一种从木贼麻黄中提取的三个新化合物及其制备方法和应用

1.本发明涉及医药技术领域，特别是一种从木贼麻黄中提取的三个新化合物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.哮喘是由多种细胞(嗜酸性粒细胞、肥大细胞、t淋巴细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞等)和细胞组分参与的慢性气道炎症性疾病，主要表现为喘息、胸闷、咳嗽以及可逆性气道阻塞。哮喘是世界范围内最常见的慢性病之一，发病率高且治疗较为困难，给患者带来较为沉重的经济负担。目前，有研究表明哮喘患者的发病率和致死率正在逐年上升(papi a,brightling c,pedersen s,et al.asthma[j].lancet,2018,391(10122):783)。肥大细胞是参与哮喘的核心效应细胞，哮喘时会发生肥大细胞脱颗粒，即组胺(histamine)、β-氨基己糖苷酶(β-hex)等的释放，在哮喘的发病过程中起关键作用(martinsson j h,enriquez e m.mast cells and their progenitors in allergic asthma[j].front immunol,2019,10:821)；而大鼠嗜碱性细胞白血病细胞株(rbl-2h3)能够模拟哮喘中肥大细胞活化脱颗粒，可用于化合物抗哮喘活性筛选(sun n,zhou c,zhou x,et al.use of a rat basophil leukemia(rbl)cell-based immunological assay for allergen identification,clinical diagnosis of allergy,and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy[j].j immunotoxicol,2015,12(2):199-205)。
[0003]
木贼麻黄传统上以干燥草质茎入药，在医药典籍中最早出自《神农本草经》，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿之功效，用于风寒感冒、胸闷咳喘、风水浮肿等症。麻黄当中含有生物碱、黄酮、有机酸、鞣质、挥发油以及多糖等多种类型的化合物，其中生物碱是其主要成分。在多种治疗哮喘相关疾病的方剂中，麻黄均是重要的组成部分，如麻黄射干汤、麻杏石甘汤(张诗瑜,黄贵锐,候丹,等.5个常用经典名方治疗儿童哮喘急性发作疗效的网状meta分析[j].中国实验方剂学杂志,2022,28(02):67-78)。
[0004]
现代药理活性研究表明麻黄当中的生物碱通过促进去甲肾上腺素、肾上腺素等神经递质的以及阻止过敏介质的释放从而发挥抗哮喘作用(miao s m,zhang q,bi x b,et al.a review of the phytochemistry and pharmacological activities of ephedra herb[j].chin j nat med,2020,18:321-344)，而麻黄当中的多糖通过缩短咳嗽时间，延长咳嗽潜伏期达到抗哮喘的目的(赵云生,毛福英,姚海花,等.麻黄多糖发汗、止咳与利尿活性研究[j].亚太传统医药,2014,10(16):11-13)；此外草麻黄中的四甲基吡嗪以及l-α-松油醇也具有一定的抗哮喘活性(miao s m,zhang q,bi x b,et al.a review of the phytochemistry and pharmacological activities of ephedra herb[j].chin j nat med,2020,18:321-344)。麻黄属植物以及其单体化合物确有抗哮喘活性，但对木贼麻黄单体化合物的抗哮喘活性研究较少，本发明涉及的3个新型化合物关于其制备方法及抗过敏性哮喘的研究尚未见报道。


技术实现要素：

[0005]
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从木贼麻黄中提取的三个新化合物及其制备方法和应用，可有效解决过敏性哮喘的用药问题。
[0006]
本发明解决的技术方案是，从木贼麻黄中提取的三个新化合物化学结构如式1～3所示：
[0007][0008]
本发明新型化合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
1)将木贼麻黄(ephedra equisetina bunge.)的茎，以5～15倍量的溶剂回流提取2～6次，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
[0010]
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，然后依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位；
[0011]
3)将步骤2)中二氯甲烷部位部位经硅胶柱层析，依次以石油醚：丙酮按比例50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100以及100％甲醇洗脱，得9个洗脱部位fr.1～fr.9；
