctatcaaagactccacaatgagaaggtatacaatttcca gtgccctcaatttgatgcaaatctgcaaaggaaagaatgtaattatatctagtgctgc agaaaggcctttagaaataagagggccatatgacgtggcaaatctaggcttgctgttt gggctctctgaaagtgacgccaaggctgcggtgtccaccaactgccgagcagcgcttc tccatggagaaactagaaaaactgcttttggaattatctctacagtgaagaaacctcg gccatcagaaggagatgaagattgtcttccagcttccaagaaagccaagtgtgagggc tgaaaagaatgccccagtctctgtcagcactcccttcttcccttttatagttcatcagcc acaacaaaaataaaacctttgtgtgatttactgttttcatttggagctagaaatcaata gtctataaaaacagttttacttgcaatccattaaaacaacaaacgaaacctagtgaag catctttttaaaaggctgccagcttaatgaatttagatgtactttaagagagaaagact ggttatttctcctttgtgtaagtgataaacaacagcaaatatacttgaataaaatgttt caggtatttttgtttcattttgtttttgagatagggtctttgttgctcaggctggagtac agtggcataatcacagctcactgcaacctcaatcctgggctcaagtgatcctcccgctt cagcctctcaagcagcgggaactacaggtgtgcactaccacacctggctattttttttt tttttttttttttcccttgtagagacatggtctcactatgttgctgaggctggtctcaaa ctcctaggatcaagccatcctcccgctttggcctcctaaagtgctgggattacatgagc caccacatgcagccagatgtttgaatattttaagagcttctttcgaaagtttcttgttc atactcaaatagtagttattttgaagatattcaaacttatattgaagaagtgactttag ttcctcttgttttaagcttctttcatgtattcaaatcagcatttttttctaagaaattgct atagaatttgtggaaggagagaggatacacatgtaaaattacatctggt
ctcttccttc actgcttcatgcctacgtaaggtctttgaaataggattccttacttttagttagaaacc cctaaaacgctaatattgattttcctgatagctgtattaaaaatagcaaagcatcggac tgaaccaactttggaaataatttatttttataatgggatcatgttaagtagaagtagct ttttatgcaaatacatgcatttatgcaatattaatgtaagggctctaaaacaatggagt agagccagaggtataactgaataagaaatttttttaagcaagagaaagacaactgttc tgcgggttggagaaaatacaatttttttttttttttttgagacagtctcgctctgtcccc caggctggagtgcagtggctcgatctctgctcactgcaagctccgcctcctgggttcat gccattctcctgcctcagcctcctgagtagctgggactacaggcgctcgccatgtattt agcagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcaatctcctgacctcatatt ccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgttagccactgcgcccggc ccgagaaaatacagttttaaaaagagaaagctttataacctcaccaatgaatacaaat gtttaaataaaatattgattaaaaaaacattaaaagtg
61.urea靶标基因的引物及探针的核苷酸序列为：
62.seq id no.1：5'-tggaagaagcgagagctggtaa-3'，如seq id no.3所示；
63.seq id no.2：5'-atggatcatgcttgccacac-3'，如seq id no.4所示；
64.seq id no.3：fam-gctgaattgatgcaagaagggcgc-bhq1，如seq id no.5所示。
65.人源rnp内参基因的引物及探针的核苷酸序列为：
66.seq id no.4：5'-tttgcagatttggacctgc-3'，如seq id no.6所示；
