一种基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法与流程

1.本发明涉及海洋生态环境保护技术领域，尤其涉及一种基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法。


背景技术：

2.生态系统健康评价已广泛应用于河流、森林、城市等不同生态系统领域，维持健康的生态系统作为可持续发展概念的一个重要目标，已成为生态学家的共识。人工鱼礁生态系统作为一个特殊的生态系统，其研究大多数是针对单个生物因子或非生物因子。且人工鱼礁投放多为广阔、开放性海域，由于水动力影响，凭非生物环境的变化很难对其生态系统进行评价。
3.微生物在生态系统中占有非常重要的地位，其结构和功能的变化可反映生态系统实时变化。微生物种群变化与环境因子密切相关，其中与环境因子负相关细菌比例高意味着微生物生态系统稳定；反之，正相关细菌比例高则意味着微生物生态系统不稳定。因此可筛选相关性较强的微生物类群作为生态系统的指示微生物，并以微生物种群变化来确定评价生态系统状态的环境指标，从而对人工鱼礁生态系统进行评价。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法。
5.一种基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，包括以下步骤：
6.步骤1：采集水体样品，并根据采集的所述水体样品确定微生物的相对丰度；
7.步骤2：根据所述微生物相对丰度和水体中关键指标j计算获得所有样本的水质指标与相应样本微生物的相关系数r及其显著性指数p；
8.步骤3：根据所述相关系数r及其显著性指数p确定水质指标与微生物类群的相关性；所述相关系数r＞0，且显著性指数p≤0.05时，水质指标与微生物类群呈正相关；当相关系数r＜0，且显著性指数p≤0.05时，则水质指标与微生物类群呈负相关；
9.步骤4：根据所述正相关和负相关的微生物类群建立相关微生物类群的总相对丰度与相关水质指标的联系；
10.对每一样本，计算所有与某一水质指标呈正相关的微生物的相对丰度之和ap,以及所有呈负相关的微生物的相对丰度之和am；以某一水质指标值为x轴，以总相对丰度差ap-am为y轴作图，建立正负两类功能微生物类群的总相对丰度差随水质指标的变化图；
11.步骤5：根据所述变化图评价人工鱼礁生态修复效果。
12.进一步地，如上所述的基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，步骤1中，所述采集水体样品包括：
13.在人工鱼礁投放海域和未投礁的对照海域设置采样点，采集底层水体，每个站点设置平行样3个，每年8月份调查采样，共调查3年。利用细菌dna试剂盒提取基因组dna，然后
进行dna纯化、浓缩，然后进行pcr扩增16s rdna的v3 v4区，将纯化后的扩增产物连接测序接头，构建测序文库，illumina上机测序，得到每个样品的测序结果，从而根据每个样品的测序结果得到多种微生物。
14.进一步地，如上所述的基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，步骤1中，某一微生物的所述相对丰度为某个样本中某一种微生物的个数占该样本中所有微生物个数的百分比，其计算方法为：所求微生物的序列数除以总序列数。
15.进一步地，如上所述的基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，步骤2中，所述关键指标j包括：tp、dip、tn、din、no
2-‑
n、no
3-‑
n、nh
4 -n、cod、toc、n/p。
16.进一步地，如上所述的基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，所述步骤2包括：选择水体中关键指标j，根据获得的高通量测序结果，选择相对丰度高于0.5％物种，利用典范对应分析并结合方差分析，运用spss等分析软件，对环境因子、样本及群落之间的关系进行分析；
