用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒Ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法与流程

用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.随着国民生活水平的提高，宠物犬饲养量大幅上升，为保障宠物犬及犬主人的健康，宠物犬病原体检测需求日益增长。引起犬类发生呼吸道疾病的病原体有多种，且存在同时感染的情况。常见的犬呼吸道病原体有犬副流感病毒，犬腺病毒ⅱ型和犬支原体。
3.犬副流感病毒（canine parainfluenza virus,cpiv）感染是犬的主要的呼吸道传染病。cpiv在分类上属副粘病毒科，副粘病毒属，核酸型为单股rna。临床表现发热、流涕和咳嗽。近年来研究认为，cpiv也可引起急性脑髓炎和脑内积水，临床表现后躯麻痹和运动失调等症状。
4.犬腺病毒ⅱ型（canine adenovirus type
‑ⅱ
, cav
‑ⅱ
）属于腺病毒属，可引起犬的传染性喉气管炎及肺炎症状，临床特征表现持续性高热、咳嗽、浆液性至粘液性鼻漏、扁桃体炎、喉气管炎和肺炎，严重情况下可致死亡。
5.犬支原体（mycoplasma canis，mc）是犬的呼吸道和泌尿生殖道共生菌，主要引起犬呼吸道疾病、泌尿生殖道疾病、贫血症、关节炎及结肠炎等。支原体常与其他细菌或病毒混合或继发感染，并加重疾病症状，如不及时治疗会引起病原扩散以及其他组织器官的损伤。
6.这三类病原体检测方法主要包括分离培养、血清学检测或普通pcr等。分离培养是最可靠的检测方法，但是由于此方法耗时长、敏感性差，且操作较为复杂，不能满足宠物犬病原检测的需求；血清学检测方法易与各种病原体之间存在交叉反应，对病原体鉴定不够友好；常规pcr方法灵敏度不高，容易受到环境的污染产生假阳的现象，且不能做到多通道检测。为解决以上问题，亟需建立一种快速、准确且检测通量高的方法，以应对持续增长的宠物检测需求。鉴于此，本发明基于灵敏度高、特异性好的荧光定量pcr检测技术，可以由一次反应检测犬副流感病毒，犬腺病毒ⅱ型和犬支原体三种病原体。


技术实现要素：

7.针对上述技术缺陷，本发明提供用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物、试剂盒及其制备方法，达到以下发明目的：可以同时检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体，并且灵敏度和特异性好。
8.本发明采用的技术方案为：用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的引物探针组合物包括：seq id no.1：针对犬副流感病毒设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑
cgatggctttgaggagggatc-3
’ꢀ
；简称cpiv-f1；
seq id no.2：针对犬副流感病毒设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
tgtcaggtagatcttctgcaagtg
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cpiv-r1；seq id no.3：针对犬副流感病毒设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑
cataggcattgatctctccacggctcatacc-3’；简称cpiv-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团6-fam，3
’ꢀ
端标记为猝灭基团bhq1；seq id no.4：针对犬腺病毒ⅱ型设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
cctccttcaagccttacagc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
f1；seq id no.5：针对犬腺病毒ⅱ型设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
tgttaatattggcaccctgtcc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
r1；seq id no.6：针对犬腺病毒ⅱ型设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
ccgcctacaatgccctcgccc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团rox，3’端标记为猝灭基团bhq2；seq id no.7：针对犬支原体设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
ctaataatagaaagttcaatgtcaagac-3
’ꢀ
；简称mc-f1；seq id no.8：针对犬支原体设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
taaaaagtatttgatgggattgtaga-3
’ꢀ
；简称mc-r1；seq id no.9：针对犬支原体设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
tttctcagcatcatcatcaatgtcgttatcat-3
’ꢀ
；简称mc-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团cy5，3’端标记为猝灭基团bhq1；seq id no.10：针对拟南芥suc2基因设计外参的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
