一种功能性RNA纳米颗粒及其制备方法与应用

一种功能性rna纳米颗粒及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种功能性rna纳米颗粒的设计及其通过rnai机制调控靶基因表达的基因抑制剂或rnai生物农药的制备。


背景技术：

2.rna干扰（rna interference，rnai）是真核生物中一种由rna介导的保守调节机制，又称rna沉默（rna silencing），是一种能以同源序列配对的形式靶向目标基因，在转录水平或转录后水平有效沉默或抑制目标基因表达的技术。经过20年的发展，rnai技术本身已处于成熟期。在医学领域，用于治疗成人患者由遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性引起的多发神经病的rnai药物，2018年获美国fda批准上市，在rnai药物发展史上具有里程碑的意义。在农药领域，利用rnai原理开发的仅针对病、虫、草等农业有害生物的目标基因而不影响农作物的遗传表达的一种新型生物制剂产品，目前还处于起步阶段。rna农药是具有高度特异性和系统性的全新机制药物，有望带来农业可持续发展道路上的又一次科技革命，是当前和未来科技战略必争的前沿领域。预计在未来5～10年，以rnai技术为核心的rna农药将进入研发热潮，在农药市场上rna农药有望实现零的突破。
3.喷洒具有触发 rnai 潜能的外源性双链rna（dsrna） 或小干扰rna（sirna） 分子诱导rnai（外源rnai），被认为是一种新型的、环境友好的生物农药，对于植物病毒、真菌和昆虫都有较好的防治效果。然而，由于rna本身环境稳定性差，易降解、植物吸收效率低下等特点，导致直接喷施裸露的dsrna或sirna时，存在rnai诱导效率低，作用时间短等缺陷，因此这种通过喷洒诱导基因沉默（spray-induced gene silence, sigs）的效应在应用中需要递送载体，以提高dsrna/sirna的吸收效率，否则只有在连续供应dsrna时才能维持。因此，选用合适的载体以提高dsrna/sirna递送效率和rnai诱导效率是当前rnai生物农药面临的关键问题。


技术实现要素：

4.针对现有技术中dsrna/sirna的稳定性差、作物吸收效率低及rnai时间短等技术缺陷，本发明的第一方面，提供了一种功能性单链自组装rna纳米颗粒，其由rna分子折叠形成各种纳米结构，使其可以通过添加、喷洒、注射等方式进入细胞或生物体内，通过特异性地抑制靶基因的表达，实现特定的生物防控效果。
5.本发明的第二方面，提供了一种功能性单链自组装rna纳米分子的设计方法，通过将靶向目标基因的一个或多个dsrna或sirna按一定顺序通过六个尿嘧啶寡核苷酸接头串联成一条单链rna分子，并具备自我折叠形成结构稳定的rna纳米颗粒，以提高dsrna/sirna的稳定性、作物吸收效率及rnai作用时长。
6.本发明的第三方面，提供了功能性rna纳米颗粒的应用，可用于免转化进入生物体内，通过诱导rnai机制沉默靶基因的表达，具体的，可通过喷洒、添加、浇灌、注射等方式进入生物体内，触发rnai机制抑制特定靶基因的表达。
7.本发明的有益效果在于：1.本专利通过将多个dsrna/sirna串联成的单链rna分子，具备自我折叠形成结构稳定的rna纳米颗粒，均可提高dsrna/sirna的稳定性、作物吸收效率及rnai作用时长，成功解决了功能性dsrna/sirna分子大规模制备成本高，rna稳定性差、递送效率低、rnai作用时间短的技术瓶颈。
8.2.本发明可以通过将rna纳米分子直接喷施植物进入到植物体内，进而触发rnai抑制靶基因的表达，无需建立植物的再生体系和遗传转化体系，使rnai的研究再不会受到宿主植物有无遗传转化体系的阻碍。
9.3.本发明可以通过将rna纳米分子直接喷施植物进入到植物体或者病原菌体内，通过触发rnai抑制病菌基因的表达，进而抑制病菌的生长发育，达到抑菌的目的。
10.4.本发明可以通过将rna纳米分子直接添加到动物细胞培养基而进入细胞内，无需细胞转染步骤，进而通过触发rnai抑制靶基因的表达。