17.将不同站位采集的样品分别进行tp、dip、tn、din、no
2-‑
n、no
3-‑
n、nh
4 -n、cod、toc、n/p指标的测定，将测得的数据分别与高通量测序获得细菌的相对丰度利用spss软件进行分析，从而获得所有样本的水质指标与相应样本微生物的相关系数r及其显著性指数p。
18.进一步地，如上所述的基于微生物群落的人工鱼礁生态修复效果评价方法，步骤5包括：(1)当差值ap-am＝0时的水质指标的值作为功能平衡点b1，ap-am不再增加时的水质指标的值作为环境容量点b2，b1和b2作为评价生态系统的阈值；当某一采样点的水质指标j的值xj≤b1时，则该采样点区域可评判为生态健康；当某一采样点的水质指标j的值xj为b1﹤xj≤b2，则该采样点区域评判为亚健康；当某一采样点的水质指标j的值xj﹥b2，则该采样点区域评判为不健康。
19.(2)当差值ap-am＝0时的水质指标的值有两个数值，分别记作b1-1和b1-2，均作为功能平衡点；ap-am不再增加时的水质指标的值作为环境容量点b2，b1-1、b1-2和b2作为评价生态系统的阈值；当某一采样点的水质指标j的值xj﹤b1-2，以及b1-1﹤xj≤b2时该采样点区域可评判为生态亚健康；当某一采样点的水质指标j的值xj为b1-2≤xj≤b1-1，则该采样点区域评判为健康；当某一采样点的水质指标j的值xj﹥b2，则该采样点区域评判为不健康。
20.(3)若功能平衡点b1和环境容量点b2均未出现，则该采样点区域评判为健康或不健康，需根据具体情况判定。
21.有益效果：
22.(1)利用微生物群落与环境介质中不同因子间存在的复杂交互关系，通过分析海洋水体中微生物群落的稳定性来评价人工鱼礁生态修复效果，可为人工鱼礁生态修复评价提供另一种思路和方法。
23.(2)方法简单快捷，成本较低，指示全面，客观准确，生态学意义明确。
附图说明
24.图1为正负两类功能微生物类群的总相对丰度差随n/p的变化图；
25.图2为正负两类功能微生物类群的总相对丰度差随活性磷酸盐的变化图；
26.图3为正负两类功能微生物类群的总相对丰度差随无机氮的变化图。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.以下是本发明提供的评价方法，具体包括以下步骤：
29.(1)水体样品采集及微生物种群分析
30.在人工鱼礁投放海域和未投礁的对照海域设置采样点，采集底层水体，每个站点设置平行样3个，每年8月份调查采样，共调查3年。利用细菌dna试剂盒提取基因组dna，然后进行dna纯化、浓缩，然后进行pcr扩增16s rdna的v3 v4区，将纯化后的扩增产物连接测序接头，构建测序文库，illumina上机测序，得到每个样品的测序结果，从而根据每个样品的测序结果得到多种微生物。
31.通过高通量测序对每个样本进行分析，计算样本中每一种微生物的相对丰度，其中某一种微生物的相对丰度为某个样本中某一种微生物的个数占该样本中所有微生物个数的百分比。
32.(2)计算水体指标与微生物相对丰度的相关系数
33.选择水体中关键指标j，根据获得的高通量测序结果，选择高丰度的(相对丰度高于0.5％)物种，利用典范对应分析(cca)并结合方差分析(anova test)，运用spss等分析软件，对环境因子、样本及群落之间的关系进行分析。将不同站位采集的样品分别进行tp、dip、tn、din、no
2-‑
n、no
3-‑
n、nh
4 -n、cod、toc、n/p等指标的测定，将测得的数据分别与高通量测序获得细菌的相对丰度利用spss软件进行分析，获得所有样本的水质指标与相应样本微生物的相关系数r及其显著性指数p。
34.选择水体中关键指标tp、dip、tn、din、no
2-‑
n、no
3-‑
n、nh
4 -n、cod、toc、n/p等，并将其与相应样本的微生物的相对丰度进行相关性分析，获得所有样本的水质指标与相应样本微生物的相关系数及其显著性指数。经过分析得出：din、dip和n/p与微生物的相关性较强，尤其是n/p，其数值大小与微生物多样性有显著相关性。因此该三个指标可作为人工鱼礁水环境评价的关键环境因子，文中以此3个水质指标为例，来说明具体流程与方法。