cccatgtggatgcttcttatagtc-3
’ꢀ
；简称ec-f1；seq id no.11：针对拟南芥suc2基因设计外参的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3
’ꢀ
；简称ec-r1；seq id no.12：针对拟南芥suc2基因设计外参的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3
’ꢀ
；简称ec-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团vic，3’端标记为猝灭基团bhq1。
9.本发明引入外参，用于监控反应体系中可能的反应抑制物，可避免假阴性产生，适合宠物检测使用。
10.本发明的探针分别用6-fam、rox、cy5、vic荧光基团修饰，满足了多通道、高通量检测需求。
11.用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的试剂盒，包括的反应缓冲液、阴性对照、阳性对照和外参；所述反应缓冲液包括具有如seq id no .1-seq id no .12所示核苷酸序列的引物探针组合、反应酶和反应buffer。
12.所述阴性对照为te buffer；所述阳性对照为犬副流感病毒人工合成质粒、犬腺病毒ⅱ型人工合成质粒、犬支原体人工合成质粒的质粒混合液，所述犬副流感病毒人工合成质粒、犬腺病毒ⅱ型人工合成质粒、犬支原体人工合成质粒的浓度比为1：1：1。
13.所述外参为插入了拟南芥suc2基因序列片段的质粒，浓度为5
×
106拷贝/ml。
14.用于检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体的试剂盒的制备方法包括以下步骤：配置反应缓冲液、配制阴性和阳性对照、配制外参、组装成检测试剂盒以及构建反应
程序；所述配置反应缓冲液：将如seq id no .1-seq id no .12所示核苷酸序列的引物和探针分别配置为10μm。
15.所述构建反应程序： 反应程序包括50℃逆转录10min；95℃预变性5min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，循环40次。
16.循环步骤中，采集6-fam、rox、cy5、vic通道荧光信号。
17.本发明提供了实时荧光定量pcr检测的试剂盒，优化了pcr反应体系和扩增程序。
18.本发明所具有的有益效果：（1）采用本发明检测试剂盒检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体，操作简便，可以同时检测三种病原体感染情况，符合宠物犬临床检测发展需求。
19.（2）本发明通过特定的四对引物探针，优化了试剂盒反应体系及程序，同时检测三种病原体，提高了检测通量；本发明引入外参，可以监控反应体系中是否存在因pcr抑制物等引起的假阴性；配合特定的反应体系和程序，避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。
20.（3）采用本发明检测试剂盒检测犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体，灵敏度高、特异性好。
附图说明
21.附图1为实施例3中采用本发明试剂盒对犬副流感病毒检测的荧光定量标准曲线；附图2为实施例3中1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬副流感病毒（cpiv）检测的pcr扩增曲线图；附图3为实施例3中采用本发明试剂盒对犬腺病毒ⅱ型检测的荧光定量标准曲线；附图4为实施例3中1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬腺病毒ⅱ型（cav
‑ⅱ
）检测的pcr扩增曲线图；附图5为实施例3中采用本发明试剂盒对犬支原体检测的荧光定量标准曲线；附图6为实施例3中1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬支原体（mc）检测的pcr扩增曲线图；附图7为实施例3中cpiv、cav
‑ⅱ
、mc、犬细小病毒、犬温热病毒、人型腺病毒、人型副流感病毒的pcr扩增曲线对比图；附图8为实施例4中采用本发明进行8例临床标本检测的阴性对照、阳性对照及外参结果图；附图9为实施例4中采用本发明进行8例临床标本检测的样本1-2及外参结果图；附图10为实施例4中采用本发明进行8例临床标本检测的样本3-5及外参结果图；附图11为实施例4中采用本发明进行8例临床标本检测的样本6-8及外参结果图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明发明而不用于限制本发明范围。此外应理解，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员可通过技术尝试对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式通用落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
23.实施例1 一种犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体核酸检测试剂盒的引物探针
根据ncbi genebank数据库获得cpiv、cav
‑ⅱ
、mc及拟南芥suc2基因序列，对基因序列进行比对，设计以下引物探针：seq id no.1：针对犬副流感病毒设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑
cgatggctttgaggagggatc-3
’ꢀ
；简称cpiv-f1；seq id no.2：针对犬副流感病毒设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
tgtcaggtagatcttctgcaagtg
