一种高效诱导小麦花药出愈的培养基

1.本发明涉及花培育种技术领域，具体的，涉及一种高效诱导小麦花药出愈的培养基。


背景技术：

2.用培养基培养植物的花药，调动其中单倍体小孢子的干性，将其诱导成可持续分裂并具有再生出完整植株能力(即具全能性)的愈伤组织，是植物花培育种的重要技术关键。这样做的目的在于，通过单倍体加倍，可省去漫长的杂交后代自交纯化过程，从而大幅度加速育种进程。由于小麦具有复杂而庞大的基因组，客观地决定了小麦花培育种会有更多保留或选出优异遗传变异的机会和通过单倍体加倍加速纯化的必要性。
3.大量的研究和应用实践表明，培养基是花培育种最关键的技术，但使用不同的培养基，花培育种的效率有很大的不同。关于花药培养的培养基，已报道了不少驰名的培养基，如n6培养基(朱至清等，1975，中国科学，5：484-490)、马铃薯
‑ⅱ
培养基(chuang,et al,1978,proc.symp.plant tissue cult.,sci.press,peking,p.51-65)、c17培养基(王培等，1986，植物学报，28：38-45)、w14【欧阳俊文等，1988，中国科学院遗传所《研究工作年报(1987-1988)》，科学出版社，102】等。特别是c17、w14培养基，就是专门为小麦花培研制的。但是，在现实的花培育种应用中，诱导小孢子成愈伤组织的比率仍然还不够高。
4.为避开花培育种较突出的小孢子出愈率低的问题，一些研究者另辟蹊径找到了用远缘杂交导致父本染色体消失(laurie,et al,1988,theor.appl.genet.,76,393-397)和用单倍体诱导系诱导孤雌发育【ravi,et al,2010,nature,464,615-618；黎亮等，2012,中国农业大学学报，17(1)：9-13；zhao,et al,2013,plant physiology,163：721-731；liu,et al,2020,plant biotech.j.,18:316
–
318】等途径创造单倍体的方法。这样做虽取得了可喜的成效，并有其显著的特色，但通过花培诱导单倍体依然是不可替代的，因为花培并不仅仅能获得单倍体，还具有以下独特的优点：
5.1.可克隆小孢子中出现的常规育种或其他方法无机会出现的遗传重组体(小孢子数量巨大、类型众多，是其他技术无法比拟的)；
6.2.可获得常规育种时因配子识别或柱头选择等导致的无法保留的新变异；
7.3.可通过培养基繁衍和扩增常规育种或其他方法无法获得的新变异；
8.4.可通过离体培养在单细胞水平上进一步诱发和创造新变异。
9.鉴于花培的诸多不可替代的优势，花药培养技术的地位并未受到动摇，育种家们十分期望有更高效率的花药(花粉)培养基问世。


技术实现要素：

10.本发明提出一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，解决了现有技术中的花培育种小孢子出愈率低的问题。
11.本发明的技术方案如下：
12.一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，
13.调整氮源：去掉无机还原态氮，将还原态氮调整为有机还原态氮，所述有机还原态氮包括l-谷氨酰胺、l-精氨酸或所述有机还原态氮包括l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-天冬素、甘氨酸；
14.和/或，
15.调整碳源：将蔗糖调整为葡萄糖。
16.作为进一步的技术方案，以mg/l为质量浓度单位计算，所述氮源包括以下组分：谷氨酰胺500-1200、l-精氨酸150-200或谷氨酰胺500-1200、l-精氨酸150-200、l-天冬素110-135、甘氨酸35-60；
17.和/或，
18.所述碳源包括以下组分：葡萄糖50000-60000。
19.本发明还提出了一种高效诱导小麦花药出愈的pci培养基，所述培养基为pci培养基，所述pci培养基的配方包括大量元素、氮源、铁盐、微量元素、有机成分、碳源；
20.以mg/l为质量浓度单位计算，所述大量元素包括以下组分：kno
