一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物及其合成方法、用途

1.本发明属于肿瘤药物研究领域，具体涉及一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物及其合成方法、用途。


背景技术：

2.肝细胞性肝癌(hepatocellular carcinoma，hcc)，是最常见的原发性肝癌，也是全球第四大癌症相关死亡原因。目前可供选择的治疗方案主要包括手术切除、肝移植、射频消融、介入治疗、靶向治疗和放化疗等。近年来，随着免疫学的发展，肿瘤免疫治疗成为了研究者们寄予厚望的一种肿瘤治疗方法。近来研究表明，阻断免疫检查点通路pd-1/pd-l1已经被证明能够有效地治疗肿瘤。
3.细胞程序性死亡-配体1(programmed cell death 1ligand 1，pd-l1)，作为一种40kda大小的一种跨膜蛋白，又称为表面抗原分化簇274，主要表达于t细胞、b细胞、dc、巨噬细胞、间充质干细胞、骨髓源性肥大细胞及肿瘤细胞表面。其能够与细胞程序性死亡受体-1(programmed cell deathprotein 1，pd-1)结合，传导抑制性信号，抑制淋巴结cd8

t细胞的增生与淋巴结中抗原特异性t细胞的聚积，显著抑制效应性t细胞的抗肿瘤作用。不仅如此，pd-l1的高表达还会抑制肿瘤组织中邻近巨噬细胞的效应。在荷瘤小鼠中，pd-l1信号途径阻断能够显著激活巨噬细胞，即使是在缺乏t细胞的情况下依然能够发挥显著的抗肿瘤活性。因此，开发pd-1/pd-l1通路的抑制剂依然非常重要。


技术实现要素：

4.鉴于以上技术问题，本发明提供一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，该衍生物能够有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并显著抑制肝细胞癌细胞中pd-l1蛋白的表达。
5.本发明提供的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物或其药学上可接受的盐，其结构式如式ⅰ所示：
[0006][0007]
其中，x选自硫原子、氧原子或氮原子；r选自c1-c5烷基、硝基、氨基、取代氨基、甲氧基、羟基或羧基。
[0008]
优选地，x选自硫原子，r选自甲氧基。
[0009]
本发明还提供了上述衍生物的合成方法，包括以下步骤：
[0010]
将苯甲酸酯或其取代物与质量分数40～80％的水合肼溶液混合，在25～80℃下反
应4～8h，得酰肼类化合物；
[0011]
将酰肼类化合物与硝基杂环醛混合，加入至水和乙醇或甲醇的混合溶剂中溶解，调ph至5-7，在60～90℃回流1～6h，获得粗产物，过滤，得到目标产物。
[0012]
优选地，所述苯甲酸酯或其取代物与水合肼溶液的质量比为1∶1.5～10；
[0013]
所述酰肼类化合物与硝基杂环醛的摩尔比为1～2∶1；
[0014]
所述混合溶剂中乙醇或甲醇与水的体积比为5～20∶3～8。
[0015]
本发明还提供了上述衍生物在制备pd-l1表达抑制剂中的用途。
[0016]
优选地，所述衍生物能够杀伤癌细胞，抑制癌细胞增殖和前移，促进癌细胞凋亡。
[0017]
优选地，所述癌细胞为hepg2细胞或a549细胞。
[0018]
本发明还提供一种药物组合物，其包括所述硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物或其药学上可接受的盐。
[0019]
优选地，还包括药学上可接受的辅料或载体。
[0020]
对比现有技术，本发明的有益效果为：
[0021]
