一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体及其应用

1.本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体及其应用。


背景技术：

2.肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts, cafs）是肿瘤微环境中一类特殊的间质细胞，研究显示，cafs对维持肿瘤的标志性特征，如增殖信号的持续活化、诱导血管生成、抵抗细胞死亡、改变细胞能量代谢等具有重要意义。既往研究提示cafs具有高度的异质性且缺乏有效分群的表面标记物，导致身份识别困难，严重阻碍了对不同亚群肿瘤成纤维细胞功能的研究以及靶向治疗手段的研发。因此，非常有必要进一步探索和寻找cafs新的表面相关分子标记物，对cafs进行更为详细的分类和功能研究。
3.核酸适配体（aptamer）是用指数富集的配基系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，selex）从大容量rna/单链dna随机文库中筛选得到的能与靶标物质特异性结合的寡核苷酸序列，被称为化学抗体。与传统的抗体相比，具有特异性强，亲和力高，稳定性好，易于进行化学修饰形成各种形式的分子探针等特点。cell-selex是以完整细胞作为靶标进行核酸适配体筛选的技术，筛选前无需预先了解细胞表面的蛋白情况，因此有可能发现新的细胞表面标记物。由于筛选出的核酸适配体主要与细胞表面分子结合，特别适合用来制备分子探针进行靶细胞分群、分选以及作为靶向载体等使用。至今未见针对肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体及其应用。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
6.本发明提供了一种靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体序列如下：5
’‑
agcgtggaggataattaggcatccgttccgcctaggaaattattcaatctacgc-3’。
7.进一步地，所述核酸适配体靶向识别肿瘤相关成纤维细胞。
8.进一步地，所述核酸适配体对肿瘤相关成纤维细胞的解离常数kd为15.70
ꢀ±ꢀ
2.47nm。
9.本发明还提供一种肿瘤相关成纤维细胞特异性成像的分子探针，其特征在于，所述分子探针是以权利要求1所述的核酸适配体为核心，连接生物素、荧光标记物或化学发光标记物。
10.本发明还提供一种如权利要求1所述的核酸适配体在制备肿瘤相关成纤维细胞特异性相关靶分子的鉴定及功能研究的试剂中的应用。
11.本发明还提供一种如权利要求1所述的核酸适配体在制备肿瘤相关成纤维细胞检测试剂或试剂盒中的应用。
12.本发明还提供一种如权利要求1所述的核酸适配体在制备肿瘤相关成纤维细胞捕获、富集和纯化制剂中的应用。
13.本发明还提供一种如权利要求1所述的核酸适配体在肿瘤相关成纤维细胞靶向给药系统中的应用，其特征在于，所述应用包括用于药物的靶向运输和定点释放。
14.进一步地，所述的靶向给药系统是基于权利要求1所述的核酸适配体与肿瘤相关成纤维细胞特异性识别、结合与解离的作用。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果如下。
16.1.提供了一种新的靶向肿瘤相关成纤维细胞的核酸适配体序列，它可以特异性识别肿瘤相关成纤维细胞，并且能够对不同来源的肿瘤相关成纤维细胞进行识别分类，有效分辨肿瘤相关成纤维细胞的异质性。
17.2.本发明的核酸适配体具有高亲和力，对肿瘤相关成纤维细胞的解离常数kd值为纳摩尔级（15.70
±
2.47nm），具有可体外合成及修饰、化学性质稳定、无免疫原性等特点。
18.3.本发明的核酸适配体在肿瘤细胞生物学、临床实验诊断学、分子成像新技术开发以及靶向治疗方面具有广阔的应用前景和重要的学术价值。
19.4.本发明的核酸适配体的合成成本较抗体制备的成本低、且周期短，重现性好。
附图说明
20.图1为核酸适配体的空间结构示意图。
21.图2为实施例中荧光显微镜观察成纤维相关标志物在肿瘤相关成纤维细胞上的表达。
22.图3为实施例中流式细胞术分析所述核酸适配体与肿瘤相关成纤维细胞和癌旁成纤维细胞的结合能力图。