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cpiv-r1；seq id no.3：针对犬副流感病毒设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑
cataggcattgatctctccacggctcatacc-3’；简称cpiv-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团6-fam，3’端标记为猝灭基团bhq1；seq id no.4：针对犬腺病毒ⅱ型设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
cctccttcaagccttacagc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
f1；seq id no.5：针对犬腺病毒ⅱ型设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
tgttaatattggcaccctgtcc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
r1；seq id no.6：针对犬腺病毒ⅱ型设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
ccgcctacaatgccctcgccc
ꢀ‑3’ꢀ
；简称cav
‑ⅱ‑
p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团rox，3’端标记为猝灭基团bhq2；seq id no.7：针对犬支原体设计的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
ctaataatagaaagttcaatgtcaagac-3
’ꢀ
；简称mc-f1；seq id no.8：针对犬支原体设计的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
taaaaagtatttgatgggattgtaga-3
’ꢀ
；简称mc-r1；seq id no.9：针对犬支原体设计的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
tttctcagcatcatcatcaatgtcgttatcat-3
’ꢀ
；简称mc-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团cy5，3’端标记为猝灭基团bhq1；seq id no.10：针对拟南芥suc2基因设计外参的上游引物，该上游引物的序列为5
’‑ꢀ
cccatgtggatgcttcttatagtc-3
’ꢀ
；简称ec-f1；seq id no.11：针对拟南芥suc2基因设计外参的下游引物，该下游引物的序列为5
’‑ꢀ
ccatccaatcagtgtcgaagagaa-3
’ꢀ
；简称ec-r1；seq id no.12：针对拟南芥suc2基因设计外参的荧光探针，该荧光探针的序列为5
’‑ꢀ
ctgcactaaactggatcgcttggttcc-3
’ꢀ
；简称ec-p1；该荧光探针的5’端标记为报告基团vic，3’端标记为猝灭基团bhq1。
24.以上引物探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
25.实施例2 一种犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体核酸检测试剂盒的制备方法步骤1、配制阴性和阳性对照阴性对照为te buffer；阳性对照：将cpiv目标基因序列、cav
‑ⅱ
目标基因序列、mc目标基因序列分别插入puc 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，得到cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒。cpiv目标基因序列如seq id no.13所示；cav
‑ⅱ
目标基因序列如seq id no.14所示；mc目标基因序列如seq id no.15所示。
26.将cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒分别定量至3
×
106拷贝/ml后，按照体积比1：1：1的比例混合制成阳性对照。获得的阳性对照中，cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒浓度均为1
×
106拷贝/ml。
27.步骤2、配制外参外参：将拟南芥suc2基因序列片段插入puc57载体质粒中得到外参质粒，将外参质粒配至浓度为5
×
106拷贝/ml。
28.所述拟南芥suc2基因序列片段：序列如seq id no.16所示。
29.步骤3、配制反应缓冲液采用实施例1的引物和探针，配制100测试的反应缓冲液，反应缓冲液的组分及浓度如表1所示；反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板为5μl，总体积25μl。
30.表1反应缓冲液的组分及浓度hifair
®ꢀ
v c58p2 enzyme mix为反应酶，2
×
hifair
®ꢀ
v c58p2 mp buffer为反应buffer，反应酶和反应buffer（货号：13650es50）购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司。
31.步骤4、组装成检测试剂盒核酸检测试剂盒包括反应缓冲液、一个阴性对照、一个阳性对照和一个外参。阴性对照和阳性对照每管分装500μl，外参每管分装50μl。核酸检测试剂盒保存于-20℃冰箱内。
32.步骤5、构建反应程序反应程序为：50℃逆转录10min；95℃预变性5min；扩增反应：95℃反应15s，60℃反应30s，循环40次。
33.实施例3 试剂盒线性、灵敏度、重复性及特异性检测实验步骤1、模板制备