本发明提供的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，能够有效地抑制肝细胞癌细胞的增殖，诱导细胞凋亡，并显著抑制肝细胞癌细胞中pd-l1蛋白的表达；同时，该衍生物对肺癌细胞也具有一定的抑制增殖作用。表明本发明提供的该化合物可以作为pd-l1抑制剂，具有较佳的抗肿瘤应用前景。
附图说明
[0022]
图1是化合物作用于肝细胞癌细胞12小时后对细胞的杀伤作用；
[0023]
图2是化合物作用于肝细胞癌细胞24小时后对细胞的杀伤作用；
[0024]
图3是化合物作用于肝细胞癌细胞36小时后对细胞的杀伤作用；
[0025]
图4是化合物对肝细胞癌细胞增殖的影响；
[0026]
图5是化合物对肝细胞癌细胞迁移的影响；
[0027]
图6是化合物作用于肝细胞癌细胞24小时后对细胞凋亡的影响；
[0028]
图7是化合物作用于肝细胞癌细胞48小时后对细胞凋亡的影响；
[0029]
图8是化合物作用于肝细胞癌细胞12小时后对pd-l1表达的影响；
[0030]
图9是化合物作用于肝细胞癌细胞24小时后对pd-l1表达的影响；
[0031]
图10是化合物作用于肝细胞癌细胞36小时后对pd-l1表达的影响。
[0032]
图11是化合物对肺癌细胞增殖的影响；
[0033]
图12是化合物作用于肺癌细胞24小时后对pd-l1表达的影响。
具体实施方式
[0034]
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。
[0035]
本发明实施例提供的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，其结构式如式ⅰ所示：
[0036][0037]
其中，x选自硫原子、氧原子或氮原子；r选自c1-c5烷基、硝基、氨基、取代氨基、甲氧基、羟基或羧基。
[0038]
该衍生物的基本母核为式ⅰ中虚线框内部分。本发明利用取代的苯甲酰肼与硝基杂环醛合成具有类似经典抗菌药——硝呋齐特的结构的衍生物，硝基杂环醛的杂原子可以是氧、氮或硫原子。经过实验验证，该化合物能够有效地抑制肿瘤细胞的增殖及迁移，促进肿瘤细胞的凋亡，显示出了明显的抗肿瘤作用。重要的是，该化合物显著抑制了免疫抑制分子pd-l1的表达，具有提高机体抗肿瘤免疫的潜力。
[0039]
该衍生物是按照以下方法制备得到：
[0040]
将苯甲酸酯或其取代物与质量分数40～80％的水合肼溶液混合，在25～80℃下反应4～8h，得酰肼类化合物；
[0041]
将酰肼类化合物与硝基杂环醛混合，加入至水和乙醇或甲醇的混合溶剂中溶解，调ph至5-7，在60～90℃下回流1～5h，获得粗产物，过滤，得到目标产物。
[0042]
下面结合具体实施例进行说明。
[0043]
实施例1
[0044]
一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，其结构式如式ⅰ所示：
[0045][0046]
该衍生物是按照以下合成路线得到：
[0047][0048]
具体合成过程为：
[0049]
10mmol的对甲氧基苯甲酸酯溶解于25ml的甲醇中，加入质量分数80％的的水合肼100mmol，混合溶液加热至80℃回流6h，待对甲氧基苯甲酸酯全部反应完毕，减压除去溶剂并干燥，得到对甲氧基苯甲酰肼；
[0050]
将对甲氧基苯甲酰肼和2-硝基噻吩-4-甲醛按照摩尔比1∶1溶解于甲醇、冰醋酸、浓硫酸和水的混合溶液中(四者的体积比为20∶8∶7∶8，水与甲醇的混合溶剂可以增加反应
终产物的产率，利于目标产物的分离)加热至60℃回流6h，反应结束后，抽滤反应物，沉淀用甲醇重结晶得黄色目标化合物，产率：79.4％。
[0051]
该衍生物的表征数据：1hnmr：(400mhz,dmso-d6)δ12.14(s,1h),8.68(s,1h),8.14(d,j＝4.3hz,1h),7.91(d,j＝8.4hz,2h),7.57(d,j＝4.3hz,1h),7.08(d,j＝8.6hz,2h),3.85(s,3h).