附图说明
11.图1：rna纳米的结构示意图，实线方框为6us接头，虚线方框为kl元件；图2：rna纳米的体外转录，其中，m：dna marker；泳道1：dsrna；泳道2：rna三角形；泳道3：rna正方形；泳道4：rna五边形；泳道5：rna四面体；图3：实施例测试结果；图4：rna正方形纳米在昆虫细胞中的实施效果；图5：rna纳米对灰霉病菌的抑制效果；图6：rna纳米对cmv病毒感染的抑制效果。
12.具体实施方式：一种功能性单链自组装rna纳米的设计及其制备包括以下步骤：1.rna纳米的分子设计：将靶向一个真核编码基因的dsrna或sirna通过6个连续的尿嘧啶u（6us）和kissing-loop（kl）元件相互串联形成结构如图1所示的功能性单链自组装rna纳米颗粒，根据所形成的结构不同分别称之为rna三角形、rna正方形、rna五边形和rna四面体。
13.2. rna纳米颗粒的制备：根据上述设计的单链rna分子序列，可得出相应的编码该rna纳米颗粒的模板dna序列；然后在模板dna的上游加入t7启动子序列（5
’‑
tctaatacgactcactata-3’）后，通过化学合成的方法得到相应的dna分子；最后利用t7体外转录试剂盒，按照说明书操作即可得到目标rna纳米颗粒。
14.对比例1：基于靶基因序列设计上下游引物（f1/r1），然后分别在引物两端加入t7启动子序列，得到t7_f1/t7_r1。分别以t7_f1/r1和f1/t7_r1为引物扩增目的片段，得到的片段分别用于体外转录模板，得到的两条rna混合后退火，即可得到靶向目标基因的dsrna。
15.对比例2：不能靶向目标基因的任意rna分子作为阴性对照（nc-rna）。
16.与裸露的dsrna或sirna分子相比，本发明的功能性rna纳米分子具有以下优点：验证试验：1.为了验证上述技术方案，我们首先以egfp基因为靶标，根据sirna的设计原则设计并筛选靶向egfp的多个sirna序列，然后按照上述技术方案得到靶向egfp基因的三角形、
正方形、五边形和四面体的rna纳米结构，其序列分别为seq1、seq2、seq3和seq4。
17.seq1：三角形gggcacccgugcugcugcccgcuuuuuugcuucaaggacgacggcaacuacaacccgugcugcugcccgcuuuuuugccacaaguucagcguguccggcgaaagcgguacgccggacacgcugaacuuguggcgcgggcagcagcacggguuguaguugccgucguccuugaagcgcgggcagcagcacgggugcccguuguacuccagcuugugccgcgggcagcagcaaaccgcuagcugcugcccgcuuuuuuggcacaagcuggaguacaacseq2：正方形gggcagacccgcgccgaggugcuuuuuuggaacggcaucaaggugaacuucaagacccgcgccgaggugcuuuuuugcggccccgugcugcugcccgacaagacccgcgccgaggugcuuuuuugccacaaguucagcguguccggcgaacaggugacgccggacacgcugaacuuguggcgcaccucggcgcgggucuugucgggcagcagcacggggccgcgcaccucggcgcgggucuugaaguucaccuugaugccguuccgcaccucggcgcgggucugcccgguacagcucguccaugcccgcaccucggcgcaacaccugagcgccgaggugcuuuuuugggcauggacgagcuguaccseq3：五边形gggcacgagacccgcgccgagcuuuuuuggcacaagcuggaguacaacuacaacgagacccgcgccgagcuuuuuugccuggggcacaagcuggaguacaacgagacccgcgccgagcuuuuuugcggccccgugcugcugcccgacaacgagacccgcgccgagcuuuuuugccacaaguucagcguguccggcgaaagcgguacgccggacacgcugaacuuguggcgcucggcgcgggucucguugucgggcagcagcacggggccgcgcucggcgcgggucucguuguacuccagcuugugccccaggcgcucggcgcgggucucguuguaguuguacuccagcuugugccgcucggcgcgggucucgugcccgagcucguccaugccgugacgcucggcgcgggaaaccgcuacccgcgccgagcuuuugcuuuuuugucacggcauggacgagcucseq4：四面体gggcagacgagacccgcgccgcgccacaaguucagcguguccggcgaagccuccacgccggacacgcugaacuuguggcgcggcgcgggucaacaggugagacccgcgccgcgcggcgcgggucucgucugcccgguacagcucguccaugcccgcggcgcgggucucgucuugaaguucaccuugaugccguuccgcggcaagcugacccugaaguucaaacaccugaugaacuucagggucagcuugccgcgcggcgcgggucaaagcgguagacccgcgccgcggaacggcaucaaggugaacuucaagacgagacccgcgccgcgccuggggcacaagcuggaguacaagacgagacccgcgccgcgcggccccgugcugcugcccgacaaaaccgcuaugucgggcagcagcacggggccgcgcggcgcgggucaaggaggcagacccgcgccgcgcggcgcgggucucgucuuguacuccagcuugugccccaggcgggcauggacgagcuguacc2.直接喷洒功能性rna纳米颗粒对egfp在植物中表达抑制效果为了验证我们设计的rna纳米是否能通过喷洒进入植物诱导基因沉默，我们首先进行体外转录合成，结果如图2所示，dsrna、rna三角形、rna正方形和五边形的电泳条带很亮，而rna四面体的条带较暗。
18.为了进一步验证上述rna纳米的生物学功能，利用具有过量表达egfp基因的转基因拟南芥作为供试材料，培养一个月后，分别将体外转录合成得到的dsrna、以及体外转录得到的四种rna纳米溶液以及不能靶向egfp的nc-rna溶液喷洒到拟南芥叶片表面，所有rna溶液的终浓度均为100 ng/μl，继续温室培养3d后采样，通过荧光显微镜检测绿色荧光信号确定rna纳米对egfp表达的抑制效果，结果如图3所示。
19.由图3可知，与对比例nc-rna和dsrna相比，使用本发明的rna正方形处理的叶片中绿色荧光信号很低，表明它对egfp表达的抑制效率最高。除此之外，其他几个rna纳米分子
对egfp的抑制和dsrna差不多。
20.3.rna正方形对egfp在昆虫细胞中表达的抑制效果为了验证rna正方形纳米对昆虫细胞基因表达的抑制效果，我们首先培养家蚕卵巢上皮细胞，2天后接种能够表达egfp的家蚕核型多角体病毒（bmnpv）继续培养4 h，然后直接在培养液中滴加rna正方形纳米颗粒（终浓度为50 ng/μl）。实施例效果如图4所示。
21.由图4可知，与体外转录获得的dsrna相比，使用本发明的rna正方形纳米分子直接添加细胞培养液，对egfp的抑制效果极为明显。
22.4.rna正方形纳米对植物真菌病害的防治效果为了验证四边形rna纳米颗粒对植物真菌的防治效果，我们选择灰霉病菌作为供试菌株，以灰霉病菌的dcl基因为靶标设计得到sirna，并按照上述技术方案得到靶向灰霉病菌dcl基因的rna正方形纳米结构，其序列为seq5。