[0012]
4)将步骤3)中fr.8的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用ch2cl2：meoh＝30:1、20:1、10:1洗脱，得到6个洗脱部位fr.8-1～fr.8-6；
[0013]
5)将步骤4)中fr.8-2的浓缩液经sephadex lh-20凝胶柱层析，用100％的甲醇洗脱，得6个洗脱部位fr.8-2-1～fr.8-2-6；
[0014]
6)将步骤5)中fr.8-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝200:1、50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.8-2-2-1～fr.8-2-2-5；
[0015]
7)将步骤6)中得到的fr.8-2-2-4用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物1(tr＝26.4min)；
[0016]
8)将步骤3)中fr.7的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝50:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.7-1～fr.7-5；
[0017]
9)将步骤8)中fr.7-4的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝100:1、50:1、25:1、10:1、5:1进行梯度洗脱，得到10个洗脱部位fr.7-4-1～fr.7-4-10；
[0018]
10)将步骤9)中fr.7-4-7的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝30:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.7-4-7-1～fr.7-4-7-5；
[0019]
11)将步骤10)中得到的fr.7-4-7-2用c
18 ods rp-hplc分离，得到3个洗脱部位fr.7-4-7-2-1～fr.7-4-7-2-3；
[0020]
12)将步骤11)中得到的fr.7-4-7-2-1用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物2(tr＝16.0min)；
[0021]
13)将步骤8)中fr.7-3的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝50:1、25:1进行梯度洗脱，得到2个洗脱部位fr.7-3-1～fr.7-3-2；
[0022]
14)将步骤13)中fr.7-3-2的浓缩液经sephadex lh-20凝胶柱层析，用75％的甲醇洗脱，得12个洗脱部位fr.7-3-2-1～fr.7-3-2-12；
[0023]
15)将步骤14)中得到的fr.7-3-2-5用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物3(tr＝27.6min)。
[0024]
所述的步骤7)中c
18 ods rp-hplc制备的条件为5μm，250
×
10mm，55％甲醇，3ml/min。
[0025]
所述的步骤11)中c
18 ods rp-hplc制备的条件为5μm，250
×
10mm，65％甲醇，3ml/min。
[0026]
所述的步骤12)中c
18 ods rp-hplc制备的条件为5μm，250
×
10mm，10％乙腈，3ml/min。
[0027]
所述的步骤15)中c
18 ods rp-hplc制备的条件为5μm，250
×
10mm，18％乙腈，3ml/min。
[0028]
本发明新型化合物1～3在制备治疗过敏性哮喘药物中的应用。
[0029]
本发明所述的新型化合物1～3，可显著抑制c48/80诱导rbl-2h3细胞的β-hex的释放，改善rbl-2h3脱颗粒现象，可作为治疗过敏性哮喘的药物，其药物组成可以是单体或者其衍生物，是从木贼麻黄中提取的化合物及其用途上的创新。
附图说明
[0030]
图1为本发明新型化合物1的1h-nmr图谱。
[0031]
图2为本发明新型化合物1的
13
c-nmr图谱。
[0032]
图3为本发明新型化合物1的ecd图谱。
[0033]
图4为本发明新型化合物2的1h-nmr图谱。
[0034]
图5为本发明新型化合物2的
13
c-nmr图谱。
[0035]
图6为本发明新型化合物3的1h-nmr图谱。
[0036]
图7为本发明新型化合物3的
13
c-nmr图谱。
[0037]
图8为本发明新型化合物3的ecd图谱。
具体实施方式
[0038]
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0039]
实施例1
[0040]
本发明在具体实施时，化合物1的制备方法可包括以下步骤：
[0041]
1)取木贼麻黄茎35kg，加10倍量的水回流提取3次，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