13
c nmr(101mhz,dmso-d6)δ157.87,153.39,151.12,147.48,144.62,133.99,131.03,130.84,130.21,129.88,125.24,114.29,55.94。
[0052]
实施例2
[0053]
一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，其结构式如式ⅱ所示：
[0054][0055]
具体合成过程为：
[0056]
取10mmol的间甲基苯甲酸酯溶解于25ml的甲醇中，加入质量分数40％的的水合肼50mmol，混合溶液加热至25℃回流4h，待对甲氧基苯甲酸酯全部反应完毕，减压除去溶剂并干燥，得到间甲基苯甲酰肼；
[0057]
将间甲基苯甲酰肼和2-硝基噻吩-4-甲醛按照摩尔比2∶1溶解于甲醇、冰醋酸、浓硫酸和水的混合溶液中(四者的体积比为15∶8∶4∶5)加热至65℃回流4h，反应结束后，抽滤反应物，沉淀用甲醇重结晶得黄色目标化合物，产率：81.2％。
[0058]
实施例3
[0059]
一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，其结构如式ⅲ所示：
[0060][0061]
该衍生物的具体合成方法为：
[0062]
10mmol的邻羟基苯甲酸酯溶解于25ml的甲醇中，加入质量分数60％的的水合肼15mmol，混合溶液加热至55℃回流5h，待甲氧基苯甲酸酯全部反应完毕，减压除去溶剂并干燥，得到邻羟基苯甲酰肼；
[0063]
将邻羟基苯甲酰肼和5-硝基-2-呋喃甲醛按照摩尔比2∶1溶解于甲醇、冰醋酸、浓硫酸和水的混合溶液中(四者的体积比为2∶1∶1∶1)加热至90℃回流1h，反应结束后，抽滤反应物，沉淀用甲醇重结晶得黄色目标化合物，产率：80.3％。
[0064]
实施例4
[0065]
一种硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，其结构如式ⅳ所示：
[0066][0067]
该衍生物的具体合成方法为：
[0068]
10mmol的间二甲氨基苯甲酸酯溶解于25ml的甲醇中，加入质量分数55％的的水合肼80mmol，混合溶液加热至75℃回流6h，待甲氧基苯甲酸酯全部反应完毕，减压除去溶剂并干燥，得到间二甲氨基苯甲酸酯；
[0069]
将间二甲氨基苯甲酸酯和5-硝基吡咯-2-甲醛按照摩尔比2∶1溶解于甲醇、冰醋酸、浓硫酸和水的混合溶液中(四者的体积比为12∶5∶7∶8)加热至65℃回流3h，反应结束后，抽滤反应物，沉淀用甲醇重结晶得黄色目标化合物，产率：78.9％。
[0070]
下面对本发明提供的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物(各个实施例提供的化合物的抗肿瘤效果基本相同，故以下仅以实施例1提供的化合物为例进行说明)的抗肿瘤效果进行说明。
[0071]
对肝癌细胞的影响：
[0072]
1、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞的杀伤影响
[0073]
将肝细胞癌hepg2细胞铺至细胞96孔板，37℃、5％co2培养箱中孵育16小时后，加入不同浓度的化合物(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40μg/ml)，共培养12小时、24小时及36小时后，通过cck8实验检测化合物对肝细胞癌细胞的杀伤能力。
[0074]
2、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞增殖的影响
[0075]
将肝细胞癌hepg2细胞铺至细胞6孔板，37℃、5％co2培养箱中孵育16小时后，加入不同浓度的化合物(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml)。继续培养24小时后，将相应的6孔板中的培养基弃掉，换成不含药物的10％胎牛血清的完全培养基，放入37℃、5％co2培养箱继续培养，待观察到形成肉眼可见的细胞克隆团块，且细胞团块大小适中时，取出6孔板，弃去培养基，用3ml pbs洗两次，每孔加入1ml 4％组织细胞固定液，固定30min后弃去组织细胞固定液，每孔加入结晶紫染液染色30min，后弃去结晶紫染液，用超纯水冲去剩余结晶紫即可，将细胞板晾干后，进行拍照并分析化合物对肝细胞癌细胞增殖的影响。
[0076]
3、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞迁移的影响
[0077]
应用细胞划痕实验检测新化合物对肝细胞癌细胞迁移的影响。将肝细胞癌hepg2
细胞铺至细胞6孔板，37℃、5％co2培养箱中孵育16小时后，用200μl移液器头在细胞板中央上呈“一”字划痕，之后加入不同浓度的化合物(0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml)，继续培养24小时及48小时，分别用显微镜拍摄细胞迁移情况。
[0078]
4、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞凋亡的影响
[0079]
将肝细胞癌hepg2细胞铺至6孔细胞板，37℃、5％co2培养箱中孵育16h后，加入不同浓度的化合物(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)，继续培养24h及48h，弃去培养基，收集细胞，按照annexin v-fitc/pi细胞凋亡流式检测试剂盒，检测化合物对肝细胞癌细胞凋亡的影响。
[0080]
5、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞中pd-l1蛋白表达的影响
[0081]