3 1300-1700，cacl2·
2h2o 120-135，mgso4·
7h2o 155-180，kh2po
4 410-500；
21.以mg/l为质量浓度单位计算，所述氮源包括以下组分：l-谷氨酰胺500-1200，l-精氨酸150-200，l-天冬素110-135，甘氨酸35-60；
22.以mg/l为质量浓度单位计算，所述碳源包括以下组分：葡萄糖50000-60000。
23.作为进一步的技术方案，所述pci培养基的配方包括大量元素、氮源、铁盐、微量元素、有机成分、碳源；
24.以mg/l为质量浓度单位计算，所述大量元素包括以下组分：kno
3 1500，cacl2·
2h2o 130，mgso4·
7h2o 160，kh2po
4 450；
25.以mg/l为质量浓度单位计算，所述氮源包括以下组分：l-谷氨酰胺1000，l-精氨酸170，l-天冬素130，甘氨酸50；
26.以mg/l为质量浓度单位计算，所述铁盐包括以下组分：feso4·
7h2o 27.85，na
2-edta
·
2h2o 37.25；
27.以mg/l为质量浓度单位计算，所述微量元素包括以下组分：ki 0.415，h3bo
3 3.1，mnso4·
4h2o 11.15，znso4·
7h2o 4.3，na2mno4·
2h2o 0.125，cuso4·
5h2o 0.0125，cocl2·
6h2o 0.0125；
28.以mg/l为质量浓度单位计算，所述有机成分包括以下组分：肌醇100，生物素3，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.4，盐酸硫胺素0.5，甘氨酸2；
29.以mg/l为质量浓度单位计算，所述碳源包括以下组分：葡萄糖54000。
30.所述pci培养基的设计思路如下：
31.(1)重新设计大量元素组成
32.有机还原态氮(＝nh、-nh2)有利于愈伤组织早出、快长，但与无机还原态氮(nh
4
)共存时形成的氨毒害较重，ca
2
虽有利于保护细胞膜，但影响小孢子细胞分裂；因此，去掉大量元素中的无机还原态氮(nh
4
)，进一步降低ca
2
水平，并根据其他元素的功能与作用性质，重新设计了培养基的大量元素组成，具体组方(mg/l)为：kno
3 1500、cacl2·
2h2o 130、mgso4·
7h2o 160、kh2po
4 450；
33.(2)还原态氮仅使用有机态类型
34.有机还原态氮(＝nh、-nh2)可诱导细胞更早、更快地分裂，促进愈伤组织较快地增长，故将还原态氮全部换成有机态类型，设计培养基的还原态氮组成(mg/l)为：l-谷氨酰胺1000、l-精氨酸170、l-天冬素130、甘氨酸50；
35.(3)采用ms培养基的铁盐
36.培养基的铁盐同ms培养基(mg/l)：feso4·
7h2o 27.85、na
2-edta
·
2h2o 37.25；
37.(4)采用1/2水平的ms培养基的微量元素
38.调整培养基的微量元素(mg/l)为：ki 0.415、h3bo
3 3.1、mnso4·
4h2o 11.15、znso4·
7h2o 4.3、na2mno4·
2h2o 0.125、cuso4·
5h2o 0.0125、cocl2·
6h2o 0.0125；
39.(5)采用ms培养基的专属有机成分
40.培养基的专属有机成分同ms培养基(mg/l)：肌醇100、生物素1.5、烟酸0.5、盐酸吡哆醇0.4、盐酸硫胺素0.5、甘氨酸2；
41.(6)附加生物素
42.培养基中附加生物素1.5mg/l；
43.(7)调整培养基的碳源类型
44.将培养基中常用的蔗糖碳源改变为葡萄糖碳源，具体用量为54000mg/l；
45.(8)附加生长调节剂
46.培养基中附加2,4-d 2mg/l、kt 0.5mg/l，生长调节剂的用量可根据实际调整；
47.(9)用植物凝胶做凝固剂
48.培养基凝固剂为植物凝胶(phytagel)，具体用量为：2400mg/l，如凝固效果不佳，可适当增加用量；
49.(10)改变灭菌条件和方式