[0042]
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，然后依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位；
[0043]
3)将步骤2)中二氯甲烷部位部位经硅胶柱层析，依次以石油醚：丙酮＝50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100以及100％甲醇洗脱，得9个洗脱部位fr.1～fr.9；
[0044]
4)将步骤3)中fr.8的浓缩液经过硅胶柱层析，依次用ch2cl2：meoh＝30:1、20:1、
10:1洗脱，得到6个洗脱部位fr.8-1～fr.8-6；
[0045]
5)将步骤4)中fr.8-2的浓缩液经sephadex lh-20凝胶柱层析，用100％的甲醇洗脱，得6个洗脱部位fr.8-2-1～fr.8-2-6；
[0046]
6)将步骤5)中fr.8-2-2的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝200:1、50:1、20:1、10:1、5:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.8-2-2-1～fr.8-2-2-5；
[0047]
7)将步骤6)中得到的fr.8-2-2-4用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物1(tr＝26.4min)。
[0048]
实施例2
[0049]
本发明在具体实施时，化合物2的制备方法可包括以下步骤：
[0050]
1)取木贼麻黄茎20kg，加以5倍量的水回流提取4次，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
[0051]
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，然后依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位；
[0052]
3)将步骤2)中二氯甲烷部位部位经硅胶柱层析，依次以石油醚：丙酮＝50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100以及100％甲醇洗脱，得9个洗脱部位fr.1～fr.9；
[0053]
4)将步骤3)中fr.7的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝50:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.7-1～fr.7-5；
[0054]
5)将步骤4)中fr.7-4的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝100:1、50:1、25:1、10:1、5:1进行梯度洗脱，得到10个洗脱部位fr.7-4-1～fr.7-4-10；
[0055]
6)将步骤5)中fr.7-4-7的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝30:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.7-4-7-1～fr.7-4-7-5；
[0056]
7)将步骤6)中得到的fr.7-4-7-2用c
18 ods rp-hplc分离，得到3个洗脱部位fr.7-4-7-2-1～fr.7-4-7-2-3；
[0057]
8)将步骤7)中得到的fr.7-4-7-2-1用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物2(tr＝16.0min)。
[0058]
实施例3
[0059]
本发明在具体实施时，化合物3的制备方法可包括以下步骤：
[0060]
1)取木贼麻黄茎30kg，加以15倍量的水回流提取6次，合并提取液，过滤，减压浓缩，得浓缩浸膏；
[0061]
2)将步骤1)得到的浓缩物用水混悬，然后依次采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯以及正丁醇进行萃取，得到石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位；
[0062]
3)将步骤2)中二氯甲烷部位部位经硅胶柱层析，依次以石油醚：丙酮＝50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:100以及100％甲醇洗脱，得9个洗脱部位fr.1～fr.9；
[0063]
4)将步骤3)中fr.7的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝50:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行洗脱，得到5个洗脱部位fr.7-1～fr.7-5；
[0064]
