细胞培养装置和方法与流程

1.本发明涉及细胞培养，特别涉及细胞培养装置和方法。


背景技术：

2.体外培养细胞的环境还必须具备一定的物理化学特性，维持细胞生存和増殖所要求的正常生理性条件，包括温度、渗透压、气相和ph等。传统细胞培养使用培养瓶和培养皿等容器，然而培养瓶的气体交换主要通过瓶盖上的透气膜进行，面积较小，无透气瓶盖则通过拧松瓶盖，容易污染；培养皿气体交换空间较小，且易受污染。
3.此外，在培养细胞的过程中，对细胞进行传代是一项常规的操作，传代可以扩大细胞培养的数量，同时也避免了因细胞进入稳定期造成接触抑制，乃至衰亡期而大量死亡。但，传统的细胞传代需要肉眼观察，主观性强，且需手动打开培养瓶、培养皿；还需要通过深入移液枪进行液体操纵，污染风险大。


技术实现要素：

4.为解决上述现有技术方案中的不足，本发明提供了一种细胞培养装置。
5.本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
6.细胞培养装置，所述细胞培养装置包括培养单元、输送单元和监测单元，所述培养单元包括第一培养容器，所述监测单元包括光源、光电探测器和分析模块；
7.所述第一培养容器的底部具有外凸部，透气膜设置在所述第一培养容器的底端；
8.所述光源设置在所述外凸部的上侧，所述光电探测器设置在所述外凸部的下侧。
9.本发明的目的还在于提供了细胞培养方法，该发明目的是通过以下技术方案得以实现的：
10.细胞培养方法，所述细胞培养方法为：
11.细胞在第一培养容器的底部的透气膜上培养，所述第一培养容器的底部具有外凸部，透气膜设置在所述第一培养容器的底端；
12.光源发出的光照射凸出部内透气膜上侧的细胞，处于所述透气膜下侧的光电探测器接收光信号，转换为电信号并送分析模块；
13.分析模块根据所述电信号得出细胞的图像，并得出细胞培养状况。
14.与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：
15.1.自动化；
16.通过在第一培养容器的底部设置外凸部，使得能够实时监测细胞培养状况，并根据培养状况置换培养基、转移细胞扩大培养量等，全程自动化，无需人工操作，避免了监测的主观性；
17.2.细胞监测结果准确；
18.利用图像分割、参数矩阵构建，校正了图像中各像素点灰度值，使得图像的光照均衡处理，提高了图像修复效果；
19.在细胞图像的分割中，不仅利用本专利的图像修复方法，还结合了双阈值分割以及孔洞填充，从而实现了准确分割，提高了细胞监测的准确性；
20.3.结构简单；
21.根据需要设置多个培养容器，但仅在第一培养容器上设置监测单元，利用监测单元输出的培养状况得出其它培养容器的培养状况，降低二路装置结构复杂度和成本。
附图说明
22.参照附图，本发明的公开内容将变得更易理解。本领域技术人员容易理解的是：这些附图仅仅用于举例说明本发明的技术方案，而并非意在对本发明的保护范围构成限制。图中：
23.图1是根据本发明实施例的细胞培养装置的结构示意图；
24.图2是根据本发明实施例的细胞培养装置的另一结构示意图；
25.图3是根据本发明实施例的分析模块工作方式的流程示意图。
具体实施方式
26.图1-3和以下说明描述了本发明的可选实施方式以教导本领域技术人员如何实施和再现本发明。为了解释本发明技术方案，已简化或省略了一些常规方面。本领域技术人员应该理解源自这些实施方式的变型或替换将在本发明的范围内。本领域技术人员应该理解下述特征能够以各种方式组合以形成本发明的多个变型。由此，本发明并不局限于下述可选实施方式，而仅由权利要求和它们的等同物限定。
27.实施例1：
28.图1示意性地给出了本发明实施例1的细胞培养装置的结构简图，如图1所示，所述细胞培养装置包括：
29.培养单元，所述培养单元包括第一培养容器11，所述第一培养容器11为密封状态；所述第一培养容器11的底部具有外凸部12，透气膜13设置在所述第一培养容器11的底端，也即，外凸部12的底端为透气膜13；
30.输送单元21，所述输送单元21包括泵、管道，用于往所述第一培养容器11内输送种子液或培养基；