50.培养基定容后，将ph值调至5.8，进行高压灭菌，灭菌条件为：115℃、15分钟；或
51.将葡萄糖和培养基的其他成分分开灭菌，然后混合均匀再倒皿，即：将每升培养基中除葡萄糖以外的成分溶解于水，定容至900ml，调ph值至5.8；将每升培养基中的葡萄糖溶解于水，定容至100ml，调ph值至5.8；将两部分单独高压灭菌；灭菌完成后，待两部分的温度降至接近50℃时，于超净台上将二者混匀，倒成平板培养基(平板厚度为皿底高度的2/3)；平板冷凝后，即可供小麦花药培养使用；
52.(11)平板培养基的保存
53.平板培养基制好后，不能立即使用的，可以在保证不被污染的前提下常温存放，保存过程中需注意防止培养基散失水分，当培养基干缩至原体积的将近一半时便不宜再使用。
54.本发明的工作原理及有益效果为：
55.1、本发明中，通过调整培养基氮源，去掉无机还原态氮，将还原态氮调整为有机还原态氮(＝nh、-nh2)，可诱导细胞更早、更快地分裂，促进愈伤组织较快地增长，和/或通过调整碳源，将蔗糖调整为葡萄糖，从而得到高效诱导小麦花药出愈的培养基，显著提高了小麦花药的出愈率。
56.2、本发明中，通过对小麦花药培养基的配方进行优化设计，得到了pci培养基，以小麦品种
‘
金禾9123’、
‘
科农199’为试材，与当前人们认为效果最好的小麦花药培养基w14
相比，pci培养基上的出愈率至少提高20个百分点(把w14的碳源改为葡萄糖，出愈率提高了10个百分点，pci又比以葡萄糖为碳源的w14至少提高了10个百分点)，出愈率高达40％以上，显著提高了小麦花药的出愈率。
57.3、在pci培养基上，花药的出愈时间早，大约提早一周；花药的出愈度(即出愈程度，据单个花药中出现独立小孢子愈伤的块数决定)也高，有的花药可以高达几十块；愈伤组织的生长速度也快。这说明通过本发明设计的pci培养基对小麦花药培养，实现了小麦花药培养中小孢子出愈快、出愈率高的效果，表现了大幅度提升育种应用时可捕捉较多基因重组体和提高获得单倍体效率的优越性。
附图说明
58.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
59.图1为本发明实验例1中代表性培养皿照片，拍摄于接种培养5周后，图中，培养皿的直径为6cm，a、b、c分别为
‘
金禾9123’花药在c、d、e培养基上的出愈情况；d、e、f分别为
‘
科农199’花药在c、d、e培养基上的出愈及其生长情况；
60.图2为本发明实验例2中代表性培养皿照片，拍摄于接种培养5周后，
‘
金禾9123’花药在i培养基上接种6周后出愈及其生长情况；
61.图3为本发明实验例2中代表性培养皿照片，拍摄于接种培养8周后，图中，培养皿的直径为6cm，a、b分别为
‘
金禾9123’花药在i、e培养基上的出愈情况；c、d分别为
‘
科农199’花药在i、e培养基上的出愈及其生长情况；
62.图4为本发明实验例3中代表性培养皿照片，拍摄于接种培养8周后，图中，培养皿的直径为6cm，a、b分别为
‘
金禾9123’花药在i、j培养基上的出愈情况；
63.图5为本发明实验例4中代表性培养皿照片(1)，拍摄于接种培养5周后，图中，培养皿的直径为6cm，a、b、c分别为
‘
金禾9123’花药，d、e、f分别为
‘
科农199’花药，在b、c、d培养基上的出愈及其生长情况；
64.图6为本发明实验例4中代表性培养皿照片(2)，拍摄于接种培养9周后，图中，培养皿的直径为6cm，a、b为
‘
科农199’花药，在d、g培养基上的出愈及其生长情况；
具体实施方式
65.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。
66.实施例1
67.一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，在现有的w14培养基的基础上，调整碳源，即将蔗糖调整为葡萄糖，葡萄糖的质量浓度为54000mg/l。
68.实施例2