67.seq id no.5：5'-ggtgagcggctgtctccaca-3'，如seq id no.7所示；
68.seq id no.6：hex-ggttctgacctgaaggctctgcgcg-bhq1，如seq id no.8所示。
69.实施例2：待测样本dna的提取
70.本技术可以利用dna ffpe advanced kit(qiagen，cat.no.56604)，从人石蜡包埋组织样本中提取dna；或者利用qiaamp powerfecal pro dna kit(qiagen，cat.no.51804) 从人粪便样本中提取dna。
71.本实施例采用利用dna ffpe advanced kit(qiagen，cat.no.56604)，从人石蜡包埋组织样本中提取dna，最终获得dna提取液100μl。dna提取液可直接用于后续的实时荧光定量pcr反应，每次实时荧光定量pcr反应的使用量是4.5μl。剩余的dna提取液在-20℃下保存。
72.实施例3：基于实时荧光定量pcr方法的检测幽门螺杆菌突变的方法建立
73.基于实时荧光定量pcr方法检测幽门螺杆菌突变的试剂盒，具体组成如表1所示。
74.表1 试剂盒的具体组成
[0075][0076]
一份用于实时荧光定量pcr反应的反应液为：反应液a(45μl)和反应液b(0.5μl)。
[0077]
配制反应液时，反应液的配制份数＝待测样本的份数 3份。将配制好的反应液按照每份 45.5μl的量分装到pcr反应管中，其中3个pcr反应管中分别加入4.5μl的阳性对照、4.5μl 的临界阳性对照和4.5μl的阴性对照，其他pcr反应管中分别加入4.5μl的dna提取液。
[0078]
实时荧光定量pcr反应的扩增程序为：94℃预变性3min，进行1个循环；94℃变性15s， 58℃退火与延伸40s，进行40个循环。
[0079]
在退火与延伸时收集靶标基因荧光通道和内参基因荧光通道的荧光信号，分别得到待测样本、阳性对照、临界阳性对照和阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线。
[0080]
结合待测样本、阳性对照、临界阳性对照和阴性对照的实时荧光定量pcr扩增曲线判断幽门螺杆菌的感染情况，幽门螺杆菌的感染情况的判断标准如下：
[0081]
①
阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增，有典型s型曲线，且ct值应在18.00～24.00之间；
[0082]
②
临界阳性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应有明显扩增，有典型s 型曲线，且ct值小于35.00；
[0083]
③
阴性对照在靶标基因荧光通道及内参基因荧光通道上均应无明显扩增；
[0084]
④
待测样本的内参基因荧光通道上均应有明显扩增，且ct值≤35.00，否则该待测
样本的检测结果不成立；
[0085]
⑤
满足
①
～
④
的前提下，若待测样本的靶标基因荧光通道上的ct值≤35.00，则为阳性；若待测样本的靶标基因荧光通道上的ct值＞35或无扩增信号，则为阴性。
[0086]
实施例4：验证检测幽门螺旋杆菌基因的方法
[0087]
将本技术试剂盒与碳13尿素呼气试验结果进行一致性比较。
[0088]
采集300例进行了碳13尿素呼气试验检测的患者的粪便样本，利用实施例2中所提及的提取试剂盒将该粪便样本进行核酸提取，并使用本技术试剂盒进行幽门螺杆菌的检测，通过比较使用本技术试剂盒对样本的urea基因的检测结果与碳13尿素呼气试验的结果进行对比，来计算两种方法的符合率。与碳13尿素呼气试验的结果符合率高代表两种方法有很高的一致性，该试剂盒检测位点精准度高。符合率低表明本技术试剂盒精准度低，不适用。
[0089]
根据结果可知，使用本技术试剂盒的检测结果与基因测序法检测结果的符合率为100％，各突变位点类型样本统计结果详见表2。
[0090]
表2 本技术试剂盒与碳13尿素呼气试验检测结果对比统计
[0091][0092]
临床灵敏度＝137/(137 1)
×
100％＝99.28％；
[0093]
临床特异性＝167/(1 167)
×
100％＝99.40％；
[0094]
阳性预测值＝137/(137 1)
×
100％＝99.28％；
[0095]
阴性预测值＝167/(1 167)
×
100％＝99.40％；
[0096]
总符合率＝(137 167)/306
×
100％＝99.35％。
[0097]
实施例5：石蜡包埋胃粘膜组织临床样本检测
[0098]
收集5例经临床鉴定为阳性的石蜡包埋胃粘膜组织和5例阴性样本，按照石蜡包埋组织核酸提取试剂盒的要求，每个样本取5-8片石蜡切片进行核酸提取，获得dna提取液。采用本技术的基于实时荧光定量pcr方法的检测幽门螺杆菌突变的方法对每个样本的dna提取液进行检测，检测结果与临床鉴定结果完全一致，各样本扩增曲线如图1-4所示。表明本技术的试剂盒可很好的应用于实际临床检测和辅助诊断。
[0099]
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。