一株分泌抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

一株分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
1.本发明属于免疫学和体外诊断技术领域，涉及一株能分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体和应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒会导致发热、咳嗽以及气促和呼吸困难等呼吸道症状，严重的可导致急性呼吸综合征，甚至死亡。目前对该病毒检测的主要方法是pcr技术，pcr检测的是mrna水平，且检测用时比较长，需要2～3h；pcr检测对设备、环境和操作人员的要求比较高，检测效率比较低；pcr检测对样本的时效性有要求，样本采集后，需要在一定时间内完成检测，否则会影响检测结果；另外核酸检测的成本比较高。
3.抗体检测方法是从蛋白水平上进行检测，操作简单快捷，检测时间可缩短至10min左右，提高检测效率；但是，抗体检测是采集血清、全血或血浆进行检测，很容易受样本中其他抗体的干扰，产品灵敏度和准确率相对比较低，检测容易出现漏检和假阳；已经痊愈的患者和复阳患者体内均存在抗体，这种情况下，抗体检测方法无法对二者进行区分；一般抗体的产生需要1周左右的时间，抗体筛查虽然快速方便，但不适合做人群筛查和感染初期的发现。
4.抗原检测方法相比于抗体检测和核酸检测方法，同样可以使用咽拭子样本，可以在病毒感染早期进行筛查，且对场地和设备要求不高，可以随时随地进行检测，提高检测效率，做到尽早发现，尽早隔离。因此，制备高效价、高灵敏度和特异性的抗体并用于检测，具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一株分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。
6.本发明的技术方案是：
7.本发明提供了分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株16f3，其保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，地址为中国武汉，武汉大学；保藏编号为cctcc no：c202113。
8.本发明还提供了该杂交瘤细胞株的制备方法，即用新型冠状病毒n蛋白的基因重组蛋白进行小鼠免疫，取免疫小鼠脾脏、胸腺和四肢的b淋巴细胞，和小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，经过亚克隆和筛选得到杂交瘤细胞株，命名为16f3，该细胞株能够稳定分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体。
9.本发明还提供了杂交瘤细胞株16f3分泌产生的抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体。将杂交瘤细胞株16f3分泌的单克隆抗体命名为单克隆抗体16f3。
10.进一步的，所述单克隆抗体为igg1亚型，对新型冠状病毒n蛋白有特异性。
11.本发明还保护所述单克隆抗体在检测新型冠状病毒n蛋白中的应用。
12.进一步的，所述单克隆抗体用于制备检测新型冠状病毒n蛋白的检测试剂。
13.本发明的有益效果：
14.本发明提供的杂交瘤细胞株16f3及其传代细胞株，能够稳定分泌抗新型冠状病毒n蛋白的单克隆抗体，分泌的抗体具有高效价、高亲和力、高特异性和高灵敏度；该抗体针对新型冠状病毒n蛋白，亚型为igg1，亚型单一，抗体效价高；该抗体能够特异性结合新型冠状病毒2019-ncov的n蛋白，特异性好。
15.生物材料保藏信息如下：
16.本发明的杂交瘤细胞株16f3，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，武汉大学保藏中心；保藏编号为cctcc no：c202113；保藏时间为2020年12月30日。
附图说明
17.图1为抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体效价和亲和力的检测结果；
18.图2为杂交瘤细胞株16f3不同传代次数检测效价一致性结果；
19.图3为抗体的双抗体夹心法的检测结果；
20.图4为抗体的胶体金法的检测结果。
具体实施方式
21.为了进一步理解本发明，下面将结合实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的常规技术或按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
23.实施例1
24.可分泌抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备
25.1、小鼠免疫
26.用新型冠状病毒的重组n蛋白免疫6周龄的雌性balb/c小鼠。蛋白按照100μg/只的剂量与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。三周后加强免疫，蛋白按照50μg/只的剂量与等体积的不完全弗氏佐剂混合，乳化完全，背部皮下多点免疫小鼠。1周后，对小鼠进行断尾采血，检测血清效价。血清效价达到5万以上，准备融合。融合前3天，对小鼠进行腹腔注射免疫，不加佐剂，免疫剂量为100μg/只。
27.2、细胞融合
28.在进行杂交瘤制备过程中，通过调整胎牛血清的品质，选取质量好、批间稳定的胎牛血清，优化胎牛血清浓度，选择优质骨髓瘤细胞和小鼠免疫淋巴细胞，增强细胞融合效率。
29.融合时，在无菌环境下，取免疫小鼠的脾脏、胸腺和四肢淋巴结，研磨分散细胞，用