69.一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，在现有的w14培养基的基础上，调整氮源，即将无机还原态氮调整为有机还原态氮，有机还原态氮包括l-谷氨酰胺、l-精氨酸各组分的质量浓度mg/l为：l-谷氨酰胺1000，l-精氨酸170。
70.实施例3
71.一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，在现有的w14培养基的基础上，调整氮源，即将无机还原态氮调整为有机还原态氮，有机还原态氮包括l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-天冬素、甘氨酸，各组分的质量浓度mg/l为：l-谷氨酰胺1000，l-精氨酸170，l-天冬素130，甘氨酸50。
72.实施例4
73.一种高效诱导小麦花药出愈的培养基，在现有的w14培养基的基础上，调整碳源，即将蔗糖调整为葡萄糖，葡萄糖的质量浓度为54000mg/l，还调整氮源，即将无机还原态氮调整为有机还原态氮，有机还原态氮包括l-谷氨酰胺、l-精氨酸、l-天冬素、甘氨酸，各组分的质量浓度mg/l为：l-谷氨酰胺1000，l-精氨酸170，l-天冬素130，甘氨酸50。
74.实施例5
75.一种高效诱导小麦花药出愈的pci培养基，配方如下(mg/l)：kno
3 1300，cacl2·
2h2o 120，mgso4·
7h2o 155，kh2po
4 410，l-谷氨酰胺500，l-精氨酸150，l-天冬素110，甘氨酸35，feso4·
7h2o 27.85，na
2-edta
·
2h2o 37.25，ki 0.415，h3bo
3 3.1，mnso4·
4h2o 11.15，znso4·
7h2o 4.3，na2mno4·
2h2o 0.125，cuso4·
5h2o 0.0125，cocl2·
6h2o 0.0125，肌醇100，生物素3，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.4，盐酸硫胺素0.5，甘氨酸2，葡萄糖50000，2,4-d 2，kt 0.5，植物凝胶2400。
76.实验例6
77.一种高效诱导小麦花药出愈的pci培养基，配方如下(mg/l)：kno
3 1700，cacl2·
2h2o 135，mgso4·
7h2o 180，kh2po
4 500，l-谷氨酰胺1200，l-精氨酸200，l-天冬素135，甘氨酸30，feso4·
7h2o 27.85，na
2-edta
·
2h2o 37.25，ki 0.415，h3bo
3 3.1，mnso4·
4h2o 11.15，znso4·
7h2o 4.3，na2mno4·
2h2o 0.125，cuso4·
5h2o 0.0125，cocl2·
6h2o 0.0125，肌醇100，生物素3，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.4，盐酸硫胺素0.5，甘氨酸2，葡萄糖60000，2,4-d 2，kt 0.5，植物凝胶2400。
78.实验例7
79.一种高效诱导小麦花药出愈的pci培养基，配方如下(mg/l)：kno
3 1500，cacl2·
2h2o 130，mgso4·
7h2o 160，kh2po
4 450，l-谷氨酰胺1000，l-精氨酸170，l-天冬素130，甘氨酸50，feso4·
7h2o 27.85，na
2-edta
·
2h2o 37.25，ki 0.415，h3bo
3 3.1，mnso4·
4h2o 11.15，znso4·
7h2o 4.3，na2mno4·
2h2o 0.125，cuso4·
5h2o 0.0125，cocl2·
6h2o 0.0125，肌醇100，生物素3，烟酸0.5，盐酸吡哆醇0.4，盐酸硫胺素0.5，甘氨酸2，葡萄糖54000，2,4-d 2，kt 0.5，植物凝胶2400。