23.图4为实施例中流式细胞术分析测定所述核酸适配体对肿瘤相关成纤维细胞的解离常数绘制曲线图。解离常数kd=15.70
ꢀ±ꢀ
2.47nm。
24.图5为实施例中流式细胞术分析所述核酸适配体在不同温度下与肿瘤相关成纤维细胞的结合活性结果。
25.图6为实施例中流式细胞术分析所述核酸适配体与临床不同大肠癌组织的肿瘤相关成纤维细胞的结合能力图。其中，a为流式细胞术结果图；b为荧光定量分析图。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例详细描述本发明，以下所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
27.洗涤缓冲液（ph=7.4）由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其在溶剂中的浓度为：4.5g/l 葡萄糖、137mm nacl、2.7mm kcl、2mm kh2po4、5mm mgcl2、1mm cacl2。
28.结合缓冲液（ph=7.4）是含有1mg/ml bsa和0.1 mg/ml鲱鱼精dna的洗涤缓冲液。
29.实施例1 核酸适配体的筛选。
30.（1）随机筛选文库的准备：委托生工生物工程股份有限公司合成随机单链dna文库（5
’‑
aaggagcagcgtggaggatannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnttagggtgtgtcgtcgtggt-3’），其中，n代表碱基a，t，c，g中任一个；取1管10od的随机单链dna文库，加入结合缓冲液，涡旋震荡溶解，盖好离心管盖，95℃水浴5min，迅速加至冰上8min，备用。
31.（2）肿瘤相关成纤维细胞和癌旁成纤维细胞的分离和制备：取来自同一患者的临床大肠癌新鲜组织或癌旁组织，使用pbs（含有双抗、庆大霉素和两性霉素）冲洗至组织清澈，加入3-5倍组织体积的胶原酶（2mg/ml），置于组织处理器中处理。使用10%dmem-f12培养基重悬组织，转移至培养瓶中，放置培养箱中培养，三天后换液。胰酶消化细胞，将细胞进行扩大培养，作为适配体筛选的靶细胞。
32.（3）核酸适配体筛选：取分离培养后的肿瘤相关成纤维细胞，洗涤缓冲液洗涤两次，将步骤（1）准备的随机文库加入培养皿，与肿瘤相关成纤维细胞孵育，4℃摇床震荡1h；弃上清；洗涤缓冲液洗涤肿瘤相关成纤维细胞三次；用细胞刮将肿瘤相关成纤维细胞刮下，用1ml洗涤缓冲液将肿瘤相关成纤维细胞重悬，移入至离心管中，95℃水浴5min，1000rpm室温离心5min，留取上清。
33.（4）pcr扩增：取100
µ
l步骤（2）所得的上清样品，加入到1ml pcrmix液中；涡旋振荡混匀后，按每管50
µ
l分装进行pcr扩增，扩增条件为：94℃加热预变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，12个循环。其中1ml pcrmix液中含有：ddh2o 865
µ
l；10
×
pcr缓冲液100
µ
l；上游引物：5
’‑
fam-aaggagcagcgtggaggata-3’；下游引物：5
’‑
biotin-accacgacgacacaccctaa-3’各5
µ
l；rtaq酶5
µ
l；dntp 20
µ
l。所述上下游引物均委托生工生物工程股份有限公司合成。
34.（5）单链dna的制备：将60
µ
l链霉亲和素琼脂糖珠悬液（购于ge healthcase公司）在5000rpm转速下离心取上清，沉淀用pbs洗涤，离心取上清；重复洗涤一次。将步骤（4）中pcr扩增所得的扩增产物与洗涤后的链霉亲和素琼脂糖珠在常温下孵育30min，通过扩增产物双链dna上的生物素与琼脂糖珠上的链霉亲和素发生亲和作用，得到结合有双链dna的琼脂糖珠上，5000rpm转速下离心去上清，沉淀用pbs离心洗涤两次；然后加入200
µ
l 0.1m naoh溶液常温下与沉淀孵育10min，使琼脂糖珠上的双链dna变性。将碱变性反应得到的反应液在5000rpm离心2min，收集上清。
35.（6）脱盐：将脱盐柱（购于ge healthcase公司）用15ml无菌水洗涤后，加入步骤（4）中经过碱变性后得到的上清液，自然滴完，然后加入1ml无菌水，收集滴下的溶液，此即为单链dna文库。
36.（7）重复多轮筛选：将步骤(6)得到的单链dna文库替代步骤（2）中的随机文库，重复上述步骤（2）~（5）所示的筛选、pcr扩增、单链dna的制备及脱盐过程。重复筛选过程中用流式细胞仪（美国bd公司）监测所得单链dna文库与肿瘤相关成纤维细胞结合能力的情况，直至11轮筛选后单链dna文库与肿瘤相关成纤维细胞结合能力处于饱和状态，将所得产物经克隆测序分析，对测序结果整理分析后，最终可得到一条与肿瘤相关成纤维细胞结合能力最强的序列：5
’‑
agcgtggaggataattaggcatccgttccgcctaggaaattattcaatctacgc-3’。
37.利用oligo-analyzer在线软件分析出所述核酸适配体序列的二级结构示意图如图1所示。
38.实施例2荧光显微镜观察成纤维细胞标志物在肿瘤相关成纤维细胞上的表达情况。
39.取分离培养的肿瘤相关成纤维细胞，接种于盖玻片上，24h后，pbs洗涤细胞两次；加入4%多聚甲醛室温固定25min，pbs洗涤三次；加入0.1%triton x-100室温透膜10min，pbs洗涤三次；加入5�s室温封闭60min后，吸弃fbs，加入一抗（α-sma、fap、pdgfrβ）4℃过夜孵育。pbs洗涤三次，加入荧光二抗室温45min；pbs洗涤三次，加入dapi室温30min；pbs洗涤三次，ddh2o漂洗一次，封片，自然风干。如图2所示，分离的肿瘤相关成纤维细胞上均能观察到很强的荧光信号，提示分离培养的肿瘤成纤维细胞均表达成纤维相关标志物α-sma、fap和pdgfrβ。
40.实施例3流式细胞术检测所述核酸适配体与肿瘤相关成纤维细胞和癌旁成纤维细胞的结合情况。
41.取上述肿瘤相关成纤维细胞或癌旁成纤维细胞，分别用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，1000rpm离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。取fam标记的所述核酸适配体分别与肿瘤相关成纤维细胞或癌旁成纤维细胞于4℃摇床上轻摇孵育30min，1000rpm室温离心5min后去上清，用4℃预冷洗涤缓冲液洗涤细胞两次。最后加入300
µ
l pbs用于流式细胞仪检测，测定细胞的荧光强度。如图3所示，肿瘤相关成纤维细胞上的荧光强度明显高于来自癌旁组织的成纤维细胞，提示所述核酸适配体能够特异性识别肿瘤相关成纤维细胞。
42.实施例4流式细胞术测定所述核酸适配体对肿瘤相关成纤维细胞的解离常数。
43.取肿瘤相关成纤维细胞，用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，与不同浓度的fam荧光标记的所述核酸适配体孵育，依实施例3操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度。以核酸适配体的浓度为横坐标，相应的荧光强度值为纵坐标，按照公式y=bmaxx/(kd x)拟合曲线，得到所述核酸适配体的解离曲线，如图4所示。由解离曲线得到的所述核酸适配体的解离常数kd为15.70
ꢀ±ꢀ
2.47nm。
44.实施例5流式细胞术检测所述核酸适配体在不同温度下与肿瘤相关成纤维细胞的结合活性。
45.将肿瘤相关成纤维细胞用无酶消化液消化并吹打成单个细胞悬液，与fam荧光标记的所述核酸适配体分别在不同温度（4℃和37℃）下孵育，依实施例3操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图5所示，在所使用的不同温度条件下，所述核酸适配体均显示了与肿瘤相关成纤维细胞的良好结合能力，为在不同条件下进行所述核酸适配体的应用提供了可能。
46.实施例6流式细胞术检测所述核酸适配体对临床不同大肠癌组织的肿瘤相关成纤维细胞的结合情况。
47.取临床不同大肠癌患者的大肠癌新鲜组织，依实施例1操作，分别分离培养肿瘤相关成纤维细胞，与fam荧光标记的所述核酸适配体孵育，依实施例3操作，流式细胞仪检测细胞的荧光强度，结果如图6所示：所述核酸适配体与不同患者来源的肿瘤相关成纤维细胞具有不同的结合能力，提示所述核酸适配体具有与特定肿瘤相关成纤维细胞亚群的结合能力。本发明所述核酸适配体有效分辨肿瘤相关成纤维细胞的异质性，为后续对肿瘤相关成纤维细胞高度异质性的研究提供可靠依据。