将肝细胞癌hepg2细胞铺至细胞6孔板，37℃、5％co2培养箱中孵育16小时后，加入不同浓度的化合物(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)，共培养12小时、24小时及36小时后，通过westernblot实验检测化合物对肝细胞癌细胞中pd-l1蛋白表达的影响。
[0082]
6、结果
[0083]
6.1、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞的杀伤影响
[0084]
通过cck8实验检测了化合物作用于肝细胞癌细胞12小时、24小时及36小时后，对细胞的杀伤作用。
[0085]
结果显示，当化合物作用于细胞12小时后，药物浓度为10、20、40μg/ml时，化合物显著杀伤了肝细胞癌细胞(图1)。当化合物作用于细胞24小时及36小时后，药物浓度为5、10、20、40μg/ml时，化合物均显著杀伤了肝细胞癌细胞(图2及图3)。表明该衍生物对肝细胞癌细胞具有一定的杀伤作用。
[0086]
6.2、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞增殖的影响
[0087]
通过细胞克隆实验检测了不同浓度(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml)的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞增殖的影响。
[0088]
结果显示，化合物的浓度为0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml时，显著抑制了肝细胞癌细胞的增殖(图4)。表明该衍生物具有抑制肝细胞癌细胞增殖的作用。
[0089]
6.3、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞迁移的影响
[0090]
应用细胞划痕实验检测了不同浓度(0、0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml)化合物作用于肝细胞癌细胞24小时及48小时后对细胞迁移的影响。
[0091]
结果显示，化合物作用于细胞12小时后，浓度为1.25、2.5、5、10μg/ml时，均显著抑制了肝细胞癌细胞的迁移；作用于细胞48小时后，浓度为0.625、1.25、2.5、5、10μg/ml时，均显著抑制了肝细胞癌细胞的迁移(图5)。表明该衍生物具有抑制肝细胞癌细胞迁移的作用。
[0092]
6.4、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞凋亡的影响
[0093]
应用流式细胞术检测了不同浓度(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)化合物作用于肝细胞癌细胞24小时及48小时后对细胞凋亡的影响。
[0094]
结果显示，化合物作用于细胞24小时后，浓度为1.25、2.5及5μg/ml时，均显著增加了肝细胞癌细胞的凋亡(图6)；作用于细胞48小时后，浓度为0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/ml时，均显著增加了肝细胞癌细胞的凋亡(图7)。表明该衍生物具有显著增加肝细胞癌细胞凋亡的作用。
[0095]
6.5、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肝细胞癌细胞中相关蛋白表达的影响
[0096]
应用westernblot实验检测了不同浓度(0、0.3125、0.625、1.25、2.5、5μg/ml)化合物作用于肝细胞癌细胞12小时，24小时及36小时后细胞中pd-l1蛋白表达的影响。
[0097]
结果显示，化合物作用于肝细胞癌细胞12小时、24小时以及36小时后，浓度为2.5及5μg/ml时，均显著抑制了pd-l1蛋白的表达(图8-10)。表明该化合物能够作为一种pd-l1的抑制剂。
[0098]
对肺癌细胞的影响：
[0099]
1、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肺癌细胞增殖的影响
[0100]
通过细胞克隆实验检测了不同浓度(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4μg/ml)的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肺癌细胞增殖的影响。
[0101]
结果显示，化合物的浓度为0.1、0.2、0.4μg/ml时，显著抑制了肝细胞癌细胞的增殖(图11)。表明该衍生物具有抑制肺癌细胞增殖的作用。
[0102]
2、硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物对肺癌细胞中pd-l1表达的影响
[0103]
应用westernblot实验检测了不同浓度(0、0.3125、0.625、1.25、2.5μg/ml)化合物作用于肺癌细胞24小时后细胞中pd-l1蛋白表达的影响。
[0104]
结果显示，化合物作用于肺癌细胞24小时后，浓度为0.625、1.25及2.5μg/ml时，均显著抑制了pd-l1蛋白的表达(图12)。表明该化合物能够作为一种pd-l1的抑制剂。
[0105]
综上所述，本发明提供的硝呋齐特类杂环苄叉酰肼衍生物，能够显著杀伤肝细胞癌细胞及肺癌细胞，抑制细胞的增殖及迁移，促进细胞的凋亡，并能够显著抑制肿瘤细胞中pd-l1的表达，能够作为一种新型pd-l1抑制剂。
[0106]
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0107]
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。