将cpiv目标基因序列、cav
‑ⅱ
目标基因序列、mc目标基因序列分别插入puc 57载体质粒，经由扩大培养、鉴定并质粒提取，得到cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒。将cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒分别定量至1
×
107拷贝/ml。
34.cpiv目标基因序列如seq id no.13所示；cav
‑ⅱ
目标基因序列如seq id no.14所示；mc目标基因序列如seq id no.15所示。
35.将1
×
107拷贝/ml的cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒、mc人工合成质粒分别用te buffer稀释至1
×
106拷贝/ml、1
×
105拷贝/ml、1
×
104拷贝/ml、1
×
103拷贝/ml，备用。
36.取犬细小病毒、犬温热病毒、人型腺病毒、人型副流感病毒质控品，使用核酸提取或纯化试剂进行提取，提取后获得犬细小病毒核酸、犬温热病毒核酸、人型腺病毒核酸、人型副流感病毒核酸各100μl，备用。
37.步骤2、荧光pcr检测将实施例2制备的试剂盒从-20℃冰箱取出，冻融、混匀、短暂离心，按照20μl/测试将反应液分装到pcr反应管中，然后分别加入5μl 检测样品；每管反应体积25μl。
38.检测样品分别为阳性对照、阴性对照、1
×
103~1
×
107拷贝/ml的cpiv人工合成质粒、1
×
103~1
×
107拷贝/ml的cav
‑ⅱ
人工合成质粒、1
×
103~1
×
107拷贝/ml的mc人工合成质粒，犬细小病毒核酸、犬温热病毒核酸、人型腺病毒核酸、人型副流感病毒核酸，其中1
×
104~1
×
107拷贝/ml的cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒和mc人工合成质粒分别进行两次复孔实验，1
×
103拷贝/ml的cpiv人工合成质粒、cav
‑ⅱ
人工合成质粒和mc人工合成质粒分别进行8次复孔实验，其他样本一次实验。将pcr反应管放到abi 7500荧光pcr仪上，设定每个样本的名称，按照如下反应程序反应：循环步骤中，采集6-fam、rox、cy5、vic通道荧光信号。
39.实验获得的ct值如下表所示：ct值统计表
结果分析：附图1为采用本发明试剂盒对犬副流感病毒检测的荧光定量标准曲线；附图2为1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬副流感病毒（cpiv）检测的pcr扩增曲线图；附图3为采用本发明试剂盒对犬腺病毒ⅱ型检测的荧光定量标准曲线；附图4为1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬腺病毒ⅱ型（cav
‑ⅱ
）检测的pcr扩增曲线图；附图5为采用本发明试剂盒对犬支原体检测的荧光定量标准曲线；附图6为1
×
103~1
×
107拷贝/ml的犬支原体（mc）检测的pcr扩增曲线图；附图7为采用本发明试剂盒对犬细小病毒、犬温热病毒、人型腺病毒、人型副流感病毒检测的pcr扩增曲线图。
40.附图1-2分析可知，1
×
103~1
×
107拷贝/ml的cpiv质粒均能扩增，相关系数r2为0.999，cv为0.48%，表明在1
×
103~1
×
107拷贝/ml范围内具有良好的线性关系，本发明检测cpiv灵敏度为1
×
103拷贝/ml，重复性好。
41.附图3-4分析可知，1
×
103~1
×
107拷贝/ml的cav
‑ⅱ
质粒均能扩增，相关系数r2为0.998，cv为0.67%，表明在1
×
103~1
×
107拷贝/ml范围内具有良好的线性关系，本发明检测cav
‑ⅱ
灵敏度为1
×
103拷贝/ml，重复性好。
42.附图5-6分析可知，1
×
103~1
×
107拷贝/ml的mc质粒均能扩增，相关系数r2为0.998，cv为1.01%，表明在1
×
103~1
×
107拷贝/ml范围内具有良好的线性关系，本发明检测mc灵敏度为1
×
103拷贝/ml，重复性好。
43.附图7分析可知，含犬细小病毒、犬温热病毒、人型腺病毒、人型副流感病毒的检测样品均未起峰，阳性对照、阴性对照结果正常，说明试剂盒特异性良好。
44.实施例4 一种犬副流感病毒、犬腺病毒ⅱ型和犬支原体核酸检测试剂盒的应用步骤1、模板制备取临床收集的cav
‑ⅱ
感染的犬咽部分泌物2例、cpiv感染的犬咽部分泌物3例、mc感染的犬咽部分泌物3例，共8例临床标本，分别标记为样本1（cav
‑ⅱ
感染的犬咽部分泌物）、样本2（cav
‑ⅱ
感染的犬咽部分泌物）、样本3（cpiv感染的犬咽部分泌物）、样本4（cpiv感染的犬咽部分泌物）、样本5（cpiv感染的犬咽部分泌物）、样本6（mc感染的犬咽部分泌物）、样本7（mc感染的犬咽部分泌物）、样本8（mc感染的犬咽部分泌物）。将8例临床标本分别使用青岛汉唐生物科技有限公司的核酸提取或纯化试剂进行提取，提取后获得核酸各100μ
l，作为待检样品。
45.步骤2、荧光pcr检测将实施例2制备的试剂盒扩增部分从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按照20μl/测试将反应液分装到pcr反应管中，然后分别加入5μl的阳性对照、阴性对照、待检样品，每管反应体积25μl。将pcr反应管放到abi 7500荧光pcr仪上，设定每个样本的名称，按照如下反应程序反应：循环步骤中，采集6-fam、rox、cy5、vic通道荧光信号。
46.结果分析：8例临床标本检测结果如附图8-11所示，阴性对照没有起峰，阳性对照所有通道均起峰。各病原体样本均能准确检出，且外参起峰位置稳定，符合前期诊断结果。
47.需要说明的是，以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。凡采用同等替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均应包含在本发明的保护范围内。