23.seq5：bc-rna 正方形cgguagaugcuagagaucuuuuuugccauccggcauacuuguucaucuacaccgguagaugcuagagaucuuuuuuggcgccgcaucucgauggucagaaucaccgguagaugcuagagaucuuuuuuggcccaaggagaaggugcugauugacacaaagcgguagugucaaucagcaccuucuccuugggccugaucucuagcaucuaccggugauucugaccaucgagaugcggcgccgaucucuagcaucuaccgguguagaugaacaaguaugccggauggcgaucucuagcaucuaccggugauuaucucuagcaucuaccggugacgaucucuagcauaaaccgcuaaugcuagagaucuuuuuugucaccgguagaugcuagagauaaucac按照技术方案所述将编码seq5的模板dna序列及其上游t7启动子序列经化学合成后，利用t7 rna聚合酶进行体外转录合成seq5序列后自组装得到rna纳米正方形。同样以体外转录获得的靶向dcl基因的dsrna为对照。将rna正方形和dsrna稀释到终浓度为100 ng/μl的溶液并喷洒到番茄叶片的表面，以体外转录获得的靶向dcl基因的dsrna为对照。在温度为28℃，相对湿度为85%的光照培养5天后，滴加接种灰霉病菌菌丝到叶片表面，继续培养3d后，结果图5所示，相对于nc-rna和dsrna，而喷施rna纳米溶液的番茄叶片表面菌斑较小，表明rna正方形对灰霉病菌具有显著的抑制效果。
24.5.rna正方形对植物病毒的防治效果为了验证通过直接喷施四边形rna纳米对植物病毒的防治效果，我们选择黄瓜花叶病毒（cmv）作为供试病毒，以cmv的f2b基因为靶标，利用dsir在线工具设计sirna，并按照上述技术方案得到靶向cmv-2b基因的四边形rna纳米结构，其序列分别为seq6。
25.seq6：cmv-rna正方形gggcaccagcgagagagcgcgcuuuuuugucccagcgagagagcgcguucaaaccagcgagagagcgcgcuuuuuuggaauugaacguaggugcaaugacaccagcgagagagcgcgcuuuuuugcgauacagauugguucgccgguaaaggaggcauaccggcgaaccaaucuguaucgcgcgcgcucucucgcuggugucauugcaccuacguucaauuccgcgcgcucucucgcugguuugaacgcgcucucucgcugggacgcgcgcucucucgcuggugcccggcgcucucucgcugggaccgcgcgcucucucaagccuccagagagagcgcgcuuuuuuggucccagcgagagagcgcc按照技术方案所述将编码seq6的编码dna序列经合成后，同样通过体外转录获得rna纳米溶液，将其稀释到100 ng/μl后，用于抗cmv病毒验证。实验过程如下：将自带egfp表达的cmv病毒通过注射接种到温室培养的烟草底部两片叶子（如图6所示）3天后向接种植物全株喷洒终浓度为100 ng/μl 的rna纳米溶液，以不能靶向cmv的rna纳米颗粒作为阴性对
照，喷洒后温室继续培养3天，结果如图6所示。
26.在两片接种叶片上，喷施nc rna烟草叶片全部都有极强的绿色荧光信号，而在喷施rna纳米的接种叶多处出现无dgfp荧光信号现象（如图6黄色箭头所示），表明cmv病毒的增殖受到明显的抑制。此外，在非接种叶上，喷施nc-rna的植物叶片全部都有egfp信号，而在喷施cmv靶向的rna纳米的非接种叶片上，出现无egfp信号的区域（如图6黄色圆圈所示）。以上结果表明直接喷施功能性rna纳米溶液能够有效抑制cmv病毒在植物上的复制和增殖。
27.以上实施例表明，本专利通过6us接头串联成的单链rna分子，具备自我折叠形成结构稳定的rna纳米颗粒，均可提高dsrna/sirna的稳定性、作物吸收效率率及rnai作用时长，成功解决了功能性dsrna/sirna分子大规模制备成本高，rna稳定性差、递送效率低、rnai作用时间短的技术瓶颈。
28.上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的rna纳米的等效变换或修饰，或将其应用于其他动植物病害的防治，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。