31.监测单元，所述监测单元包括光源61、光电探测器62和分析模块；所述光源61设置在所述外凸部12的上侧，所述光电探测器62设置在所述外凸部12的下侧。
32.为了降低生物毒性，进一步地，所述透气膜13包括蛋白、脂质体和硅胶，质量比为1：200～290：500～700，如，所述硅胶孔径为100-200埃，粒径为4-10μm；所述脂质体包括卵磷脂。
33.为了提高细胞培养数量，进一步似，所述培养单元还包括第二培养容器31，透气膜32设置在所述第二培养容器31的底端；所述第一培养容器11和第二培养容器31间通过输送单元21连通。
34.为了降低结构复杂度，进一步地，所述第二培养容器31上未设置所述监测单元和所述外凸部12，利用监测单元获得的第一培养容器11内细胞培养状况了解第二培养容器31内细胞培养状况，因为二个培养容器内细胞相同、培养基相同。
35.本发明实施例的细胞培养方法，所述细胞培养方法为：
36.细胞在第一培养容器11的底部的透气膜13上培养，所述第一培养容器11的底部具有外凸部12，透气膜13设置在所述第一培养容器11的底端；
37.光源61发出的光照射凸出部12内透气膜13上侧的细胞，处于所述透气膜13下侧的光电探测器62接收光信号，转换为电信号并送分析模块；
38.分析模块根据所述电信号得出细胞的图像，并得出细胞培养状况。
39.为了提高细胞培养状况的准确性，进一步地，如图3所示，所述分析模块的工作方式包括以下步骤：
40.(a1)将尺寸为m
×
n的所述图像分割为尺寸为m
×
n的多个子块，m＝m
×
s，n＝n
×
t；
41.(a2)获得所述图像的平均灰度值μ，以及第c行、第d列个子块的平均灰度值μ
cd
，从而获得与第c行、第d列个子块对应的比值
42.p(i,j)为所述图像中坐标(i,j)处像素点的灰度值；
43.(a3)构建调整参数矩阵
44.(a4)对于矩阵r
′
中以r
cd
为中心的尺寸为(2l 1)
×
(2l 1)的邻域范围ω，得到比值r
cd
的校正值(a,b)是所述邻域范围ω内各元素的坐标值，σ∈[5.5,7]，l是正整数，如为1、2或3；
[0045]
(a5)得到第c行、第d列个子块中像素点的灰度值p(i,j)校正值p
′
(i,j)＝p(i,j)
×r′
cd
，从而得到修复后图像；
[0046]
(a6)对修复后的图像进行双阈值分割，实现图像的二值化；
[0047]
(a7)对细胞区进行填充，从而得到细胞的培养状况，如细胞汇合度。
[0048]
为了进一步修复图像，进一步地，步骤(a5)中，获得修复后图像平均灰度值μ
′
，得到修复后图像像素点的校正值到修复后图像像素点的校正值
[0049]
为了提高分割效果，进一步地，用形态学的孔洞填充方法对细胞区域去进行填充，之后利用面积滤波方法处理。
[0050]
为了提高细胞培养数量，进一步地，在细胞培养过程中，将所述第一培养容器内的部分细胞转移到第二培养容器，利用第一培养容器内细胞培养状况得出第二培养容器内细胞培养状况。
[0051]
实施例2：
[0052]
根据本发明实施例1的图像的细胞培养装置和方法的应用例。
[0053]
在该应用例中，如图1所示，细胞培养装置中，培养单元仅设置一个培养容器，也即第一培养容器11，第一培养容器11呈圆柱形；透气膜13包括蛋白、脂质体和硅胶，质量比为1：240：600，所述硅胶孔径为150埃，粒径为7μm；所述脂质体包括卵磷脂，如蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、人工合成卵磷脂、鞘磷脂等；
[0054]
监测单元中，外凸部12下侧依次设置物镜和光电探测器62，光电探测器62采用ccd；
[0055]
输送单元21包括第一管道、第二管道和第三管道，所述第一管道的一端利用切换模块分别连通种子液、培养基和无菌储液袋，另一端处于第一培养容器11内的底部，第二管道的一端连通废液袋，另一端处于所述第一培养容器11内，且位置高于第一管道处于第一培养容器11内的底端位置。
[0056]