红细胞裂解液裂解红细胞，离心后收集小鼠b淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞sp2/0按照5～10:1的比例进行混合，离心，用无血清dmem培养基清洗细胞，确保混合细胞中无胎牛血清，在37℃水浴中，用0.8ml peg进行细胞融合，在1min内边滴加peg，边轻柔混合，静置30s，使peg充分作用。
30.融合结束后，用20ml无血清dmem终止融合，加入速度由慢到快，在10min内加完。终止结束后，将细胞放入二氧化碳培养箱中孵育15min，800rpm/min离心10min，用hat培养基重悬融合细胞，置于96孔细胞培养板中，放入二氧化碳培养箱进行培养。
31.3、杂交瘤细胞筛选和亚克隆
32.融合后第五天用hat培养基全换液，第七天通过间接elisa的方法检测培养上清。具体检测方法如下：
33.(1)包被：用cbs缓冲液将新型冠状病毒的重组n蛋白稀释成0.5μg/ml，100μg/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
34.(2)封闭：用含2％甘氨酸的pbst缓冲液封闭酶标板，200μg/孔，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
35.(3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μg/孔，同时用小鼠免疫血清做阳性对照，用hat培养基做空白对照，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
36.(4)加酶标二抗：用pbst缓冲液将hrp标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μg/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
37.(5)显色：用tmb显色液避光显色，100μg/孔，37℃孵育15min；用2m硫酸终止液进行终止，50μg/孔，于450nm波长下检测。
38.第一次筛选结束后，重新用hat培养基全部换液，隔天进行间接elisa筛选，挑选两次筛选结果均为强阳性(od
450
强于阳性对照)的细胞进行亚克隆，其余阳性孔(od
450
》1)进行细胞冻存。亚克隆采用倍比稀释法，取200～500个细胞，转移到新的96孔细胞培养板的a1孔，按照纵向和横向各2倍稀释，进行亚克隆。七天后用间接elisa的方法检测培养上清，选取细胞团单一的阳性孔，继续亚克隆，直至96孔板的阳性率达到100％。继续重复2次亚克隆，阳性率均在100％，结束亚克隆，保证杂交瘤细胞株的稳定性。
39.4、杂交瘤细胞株保存
40.选取生长稳定的杂交瘤细胞株，进行扩大培养，细胞密度达到80％时，收集细胞，用细胞冻存液冻存细胞，保存于本公司的细胞库中；同时对其进行保藏，保藏编号为cctcc no：c202113。
41.实施例2
42.抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体的制备
43.1、腹水制备
44.选取12周龄左右的balb/c雌鼠，每只小鼠腹腔注射500μl的液体石蜡，一周后腹腔注射杂交瘤细胞，剂量为106个/只。5天后，持续观察小鼠，待其腹部膨胀明显后，收集腹水，12000rpm/min离心，去除杂质，置于-80℃冰箱保存。
45.2、腹水纯化
46.将腹水从冰箱取出，融化后离心，用0.22μm滤膜进行过滤。参照博格隆protein-a柱说明书进行纯化。收集纯化的抗体，用20mm pb进行透析，48h后收集抗体，0.22μm滤膜过
滤后，分装，置于-80℃冰箱中保存，用于后续检测和验证。
47.具体纯化方法如下：
48.(1)平衡：取protein-a层析柱，用10倍体积的上样缓冲液平衡柱子。
49.(2)上样：将处理好的腹水加入层析柱，用离心管收集流穿液。样品全部过柱后，将流穿液再次上样，同时收集流穿液，将流穿液做好标记(上样过程中，控制流速慢一点，使样品和纯化柱充分结合)。
50.(3)平衡：上样结束后，用10倍柱体积的上样缓冲液平衡柱子，同时用考马斯亮蓝试剂检测出口液体，液体蛋白浓度低于1mg/ml时，即为平衡完全。
51.(4)洗脱：提前在600μl ep管中加入50μl中和缓冲液，用10倍柱体积的洗脱缓冲液进行洗脱。洗脱时，每管收集4～5滴洗脱液，并及时混匀。用考马斯亮蓝试剂检测洗脱液中抗体的浓度(注意收集开始和结束的节点)，并做好标记。
52.(5)平衡：用10倍柱体积的上样缓冲液进行平衡，用ph试纸检测出口液体的ph，与上样缓冲液ph一致时，结束平衡。用20％乙醇进行冲洗柱子，并储存于20％乙醇中，放置4℃保存。
53.实施例3
54.单克隆抗体鉴定
55.1、抗体效价和亲和力测定
56.采用间接elisa的方法，对抗体的效价和亲和力进行检测，具体检测方法如下：
57.(1)包被：用cbs缓冲液将新型冠状病毒的重组n蛋白稀释成1μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
58.(2)封闭：用含2％甘氨酸的pbst缓冲液封闭酶标板，200μl/孔，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
59.(3)检测：将待检测的抗体稀释成1mg/ml，从1：1000开始，2倍稀释12个梯度，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
60.(4)加酶标二抗：用pbst缓冲液将hrp标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
61.(5)显色：用tmb显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育15min；用2m硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
62.抗新型冠状病毒n蛋白单克隆抗体效价和亲和力检测结果如图1所示，抗体效价达到106。