5)将步骤4)中fr.7-3的浓缩液经硅胶柱层析，用ch2cl2：meoh＝50:1、25:1进行梯度洗脱，得到2个洗脱部位fr.7-3-1～fr.7-3-2；
[0065]
6)将步骤5)中fr.7-3-2的浓缩液经sephadex lh-20凝胶柱层析，用75％的甲醇洗脱，得12个洗脱部位fr.7-3-2-1～fr.7-3-2-12；
[0066]
7)将步骤6)中得到的fr.7-3-2-5用c
18 ods rp-hplc分离，得到新型化合物3(tr＝27.6min)。
[0067]
本发明从木贼麻黄中制备的这三种化合物药理活性结果显示可显著抑制c48/80诱导rbl-2h3细胞的β-hex的释放，改善rbl-2h3脱颗粒现象，可作为治疗过敏性哮喘的药物使用，相关实验资料如下：
[0068]
一、本发明化合物的结构鉴定：
[0069]
化合物1～3的1h-nmr及
13
c-nmr数据见表1，新型化合物1 1h-nmr图谱、
13
c-nmr图谱、ecd图谱见附图1-3，新型化合物2 11h-nmr图谱、
13
c-nmr图谱见附图4-5，新型化合物3 11h-nmr图谱、
13
c-nmr图谱、ecd图谱见附图6-8。
[0070]
表1.化合物1～3的1h-nmr(500mhz，cd3od)和
13
c-nmr(125mhz，cd3od)数据
[0071][0072]
二、本发明新型化合物1～3的抗过敏性哮喘作用
[0073]
1)单体化合物的处理
[0074]
在超净台内将化合物使用pbs溶液配制成浓度为1mm的母液(dmso＜0.01％)，过滤除菌，所有配制好的药物均放于4℃冰箱备用。
[0075]
2)c48/80配制
[0076]
将c48/80从-20℃冰箱拿出室温放置半小时，于超净工作台中用pbs溶解，配制成浓度为20mg/ml的母液，封口贴标签保存于4℃冰箱中备用。
[0077]
3)1％trinton x-100配制
[0078]
于超净工作台中，取100μl triton x-100，加入9.9ml台式液溶解，配成1％trinton x-100，现用现配。
[0079]
4)β-hex底物溶液配制
[0080]
4-硝基苯基-n-乙酰基-β-d-氨基葡萄糖用1m柠檬酸盐缓冲液(ph＝4.5)配制成1mm的底物溶液。
[0081]
5)1m naoh溶液配制
[0082]
称取4g naoh颗粒，用100ml双蒸水溶解，用于调溶液的ph值。
[0083]
6)na2co3/nahco3终止液配制
[0084]
称取2.65g na2co3和2.1g nahco3，250ml双蒸水溶解，用1m naoh将溶液调至ph＝10.7。
[0085]
7)细胞培养
[0086]
取液氮冻存的rbl-2h3细胞于37℃水浴锅融化至冰水共存状态，在1000rpm/min条件下离心5min，弃上清后将细胞转入含有10％fbs的dmem培养基的培养皿中，于5％co2的37℃恒温培养箱培养，待细胞布皿80％时传代，每2天传代一次。并将传代后的细胞置于37℃，5％co2培养箱中培养至对数生长期。
[0087]
8)c48/80诱导rbl-2h3细胞脱颗粒模型的建立
[0088]
取对数生长期细胞，以2
×
104/ml的密度将细胞悬液接种于96孔板中，每孔200μl。每组设置6个复孔，每次实验至少重复3次；培养24h后，弃去培养基，使用pbs清洗2遍，加入终浓度为20μg/ml的c48/80溶液；对照组加入等量的台式液，建立c48/80致rbl-2h3细胞脱颗粒模型。
[0089]
9)分组和给药
[0090]
正常组(nc)、模型组(m，c48/80，20μg/ml)、化合物1(10μm) c48/80(20μg/ml)组、化合物2(10μm) c48/80(20μg/ml)组、化合物3(10μm) c48/80(20μg/ml)组、总酶组(1％trinton x-100)，并且另设3个空白孔。刺激30min后，离心，取上清液，检测rbl-2h3细胞相关指标的变化水平。
[0091]
10)底物显色法测定β-hex释放率
[0092]
取50μl细胞上清，加入50μl 1mm的β-hex底物溶液，37℃孵育1h，加入150μlna2co3/nahco3终止液终止反应，使用酶标仪在405nm下检测其吸光度，重复3次，计算β-hex释放率。[β-hex释放率＝(实验组上清od值-空白孔上清od值)/(总酶孔上清od值-空白孔上清od值)
×
100％]
[0093]
11)实验结果
[0094]
与c48/80造模组相比，正常组β-hex释放率显著降低(p《0.001)；与c48/80造模组相比，10μm的新型化合物1～3可显著降低rbl-2h3的β-hex释放率(p《0.05或p《0.01)。实验结果如表2所示。
[0095]
表2.木贼麻黄单体化合物对c48/80诱导rbl-2h3细胞β-hex释放率的影响
[0096][0097]
注：与m组相比，
*
p《0.05，
**
p《0.01，***p《0.001
[0098]
本发明采用麻黄科麻黄属植物木贼麻黄的茎，经过溶剂提取，toyopearl hw-40柱层析、硅胶柱层析、制备高效液相分离等步骤获得3种新型化合物1～3，药理活性结果显示这3种化合物可显著降低c48/80诱导损伤的rbl-2h3细胞的β-hex释放率，可作为治疗抗过敏性的药物使用，是新型化合物及其用途上的创新，具有良好的应用和推广价值。