80.pci培养基的制备方法为：选一个1l的洁净的大烧杯，倒入600-700ml的纯水，依次称量大量元素、有机态还原态氮的各成分，按待前一种成分溶解后再倒入后一种成分的要求顺序加入大烧杯内溶解，但cacl2需先单独用另外的洁净小烧杯装少量的纯水(6-10ml)溶解然后再倒入大烧杯内；将铁盐、微量元素、专属有机成分、生物素、植物生长调节剂(先期配成了母液且低温保存)按比例加入大烧杯；将每升培养基中除葡萄糖以外的成分溶解于水，大烧杯定容至900ml，调ph值至5.8，最后称入植物胶；将每升培养基中的葡萄糖用另外的100ml的洁净烧杯溶解于纯水，定容至100ml，调ph值至5.8(注意使用低离子浓度的ph计探头)；将两部分按计划单独分别倒入不同规格的洁净的三角瓶用封口膜封好，在115℃
下高压灭菌15min；灭菌完成后，待两部分的温度降至接近50℃时，于超净台上将二者混匀，倒成平板培养基(平板厚度为皿底高度的2/3)。平板冷凝后，即可供小麦花药培养使用。另外，培养基的基本成分可按照制备培养基粉剂的工艺先制成粉剂(成为商品化培养基)，使用时将粉剂先溶于水，再加入植物生长调节剂、葡萄糖等进行配制。
81.实验例1以蔗糖为碳源和以葡萄糖为碳源的培养基对比试验
82.1.材料与方法
83.实验材料为
‘
金禾9123’、
‘
科农199’两个小麦生产品种。其中，
‘
金禾9123’不仅是丰产、耐旱、抗白粉病的优异品种，而且还是重要的育种亲本，用其做母本已育出了
‘
马兰1号’等多个优良品种，其可培养性尚待确定，如若成功意味着用其做亲本育成的品种适于使用生物技术；
‘
科农199’是可培养性较好的品种，选择其的目的是确保对比实验成功。
84.选取以上两个小麦品种无病、无破损的健康完好种子，有计划地播种于温室和大田。在小麦植株孕穗后期(大约抽穗前1-2d)，于穗茎节结的下部剪取带旗叶的鞘苞穗，用硫酸纸包好，再用塑料袋装起来，置于4-5℃冷藏箱内暗保存3-7d或更长(低温预处理)。
85.接种时，于超净台上先用70％的酒精擦拭鞘苞穗的外部进行消毒，再脱去叶鞘露出幼穗，然后用无菌镊子拨取花药接种于培养基。接种前将培养皿置于事先已均匀画好100个小格子的灭过菌的纸上，为便于识别最好是打印出黑底白线的类型。将参试培养基同时打开，用来自同一幼穗的花药分别接种，而且还要尽量用来自于同一个小花的花药分别接种，以保障培养基之间所接花药的一致性。
86.花药接好后，将培养皿用石蜡膜封好，先在30℃条件下暗培养3d，然后转至28℃条件下继续暗培养。培养期间，适时调查出愈情况和愈伤生长情况，并进行统计和拍照。
87.所用培养基：以蔗糖为碳源的w14，用d标记；以葡萄糖为碳源的w14，配方如实施例1，用e标记，实验中还用了c17培养基，用c标记，但由于c和d上的出愈率都相对较低，而且与d的差异不明显，故在“实验结果”中省略。
88.2.实验结果
89.大约培养4周后，两种试材的花药在e培养基上便开始有“小水泡”出现，随后长出小米粒样的愈伤组织。
90.花药的出愈率结果参见表1、图1：
91.表1不同碳源培养基上的出愈率
[0092][0093][0094]
此实验开始于2020年春季(用的是2019年秋播的材料)，直接重复了2批次，又间接重复了3批次，结果均稳定。
[0095]
实验例2pci培养基和改碳源为葡萄糖的w14培养基的对比试验
[0096]
1.材料与方法
[0097]
实验材料及实验方法同实验例1；
[0098]
所用培养基：pci培养基配方如实施例7，用i标记；改碳源为葡萄糖的w14培养基，配方如实施例1，用e标记；培养基制好后分别倒入直径6cm的培养皿，每皿倒培养基约15ml。
[0099]
2.实验结果
[0100]
大约接种3周后，两种试材的花药在i培养基上便开始有类似“小水泡”样的东西出现；随后出“小水泡”的花药便长出小米粒大小的愈伤组织。愈伤组织既可以从花药体的一端出，也可以从花药体的两侧出；出愈好的花药，由于众多的小愈伤颗粒从其两侧长出，呈现蝴蝶状；在e培养基上，出愈的时间大约要晚一周。显微镜下，花药出的小愈伤颗粒极像一粒粒白色或乳白色的小玉珠。
[0101]
花药的出愈率结果参见表2、图2-3：
[0102]
表2 pci(i)培养基和改碳源为葡萄糖的w14(e)培养基上的出愈率
[0103]
实验材料e培养基i培养基金禾912320％30％科农19929％43％
[0104]