35.(3)筛选与水质指标相关性较强的微生物类群
36.设定某一显著性指数的标准值(p＝0.05)，从所有样本与微生物的显著性指数p中找出小于和等于该标准值的微生物种类，即为与相应水质指标相关的微生物类群；根据相关性分析结果，即相关系数r值为正(r＞0，且p≤0.05)，则水质指标与微生物类群呈正相关，反之(r＜0，且p≤0.05)则呈负相关，找到与水质指标正相关和负相关的微生物类群。
37.(4)建立相关微生物类群的总相对丰度与相关水质指标的联系
38.对每一样本，计算所有与某一水质指标呈正相关的微生物的相对丰度之和ap,以及所有呈负相关的微生物的相对丰度之和am；以某一水质指标值为x轴，以总相对丰度差(ap-am)为y轴作图，建立正负两类功能微生物类群的总相对丰度差随水质指标的变化图；
39.(5)人工鱼礁生态修复效果评价方法(即海域生态健康状态评价)
40.与环境指标呈正相关和负相关的微生物类群相对丰度一致时，为生态系统稳定临界点，根据曲线图得到的环境指标含量可作为评价生态系统的阈值，低于该值时水质较好，
生态系统健康，高于该值则生态系统不健康。利用投礁区和对照区生态系统健康状况的比较分析，从而对人工鱼礁生态修复效果进行评价。
41.具体为：
42.当差值ap-am＝0时的水质指标的值作为功能平衡点b1，ap-am不再增加时的水质指标的值作为环境容量点b2，b1和b2作为评价生态系统的阈值；当某一采样点的水质指标j的值xj≤b1时，则该采样点区域可评判为生态健康；当某一采样点的水质指标j的值xj为b1﹤xj≤b2，则该采样点区域评判为亚健康；当某一采样点的水质指标j的值xj﹥b2，则该采样点区域评判为不健康。
43.如图1所示，当差值ap-am＝0时的水质指标的值作为功能平衡点b1，ap-am不再增加时的水质指标的值作为环境容量点b2，b1和b2作为评价生态系统的阈值；当某一采样点的水质指标j的值xj≤b1时，则该采样点区域可评判为生态健康；当某一采样点的水质指标j的值xj为b1﹤xj≤b2，则该采样点区域评判为亚健康；当某一采样点的水质指标j的值xj﹥b2，则该采样点区域评判为不健康。
44.优势：n/p(原子比)是衡量氮和磷两元素对水体富营养化的重要性指标，一般海水中正常n/p为16:1，近岸为(5～8):1，过高或过低都可能引起浮游植物等受到某一相对低含量元素的限制。但这种判断方法过于笼统，即给予一个n/p值，无法准确判断水环境是否处于健康状态，而图1的方法则解决了该难题。
45.如图2所示，当差值ap-am＝0时的水质指标的值有两个数值，分别记作b1-1和b1-2，因此b1-1和b1-2均作为功能平衡点；ap-am不再增加时的水质指标的值作为环境容量点b2，b1-1、b1-2和b2作为评价生态系统的阈值；当某一采样点的水质指标j的值xj﹤b1-2时，以及b1-1﹤xj≤b2则该采样点区域可评判为生态亚健康；当某一采样点的水质指标j的值xj为b1-2≤xj≤b1-1，则该采样点区域评判为健康；当某一采样点的水质指标j的值xj﹥b2，则该采样点区域评判为不健康。
46.优势：活性磷酸盐能够被海水中的细菌和藻类所利用，是一种限制性营养盐，因此活性磷酸盐的含量过高或过低都会影响到水环境中细菌和藻类的群落结构和多样性。而现有的评价标准中仅规定了最高限量值，对其低值没有限量，因此可能会导致评价不全面。本发明中所述方法不仅对活性磷酸盐含量高值进行了限定，对其低值也进行了限定，评价较为全面。
47.如图3所示，若功能平衡点b1和环境容量点b2均未出现，则该采样点区域评判为健康或不健康，需根据具体情况判定。与din显著相关的微生物丰度差均为负值，表明在该浓度范围内，与其负相关细菌比例高于正相关细菌，这也表明水环境中微生物生态系统稳定，即该采样点区域评判为健康。与图1和图2不同的是，图3中功能平衡点和环境容量点均未出现，其原因是由于所分析的din含量较低，从而导致功能平衡点和环境容量点在变化图中未能体现，如果din含量增加，则会如图1所示。
48.最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。