本发明实施例的细胞培养方法，也即本实施例的细胞培养装置的工作方法，所述细胞培养方法为：
[0057]
通过切换模块切换，种子液通过输送单元2的第一管道送第一培养容器11内，细胞在第一培养容器11的底部的透气膜13上培养，所述第一培养容器11的底部具有外凸部12，透气膜13设置在所述第一培养容器11的底端；
[0058]
光源61发出的光照射凸出部12内透气膜13上侧的细胞，处于所述透气膜13下侧的光电探测器62接收光信号，转换为电信号并送分析模块；
[0059]
分析模块根据所述电信号得出细胞的图像，并得出细胞培养状况：
[0060]
如培养时间长，需进行换液，则需利用输送单元2的第二管道抽出第一培养容器11内的部分培养基；再利用所述第一管道向所述第一培养容器11内注入新的培养基；
[0061]
如培养达到要求，通过切换模块切换，并利用第一管道将第一培养容器11内的细胞送无菌储液袋中；
[0062]
如图3所示，所述分析模块的工作方式包括以下步骤：
[0063]
(a1)将尺寸为m
×
n的所述图像分割为尺寸为m
×
n的多个子块，m＝m
×
s，n＝n
×
t；
[0064]
(a2)获得所述图像的平均灰度值μ，以及第c行、第d列个子块的平均灰度值μ
cd
，从而获得与第c行、第d列个子块对应的比值
[0065]
p(i,j)为所述图像中坐标(i,j)处像素点的灰度值；
[0066]
(a3)构建调整参数矩阵
[0067]
(a4)对于矩阵r
′
中以r
cd
为中心的尺寸为(2l 1)
×
(2l 1)的邻域范围ω，得到比值rcd
的校正值(a,b)是所述邻域范围ω内各元素的坐标值，σ∈[5.5,7]，l为1、2或3；
[0068]
(a5)得到第c行、第d列个子块中像素点的灰度值p(i,j)校正值p
′
(i,j)＝p(i,j)
×r′
cd
，从而得到初步修复后图像；
[0069]
(a6)获得初步修复后图像平均灰度值μ
′
，得到修复后图像像素点的校正值
[0070]
对修复后的图像进行双阈值分割，实现图像的二值化，具体为；
[0071]
首先对处理完的图像进行高斯滤波以消除部分背景噪声，然后针对图像特点，将图像分为光晕、背景、细胞三类，选取两个最优阈值使得这三类之间的类间方差达到最大，并基于这两个最优阈值对图像进行分类，最后将背景和光晕的灰度设为0，细胞像素设为255，实现图像的二值化；
[0072]
用形态学的孔洞填充方法对部分细胞区域进行填充，同时通过面积滤波方法，滤除部分细小的杂质，通过对分割后的细胞面积进行统计排序；本实施例的面积滤波阈值设为50，连通域面积小于50的将会被滤除，从而获得细胞培养状况，如汇合度。
[0073]
实施例3：
[0074]
根据本发明实施例1的图像的细胞培养装置和方法的应用例，与实施例2不同的是：
[0075]
1.在细胞培养装置内，如图2所示，还包括第二培养容器31，第二培养容器31的底端设置透气膜32，该透气膜32和第一培养容器11底端的透气膜13相同，第二培养容器31上未设置外凸部12，也即无需配置监测单元；
[0076]
输送单元还包括更多管道，如利用管道，使得第二培养容器31连通培养基、废液袋和无菌储液袋；
[0077]
2.在细胞培养方法中，对于分析模块输出的细胞培养状况：
[0078]
若第一培养容器11内的细胞汇合度超过阈值，如85％，利用输送单元2将第一培养容器11内的部分细胞送第二培养容器31，利用监测单元输出的第一培养容器11内细胞培养状况获知第二培养容器31内的细胞培养状况；
[0079]
如培养时间长，需进行换液，则需利用输送单元2的管道分别抽出第一培养容器11和第二培养容器31内的部分培养基；再利用所述管道向所述第一培养容器11和第二培养容器31内注入新的培养基；
[0080]
如培养达到要求，利用管道分别将第一培养容器11和第二培养容器31内的细胞送无菌储液袋中。
[0081]
实施例4：
[0082]
根据本发明实施例1的图像的细胞培养装置和方法的应用例，与实施例3不同的是：
[0083]
第一培养容器和第二培养容器结构相同，也即，第二培养容器具有和第一培养容
器相同的外凸部。