此实验从2020年夏季开始(用的是早春播的材料)，加上冬季生长于温室的材料，至2021年夏季共开展了三大批次的实验，每个批次中又设了若干个小重复。所有实验表明，在i培养基上花药的出愈率明显地高于e培养基，至少要高出10个百分点。
[0105]
另外还发现，温室种植的材料可能优于大田种植的材料。
[0106]
实验例3以有机还原态氮为氮源和以有机、无机还原态氮为氮源的培养基对比试验
[0107]
1.材料与方法
[0108]
实验材料及实验方法同实验例1；
[0109]
所用培养基：pci培养基配方如实施例4，用i标记；增加无机还原态氮的培养基(比pci培养基多3.2mmol/l的nh
4
)，用j标记。
[0110]
2.实验结果
[0111]
大约3、4周后，两种试材的花药在i、j培养基上便开始有“小水泡”出现，随后长出小米粒样的愈伤组织。
[0112]
花药的出愈率结果参见表3、图4：
[0113]
表3不同氮源培养基上的出愈率
[0114]
实验材料i培养基j培养基金禾912326％10％科农19943％20％
[0115]
实验例4钙镁离子水平对小麦花药出愈的影响
[0116]
1.材料与方法
[0117]
实验材料及实验方法同实验例1；
[0118]
所用培养基：自设培养基1，用b标记，配方如下(mg/l)：l-谷氨酰胺877、l-精氨酸261、l-天冬氨酸266、甘氨酸73、kcl 2760、nh4no
3 40、ca(no3)2·
4h2o 1044、mgso4·
7h2o 810、kh2po
4 410、1/2ms微量元素、ms铁盐和专属有机成分、葡萄糖54000、植物胶2400，其特点是钙镁离子浓度高，ca
2
浓度为4.4mmol/l、mg
2
浓度为3.3mmol/l；c17培养基，用c标记，ca
2
浓度为1.02mmol/l，mg
2
浓度为0.61mmol/l；w14培养基，用d标记，ca
2
浓度为0.95mmol/l，mg
2
浓度为0.81mmol/l；自设培养基2，用g标记，与b培养基的区别仅在于ca
2
浓度为0.89mmol/l、mg
2
浓度为0.69mmol/l；
[0119]
2.实验结果
[0120]
培养4周后调查，两种试材的花药，在b、c、d三种培养基上都长出了小米粒样的愈伤组织，但在b培养基上的花药出愈率明显低于c、d培养基。而且，愈伤组织在b培养基上的生长速度也明显慢于c、d培养基(参见表4、图5)。
[0121]
表4不同钙镁离子浓度对小麦花药出愈的影响(1)
[0122]
实验材料b培养基c培养基d培养基金禾91232.5％11％8.5％科农1993.5％11％12％
[0123]
b、c、d三种培养基的对比实验，实施于2020年4月，试材2019年秋季播种于大田，重复2批次。两个参试品种，在b培养基上最终只有2％-3％的花药出愈，而在c、d培养基上出愈率可达到10％。虽然三种培养基的其他成分差异也较大，但推测抑制小孢子分裂的主要原因应是钙镁离子浓度过高所致。特别是钙，在已有的认知中钙虽有益于稳定细胞膜，但高钙浓度会影响细胞分裂。
[0124]
为了验证b培养基上出愈率低是由钙镁离子浓度高所致，用2020年早春播种于大田的试材又进行了补充实验，即d与g的对比，实验重复两批次。结果得出，钙镁浓度高是小孢子分裂的限制因素，降低其浓度后，出愈率有了显著的提升，达到了和d培养基上相当的出愈水平，而且愈伤组织的生长速度比d培养基上明显加快(参见表5、图6)。
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表5不同钙镁离子浓度对小麦花药出愈的影响(2)
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实验材料d培养基g培养基科农19910％10％
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以上仅为本发明的最具代表性的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。