63.2、抗体亚型检测
64.使用southern biotech公司的sba亚型检测试剂盒，按照说明书进行检测，具体检测方法如下：
65.(1)包被：用cbs缓冲液将试剂盒中的包被抗原稀释成5μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
66.(2)封闭：用含2％甘氨酸的pbst缓冲液封闭酶标板，200μl/孔，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
67.(3)检测：将待检测的抗体加入到酶标板中(每个抗体做8个检测)，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
68.(4)加酶标二抗：用pbst缓冲液将hrp标记的羊抗鼠抗体(包含iga-hrp、igm-hrp、igg1-hrp、igg2a-hrp、igg2b-hrp、igg3-hrp、κ-hrp、λ-hrp)500倍稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
69.(5)显色：用tmb显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育15min；用2m硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
70.由检测结果可知，亚型为igg1。结果如下表1所示：
71.表1亚型检测结果
[0072][0073]
3、抗体特异性检测
[0074]
按上述1中的间接elisa方法，分别包被新型冠状病毒及其他病毒的n蛋白片段，抗体的特异性很好，与其他病毒不反应。结果如表2所示：
[0075]
表2特异性检测结果
[0076]
病毒株检测结果sars-cov-2np2.253sars-covnp0.109oc43-covnp0.062hku1-covnp0.076his-tag0.069
[0077]
实施例4
[0078]
杂交瘤细胞分泌抗体稳定性检测
[0079]
将杂交瘤细胞16f3进行传代培养，共培养30代，分别在1、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30代时收集培养上清，用elisa的方法检测新型冠状病毒质控品，分析细胞分泌抗体的稳定性。具体检测方法如下：
[0080]
(1)包被：用cbs缓冲液将新型冠状病毒的重组n蛋白稀释成1μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0081]
(2)封闭：用含2％甘氨酸的pbst缓冲液封闭酶标板，200μl/孔，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0082]
(3)检测：将待检测的细胞上清加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓
冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0083]
(4)加酶标二抗：用pbst缓冲液将hrp标记的羊抗鼠抗体2万倍稀释，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0084]
(5)显色：用tmb显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育15min；用2m硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
[0085]
检测结果如表3和图2所示，可知，传代30次的细胞，各代次之前具有高度一致性。
[0086]
表3 16f3不同传代次数检测效价结果
[0087][0088]
实施例5
[0089]
单克隆抗体16f3的应用
[0090]
1、酶免法
[0091]
采用双抗体夹心法，筛选与单克隆抗体16f3配对的抗体，检测该配对抗体的灵敏度。具体检测方法如下：
[0092]
(1)包被：用cbs缓冲液将单克隆抗体16f3稀释成5μg/ml，100μl/孔包被到酶标板中，4℃包被过夜。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0093]
(2)封闭：用含2％甘氨酸的pbst缓冲液封闭酶标板，200μl/孔，37℃孵育2h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0094]
(3)加质控品：将新型冠状病毒的重组n蛋白稀释成5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml、0.04μg/ml，100μl/孔加入到酶标板中，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0095]
(4)加酶标抗体：用pbst缓冲液将hrp标记抗体稀释成5μg/ml，加入到酶标板中，100μl/孔，37℃孵育1h。用pbst缓冲液洗板5次，拍干酶标板。
[0096]
(5)显色：用tmb显色液避光显色，100μl/孔，37℃孵育15min；用2m硫酸终止液进行终止，50μl/孔，于450nm波长下检测。
[0097]
检测结果如图3所示，抗体配对检测的线性好。
[0098]
2、胶体金法
[0099]
将单克隆抗体16f3标记到金颗粒上，并固定在特定的结合垫上，另一个抗体(作为检测线)和羊抗鼠抗体(作为质控线)固定在nc膜上，将结合垫、样品垫、nc膜、吸水纸按照一定的层次和顺利组合到pvc板上。分别对新型冠状病毒的重组n蛋白和样品稀释液进行检测。
[0100]
检测结果如图4所示，阳性检测结果好，检测稀释液无假阳。
[0101]
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。